JPH03277277A - 新規キトサナーゼ、その生産菌および低分子キトサンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キトサンを加水分解する新規キトサナーゼ、
その生産菌及びそれを用いて低分子キトサンを製造する
方法に関するものである。

（従来技術） キチンは、エビやカニなどの甲殻類の殻から得られる含
窒素多糖であって、β（１→４）結合したポリ−Ｎ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンである。

キトサンは、キチンの脱アセチル化物であり、凝集剤と
して利用されている。近年キトサンの低分子化物が難水
溶性薬剤の溶解性促進に用いられるようになって、重合
度５〜１０のオリゴ糖の形の低分子キトサンの需要が高
まってきた。キトサンを分解する酵素すなわちキトサナ
ーゼとして微生物が生産するものは既にいくつかが報告
されている。

たとえば、バチルス６ｐ、Ｑ９９−５（特開昭６Ｏ−１
８０５８５）　、バチルスｓｐ、Ｎα７−Ｍ（特開昭Ｇ
１−２８０２７７）バチルスＢ　Ｎ　−２６２株（特開
昭６３−６３３８２　）　、バチルスサーキュランスＬ
ＣＣ−１株（特開昭６３−９４９７１　）などが生産す
るものが知られている。

（発明が解決しようとする問題点） 公知のキトサナーゼはｐＨの安定性が５〜１１程度であ
る。

一方、これらキトサナーゼは、完全に溶解したキトサン
に作用させた場合に最も効率良くキトサンを分解する。

キトサンを完全溶解するためには少なくともキトサンと
等モルの酸を用いて、キトサン酸塩溶液とする必要があ
るが、この溶液のｐＨは、酢酸等の弱酸を用いた場合で
も、ｐＨ＝４程度となり、キトサナーゼを効率よく作用
させるためには、アルカリを添加してｐＨを調整しなけ
ればならなかった。そこで、低ｐＨでも安定なキトサナ
ーゼの出現が望まれ、また、それを生産する菌の取得が
要求されていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、キトサナーゼ活性を有する微生物を広く
自然界より探索した結果、神奈川県厚木市の土壌より分
離したバチルスｓｐ。

ＫＷＩ−３菌株がキトサナーゼを生産することを見い出
した。このキトサナーゼを、精製して理化学的性質を調
べたところ、新規キトサナーゼであることがわかった。

この新規キトサナーゼは、キトサンに作用して、単糖を
生成させることなくキトサンオリゴ糖を生成させること
ができる。

次に活性測定法および本発明の新規キトサナーゼの理化
学的性質について詳細に説明する。

■ 活性測定法 標準基質として、カニの甲羅から得たキチンを脱アセチ
ル化して得られたキトサンを可溶化して用いた。

１ｇの粉末キトサンを５０Ｊの０．１Ｍ酢酸水溶液に溶
解し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液でｐ）（５，６に
調整した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，８）を加え
て全容を１００−とじ、１％キトサン溶液を調整した。

３７°Ｃで５分間ブレインキュベートした１％キトサン
溶液１−を、同様にブレインキュベートした酵素液ＩＭ
ｉに加え、３７°Ｃにおいて酵素反応を行わせた。その
後、反応液を３分間煮沸して酵素反応を停止させ、反応
液中に生成した還元糖をＲｏｎｄｌｅ−Ｍｏｒｇａｎ法
によって定量した。

１分間に１マイクロモルのグルコサミンに相当する還元
糖を遊離させる酵素量を、１単位（ユニット、Ｕ）とす
る。

なお、本酵素の活性測定は、特に記載しないかぎり上記
の条件下に行った。

■作　用 キトサンのβ−１，４結合を加水分解し、キトサンオリ
ゴ糖を生成するが、単糖は生成しない。

■　基質特異性 第１表に示す基質を用い、６０分間、酵素反応を行い、
遊離した還元糖を測定した。

結果も第１表に示した。

この表から、キトサン、グリコールキトサンを分解する
が、Ｎ−）リメチルグリコールキトサンおよびカルボキ
シメチルセルロースサンは脱アセチル化率が低くなるほ
ど分解にくくなり、キチンは分解しないことがわかる。

なお、キチン分解活性およびセルロース分解活性は次の
方法により測定した。

■）キチン分解活性測定法 ｐＨ５．０に調整した０．５％エチレングリコールキチ
ン溶液１ｗｉに酵素液１ｔ７を加え、３７°ｃｇｏ分間
攪拌後、１００℃の水浴中に４分間保持し、Ｒｅｉｓｓ
１ｇ法（ホウ酸塩溶液とパラージメチルアミノーベンズ
アルテヒドを用いて遊離したＮ−アセチルグルコサミン
を比色分析する方法）で測定する。

２）セルロース分解活性測定法 ｐ）（５．０に調整した０。５％カルボキシメチルセル
ロースナトリウム塩溶液に 酵素液ｉｔｃを加え、４０℃３０分間撹拌後、１００“
Ｃの水浴中に４分間保持し、ＤＮＳ法（３．５−ジニト
ロサリチル酸を用いた試薬によって遊離した還元糖を吸
光分析する方法）で測定する。

■　至適ｐＨ ｐＨの活性に対する影響を第１図に示した。第１図は、
活性の最大値を■００とし、各ｐＨにおける相対活性（
％）を示す。至適ｐＨは５．６であることがわかる。

■　安定ｐＨ範囲 ５０℃で２０分間、各１）Ｈに保持したのち、残存活性
を測定し、最大の酵素活性を１００して相対活性（％）
を求め、これを第２図に示した。この図から、安定ｐＨ
範囲を相対活性で５０％以上の領域とすると、それは２
〜１０であることがわかる。

なお、用いたｐＨＪｉ衝液は、ブリトンロビンソン緩衝
液である。

■　作用適温の範囲 前記の活性測定法にしたがって、各温度で酵素反応を行
い活性を調べ、活性の最大値を１００として第３図に示
した。第３図から、作用適温の範囲は、４０〜７０℃で
あり、最適温度は６０℃であることがわかる。

■　ｐＨ，温度などによる失活の条件 ｐＨによる失活： ５０℃で２０分間保持すると、ｐＨ１３以上で失活する
。（第２図参照。） 温度による失活： 各温度に１５分、または１時間、ｐＨ ５，８に保持したのち、残存活性を測定した。未処理の
酵素活性を１００として、相対活性（％）で第４図に示
した。

第４図から、５０℃までは活性はほと んど低下しないが、５０℃を越えると活性低下が著しく
、７０℃以上では失活することがわかる。

■阻害 第２表に示す２価金属イオンの存在下に３０℃、１０分
間、保持後、残存活性を測定し、未処理の酵素活性を１
００として、示した。

Ｃｕ”、Ｈｇ２＋の阻害は著しいことがわかる。またＥ
ＤＴＡ等の有機溶媒の影響も調べたが、阻害はなかった
。

第 表 ■ 分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により、 分子量４１゜ ０θＯ の値を得た。

なお、 分子量マーカーとして、 フォスフォリラーゼｂ（分子ｊ１９７，４００）、牛血
清アルブミン　　（同　ＧＧ、２００）、オボアルブミ
ン　　　（同　４２，７００）、カルポニフグアンヒド
ラーゼ　　　　　　　（同　　３１，０００）　　、ト
リプシンインヒビター　　　　　　　　　　（同　　２
１．５００）を用いた。

■　精製方法 培養後、遠心分離して菌体を除去した上澄液を分離膜で
濃縮し、液体クロマトグラフィーにより、精製すること
ができる。本酵素の製造法については後述する実施例で
具体的に説明する。

本発明のキトサナーゼの生産に使用する微生物は、前述
の理化学的性質を有するキトサナーゼ生産能を有するも
のであれば、いかなるものでもよいが、バチルスｓｐ。

ＫＷｒ−３ａ体を使用するとよい。

バチルスｓｐ、ＫＷＩ−３菌体の菌学的性質を以下に示
す。

この菌学的性質の検討には、 ｒＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｌｃ　Ｂａｃｔｅ−ｒｌｏｌｏｇ）’Ｊ　（Ｒ，
Ｇ、Ｅ、Ｍｙｒｒａｙら著、Ｗｌｌｌｌａｍｓ　＆ＷＩ
ｌｋｉｎｓ社発行、１９８４）および「改訂版微生物の
分類と同定）（長谷用武治、編著、学会出版センタータ
発行、１９８５）を参照した。

ム一」Ｌ−一監 ■　細胞の形及び大きさ：１〜１．２μｍ×２〜３．８
μｍの桿菌。

■　細胞の多形性二単独または連鎖 ■　運動性：有。軟毛は周毛。

■胞子：　１〜１．１μｍ　Ｘ　１．２〜２μｍのだ円
形 ■　ダラム染色：陽性 ■　抗酸性：なし ｉ−」ｊｌた１ ■　肉汁寒天平板 円形、とつ円状、光沢なし、白色。

■　肉汁寒天斜面 糸状、生育普通、表面にシワ、色素形 成せず、白色。

■　肉汁液体培養 生育普通、混濁、色素形成せず。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 生育は普通、液化。

■　リドマスミルク アルカリ性、液化。

旦−滋」賢ｊ慣弘霞 ■　硝酸塩の還元：陽性 ■脱窒反応：陰性 ■　ＭＲテス　ト：陰性 ■　ＶＰテス　ト：弱い陽性 ■　インドール生成：生成せず ■　硫化水素の生成：陰性 ■　デンプンの加水分解：陽性 ■　クエン酸の利用 コーザー培地：陰性 クリステンセン培地：陽性 シモンズ培地：陰性 ■　無機窒素源の利用 ＮａＮＣ）＋：弱い陽性 （ＮＨ４）２　Ｓｏ、：弱い陽性 グルタミン酸ナトリウム：陽性 ［相］　色素生成 キングＡおよびキングＢ培地（栄研） において色素の生成は見られない。

■　ウレアーゼ二弱い陽性 ［相］　オキシダーゼ：陽性 ［相］　カタラーゼ：陽性 ■　生育の範囲 １）Ｈ：５〜ＩＩで生育し、７前後が最適である。ｐＨ
４以下、１２以上で は生育しない。

温度＝１５〜４２℃。３０〜３７℃が最適である。

４５℃以上、１０℃以下では生育し ない。

［相］　酸素に対する態度：好気性 ［相］　ＯＦテスト：好気的、嫌気的に酸を生成（Ｆ） ■　糖類から酸およびガスの生成 り−グルコース、麦芽糖、シタ糖、ト レハロース、グリセリンおよびデンプンから酸を生成す
る。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−ガラクトース、乳糖、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マ
ンニット、Ｄ−イノジットからは酸は生成しない。また
上記糖類からガスの発生は認められない。

益−ま」」「Ｊ１霞 ■　糖類の分解生成物 乳糖から３ケト乳糖を生成しない。

■　グルコン酸化：陰性 ■　ジオキシアセトンの生成：陰性 ■　アルギニンの分解：陰性 ■　リジン脱炭酸：陰性 ■　フェニルアラニン脱アミノ反応：陰性■　塩化ナト
リウム耐性ニ ア％まで増殖。１０％までは生育しない。

■　キトサナーゼ：陽性 ■　７ｖｅｅｎの分解 Ｔｙｅｅｎ　４０．６０および８０を分解。

■　チロシン分解：陽性 ■　カゼイン分解：陽性 以上の菌学的性質からＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｊｌａｃｔｅｒｌｏｌｏ
ｇｙを参考にし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＣｅｒｅｕＳの近
縁種（オキシダーゼテストおよびＭＲテストが異なる）
と同定し、新菌株と判断しＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｋ
Ｗ１３と命名した。本菌株は、平成元年２月２１日に工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、微生物受託
番号は、微工研菌寄第１０５５２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
１０５５２）である。

（作　用） 本発明のキトサナーゼは、キトサンのβ−１．４結合を
加水分解し、単糖を生成することなく、キトサンオリゴ
糖を生成する。

（実施例） 実施例１（培養） 培地にバチルスｓｐ、ＫＷＩ−３を接種し、４ノジヤー
フアンメンタで３０℃、回転数３００ｒｐｍ、０２ガス
通気量０．２ｖｖｍにて通気攪拌培養した。

この培養液を遠心分離して菌体を除去し、粗酵素液を得
た。キトサナーゼ活性は比活性で０．３１μ／−ｇ−蛋
白であった。

なお、培地は、５％ペプトン、１％イーストエキス、０
．１％ＭｇＳＯ４、ｏ、ｔ　％に８２ＰＯ４，０，５％
オイルの組成としｐＨは６，０に調整した。

また、菌体増殖中に、ｐＨ３の３％キトサン溶液を対培
地０．８％滴下し、培地のｐＨは６．０に制御した。

実施例２（精製） 実施例１の粗酵素液を分画分子量１０万のＵＦ膜を用い
てろ過は、そのろ液を分画分子量１万のＵＦを用いて約
１０倍に濃縮したところ、比活性は１．Ｉ５ｕ／ｍｇ−
蛋白であった。

この濃縮液をイオン交換クロマトグラフィー（東ソーＴ
ＳＫゲルＤＥＡＴＥ−５ＰＷ）で精製した。すなわち、
０．０５Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を通液し
ながら、蛋白を樹脂に吸着した後、同緩衝液に塩化ナト
リウムを加えたものを溶離液として、塩化ナトリウムを
０．５Ｍまで増加させて酵素を溶離した。

この操作により、比活性はＥｉ、４Ｇｕ／ｗ−蛋白とな
った。

次に、この溶離液をゲルろ過（東ソーＴＳＫゲル３００
０ＳＷ）Ｌ、比活性＋５．５ｕ／ｍｇ−蛋白のキトサナ
ーゼ画分を得た。こうして得られた酵素は５ＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動において単一バンドを示した。

実施例３ 原料キトサン（０，２Ｍ酢酸／　０．１Ｍ酢酸ナトリウ
ムの緩衝液を用いて測定した極限粘度〔η）　＝３．２
　、カチオン度の度合を表わすコロイド当量値Ｃ，Ｅ、
　＝６．２＋ｗｅｑ／ｇ　）　３０ｇを水５００−に懸
濁し、酢酸！０．ＧＪを加え、攪拌して溶解し、Ｉ）８
４．０のキトサン濃度３％のキトサン溶液とした。

このキトサン溶液に実施例２の精製酵素を１２４　ｕ添
加し、３０℃で撹拌しながら、７３時間反応させた。こ
の間、１時間、２時間、３．５時間、５時間、７時間、
２１時間、および７３時間経過時にそれぞれサンプリン
グし、これを５分間煮沸して酵素反応を停止した。これ
らのサンプルについて、ＧＰＣ分析およびＨＰＬＣ分析
を行った。

ＧＰＣ分析は、東ソー轢製のカラムＴＳＫＧｅｌ　　３
０００Ｐ　ＷＸ　　Ｌ　　（７，８ｍｍ　φ　Ｘ　　　
３００ｍｍ）　　を用い、これに０．２Ｍ酢酸／　０．
１Ｍ酢酸ナトリウムの緩衝液を溶離液として流速０゜８
ｗＬ！／分で通液し、サンプルはそれぞれ５０μ！注入
してエルマ社製Ｅ　ＲＣ−７５２０で流出液の屈折率を
検出して行った。

そのクロマトグラムを第５図に示す。第５図（ａ）は酵
素反応前のキトサン溶液のクロマトグラムである。ピー
クは流出時間の短い左の方にある。（ｂ）　、（Ｃ）お
よび（ｄ）はそれぞれ酵素反応開始後１時間、２時間お
よび５時間経過したときのクロマトグラムである。酵素
反応がすすむとキトサンは低分子化され、ピークは流出
時間の長い右の方に移ると共に、ピークは特定の流出時
間のところに一本化された。このピークは標準ポリエチ
レングリコール換算で分子量７５０に相当する。この図
は、本酵素がキトサンを分解し、オリゴ糖を多量に生成
させることを示している。

次に、第５図の（ｄ）のピークを構成しているキトサン
オリゴ糖の組成を調べるため、上述の経時的にサンプリ
ングしたサンプルをＨＰＬＣ分析した。

サンプルは、まずｐＨ１ｌに調整し、アルカリ不溶分を
孔径０．４５μ朧のフィルターで除去した。カラムは、
東ソー■製のカラムＴＳＫＮＨ２６０（４，７ｍｍφＸ
　２５０＋＊ｍ）を用い、これに６５％アセトントリル
を溶離液として流速０．８　Ｎｉ／分で通液し、サンプ
ルをそれぞれ５０μノ注入してエルマ社製Ｅ　ＲＣ−７
５２０で流出液の屈折率を検出して行った。それぞれの
クロマトグラム（図示せず）から、オリゴ糖の形の低分
子キトサンの各ピーク面積を求め、その値から生成した
オリゴ糖の組成を換算したところ、第３表のとおりであ
った。

第３表 実施例４（低分子キトサンの製法） 実施例３と同様にキトサン溶液（３０ｇ／ｌりを調整し
、これに精製酵素１２４ｕを添加し、３０℃で４時間撹
拌後、５分間煮沸して酵素反応を停止した。

この反応液を孔径０．４５μ諺のフィルターでろ過後、
エバポレーターで２５０ｄ程度に濃縮したのち、凍結乾
燥を行い、ミルで粉砕して淡黄色の粉末低分子キトサン
酢酸塩３９ｇを得た。

（効　果） 本発明によると、バチルス属に属するＢａ−ｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｐ、Ｋｌｆｉ３を培養して生産されたキトサナー
ゼを分離し、これをキトサンに作用させることによって
、低分子キトサンを得ることができる。本発明のキトサ
ナーゼはｐＨ２〜１０で安定であるので、キトサンを酸
で溶解したのち、アルカリでｐＨ調整することなくその
ままキトサナーゼを作用させることができ、生成した低
分子キトサンは過剰な塩類を含有することがない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の酵素の至適ｐＨを表わし、第２図は
、本発明の酵素の安定ｐＨ範囲を表わす。 第３図は、本発明の酵素の作用適温の範囲を表わし、第
４図は、本発明の酵素の熱安定性を表わす。 第５図は、本発明における酵素反応液のＧＰＣ分析のク
ロマトグラムである。 蓋ル（°す ）昆ｆ’ｔ　　　（°と） ・１５力０１暗関 第５１Σ □友忠時間

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する新規キトサナーゼ。 ［１］作用 キトサンのβ−１、４結合を加水分解し、 キトサンオリゴ糖を生成するが単糖は生成 しない。 ［２］基質特異性 キトサン、グリコールキトサンを分解す るが、Ｎ−トリメチルグリコールキトサン およびカルボキシメチルセルロースは分解 しない。 キトサンは脱アセチル化率が低くなるほ ど分解しにくくなり、キチンは分解しない。 ［３］至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 グリコールキトサンを基質とした場合、 至適ｐＨは５．６であり、安定ｐＨ範囲は２〜１０であ
   る。 ［４］作用適温の範囲 キトサンの酸溶液を基質とした場合、 ｐＨ５．６において作用適温の範囲は４０〜７０℃であ
   り、最適温度は６０℃である。 ［５］ｐＨ、温度などによる失活の条件 ｐＨによる失活：５０℃で２０分間保持すると、ｐＨ１
   ３以上で失活 する。 温度による失活：ＰＨ５．６で１５分間保持すると、７
   ０℃以上で失 活する。 ［６］阻害 ２価金属イオンにより活性が低下し、 Ｈｇ＾２＾＋、Ｃｕ＾２＾＋の１０＾−＾２モル／ｌの
   存在下では、著しく阻害される。 ［７］分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に よる分子量は４１，０００である。
2. （２）バチルス属に属し、かつ請求項１記載のキトサナ
   ーゼ生産能を有するバチルスｓｐ．ＫＷＩ−３菌株。
3. （３）請求項１記載のキトサナーゼをキトサンに作用さ
   せ生成したキトサンオリゴ糖を分取することを特徴とす
   る低分子キトサンの製法。