JPH0154035B2

JPH0154035B2 -

Info

Publication number: JPH0154035B2
Application number: JP61264761A
Authority: JP
Inventors: Sumio Kitahata; Shigetaka Okada; Shigeru Edakawa
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd; Daikin Kogyo Co Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd; Ezaki Glico Co Ltd
Priority date: 1986-11-06
Filing date: 1986-11-06
Publication date: 1989-11-16
Also published as: JPS63116690A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、新菌種アクレモニウムSp15に関す
る。（従来の技術）バイオマスの有効利用という観点から、最近、
セルラーゼが重要視されている。セルラーゼのう
ちトリコデルマ属により生産されるセルラーゼ
は、ソフオロース（２−Ｏ−β−Ｄ−
GlucopyranosyI−Ｄ−glucose）から誘導される
ことが知られている〔バオケミカルアンドバ
イオフイジカルリサーチコミユニケーシヨン
ズ；，Biochem.Biophys.Res.Comm.，１，338
（1959）〕。このソフオロースは、２個のグルコー
スがβ−１，２結合で連結したタイプの二糖であ
り、例えば、環状あるいは直鎖の（１→２）−β
−Ｄ−グルカンにβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼ
を作用させて得られる。β−Ｄ−１，２−グルカ
ナーゼとしては、アスペルギルスフミガタス
（ASPergiIIus fumi−gatus）、フザリウムオキ
シスポラム（Fusariumoxysporum）、ペニシリ
ウムブレフエルデイアナム（Penicillium
brefeldianum）、ペニシリウムフニキユロサム
（Penicillium funiculosum）などの糸状菌由来の
β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ（カナデイアンジ
ヤーナルオブマイクロバイオロジー；Can.J.
Microbiol.，７，312（1961））が挙げられる。こ
のほか、サイトフアーガアルベンシコーラ
（Cytophaga arvensicola）IAM12648株のような
細菌由来のβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼも知ら
れている（特開昭59−154985号公報）。（発明が解決しようとする問題点）上記いずれのβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼも
（１→２）−β−Ｄ−グルカンからソフオロースへ
の変換能が低く、ソフオロースが高収率で得られ
ない。（発明の目的）本発明の目的は、環状または直鎖状（１→２）
−β−Ｄ−グルカンに作用しソフオロースを高収
率で生成しうるβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼを
生産する新規微生物を提供することにある。（問題点を解決するための手段および作用）本発明の新菌種アクレモニウムSp15は、アク
レモニウム属に属し、麦芽エキス寒天培地、バレ
イシヨ・ブドウ糖寒天培地またはツアペツク寒天
培地で培養したとき、アクレモニウムキリエン
スとは、分生子が卵形〜楕円形である点において
菌学的性質が異なる。この菌は、β−Ｄ−１，２
−グルカナーゼを高率で生産する。本発明の新菌種アクレモニウムSp15のうち、
特にアクレモニウムSp15 DK2015株（微工研菌
寄第9019号）がβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼ生
産能が高いという理由で好適に利用される。この
菌株は発明者らにより大阪市城東区の土壌から分
離・採取された新菌種であり、その菌学的性質を
次に示す。菌学的性質 (1) 各培地における生育状態麦芽エキス寒天培地生育は良好で25℃、10日間の培養で直径30〜40
mmのコロニーになる。コロニーは円形かつ平坦で
周辺部は微細なのこぎり刃状である。コロニー表
面は羊毛状で白色の色状を呈する。コロニー裏面
は淡黄色である。分生子は卵形〜楕円形であり着
生状態は良好である。液滴が見られる。子嚢果そ
の他の有性胞子器官は形成されない。バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地生育は良好で25℃、10日間の培養で直径30〜40
mmのコロニーになる。コロニーは円形、平坦で、
周辺部は微細なのこぎり刃状である。コロニー表
面は羊毛状で白色の色状を呈する。コロニー裏面
は淡黄色である。分生子は卵形〜楕円形であり着
生状態は良好である。液滴が見られる。子嚢果そ
の他の有性胞子器官は形成されない。ツアペツク寒天培地生育は良好で25℃、10日間の培養で直径25〜35
mmのコロニーになる。コロニーは円形、平坦で、
周辺部は微細なのこぎり刃状である。コロニー表
面は羊毛状で、白色の色状を呈する。コロニー裏
面は黄色〜茶色で数本の溝を形成する。茶色の拡
散性色素を生成する。分生子は、卵形〜楕円形で
あり着生状態は良好である。液滴が見られる。子
嚢果その他の有性胞子器官は形成されない。 (2) 生理学的性質好気性菌であり、次の生理学的性質を有する。

【表】 (3) 形態学的性質各種培地上で子嚢果およびその他の有性生殖器
官は確認されず、塊状になつたフイアロ型分生子
の形状が観察される。厚膜胞子の形成も観察さ
れ、その多くは連鎖状である。菌糸は多種の培地
上で形成され、複雑に分枝し１〜3μmの菌糸幅で
縦横に伸長する。分生子柄は単純分枝をなす。分
生子は透明かつ卵形〜楕円形でその大きさは、短
径が1.0〜1.6μm、長径が2.3〜3.2μmである。厚膜
胞子は透明でその大きさは、短径が3.0〜10.0μm、
長径が3.5〜12.0μmである。菌株の同定発明者らは、本発明の菌株（Acremonium
Sp15 DK2015）を、上記菌学的諸性質をもとに
ザジエネラオブフアンジヤイスポルレ
イテイングインピユアカルチヤー（The
Genera of Fungi Sporulating in Pure
Culture；A.R.Gantner Verlag KG，Ｊ，A.von
Arx 1974）およびコンペンデイウムオブソ
イルフアンジヤイ（Compen−dium of Soil
Fungi；Academic Press 1980）により同定し
た。この菌株は、上記のように、子嚢果その他の
有性生殖器官を持たず、分生子柄からは透明な分
生子を生じ、かつ生じた分生子がフイアロ型の性
状であるところから、アインワース（Ainworth）
の分類形式に従い、アクレモニウム属に属する１
菌種と同定された。しかも、コロニーが白色で分
生子が透明であり、かつ厚膜胞子を形成するとい
う点からアクレモニウムキリエンス
（Acremonium Kiliense）に近似する。しかし、
アクレモニウムキリエンスは上記３種の培地で
培養したときに形成される分生子がいずれも円筒
形であるのに対して、本菌株は卵形〜楕円形であ
るため、この種には属さないアクレモニウム
（Acremonium）属の新菌種であることが判明し
た。培養条件上記菌株の培地は格別である必要はなく、通常
の培地が用いられる。炭素源としては、ブドウ
糖、グリセリン、麦芽糖、デンプン、デキストラ
ン、乳糖、シヨ糖、糖密、粉飴などが用いられ
る。コーン、馬鈴薯、甘藷などを用いることもで
きる。窒素密としては酵母エキス、ペプトン、乾
燥酵母、大豆粉、コーンステイープリカー、アン
モニア態窒素、硝酸態窒素などが用いられる。無
機塩類としては、K₂HPO₄，KH₂PO₄，CaCl₂，
MgSO₄，Na₂HPO₄，（NH₄）₂HPO₄などが用い
られる。本菌にβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼを
有利に生産させるには、環状または直鎖状（１→
２）−β−Ｄ−１，２−グルカンを0.5〜５重量
％、好ましくは１重量％程度の割合で添加する。
上記環状（１→２）−β−Ｄ−グルカンは、例え
ば、特開昭59−71686号公報に記載のリゾビウム
フアツセオリ（Rhizobium phaseoli）RA−４
株や特開昭59−82092号公報に記載のアグロバク
テリウムラジオバクター（Agrobacterium
radiobacter）A1−５株をグルコースなどを含有
する通常の培地で培養することにより生産され
る。直鎖状の（１→２）−β−Ｄ−グルカンは、
例えば、Amemuraら（ジヤーナルオブジエ
ネラルマイクロバイオロジー；Journal of
General Micro−biology 131，301（1985））の方
法で、アセトバクター属の菌を通常の培地で培養
することにより生産される。 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを生産する本菌
の培養PHは2.0〜100.0、好ましくは4.5〜7.0、培
養温度は15〜30℃、好ましくは20〜30℃である。
好気的に液体培地で撹拌もしくは振盪しながら培
養を行う。固体培地上でも培養を行なえることは
いうまでもない。例えば、25℃で24時間液体培養
を行うと、本菌は充分に増殖し、β−Ｄ−１，２
−グルカナーゼが菌体外へ放出される。アクレモニウムSp15培養物からのβ−Ｄ−１，
２−グルカナーゼの分離法上記方法で培養されたアクレモニウム属菌の培
養物からβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼが通常の
方法により分離される。例えば、培養物を遠心分
離にかけて菌体を除き、必要に応じて濃縮して粗
酵素液を得る。さらに、例えば、上記菌体を除いた粗酵素液に
硫酸アンモニウムを加えて塩析し、得られた固形
分を透析にかけ、次いで、透析内液をセフアデツ
クスカラム、焦点電気泳動などで精製することに
より精製酵素（β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ）
が得られる。 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼの性質作用および基質特異性：（１→２）−β−Ｄ−
グルカンに作用し、ソフオロースを生成する。至適PHおよび安定PH範囲：至適PHは4.0〜4.5
である。安定PH範囲は4.5〜6.0であり、40℃に
て１時間保持したとき100％安定に存在する
（同条件でPHを3.0としたときの残存活性は80
％、PHを７〜８としたときの残存活性は70％で
ある）。温度安定性：40℃以下において15分間安定に
存在する（50℃における残存活性は80％、55℃
では65％、そして60℃では20％である）。分子量：SDS電気泳動法による分子量は
35000である。等電点：9.6 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼの力価測定法 20mM酢酸緩衝液（PH5.6）に環状（１→２）−
β−Ｄ−グルカンを濃度2.5mg／mlになるように
溶解する。この溶液0.8mlに適当な濃度の酵素溶
液0.2mlを加え、40℃で１時間反応させる。次い
で、ソモギ銅液１mlを添加して反応を中止させ、
還元力をソモギ−ネルソン法で定量する。既知濃
度のソフオロースを用いてあらかじめ検量線を作
成し、これと比較してソフオロースの生成量を算
出する。40℃で１時間に1μmoleのソフオロース
を生成する酵素量を１単位とする。 β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを用いたソフオロ
ースの製造法上記方法で得られた製製β−Ｄ−１，２−グル
カナーゼまたはβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼの
粗酵素液を環状または直鎖状（１→２）−β−Ｄ
−グルカンに作用させるとソフオロースが得られ
る。例えば、環状（１→２）−β−Ｄ−グルカン
を酢酸緩衝液に溶解させ、β−Ｄ−１，２−グル
カナーゼを加えて40℃で22時間反応させると、反
応液中にソフオロースが生成する。これを活性炭
カラムなどで精製するとソフオロースが得られ
る。ソフオロースの用途ソフオロースは、従来技術の項で述べたよう
に、セルラーゼの誘導基質として有効に利用され
うる。このほか、ソフオロースは、発見者らによ
り良質の甘味を有することが発見されており、蔗
糖の代わりに食品用の甘味料として用いられう
る。特に、ソフオロースは摂取してもほとんどノ
ンカロリーである（動物はグルコースのβ−１，
２結合を切断する酵素を持たない）ため、ダイエ
ツト食品用に好適に利用される。（実施例）以下に本発明を実施例につき説明する。実施例１（菌体の分離）大阪市城東区の土壌から分離した菌株のうち、
表１に示す培地に生育しうる菌株を検索した。表
１の培地成分のうち環状（１→２）−β−Ｄ−グ
ルカンはジヤーナルオブジエネラルマイク
ロバイオロジー〔J.Gen.Microbiol.，128，1873
（1982）〕に記載の方法で調整し、精製を行つた。

【表】得た菌をそれぞれ同組成の液体培地にて30℃で
２日間培養した。培養液を濾紙にスポツトし、ブ
タノール−ピリジン−水（６：４：３）を展開溶
媒としてペーパークロマトグラフイーを行つた。
ソフオロースのスポツトの特に大きい培養液に生
育する菌を取り出して平板培地で培養を行つた。
この菌は本発明のアクレモニウムSp15 DK2015
株であることが、その生育状態、生理学的性質お
よび形態学的性質から確認された。この菌を麦芽エキス寒天培地に１週間に１度の
割合で植え継ぎ、２ケ月を経過した菌について目
視観察したところ、菌の形態が変化していないこ
とが確認された。実施例２（菌体の培養および酵素の精製）表２に示す培地を調製し、500mlの坂口フラス
コ10本にこの培地を60mlずつ分注し、滅菌を行つ
た。

【表】この滅菌培地10本に実施例１で得られたアクレ
モニウムSp15 DK2015株を一白金耳ずつ植菌し、
30℃にて48時間振盪培養を行つた。次に、それぞ
れの培地に滅菌した環状（１→２）−β−Ｄ−グ
ルカンを１％の濃度となるように添加し、さらに
24時間培養を行つた。この培養物を遠心分離し（5000rpm、10分間）、
菌体を除去した。このようにして合計500mlの粗
酵素液が得られた。この粗酵素液の酵素活性は
10U／mlであつた。上記粗酵素液に硫酸アンモニウムをその飽和濃
度の約80％となるように加え、析出した固形分を
濾取した。これを20mM酢酸緩衝液（PH5.6）50
mlに溶解し、セルロースフイルムを用い同緩衝液
に対して透析処理を行つた。透析内液をSP−セ
フアデツクス充填カラムにかけて吸着させた後、
20mM酢酸緩衝液（PH5.6）中、０〜0.5MのNaCI
濃度勾配法で溶出を行つた。溶出するフラクシヨ
ンを集め、セフアデツクスＧ−75充填カラムでゲ
ル濾過を行い、さらにSP−セフアデツクス充填
カラムで精製を行つた。これを焦点電気泳動にか
け、β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ3mgを得た。
このβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼの比活性は
50U／mg蛋白質であつた。実施例３（β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを用
いたソフオロースの調製） 20mM酢酸緩衝液（PH5.6）50mlに環状（１→
２）−β−Ｄ−グルカン2gおよび実施例２で得ら
れた精製β−Ｄ−１，２−グルカナーゼ135Uを
加えた。これを40℃にて22時間保持した後、活性
炭カラムにかけて吸着させた。このカラムに10％
エタノール水溶液を流して吸着物を溶離させた。
溶離液からは精製ソフオロース960mgが得られ
た。実施例４（β−Ｄ−１，２−グルカナーゼを用
いたソフオロースの調製）環状（１→２）−β−Ｄ−グルカンの代わりに
直鎖状（１→２）−β−Ｄ−グルカン
（Amemuraらの方法により調製）3gを用いたこ
と以外は実施例３と同様に操作したところ、精製
ソフオロース1400mgが得られた。比較例アクレモニウムクレソゲナム（ATCC
14615）を実施例２と同様の方法で培養したとこ
ろ、合計500mlのβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼ
の粗酵素液が得られた。その酵素活性は3U／ml
であつた。（発明の効果）本発明によれば、このように、アクレモニウム
キリエンスに近似し、分生子形状の異なる新菌種
アクレモニウムSp15が得られる。この菌は、β
−Ｄ−１，２−グルカナーゼを高率で生成しう
る。β−Ｄ−１，２−グルカナーゼは菌体外に放
出されるため容易に採取・精製され得る。得られ
たβ−Ｄ−１，２−グルカナーゼは環状または直
鎖状（１→２）−β−Ｄ−グルカンに作用し、ソ
フオロースを効果的に生成する。ソフオロースは
セルラーゼの誘導基質として、さらに各種食品の
甘味剤として利用され得る。

Claims

【特許請求の範囲】１アクレモニウム属に属し、麦芽エキス寒天培
地、バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地またはツアペ
ツク寒天培地で培養したとき、アクレモニウムキ
リエンスとは、分生子が卵形〜楕円形である点に
おいて菌学的性質が異なる、新菌種アクレモニウ
ムSp15。２アクレモニウムSp15 DK2015株（微工研菌
寄第9019号）である特許請求の範囲第１項に記載
の新菌種アクレモニウムSp15。