JPH0251595B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、β−Ｄ−１，２−グルカナーゼの製
造法に関する。 （従来の技術） バイオマスの有効利用という観点から、最近、
セルラーゼが重要視されている。セルラーゼのう
ちトリコデルマ属により生産されるセルラーゼ
は、ソフオロース（２−０−β−Ｄ−
Glucopyranosyl−Ｄ−glucose）から誘導される
ことが知られている〔バイオケミカル アンド
バイオフイジカル リサーチ コミユニケーシヨ
ンズ；、Biochem.Biophys.Res.Comm.、１、
338（1959）〕。このソフオロースは、２個のグルコ
ースがβ−１，２結合で連結したタイプの二糖で
あり、例えば、環状あるいは直鎖の（１→２）−
β−Ｄ−グルカンにβ−Ｄ−１，２−グルカナー
ゼを作用させて得られる。β−Ｄ−１，２−グル
カナーゼとしては、アスペルギルス フミガタス
（Aspergills fumigatus）、フザリウム オキシス
ポラム（Fusarium oxysporum）、ペニシリウム
ブレフエルデイアナム（Penicillium
brefeldianum）、ペニシリウム フニキユロサム
（Penicillium funiculosum）などの糸状菌由来の
β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ（カナデイアンジ
ヤーナル オブ マイクロバイオロジー；Can.J.
Microbiol.、７、312（1961））が挙げられる。こ
のほか、サイトフアーガ アルベンシコーラ
（Cytophaga arvensicola）IAM12648株のような
細菌由来のβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼも知ら
れている（特開昭59−154985号公報）。 （発明が解決しようとする問題点） 上記いずれのβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼも
（１→２）−β−Ｄ−グルカンからソフオロースへ
の変換能が低く、ソフオロースが高収率で得られ
ない。 （発明の目的） 本発明の目的は、環状または直鎖状（１→２）
−β−Ｄ−グルカンに作用しソフオロースを高収
率で生成しうるβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼを
生産する新規微生物を得、それを用いたβ−Ｄ−
１，２−グルカナーゼの製造法を提供することに
ある。 （問題点を解決するための手段および作用） 本発明で使用される新菌種アクレモニウム
Sp15は、アクレモニウム属に属し、麦芽エキス
寒天培地、バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地または
ツアペツク寒天培地で培養したとき、アクレモニ
ウム キリエンスとは、分生子が卵形〜楕円形で
ある点において菌学的性質が異なる。この菌は、
β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを高率で生産す
る。 本発明のβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼの製造
法は、アクレモニウム属菌を培養し、培養物から
β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを得る工程を包含
し、そのことにより上記目的が達成される。 上記新菌種アクレモニウムSp15のうち、特に
アクレモニウムSp15 DK2015株（微工研菌寄第
9019号）がβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼ生産能
が高いという理由で好適に利用される。この菌株
は発明者らにより大阪市城東区の土壌から分離・
採取された新菌種であり、その菌学的性質を次に
示す。 菌学的性質 (1) 各培地における生育状態 麦芽エキス寒天培地 生育は良好で25℃、10日間の培養で直径30
〜40mmのコロニーになる。コロニーは円形か
つ平坦で周辺部は微細なのこぎり刃状であ
る。コロニー表面は羊毛状で白色の色状を呈
する。コロニー裏面は淡黄色である。分生子
は卵形〜楕円形であり着生状態は良好であ
る。液滴が見られる。子嚢果その他の有性胞
子器官は生成されない。 バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地 生育は良好で25℃、10日間の培養で直径30
〜40mmのコロニーになる。コロニーは円形、
平坦で、周辺部は微細なのこぎり刃状であ
る。コロニー表面は羊毛状で白色の色状を呈
する。コロニー裏面は淡黄色である。分生子
は卵形〜楕円形であり着生状態は良好であ
る。液滴がみられる。子嚢果その他の有性胞
子器官は生成されない。 ツアペツク寒天培地 生育は良好で25℃、10日間の培養で直径25
〜35mmのコロニーになる。コロニーは円形、
平坦で、周辺部は微細なのこぎり刃状であ
る。コロニー表面は羊毛状で、白色の色状を
呈する。コロニー裏面は黄色〜茶色で数本の
溝を形成する。茶色の拡散性色素を生成す
る。分生子は、卵形〜楕円形であり着生状態
は良好である。液滴が見られる。子嚢果その
他の有性胞子器官は生成されない。 (2) 生理学的性質 好気性菌であり、次の生理学的性質を有す
る。

【表】 (3) 形態学的性質 各種培地上で子嚢果およびその他の有性生殖
器官は確認されず、塊状になつたフイアロ型分
生子の形成が観察される。厚膜胞子の形成も観
察され、その多くは連鎖状である。菌糸は多種
の培地上で形成され、複雑に分枝し１〜3μｍ
の菌糸幅で縦横に伸長する。分生子柄は単純分
枝をなす。分生子は透明かつ卵形〜楕円形でそ
の大きさは、短径が1.0〜1.6μｍ、長径が2.3〜
3.2μｍである。厚膜胞子は透明でその大きさ
は、短径が3.0〜10.0μｍ、長径が3.5〜12.0μｍ
である。 菌株の同定 発明者らは、本発明の菌株（Acremonium
Sp15 DK2015）を、上記菌学的諸性質をもとに
ザ ジエネラ オブ フアンジヤイ スポルレイ
テイング イン ピユアカルチヤー（The
Genera of Fungi Sporulating in Pure
Culture；A.R.Gantner Verlag KG、J.A.von
Arx、1974）およびコンペデイウム オブ ソイ
ル フアンジヤイ（Compendium of Soil
Fungi；Academic Press、1980）により同定し
た。この菌株は、上記のように、子嚢果その他の
有性生殖器官を持たず、分生子柄からは透明な分
生子を生じ、かつ生じた分生子がフイアロ型の性
状であるところから、アインワース（Ainworth）
の分類形式に従い、アクレモニウム属に属する１
菌種と同定された。しかも、コロニーが白色で分
生子が透明であり、かつ厚膜胞子を形成するとい
う点からアクレモニウム キリエンス
（Acremonium kiliense）に近似する。しかし、
アクレモニウム キリエンスは上記３種の培地で
培養したときに形成される分生子がいずれも円筒
形であるのに対して、本菌株は卵形〜楕円形であ
るため、この種には属さないアクレモニウム
（Acremonium）属の新菌種であることが判明し
た。 培養条件 上記菌株の培地は格別である必要はなく、通常
の培地が用いられる。炭素源としては、ブドウ
糖、グリセリン、麦芽糖、デンプン、デキストラ
ン、乳糖、シヨ糖、糖蜜、粉飴などが用いられ
る。コーン、馬鈴薯、甘藷などを用いることもで
きる。窒素源としては酵母エキス、ペプトン、乾
燥酵母、大豆粉、コーンステイープリカー、アン
モニア態窒素、硝酸態窒素などが用いられる。無
機塩類としては、K₂HPO₄、KH₂PO₄、CaCl₂、
MgSO₄、Na₂HPO₄、（NH₄）₂HPO₄などが用い
られる。本菌にβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼを
有利に生産させるには、環状または直鎖状（１→
２）−β−Ｄ−グルカンを0.5〜５重量％、好まし
くは１重量％程度の割合で添加する。上記環状
（１→２）−β−Ｄ−グルカンは、例えば、特開昭
59−71686号公報に記載のリゾビウム フアツセ
オリ（Rhizobium phaseoli）RA−４株や特開昭
59−82092号公報に記載のアグロバクテリウム
ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）
Al−５株をグルコースなどを含有する通常の培
地で培養することにより生産される。直鎖状の
（１→２）−β−Ｄ−グルカンは、例えば
Amemuraら（ジヤーナル オブ ジエネラル
マイクロバイオロジー；Journal of General
Microbiology 131、301（1985））の方法で、ア
セトバクター属の菌を通常の培地で培養すること
により生産される。 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを生産する本菌
の培養PHは、2.0〜10.0、好ましくは4.5〜7.0、培
養温度は15〜30℃、好ましくは20〜30℃である。
好気的に液体培地で撹拌もしくは振盪しながら培
養を行う。固体培地上でも培養を行なえることは
いうまでもない。例えば、25℃で24時間液体培養
を行うと、本菌は充分に増殖し、β−Ｄ−１，２
−グルカナーゼが菌体外へ放出される。 アクレモニウムSp15培養物からのβ−Ｄ−１，
２−グルカナーゼの分離法 上記方法で培養されたアクレモニウム属菌の培
養物からβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼが通常の
方法により分離される。例えば、培養物を遠心分
離にかけて菌体を除き、必要に応じて濃縮して粗
酵素液を得る。 さらに、例えば、上記菌体を除いた粗酵素液に
硫酸アンモニウムを加えて塩析し、得られた固形
分を透析にかけ、次いで、透析内液をセフアデツ
クスカラム、焦点電気泳動などで精製することに
より精製酵素（β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ）
が得られる。 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼの性質 作用および基質特異性：（１→２）−β−Ｄ−
グルカンに作用し、ソフオロースを生成する。 至適PHおよび安定PH範囲：至適PHは4.0〜4.5
である。安定PH範囲は4.5〜6.0であり、40℃に
て１時間保持したとき100％安定に存在する
（同条件でPHを3.0としたときの残存活性は80
％、PHを７〜８としたときの残存活性は70％で
ある）。 温度安定性：40℃以下において15分間安定に
存在する（50℃における残存活性は80％、55℃
では65％、そして60℃では20％である）。 分子量：SDS電気泳動法による分子量は
35000である。 等電点：9.6 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼの力価測定法 20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.6）に環状（１→２）−
β−Ｄ−グルカンを濃度2.5mg／mlになるように
溶解する。この溶液0.8mlに適当な濃度の酵素溶
液0.2mlを加え、40℃で１時間反応させる。次い
で、ソモギ銅液１mlを添加して反応を中止させ、
還元力をソモギ−ネルソン法で定量する。既知濃
度のソフオロースを用いてあらかじめ検量線を作
成し、これと比較してソフオロースの生成量を算
出する。40℃で１時間に1μmoleのソフオロース
を生成する酵素量を１単位とする。 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを用いたソフオロ
ースの製造法 上記方法で得られた精製β−Ｄ−１，２−グル
カナーゼまたはβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼの
粗酵素液を環状または直鎖状（１→２）−β−Ｄ
−グルカンに作用させるとソフオロースが得られ
る。例えば、環状（１→２）−β−Ｄ−グルカン
を酢酸緩衝液に溶解させ、β−Ｄ−１，２−グル
カナーゼを加えて40℃で22時間反応させると、反
応液中にソフオロースが生成する。これを活性炭
カラムなどで精製するとソフオロースが得られ
る。 ソフオロースの用途 ソフオロースは、従来技術の項で述べたよう
に、セルラーゼの誘導基質として有効に利用され
うる。このほか、ソフオロースは、発明者らによ
り良質の甘味を有することが発見されており、蔗
糖の代わりに食品用の甘味料として用いられう
る。特に、ソフオロースは摂取してもほとんどノ
ンカロリーである（動物はグルコースのβ−１，
２結合を切断する酵素を持たない）ため、ダイエ
ツト食品用に好適に利用される。 （実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。 実施例 １ （菌体の分離） 大阪市城東区の土壌から分離した菌株のうち、
表１に示す培地に生育しうる菌株を検索した。表
１の培地成分のうち環状（１→２）−β−Ｄ−グ
ルカンはジヤーナル オブ ジエネラル マイク
ロバイオロジー〔J.Gen.Microbiol.、128、1873
（1982）〕に記載の方法で調製し、精製を行つた。

【表】 得た菌をそれぞれ同組成の液体培地にて30℃で
２日間培養した。培養液を濾紙にスポツトし、ブ
タノール−ピリジン−水（６：４：３）を展開溶
媒としてペーパークロマトグラフイーを行つた。
ソフオロースのスポツトの特に大きい培養液に生
育する菌を取り出して平板培地で培養を行つた。
この菌は本発明のアクレモニウムSp15 DK2015
株であることが、その生育状態、生理学的性質お
よび形態学的性質から確認された。 この菌を麦芽エキス寒天培地に１週間に１度の
割合で植え継ぎ、２ケ月を経過した菌について目
視観察したところ、菌の形態が変化していないこ
とが確認された。 実施例 ２ （菌体の培養および酵素の精製） 表２に示す培地を調製し、500mlの坂口フラス
コ10本にこの培地を60mlずつ分注し、滅菌を行つ
た。

【表】

【表】 この滅菌培地10本に実施例１で得られたアクレ
モニウムSp15 DK2015株を一白金耳ずつ植菌し、
30℃にて48時間振盪培養を行つた。次に、それぞ
れの培地に滅菌した環状（１→２）−β−Ｄ−グ
ルカンを１％の濃度となるように添加し、さらに
24時間培養を行つた。 この培養物を遠心分離し（5000rpm、10分間）、
菌体を除去した。このようにして合計500mlの粗
酵素液が得られた。この粗酵素液の酵素活性は
10U／mlであつた。 上記粗酵素液に硫酸アンモニウムをその飽和濃
度の約80％となるように加え、析出した固形分を
濾取した。これを20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.6）50
mlに溶解し、セルロースフイルムを用い同緩衝液
に対して透析処理を行つた。透折内液をSP−セ
フアデツクス充填カラムにかけて吸着させた後、
20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.6）中、０〜0.5MのNaCl
濃度勾配法で溶出を行つた。溶出するフラクシヨ
ンを集め、セフアデツクスＧ−75充填カラムでゲ
ル濾過を行い、さらにSP−セフアデツクス充填
カラムで精製を行つた。これを焦点電気泳動にか
け、β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ３mgを得た。
このβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼの比活性は
50U／mg蛋白質であつた。 実施例 ３ （β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを用いたソフ
オロースの調製） 20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.6）50mlに環状（１→
２）−β−Ｄ−グルカン２ｇおよび実施例２で得
られた精製β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ135U
を加えた。これを40℃にて22時間保持した後、活
性炭カラムにかけて吸着させた。このカラムに10
％エタノール水溶液を流して吸着物を溶離させ
た。溶離液からは精製ソフオロース960mgが得ら
れた。 実施例 ４ （β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを用いたソフ
オロースの調製） 環状（１→２）−β−Ｄ−グルカンの代わりに
直鎖状（１→２）−β−Ｄ−グルカン
（Amemuraらの方法により調製）３ｇを用いた
こと以外は実施例３と同様に操作したところ、精
製ソフオロース1400mgが得られた。 比較例 アクレモニウム クレソゲナム（ATCC
14615）を実施例２と同様の方法で培養したとこ
ろ、合計500mlのβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼ
の粗酵素液が得られた。その酵素活性は3U／ml
であつた。 （発明の効果） 本発明によれば、このように、新菌種アクレモ
ニウムSp15を利用して、β−Ｄ−１，２−グル
カナーゼを高率で生産することが可能となる。β
−Ｄ−１，２−グルカナーゼは菌体外に放出され
るため容易に採取・精製され得る。得られたβ−
Ｄ−１，２−グルカナーゼは環状または直鎖状
（１→２）−β−Ｄ−グルカンに作用し、ソフオロ
ースを効果的に生成する。ソフオロースはセルラ
ーゼの誘導基質として、さらに各種食品の甘味剤
として利用され得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクレモニウム属に属し、β−Ｄ−１，２−
   グルカナーゼ生産能を有する菌を培養し、培養物
   からβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼを得る工程を
   包含するβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼの製造
   法。 ２ 前記アクレモニウム属菌がアクレモニウム
   Sp15であり、 該アクレモニウムSp15が、麦芽エキス寒天培
   地、バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地またはツアペ
   ツク寒天培地で培養したとき、アクレモニウム
   キリエンスとは、分生子が卵形〜楕円形である点
   において菌学的性質が異なる新菌種である、 特許請求の範囲第１項に記載の製造法。 ３ 前記アクレモニウム属菌がアクレモニウム
   Sp15 DK2015株（微工研菌寄第9019号）である
   特許請求の範囲第２項に記載の製造法。 ４ 前記β−Ｄ−１，２−グルカナーゼが（１→
   ２）−β−Ｄ−グルカンに作用しソフオロースを
   生成する能力を有する特許請求の範囲第１項に記
   載の製造法。