JP2664586B2 - ポリフェノール配糖体合成能を有する酵素 - Google Patents
ポリフェノール配糖体合成能を有する酵素Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ポリフェノール配糖
体合成能を有する新規な酵素、酵素の製造法およびこの
酵素を用いるポリフェノール配糖体の製造法に関する。
体合成能を有する新規な酵素、酵素の製造法およびこの
酵素を用いるポリフェノール配糖体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリフェノール配糖体は、従来から、例
えば、甘味料、鎮痛剤、下剤、抗マラリヤ剤および強壮
剤等として利用されているが、本件出願人は先に、肝斑
や雀斑等の原因となるメラニン色素の生成に関与するチ
ロシナーゼの酵素作用を阻害して優れた美白効果を発揮
するポリフェノール配糖体を提供した(特願平３−３４
１５１号)。この場合、該ポリフェノール配糖体の合成
用酵素として、バシルス・マセランス(Ｂacillus mace
rans)ＩＦＯ３４９０株から分泌されるシクロマルトデ
キストリン−グルカノトランスフェラーゼ(ＣＧＴアー
ゼ)(「大阪市立工業研究所報告第５６回(１９７８年)」、
第１９頁〜第２４頁参照)を使用した。しかしながら、
ＣＧＴアーゼには、配糖体合成効率が一般に低いだけで
なく(０.５〜１％)、活性を糖基質やポリフェノール受
容体の種類が非常に制限されるという難点がある。
えば、甘味料、鎮痛剤、下剤、抗マラリヤ剤および強壮
剤等として利用されているが、本件出願人は先に、肝斑
や雀斑等の原因となるメラニン色素の生成に関与するチ
ロシナーゼの酵素作用を阻害して優れた美白効果を発揮
するポリフェノール配糖体を提供した(特願平３−３４
１５１号)。この場合、該ポリフェノール配糖体の合成
用酵素として、バシルス・マセランス(Ｂacillus mace
rans)ＩＦＯ３４９０株から分泌されるシクロマルトデ
キストリン−グルカノトランスフェラーゼ(ＣＧＴアー
ゼ)(「大阪市立工業研究所報告第５６回(１９７８年)」、
第１９頁〜第２４頁参照)を使用した。しかしながら、
ＣＧＴアーゼには、配糖体合成効率が一般に低いだけで
なく(０.５〜１％)、活性を糖基質やポリフェノール受
容体の種類が非常に制限されるという難点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、ポリフェ
ノール配糖体の合成効率が高く、広範囲の糖基質やポリ
フェノール受容体に対して活性を示すポリフェノール配
糖体合成能を有する新規な酵素を提供するためになされ
たものである。
ノール配糖体の合成効率が高く、広範囲の糖基質やポリ
フェノール受容体に対して活性を示すポリフェノール配
糖体合成能を有する新規な酵素を提供するためになされ
たものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】即ちこの発明は、(i)サ
イクロデキストリン合成能およびマルトース分解能を有
さず、(ii)糖基質を加水分解して生成するグルコースを
ポリフェノール受容体に転移させてポリフェノール配糖
体を合成する特性を有し、至適ｐＨが６〜８であり、安
定ｐＨが６〜９であり、至適温度が４０〜５０℃であ
り、安定温度が０〜５０℃であり、分子量が２９５００
であり、等電点が５.１である酵素に関する。本発明に
よる酵素は、サイクロデキストリン合成能およびマルト
ース分解能を有さないが、ポリフェノール配糖体合成能
を有する新規な酵素である。本発明による酵素は、サイ
クロデキストリン合成能を有さないという点で、ＣＧＴ
アーゼとは基本的に相違し、また、マルトース分解能を
有さないという点で、細菌糖化型α−アミラーゼ(ＢＳ
Ａ)(「ハンドブック・オブ・アミラーゼ・アンド・リレ
イテッド・エンザイムズ(Ｈandbook of Ａmylase and
Ｒelated Ｅnzymse)」、パーガモン・プレス(Ｐergamon
Ｐress)発行、第４３頁(１９８８年)参照)とは本質的に
相違する。
イクロデキストリン合成能およびマルトース分解能を有
さず、(ii)糖基質を加水分解して生成するグルコースを
ポリフェノール受容体に転移させてポリフェノール配糖
体を合成する特性を有し、至適ｐＨが６〜８であり、安
定ｐＨが６〜９であり、至適温度が４０〜５０℃であ
り、安定温度が０〜５０℃であり、分子量が２９５００
であり、等電点が５.１である酵素に関する。本発明に
よる酵素は、サイクロデキストリン合成能およびマルト
ース分解能を有さないが、ポリフェノール配糖体合成能
を有する新規な酵素である。本発明による酵素は、サイ
クロデキストリン合成能を有さないという点で、ＣＧＴ
アーゼとは基本的に相違し、また、マルトース分解能を
有さないという点で、細菌糖化型α−アミラーゼ(ＢＳ
Ａ)(「ハンドブック・オブ・アミラーゼ・アンド・リレ
イテッド・エンザイムズ(Ｈandbook of Ａmylase and
Ｒelated Ｅnzymse)」、パーガモン・プレス(Ｐergamon
Ｐress)発行、第４３頁(１９８８年)参照)とは本質的に
相違する。
【０００５】本発明による酵素は、例えば、バシルス属
(Ｂacillus)の細菌から生産される。好適なバシルス属
の細菌としては、バシルス・ズブチリス(Ｂacillus sub
til-is)Ｋ−５３１−１(微工研菌寄第１２６６８号)、
バシルス・スブチリスＫ−５３１−８６(微工研菌寄第
１２６６９号)、バシルス・スリンジエンシス(Ｂac-ill
us thuringiensis)(ＩＦＯ ３９５１)、バシルス・リ
ケニホルミス(Ｂacilluslicheniformis)(ＡＴＣＣ２５
９７２)およびバシルス・アミロリケファシエンス(Ｂac
illus amyloliquefaciens)(ＩＦＯ１４１４１)等が例示
される。
(Ｂacillus)の細菌から生産される。好適なバシルス属
の細菌としては、バシルス・ズブチリス(Ｂacillus sub
til-is)Ｋ−５３１−１(微工研菌寄第１２６６８号)、
バシルス・スブチリスＫ−５３１−８６(微工研菌寄第
１２６６９号)、バシルス・スリンジエンシス(Ｂac-ill
us thuringiensis)(ＩＦＯ ３９５１)、バシルス・リ
ケニホルミス(Ｂacilluslicheniformis)(ＡＴＣＣ２５
９７２)およびバシルス・アミロリケファシエンス(Ｂac
illus amyloliquefaciens)(ＩＦＯ１４１４１)等が例示
される。
【０００６】従って、本発明による酵素の特に好適な製
法は、バシルス属の細菌、就中、バシルス・ズブチリス
Ｋ−５３１−１等の上記の細菌を培養して得られる培養
物を精製処理に付す方法である。培地成分としては、各
種の炭素源(例えば、可溶性澱粉、コーンスチープリカ
ー、脱脂大豆、デキストリン、グリセロールおよびグル
コース等)、窒素源(例えば、ポリペプトン、脱脂大豆、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アミノ酸、酵母
エキス、カゼイン、肉エキス、コラーゲンおよびゼラチ
ン等)、無機塩類(例えば、カリウム、ナトリウム、マグ
ネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、コバルト、カルシ
ウム、酸化モリブデンなどの硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、
酢酸塩等)およびビタミン類(例えば、ビオチン、ビタミ
ンＢ1、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、
ビリドキサール、ピリドキサミン、ニコチン酸ｐ−アミ
ノ安息香酸および葉酸等)を適宜使用すればよい。好適
な培地は、可溶性澱粉、ポリペプトンおよび塩化ナトリ
ウムを主成分とし、さらに無機酸の金属塩、例えば、燐
酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸亜
鉛、硫酸銅および硫酸マンガン等を適宜含有する水性培
地である。この種の金属塩を添加することによって、該
酵素の生産量はほぼ倍増する。
法は、バシルス属の細菌、就中、バシルス・ズブチリス
Ｋ−５３１−１等の上記の細菌を培養して得られる培養
物を精製処理に付す方法である。培地成分としては、各
種の炭素源(例えば、可溶性澱粉、コーンスチープリカ
ー、脱脂大豆、デキストリン、グリセロールおよびグル
コース等)、窒素源(例えば、ポリペプトン、脱脂大豆、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アミノ酸、酵母
エキス、カゼイン、肉エキス、コラーゲンおよびゼラチ
ン等)、無機塩類(例えば、カリウム、ナトリウム、マグ
ネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、コバルト、カルシ
ウム、酸化モリブデンなどの硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、
酢酸塩等)およびビタミン類(例えば、ビオチン、ビタミ
ンＢ1、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、
ビリドキサール、ピリドキサミン、ニコチン酸ｐ−アミ
ノ安息香酸および葉酸等)を適宜使用すればよい。好適
な培地は、可溶性澱粉、ポリペプトンおよび塩化ナトリ
ウムを主成分とし、さらに無機酸の金属塩、例えば、燐
酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸亜
鉛、硫酸銅および硫酸マンガン等を適宜含有する水性培
地である。この種の金属塩を添加することによって、該
酵素の生産量はほぼ倍増する。
【０００７】培地のpＨは燐酸緩衝液や酸およびアルカ
リ水溶液を用いて５〜９に調整する。培地のpＨがこの
範囲外になると、酵素失活を招き、収量が大きく低下す
る。培養温度は通常２５〜５０℃である。培養効率の観
点からは、培養は、種培養と本培養の二段階に分けてお
こなうのが好ましい。通常、種培養は液体振盪培養でお
こない(振盪数:８０〜２００rpm、培養時間:１６〜３０
時間)、本培養は通気撹拌培養でおこなう(撹拌数:１０
０〜３００rpm、通気量:２〜５l／min、培養時間:２０
〜１２０時間)。但し、撹拌数、通気量、培養時間は培
養装置の形状、大きさによって大きく変化する。
リ水溶液を用いて５〜９に調整する。培地のpＨがこの
範囲外になると、酵素失活を招き、収量が大きく低下す
る。培養温度は通常２５〜５０℃である。培養効率の観
点からは、培養は、種培養と本培養の二段階に分けてお
こなうのが好ましい。通常、種培養は液体振盪培養でお
こない(振盪数:８０〜２００rpm、培養時間:１６〜３０
時間)、本培養は通気撹拌培養でおこなう(撹拌数:１０
０〜３００rpm、通気量:２〜５l／min、培養時間:２０
〜１２０時間)。但し、撹拌数、通気量、培養時間は培
養装置の形状、大きさによって大きく変化する。
【０００８】上記の培養法によって得られる培養物の精
製処理法は特に限定的ではなく、従来から酵素の精製法
として知られている方法を適宜採用すればよいが、好適
な精製法としては下記の工程(i)〜(ix)から成る方法が
例示される: (i)培養液を遠心分離処理あるいは濾過に付すことによ
って培養上清を採取する。 (ii)培養上清をカチオンカラム(例えば、アンバーライ
トＣＧ５０、ＣＭ−トヨパール、ＣＭ−セファロース、
ＣＭ−セルロース、５Ｐ−セファロースおよびＣＭ−セ
ルロファイン等)を用いるクロマトグラフィー処理に付
す。 (iii)溶出液を限外濾過、塩析または有機溶媒沈殿によ
る濃縮処理に付す。 (iv)濃縮液を透析処理に付す。 (v)透析内液をアニオンカラム(例えば、ＤＥＡＥ−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂ、デュオライトＡ−７、ＱＡＥ−セ
ファロース、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セルロ
ファインおよびＤＥＡＥ−トヨパール等)を用いるクロ
マトグラフィー処理に付す。 (vi)溶出液を限外濾過膜等を用いる濃縮処理に付す。 (vii)濃縮液を高速液体クロマトグラフィー(例えば、Ｔ
sk−ゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラム)またはアフィニティ
ークロマトグラフィー処理に付す。 (viii)溶出液を限外濾過膜等を用いる濃縮処理に付す。 (ix)濃縮液をカラム(例えば、セファデックスＧ−７
５、セファロース６ＢおよびトヨパールＨＷ−５５等)
を用いるゲル濾過処理に付す。 場合によっては、澱粉吸着処理等も有効である。上記の
精製処理によって、酵素の精製倍率は約１０００〜３０
００となる。勿論、上記精製のステップの順序を変えた
り、一部を省略することも可能であり、酵素の使用目的
によっては精製倍率を必要最小限にすることも可能であ
る。
製処理法は特に限定的ではなく、従来から酵素の精製法
として知られている方法を適宜採用すればよいが、好適
な精製法としては下記の工程(i)〜(ix)から成る方法が
例示される: (i)培養液を遠心分離処理あるいは濾過に付すことによ
って培養上清を採取する。 (ii)培養上清をカチオンカラム(例えば、アンバーライ
トＣＧ５０、ＣＭ−トヨパール、ＣＭ−セファロース、
ＣＭ−セルロース、５Ｐ−セファロースおよびＣＭ−セ
ルロファイン等)を用いるクロマトグラフィー処理に付
す。 (iii)溶出液を限外濾過、塩析または有機溶媒沈殿によ
る濃縮処理に付す。 (iv)濃縮液を透析処理に付す。 (v)透析内液をアニオンカラム(例えば、ＤＥＡＥ−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂ、デュオライトＡ−７、ＱＡＥ−セ
ファロース、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セルロ
ファインおよびＤＥＡＥ−トヨパール等)を用いるクロ
マトグラフィー処理に付す。 (vi)溶出液を限外濾過膜等を用いる濃縮処理に付す。 (vii)濃縮液を高速液体クロマトグラフィー(例えば、Ｔ
sk−ゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラム)またはアフィニティ
ークロマトグラフィー処理に付す。 (viii)溶出液を限外濾過膜等を用いる濃縮処理に付す。 (ix)濃縮液をカラム(例えば、セファデックスＧ−７
５、セファロース６ＢおよびトヨパールＨＷ−５５等)
を用いるゲル濾過処理に付す。 場合によっては、澱粉吸着処理等も有効である。上記の
精製処理によって、酵素の精製倍率は約１０００〜３０
００となる。勿論、上記精製のステップの順序を変えた
り、一部を省略することも可能であり、酵素の使用目的
によっては精製倍率を必要最小限にすることも可能であ
る。
【０００９】上記の特性を有する本発明による酵素は、
広範囲の糖基質を加水分解し、種々のポリフェノール類
にグルコースを転移させ、これによって多種多様なポリ
フェノール配糖体が得られる。この種の糖基質およびポ
リフェノール受容体としては下記のものが例示される:糖基質 : 澱粉、アミロペクチン、マルトオリゴ糖(Ｇ3
〜Ｇ7)。ポリフェノール受容体 : カテキン、カフェー酸、コウ
ジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、
プロトカテキュー酸、α−レゾルシル酸、フロログルシ
ノール、没食子酸。
広範囲の糖基質を加水分解し、種々のポリフェノール類
にグルコースを転移させ、これによって多種多様なポリ
フェノール配糖体が得られる。この種の糖基質およびポ
リフェノール受容体としては下記のものが例示される:糖基質 : 澱粉、アミロペクチン、マルトオリゴ糖(Ｇ3
〜Ｇ7)。ポリフェノール受容体 : カテキン、カフェー酸、コウ
ジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、
プロトカテキュー酸、α−レゾルシル酸、フロログルシ
ノール、没食子酸。
【００１０】本発明に包含されるポリフェノール配糖体
の新規な製造法は、澱粉等の糖基質およびカテキン等の
ポリフェノール受容体を、上述の酵素の存在下で反応さ
せる方法である。この反応は、通常、燐酸緩衝液等の緩
衝液を用いて反応系のpＨを約４〜９に調整し、約１０
〜６０℃で約３〜７０時間おこなう。反応溶媒として
は、水,メタノール／水(５〜５０体積％),エタノール／
水(５〜５０体積％),酢酸エチル／水(１０〜８０体積
％)等が例示される。又、使用する酵素を不倍性担体に
固定化することにより製造したポリフェノール配糖体か
ら酵素を除くステップを省略することもできる。以下、
本発明を実施例によって説明する。
の新規な製造法は、澱粉等の糖基質およびカテキン等の
ポリフェノール受容体を、上述の酵素の存在下で反応さ
せる方法である。この反応は、通常、燐酸緩衝液等の緩
衝液を用いて反応系のpＨを約４〜９に調整し、約１０
〜６０℃で約３〜７０時間おこなう。反応溶媒として
は、水,メタノール／水(５〜５０体積％),エタノール／
水(５〜５０体積％),酢酸エチル／水(１０〜８０体積
％)等が例示される。又、使用する酵素を不倍性担体に
固定化することにより製造したポリフェノール配糖体か
ら酵素を除くステップを省略することもできる。以下、
本発明を実施例によって説明する。
【００１１】
【実施例】実施例１ 可溶性澱粉２w／v％、ポリペプトン０．５w／v％、塩化
ナトリウム０．０５w／v％、燐酸二カリウム０．１w／v
％、硫酸マグネシウム０．０５w／v％、硫酸第一鉄０．
００１w／v％、硫酸亜鉛０．０００１w／v％、硫酸銅
０．０００１w／v％および硫酸マンガン０．０００１w
／v％含有する水溶液(pＨ６．５)を１２１℃で１５分間
加圧滅菌することによって培地を調製した。坂口フラス
コ(５００ml)内へ該培地を１００ml入れ、次いでバシル
ス・ズブチリスＫ−５３１−８６を１白金耳量植菌し、
１２０rpmの条件下、３０℃で２４時間振盪培養した(種
培養)。上記のようにして新たに調製した培地３lに、該
培養液を混入させ、該混合物をミニジャー(５l)内にお
いて、撹拌数２００rpmおよび通気量３l／minの条件下
において、３０℃で７２時間にわたって通気撹拌培養し
た(本培養)。
ナトリウム０．０５w／v％、燐酸二カリウム０．１w／v
％、硫酸マグネシウム０．０５w／v％、硫酸第一鉄０．
００１w／v％、硫酸亜鉛０．０００１w／v％、硫酸銅
０．０００１w／v％および硫酸マンガン０．０００１w
／v％含有する水溶液(pＨ６．５)を１２１℃で１５分間
加圧滅菌することによって培地を調製した。坂口フラス
コ(５００ml)内へ該培地を１００ml入れ、次いでバシル
ス・ズブチリスＫ−５３１−８６を１白金耳量植菌し、
１２０rpmの条件下、３０℃で２４時間振盪培養した(種
培養)。上記のようにして新たに調製した培地３lに、該
培養液を混入させ、該混合物をミニジャー(５l)内にお
いて、撹拌数２００rpmおよび通気量３l／minの条件下
において、３０℃で７２時間にわたって通気撹拌培養し
た(本培養)。
【００１２】培養液２．７lを遠心分離処理(９０００rp
m:１５分間)に付すことによって得られた培養上清２．
６５lを、１Ｍ酢酸を用いてpＨを５．０に調整した後、
５０mＭ酢酸緩衝液(pＨ５．０)を用いて平衡化したアン
バーライトＣＧ５０カラム(１５．９cm2×２７cm)に注
入し、該酢酸緩衝液７．５lを用いて洗浄した。次い
で、０．５Ｍ燐酸カリウム緩衝液(pＨ７．０)を用い、
流速１．６l／hrで溶出をおこない、溶出量１l〜３lに
かけての溶出液２０４０mlを、分画分子量３０００の限
外濾過膜(旭化成工業株式会社製ペンシル型モジュール
ＳＥＰ−００１３)を用いて１５０mlまで濃縮し、該濃
縮液を、０．５Ｍ燐酸二カリウム水溶液を用いてpＨを
７．０に調整した後、１０倍量の水に対し、４℃で１６
時間透析をおこなった。
m:１５分間)に付すことによって得られた培養上清２．
６５lを、１Ｍ酢酸を用いてpＨを５．０に調整した後、
５０mＭ酢酸緩衝液(pＨ５．０)を用いて平衡化したアン
バーライトＣＧ５０カラム(１５．９cm2×２７cm)に注
入し、該酢酸緩衝液７．５lを用いて洗浄した。次い
で、０．５Ｍ燐酸カリウム緩衝液(pＨ７．０)を用い、
流速１．６l／hrで溶出をおこない、溶出量１l〜３lに
かけての溶出液２０４０mlを、分画分子量３０００の限
外濾過膜(旭化成工業株式会社製ペンシル型モジュール
ＳＥＰ−００１３)を用いて１５０mlまで濃縮し、該濃
縮液を、０．５Ｍ燐酸二カリウム水溶液を用いてpＨを
７．０に調整した後、１０倍量の水に対し、４℃で１６
時間透析をおこなった。
【００１３】透析内液を、５０mＭ燐酸カリウム緩衝液
(pＨ７．０)を用いて平衡化したＤＥＡＥセファロース
ＣＬ６Ｂカラム(１１．９cm2×１６cm)に注入し、該緩
衝液を用いて洗浄した(４００ml／hr)。洗浄液量２５０
〜５５０mlにかけて溶出した溶出液３００mlを、前記の
限外濾過膜を用いて５mlまで濃縮し、該濃縮液を、０.
２ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液(ｐＨ
７.０)を用いて平均化したセファデックスＧ−１５０カ
ラム(５.３ｃｍ2×９３ｃｍ)を用いるゲル濾過処理に付
した。該緩衝液を用いて溶出をおこない、溶出液量２６
０〜３００ｍｌにかけての溶出液４０ｍｌを得た。該酵
素液は電気泳動的に単一であった。上述の一連の精製過
程の結果を以下の表１にまとめて示す。
(pＨ７．０)を用いて平衡化したＤＥＡＥセファロース
ＣＬ６Ｂカラム(１１．９cm2×１６cm)に注入し、該緩
衝液を用いて洗浄した(４００ml／hr)。洗浄液量２５０
〜５５０mlにかけて溶出した溶出液３００mlを、前記の
限外濾過膜を用いて５mlまで濃縮し、該濃縮液を、０.
２ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液(ｐＨ
７.０)を用いて平均化したセファデックスＧ−１５０カ
ラム(５.３ｃｍ2×９３ｃｍ)を用いるゲル濾過処理に付
した。該緩衝液を用いて溶出をおこない、溶出液量２６
０〜３００ｍｌにかけての溶出液４０ｍｌを得た。該酵
素液は電気泳動的に単一であった。上述の一連の精製過
程の結果を以下の表１にまとめて示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】表−１中の活性量(単位)およびタンパク量
(mg)は下記の方法によって算出した値である。活性量 可溶性澱粉を５０mＭ燐酸ナトリウム緩衝液(pＨ７．０)
に０．５w／v％の濃度で溶解した溶液０．４５mlに酵素
液０．０５mlを加え、４０℃で１０分間反応をおこなっ
た後、０．５Ｎ塩酸１．０mlを添加することによって反
応を停止させ、次いで、ヨウ素５mgとヨウ化カリウム５
０mgを水１００mlに溶解させた溶液２．５mlを加え、室
温で２０分間放置後、６６０nmにおける吸光度を測定
し、該吸光度を１分間に１％低下させる酵素量を１単位
とした(ブランクテストは、酵素の替りに上記緩衝液を
用いる以外は上記と同様の操作によっておこなった)。タンパク量 次式によって算出した: タンパク量(mg)＝(２８０nmにおける吸光度)×試料の容
量（ｍｌ）
(mg)は下記の方法によって算出した値である。活性量 可溶性澱粉を５０mＭ燐酸ナトリウム緩衝液(pＨ７．０)
に０．５w／v％の濃度で溶解した溶液０．４５mlに酵素
液０．０５mlを加え、４０℃で１０分間反応をおこなっ
た後、０．５Ｎ塩酸１．０mlを添加することによって反
応を停止させ、次いで、ヨウ素５mgとヨウ化カリウム５
０mgを水１００mlに溶解させた溶液２．５mlを加え、室
温で２０分間放置後、６６０nmにおける吸光度を測定
し、該吸光度を１分間に１％低下させる酵素量を１単位
とした(ブランクテストは、酵素の替りに上記緩衝液を
用いる以外は上記と同様の操作によっておこなった)。タンパク量 次式によって算出した: タンパク量(mg)＝(２８０nmにおける吸光度)×試料の容
量（ｍｌ）
【００１６】酵素の分子量 上で得た酵素の分子量を、ゲル濾過法で測定した。酵素
液を、ｐＨ７．０の２０ｍＭの燐酸カリウム緩衝液
（０．２Ｍの食塩を含む)で平衡化したセファデックス
Ｇ−７５のカラム(１．６６ｃｍ2×５０ｃｍ)に加え、
該緩衝液で溶出した。分子量マーカーとして牛血清アル
ブミン(分子量６７０００)、卵白アルブミン(分子量、
４３０００)、キモトリプシノーゲン(分子量、２５００
０)、リボヌクレアーゼＡ(分子量、１３７００)を用い
た。その結果、酵素の分子量は２９５００であった。
液を、ｐＨ７．０の２０ｍＭの燐酸カリウム緩衝液
（０．２Ｍの食塩を含む)で平衡化したセファデックス
Ｇ−７５のカラム(１．６６ｃｍ2×５０ｃｍ)に加え、
該緩衝液で溶出した。分子量マーカーとして牛血清アル
ブミン(分子量６７０００)、卵白アルブミン(分子量、
４３０００)、キモトリプシノーゲン(分子量、２５００
０)、リボヌクレアーゼＡ(分子量、１３７００)を用い
た。その結果、酵素の分子量は２９５００であった。
【００１７】酵素の等電点 上で得た酵素の等電点を、ショ糖密度勾配等電点電気泳
動法(蛋白質・酵素の基礎実験法、堀尾武一、山下仁平
編(南江堂発行)、第２５０頁〜第２６９頁(１９８１年)
参照)によって測定した。実施例１で調製した酵素液
を、ｐＨ３．５〜１０．０のキャリア−アンフォライト
(ＬＫＢ社製)および１１０ｍｌ容泳動カラム(ＬＫＢ社
製)を用い、４００〜６００Ｖで４０時間泳動した。そ
の結果、酵素の等電点は、５．１であった。
動法(蛋白質・酵素の基礎実験法、堀尾武一、山下仁平
編(南江堂発行)、第２５０頁〜第２６９頁(１９８１年)
参照)によって測定した。実施例１で調製した酵素液
を、ｐＨ３．５〜１０．０のキャリア−アンフォライト
(ＬＫＢ社製)および１１０ｍｌ容泳動カラム(ＬＫＢ社
製)を用い、４００〜６００Ｖで４０時間泳動した。そ
の結果、酵素の等電点は、５．１であった。
【００１８】ｐＨと酵素活性 上で得た酵素の活性におよぼすｐＨの影響(作用最適ｐ
Ｈ)、該活性におよぼす温度の影響、該活性におよぼす
ｐＨの影響(ｐＨ安定範囲)および該酵素の熟安定性を常
法によって調べ、結果をそれぞれ図１、図２、図３およ
び図４に示す。酵素の活性試験は下記実施例２に準拠し
ておこなった。図１および図３において、符号１、２お
よび３はそれぞれ緩衝液として酢酸塩緩衝液を用いた場
合、燐酸ナトリウム緩衝液を用いた場合および硼酸緩衝
液を用いた場合を示す。なお、図３においては、緩衝液
として０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ８．０)を使
用し、熱処理は４０℃で３０分間おこなった。また、図
４においては、緩衝液として０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩
衝液を使用し、熱処理は各温度において３０分間おこな
った。
Ｈ)、該活性におよぼす温度の影響、該活性におよぼす
ｐＨの影響(ｐＨ安定範囲)および該酵素の熟安定性を常
法によって調べ、結果をそれぞれ図１、図２、図３およ
び図４に示す。酵素の活性試験は下記実施例２に準拠し
ておこなった。図１および図３において、符号１、２お
よび３はそれぞれ緩衝液として酢酸塩緩衝液を用いた場
合、燐酸ナトリウム緩衝液を用いた場合および硼酸緩衝
液を用いた場合を示す。なお、図３においては、緩衝液
として０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ８．０)を使
用し、熱処理は４０℃で３０分間おこなった。また、図
４においては、緩衝液として０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩
衝液を使用し、熱処理は各温度において３０分間おこな
った。
【００１９】実施例２ ハイドロキノンの酢酸エチル溶液(０．５Ｍ)０．５mlお
よび可溶性澱粉５w／v％、燐酸ナトリウム緩衝液(pＨ
７．０)５０mＭおよび実施例１で製造した酵素１０単位
／mlを含有する水溶液０．５mlを蓋付試験管(５ml)内へ
入れ、該試験管を回転数２８０rpmの条件下において、
４０℃で１８時間振盪させた。静置後、水性層を下記の
条件下での薄層クロマトグラフィー分析に付し、酵素の
ポリフェノール配糖体合成活性を確認した。 薄層: メルク社製シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレ
ート 展開溶媒: 酢酸エチル／酢酸／水＝３／２／２(体積
比) 検出: ３３v／v％硫酸／メタノール混合液を薄層に噴
霧後、該薄層を１２０℃で１０分間加熱する。 Ｒf値: ０．６１〜０．８６(澱粉の分解物のＲf値は
０．５８以下である)
よび可溶性澱粉５w／v％、燐酸ナトリウム緩衝液(pＨ
７．０)５０mＭおよび実施例１で製造した酵素１０単位
／mlを含有する水溶液０．５mlを蓋付試験管(５ml)内へ
入れ、該試験管を回転数２８０rpmの条件下において、
４０℃で１８時間振盪させた。静置後、水性層を下記の
条件下での薄層クロマトグラフィー分析に付し、酵素の
ポリフェノール配糖体合成活性を確認した。 薄層: メルク社製シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレ
ート 展開溶媒: 酢酸エチル／酢酸／水＝３／２／２(体積
比) 検出: ３３v／v％硫酸／メタノール混合液を薄層に噴
霧後、該薄層を１２０℃で１０分間加熱する。 Ｒf値: ０．６１〜０．８６(澱粉の分解物のＲf値は
０．５８以下である)
【００２０】実施例３および４ 澱粉の代わりに、アミロペクチンまたはマルトオリゴ糖
を使用する以外は、実施例２の手順に準拠して、本発明
による酵素のポリフェノール配糖体合成活性を確認し
た。
を使用する以外は、実施例２の手順に準拠して、本発明
による酵素のポリフェノール配糖体合成活性を確認し
た。
【００２１】実施例５〜１３ ハイドロキノンの代わりに、カテキン、カフェー酸、コ
ウジ酸、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュ
ー酸、α−レゾルシル酸、フロログルシノールまたは没
食子酸を使用する以外は、実施例２の手順に準拠して、
本発明による酵素のポリフェノール配糖体合成活性を確
認した。
ウジ酸、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュ
ー酸、α−レゾルシル酸、フロログルシノールまたは没
食子酸を使用する以外は、実施例２の手順に準拠して、
本発明による酵素のポリフェノール配糖体合成活性を確
認した。
【００２２】実施例１４ 実施例１で用いた培地と同じ培地１００ｍｌを用いてバ
シルス・スリンジエンシス(ＩＦＯ３９５１)を３０℃で
１２０ｒｐｍの条件下において３日間液体振盪培養し
た。培養物を分画分子量３０００の前記限外濾過膜(Ｓ
ＥＰ−００１３)を用いて濃縮した(１０ｍｌ；１．０単
位／ｍｌ)。該濃縮液１０ｖ／ｖ％、ハイドロキノン
２．５ｗ／ｖ％、澱粉２ｗ／ｖ％および燐酸緩衝液(ｐ
Ｈ７．０)１０ｍＭから成る混合液１００ｍｌを三角フ
ラスコ(２００ｍｌ)内に入れ、４０℃で９０時間反応を
おこなうことによってハイドロキノン配糖体を合成し
た。反応混合物を下記の条件でのＨＰＬＣ分析に付した
ところ、ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコース(保持時
間：１２．２分)が０．６４ｇ／ｍｌの濃度で得られ
た。 カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲパックドカラム
(内径２０ｍｍ；長さ２５０ｍｍ) 溶離液：メタノール／０.１ｗ／ｖ％トリフルオロ酢酸
水(体積比１８／８２) 流速：５ｍｌ／分 検出：２７９ｎｍの紫外部吸収 温度：４０℃
シルス・スリンジエンシス(ＩＦＯ３９５１)を３０℃で
１２０ｒｐｍの条件下において３日間液体振盪培養し
た。培養物を分画分子量３０００の前記限外濾過膜(Ｓ
ＥＰ−００１３)を用いて濃縮した(１０ｍｌ；１．０単
位／ｍｌ)。該濃縮液１０ｖ／ｖ％、ハイドロキノン
２．５ｗ／ｖ％、澱粉２ｗ／ｖ％および燐酸緩衝液(ｐ
Ｈ７．０)１０ｍＭから成る混合液１００ｍｌを三角フ
ラスコ(２００ｍｌ)内に入れ、４０℃で９０時間反応を
おこなうことによってハイドロキノン配糖体を合成し
た。反応混合物を下記の条件でのＨＰＬＣ分析に付した
ところ、ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコース(保持時
間：１２．２分)が０．６４ｇ／ｍｌの濃度で得られ
た。 カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲパックドカラム
(内径２０ｍｍ；長さ２５０ｍｍ) 溶離液：メタノール／０.１ｗ／ｖ％トリフルオロ酢酸
水(体積比１８／８２) 流速：５ｍｌ／分 検出：２７９ｎｍの紫外部吸収 温度：４０℃
【００２３】実施例１５ 他の細菌からの酵素の調製法 実施例１で用いた培養法でバシルス・スリンジエンシス
ＩＦＯ３９５１、バシルス・リケニホルミスＡＴＣＣ２
５９７２およびバシルス・アミロリケファシエンスＩＦ
Ｏ１４１４１をそれぞれ培養し、同様に培養上清２５０
０−２７００ｍｌを得た。これら培養上清に硫酸アンモ
ニウムを８０％飽和となるように加え、生じた沈殿物を
遠心分離処理(９０００ｒｐｍ、１５分間)で集め、５０
ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ４．０)１００ｍｌに溶解し、該緩
衝液１リットルに対し透析した。該透析内液を該緩衝液
で平衡化したアンバライトＣＧ５０カラム(１５．９ｃ
ｍ2×２７ｃｍ)に注入し、該緩衝液７．５リットルを用
いて、洗浄した。次いで０．５Ｍ燐酸二カリウム水溶液
を用い、流速1．６リットル／ｈｒで溶出をおこない、
溶出量１リットル〜３リットルにかけての溶出液２リッ
トルを実施例１で用いた限外濾過膜を用いて１０ｍｌま
で濃縮した。以上の操作でいずれの細菌からの酵素にお
いても活性回収率は６０〜８０％、比活性は８〜１５倍
上昇した。これらの酵素液を用い後で述べるサイクロデ
キストリン合成能、マルトース分解能および配糖体合成
効率を調べた。尚、これら酵素液の活性量、タンパク量
は実施例１に述べた方法によって算出した。又、これら
酵素の作用最適ｐＨはいずれも６〜８にあり、ｐＨ安定
範囲はいずれも６〜８に含まれていた。
ＩＦＯ３９５１、バシルス・リケニホルミスＡＴＣＣ２
５９７２およびバシルス・アミロリケファシエンスＩＦ
Ｏ１４１４１をそれぞれ培養し、同様に培養上清２５０
０−２７００ｍｌを得た。これら培養上清に硫酸アンモ
ニウムを８０％飽和となるように加え、生じた沈殿物を
遠心分離処理(９０００ｒｐｍ、１５分間)で集め、５０
ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ４．０)１００ｍｌに溶解し、該緩
衝液１リットルに対し透析した。該透析内液を該緩衝液
で平衡化したアンバライトＣＧ５０カラム(１５．９ｃ
ｍ2×２７ｃｍ)に注入し、該緩衝液７．５リットルを用
いて、洗浄した。次いで０．５Ｍ燐酸二カリウム水溶液
を用い、流速1．６リットル／ｈｒで溶出をおこない、
溶出量１リットル〜３リットルにかけての溶出液２リッ
トルを実施例１で用いた限外濾過膜を用いて１０ｍｌま
で濃縮した。以上の操作でいずれの細菌からの酵素にお
いても活性回収率は６０〜８０％、比活性は８〜１５倍
上昇した。これらの酵素液を用い後で述べるサイクロデ
キストリン合成能、マルトース分解能および配糖体合成
効率を調べた。尚、これら酵素液の活性量、タンパク量
は実施例１に述べた方法によって算出した。又、これら
酵素の作用最適ｐＨはいずれも６〜８にあり、ｐＨ安定
範囲はいずれも６〜８に含まれていた。
【００２４】実施例１６ 実施例１および実施例１５で調製した酵素液２０μｌ
(６０単位／ｍｌ)と可溶性でんぷん３ｗ／ｖ％の液(５
０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０の溶液)１８０
μｌと４０℃で１０分間反応させ、その反応液にトリク
ロルエチレン１００μｌを加えた後、よく撹拌し３０分
間放置し、サイクロデキストリン−トリクロルエチレン
複合体による白濁の程度を肉眼により判定した。その結
果、白濁は生じなかった。
(６０単位／ｍｌ)と可溶性でんぷん３ｗ／ｖ％の液(５
０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０の溶液)１８０
μｌと４０℃で１０分間反応させ、その反応液にトリク
ロルエチレン１００μｌを加えた後、よく撹拌し３０分
間放置し、サイクロデキストリン−トリクロルエチレン
複合体による白濁の程度を肉眼により判定した。その結
果、白濁は生じなかった。
【００２５】実施例１７ 実施例１および実施例１５で調製した酵素液(５単位／
ｍｌ)０．０５ｍｌを０．５ｗ／ｖ％マルトース溶液(溶
媒：５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液(ｐＨ７．０))に加
え、４０℃で１８時間反応させた後、その反応液１μｌ
を下記条件下の薄層クロマトグラフィー分析に付し、酵
素のマルトース分解能の有無を調べた。 薄層：メルク社製シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレー
ト 展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水＝３／２／２(体積比) 検出：３３ｖ／ｖ％硫酸／メタノール混合液を薄層に噴
霧後、該薄層を１２０℃で１０分間加熱する。その結
果、マルトース(Ｒｆ値＝０．４６)は検出されたが、グ
ルコース(Ｒｆ値：０．５６)は検出されなかった。
ｍｌ)０．０５ｍｌを０．５ｗ／ｖ％マルトース溶液(溶
媒：５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液(ｐＨ７．０))に加
え、４０℃で１８時間反応させた後、その反応液１μｌ
を下記条件下の薄層クロマトグラフィー分析に付し、酵
素のマルトース分解能の有無を調べた。 薄層：メルク社製シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレー
ト 展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水＝３／２／２(体積比) 検出：３３ｖ／ｖ％硫酸／メタノール混合液を薄層に噴
霧後、該薄層を１２０℃で１０分間加熱する。その結
果、マルトース(Ｒｆ値＝０．４６)は検出されたが、グ
ルコース(Ｒｆ値：０．５６)は検出されなかった。
【００２６】実施例１８ ハイドロキノン５ｗ／ｖ％、可溶性澱粉１０ｗ／ｖ％の
濃度で５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に溶解
した２００μｌに、実施例１および実施例１５で調製し
た酵素液および市販のＣＧＴアーゼ(天野製薬株式会社
の市販品「コンチザイム」)(４〜５単位／ｍｌ)をそれぞ
れ１００μｌ加え、４０℃で１８時間反応させた。その
反応液２５μｌを下記条件下の薄層クロマトグラフィー
に付した後、Ｒｆ値０．６〜０．９相当の薄層部分(シ
リカゲル)を削り取り配糖体をメタノール５ｍｌで２回
(計１０ｍｌ)抽出した。この抽出液を減圧濃縮乾固後、
水１ｍｌを用いて配糖体を溶解させ、配糖体水溶液中の
グリコースをフェノール・硫酸法によって、定量し、配
糖体合成効率(酵素１単位当たりの転移したグルコース
量)を比較した。その結果を表２に示す。
濃度で５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に溶解
した２００μｌに、実施例１および実施例１５で調製し
た酵素液および市販のＣＧＴアーゼ(天野製薬株式会社
の市販品「コンチザイム」)(４〜５単位／ｍｌ)をそれぞ
れ１００μｌ加え、４０℃で１８時間反応させた。その
反応液２５μｌを下記条件下の薄層クロマトグラフィー
に付した後、Ｒｆ値０．６〜０．９相当の薄層部分(シ
リカゲル)を削り取り配糖体をメタノール５ｍｌで２回
(計１０ｍｌ)抽出した。この抽出液を減圧濃縮乾固後、
水１ｍｌを用いて配糖体を溶解させ、配糖体水溶液中の
グリコースをフェノール・硫酸法によって、定量し、配
糖体合成効率(酵素１単位当たりの転移したグルコース
量)を比較した。その結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】 薄層：メルク社製シリカゲル６０Ｆガラスプレート 展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水＝３／２／２(体積比)
【００２８】実施例１９「 アグリカルチャル・バイオロジカル・ケミストリー」、
第４１巻、第２２２１頁〜第２２２８頁(１９７７ねん)
に記載された方法に従って調製したアミロスタチンを、
５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)を用いて、
濃度が１．０μｇ／ｍｌまたは３．５μｇ／ｍｌになる
ように溶解したアミロスタチン溶液０．０２５ｍｌを、
実施例１で調製した酵素液(該緩衝液で希釈した試料；
５単位／ｍｌ)０．０２５ｍｌと混合し、該混合液を４
０℃で１０分間インキュベートした後、該緩衝液を溶媒
とする０．５ｗ／ｖ％可溶性澱粉溶液０．４５ｍｌを加
え、４０℃で１０分間反応させた。０．５Ｎ塩酸１．０
ｍｌを添加することにより反応を停止させ、次いで、ヨ
ウ素５ｍｇとヨウ化カリウム５０ｍｇを水１００ｍｌに
溶解させた溶液２．５ｍｌを加え、室温で２０分間放置
後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクテ
ストは、酵素液の替りに該緩衝液を、又コントロールテ
ストは、アミロスタチンの替りに、該緩衝液を用いる以
外は上記と同様の操作によっておこなった。阻害率(％)
は下記の式に従い算出した。 阻害率(％)＝{(Ａｂ−Ａｏ)−(Ａｂ−Ａｉ)}／(Ａｂ−
Ａｏ)×１００ 式中、Ａｉ、ＡｂおよびＡｏはそれぞれ阻害テスト後測
定値、ブランクテストの測定値およびコントロールテス
トの測定値を示す。濃度が１．０μ／ｍｌおよび３．５
μｇ／ｍｌのアミロスタチン溶液による阻害率はそれぞ
れ５０％および９８％であった。
第４１巻、第２２２１頁〜第２２２８頁(１９７７ねん)
に記載された方法に従って調製したアミロスタチンを、
５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)を用いて、
濃度が１．０μｇ／ｍｌまたは３．５μｇ／ｍｌになる
ように溶解したアミロスタチン溶液０．０２５ｍｌを、
実施例１で調製した酵素液(該緩衝液で希釈した試料；
５単位／ｍｌ)０．０２５ｍｌと混合し、該混合液を４
０℃で１０分間インキュベートした後、該緩衝液を溶媒
とする０．５ｗ／ｖ％可溶性澱粉溶液０．４５ｍｌを加
え、４０℃で１０分間反応させた。０．５Ｎ塩酸１．０
ｍｌを添加することにより反応を停止させ、次いで、ヨ
ウ素５ｍｇとヨウ化カリウム５０ｍｇを水１００ｍｌに
溶解させた溶液２．５ｍｌを加え、室温で２０分間放置
後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクテ
ストは、酵素液の替りに該緩衝液を、又コントロールテ
ストは、アミロスタチンの替りに、該緩衝液を用いる以
外は上記と同様の操作によっておこなった。阻害率(％)
は下記の式に従い算出した。 阻害率(％)＝{(Ａｂ−Ａｏ)−(Ａｂ−Ａｉ)}／(Ａｂ−
Ａｏ)×１００ 式中、Ａｉ、ＡｂおよびＡｏはそれぞれ阻害テスト後測
定値、ブランクテストの測定値およびコントロールテス
トの測定値を示す。濃度が１．０μ／ｍｌおよび３．５
μｇ／ｍｌのアミロスタチン溶液による阻害率はそれぞ
れ５０％および９８％であった。
【００２９】
【発明の効果】本発明による酵素を利用することによ
り、広範囲の糖基質とポリフェノール受容体を原料とし
て種々のポリフェノール配糖体を効率よく合成すること
ができる。
り、広範囲の糖基質とポリフェノール受容体を原料とし
て種々のポリフェノール配糖体を効率よく合成すること
ができる。
【図１】 本発明による酵素の活性におよぼすｐＨの影
響（作用最適ｐＨ）を示すグラフである。
響（作用最適ｐＨ）を示すグラフである。
【図２】 本発明による酵素の活性におよぼす温度の影
響を示すグラフである。
響を示すグラフである。
【図３】 本発明による酵素の活性におよぼすｐＨの影
響（ｐＨ安定範囲）を示すグラフである。４０℃、３０
分間それぞれのｐＨ下においてた。
響（ｐＨ安定範囲）を示すグラフである。４０℃、３０
分間それぞれのｐＨ下においてた。
【図４】 本発明による酵素の熱安定性を示すグラフで
ある。ｐＨ８で３０分間それそれの温度下においた。
ある。ｐＨ８で３０分間それそれの温度下においた。
１ 酢酸塩緩衝液を用いた場合 ２ 燐酸ナトリウム緩衝液を用いた場合 ３ 硼酸緩衝液を用いた場合
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 西野 豊和 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷 紡績株式会社技術研究所内 (72)発明者 村尾 澤夫 大阪府堺市堀上緑町２−８−12
Claims (10)
- 【請求項１】 (i)サイクロデキストリン合成能および
マルトース分解能を有さず、(ii)糖基質を加水分解して
生成するグルコースをポリフェノール受容体に転移させ
てポリフェノール配糖体を合成する特性を有し、至適ｐ
Ｈが６〜８であり、安定ｐＨが６〜９であり、至適温度
が４０〜５０℃であり、安定温度が０〜５０℃であり、
分子量が２９５００であり、等電点が５.１である酵
素。 - 【請求項２】 糖基質が澱粉、アミロペクチンまたはマ
ルトオリゴ糖(Ｇ3〜Ｇ7)である請求項１記載の酵素。 - 【請求項３】 ポリフェノール受容体がカテキン、カフ
ェ−酸、コウジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾ
ルシノール、プロトカテキュー酸、α−レゾルシル酸、
フロログルシノールまたは没食子酸である請求項１記載
の酵素。 - 【請求項４】 バシルス属の細菌が生産する請求項１〜
３いずれかに記載の酵素。 - 【請求項５】 バシルス属の細菌が、バシルス・ズブチ
リス、バシルス・スリンジエンシス、バシルス・リケニ
ホルミスおよびバシルス・アミロリケファシエンスから
成る群から選択される細菌である請求項４記載の酵素。 - 【請求項６】 バシルス属の細菌を培養して得られる培
養物を精製処理に付すことを特徴とする、請求項１〜５
いずれかに記載の酵素の製造方法。 - 【請求項７】 バシルス属の細菌が、バシルス・ズブチ
リス、バシルス・スリンジエンシス、バシルス・リケニ
ホルミスおよびバシルス・アミロリケファシエンスから
成る群から選択される細菌である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 糖基質およびポリフェノール受容体を、
請求項１〜５いずれかに記載の酵素の存在下で反応させ
ることを特徴とするポリフェノール配糖体の製造方法。 - 【請求項９】 糖基質が澱粉、アミロペクチンまたはマ
ルトオリゴ糖(Ｇ3〜Ｇ7)である請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 ポリフェノール受容体がカテキン、カ
フェー酸、コウジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レ
ゾルシノール、プロトカテキュー酸、α−レゾルシル
酸、フロログルシノールまたは没食子酸である請求項８
記載の方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP4027926A JP2664586B2 (ja) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | ポリフェノール配糖体合成能を有する酵素 |
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|---|---|---|---|
| JP4027926A JP2664586B2 (ja) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | ポリフェノール配糖体合成能を有する酵素 |
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|---|---|
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| WO2004000045A2 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Canacure Corporation | Liquid compositions comprising non-digestible oligosaccharides and green tea catechins, method and uses thereof |
-
1992
- 1992-02-14 JP JP4027926A patent/JP2664586B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
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| JPH05219947A (ja) | 1993-08-31 |
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