JPS5840468B2 - コレステロ−ルオキシダ−ゼの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコレステロールオキシダーゼの精製法に関する
。

さらに詳しくは本発明はコレステロールオキシダーゼの
基質類似物（たとえばコール酸を担体（たとえば高分子
多糖体系のもの）に結合させて得た水不溶性の吸着剤と
コレステロールオキシダーゼ含有溶液とを接触させて、
コレステロールオキシダーゼを吸着剤に吸着させ、つい
で吸着したコレステロールオキシダーゼを溶出剤で溶出
することを特徴とするコレステロールオキシダーゼの精
製法に関する。

コレステロールオキシダーゼはコレステロールの定量に
用いられる有用な酵素である。

該酵素を用いる定量法は従来の化学的定量法に代るもの
として近年注目を集めている。

すでにコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロ
ール定量用ノ臨床診断薬も使用されている。

従来、コレステロールオキシダーゼの製造法としてはノ
カルディア属やブロアクチノミセス属などに属する該酵
素生産菌などを培養し、菌体中より単離して得る方法（
特開昭４１−４７５８２、特開昭４８−４４４８０など
）が知られている。

菌体よりコレステロールオキシダーゼを単離スる方法と
しては、菌体抽出液をＤＥＡＥセルロースやＤＥＡＥセ
ファデックスに通塔し、表面活性剤含有液や段階的濃度
の緩衝液で溶出を行う方法が知られている（特開昭４９
−４７５８２、特開昭４８−４４４８０）。

しかしながらこの方法では夾雑の他の酵素等の蛋白質類
を除くのには充分でなく、硫安沈殿および透析によって
代表される前処理手段が必要である。

一方、酵素をその酵素の基質や基質類似物の結合した担
体に吸着させて溶出剤で溶出することにより精製する手
法はかなり知られている。

（たとえば３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼの精製にグリココール酸を結合させたセファロース４
Ｂを用いる方法ＣＢＢＡ、４３８．１３（１９７６）、
）など）。

本発明によればコール酸等の基質類似物を結合させた担
体を吸着剤として用いることにより、硫安沈殿、透析等
の前処理を要することなく簡便にコレステロールオキシ
ダーゼを精製できる。

次に本発明をさらに詳しく説明する。

本発明で使用する担体としては例えばアミノ基を有する
高分子多糖体、アミノ基を有する多孔性ガラスなどがあ
げられる。

このうちアミノ基を有する多孔性ガラスとしてはアルキ
ルアミノガラスなどを使用する。

またアミノ基を有する高分子多糖体としてはセファロー
ス（ファーマシア社製）、バイオゲル（バイオラド社製
）等のアガロース系多糖体、セファデックス（ファーマ
シア社製）等のデキストラン系多糖体、セルロース系多
糖体などの高分子多糖体にアミノ基を付与したものがあ
げられる。

またアミノ基を有する高分子多糖体としては市販のもの
、例えばＡＨ−セファロース（ヘキサメチレンジアミン
−セファロースの商品名：ファーマシア社製）をそのま
ま使用してもよいが、一般に公知の手法、例えばＪ、
Ｂ、Ｃ。

２４５（１２）、ｐｐ ３０５９（１９７０）に記載
の手法によって上記高分子多糖体にアミノ基を導入して
製造したものを用いてもよい。

以下この手法について説明する。

高分子多糖体を分散に充分な量の水に分散させて懸濁液
とし、ついでこれにハロゲン化シアン（例えば臭化シア
ン）を加え、アルカリ性下好ましくは５０℃以下、通常
室温で通常３０分〜２時間反応を行う。

高分子多糖体に対するハロゲン化シアンの使用量は特に
制限はないが、高分子多糖体の構成単糖単位（例えばグ
ルコース単位）に対し、１〜５モル使用するのが好まし
い。

ついで高分子多糖体を分離し、高分子多糖体の構成単糖
単位に対し大過剰、好ましくは５〜２０モルのへキザメ
チレンジアミン等のジアミンを含有する水溶液を加え、
ｐＨ９〜１１で好ましくは５０℃以下通常室温で、通常
４〜２０時間反応を行うことによりアミノ基を付与した
高分子多糖体（すなわち担体）を得る。

次に上記のごとくして得られた担体に基質類似物を結合
させるのであるが、用いられる基質類似にしてはコール
酸、デオキシコール酸、クリココ−ｚ４およびこれらの
化合物のナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、ア
ンモニウム塩などがあげられる。

担体への基質類似物の結合は公知の手法、例えばＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１．２８１（１９７２）
に記載の手法を用いて行うことができる。

次にこの手法について説明する。

基質類似物を水もしくは水性媒体（例えば水−ジメチル
ホルムアミド５０ ： ５０の混合液）中で水溶性のカ
ルボジイミドの存在下、担体と反応させる。

水性媒体としては水とジメチルホルムアミドジメチルス
ルホキシド、テトラヒドロフラン等の親水性有機溶媒と
の混合液が用いられる。

親水性有機溶媒の使用量は該溶媒による担体の変質を起
さないため、水１容積に対して１容積までに止めるのが
好ましい。

水性媒体は基質類似物が水にとけにくい場合に使用する
のがよい。

水溶性のカルボジイミドとしては１−シクロへキシル−
３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミド、■−
エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミドなどの塩酸塩、ｐトルエンスルホン酸塩などが用
いられる。

反応は温度、ｐＨに特に制限はないが、好ましくは６０
℃以下、通常室温で、好ましくはｐＨ４，５〜７．０で
、通常４〜２０時間行う。

水溶性カルボジイミドの使用量は特に制限はないが担体
のグルコース単位あたり１〜１０モル用いるのが好まし
い。

以上の処理によって、担体に基質類似物の結合した吸着
剤を得ることができる。

該吸着剤は基質類似物とジアミンとの結合体を先につく
っておいて、ついでこれと高分子多糖体とを反応させる
ことによっても得られる。

次に本発明の吸着剤によるコレステロールオキシダーゼ
の精製について説明する。

吸着剤へのコレステロールオキシダーゼの吸着は単に吸
着剤とコレステロールオキシダーゼ含有溶液とを接触さ
せることによって達せられる。

処理手段としてはバッチ処理でもカラム処理でもよい。

コレステロールオキシダーゼ含有溶液としてはコレステ
ロールオキシダーゼを含有する溶液であればいずれの溶
液であってもよいが、通常はコレステロールオキシダー
ゼ生産菌の培養Ｐ液、もしくはコレステロールオキシダ
ーゼ生産菌の培養液から分離した菌体の摩砕液から固形
物を除いて得られる溶液が用いられる。

コレステロールオキシダーゼ生産菌としてはフレビバク
テリウム・ステロリクムＫＹ３６４３（ＡＴＣＣ２１３
８７）、ノカルジア・スビシーズＮＣｌＢ１０５５４（
ＮＲＲＬ５６３５）（微工研寄託受理第１６０６号）、
プロアクチノミセス・エリトロポリスＡＴＣＣ１７８９
５などが知られている。

吸着させる際のｐＨおよび温度は酵素の性質に影響を及
ぼさない範囲内で任意に選ぶことができるが、ｐＨ６〜
８、温度は３０℃以下で行うことカ好ましい。

吸着剤に吸着した酵素は、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド、テトラドロフラン、エチレングリコ
ール等の親水性溶媒と水との混合溶液に、コール酸、ト
リトンＸ−１００等の界面活性剤の水溶液で容易に溶出
することができる。

溶出剤溶液中の溶出剤の濃度は溶出できる濃度であれば
よいが、好ましくは親水性溶媒では２０〜５０％、界面
活性剤では２５〜１００ｍｍｏｌ、＄で行うのがよい。

なお、溶出に際して、溶出剤水溶液に食塩等の無機塩類
を含有させることにより、コレステロールオキシダーゼ
を含む両分がシャープに得られる。

上記のごと（して得られるコレステロールオキシダーゼ
含有溶出液はセファデックスＧ−２５やＧ−７５を用い
たゲル１過法、透析法などにより脱界面活性剤、脱塩を
行い、減圧下で濃縮後、凍結乾燥することにより、高純
度のコレステロールオキシダーゼ標品を得ることができ
る。

なお、本発明で酵素含有液の精製に使用した吸着剤は溶
出剤で溶出した後、水で洗浄することにより、再使用が
可能である。

次に実施例をあげて本発明方法を具体的に説明するが、
これらは単なる一例示であって、何ら本発明を限定する
ものではない。

実施例中での酵素活性の測定は基質であるコレステロー
ルから酵素反応により生ずる過酸化水素をパーオキシダ
ーゼの存在下、フェノールと４アミノアンチピリンでキ
ノンイミン（紅葉色）とし、可視部吸光測定（５００ｎ
ｍ）する方法で行った。

活性の単位Ｕは１分間に１μｍｏｌの基質を分解する酵
素力価とする。

実施例 １ 膨潤させたＡＨ−セファロース（ヘキサメチレンジアミ
ンセファロースの商品名、ファーマシア社製）２５０ｒ
ｎｌを水洗後コール酸ナトリウム水溶液２５０ｒｎｌ（
コール酸ナトリウム８りを含む）に加工、ｐＨを６．５
に調整し、■−シクロヘキシル３−（２−モルフォリノ
エチル）カルボジイミド−ｐ−１ルエンスルホン酸塩６
ｙを加えて室温で１６時間反応させる。

反応後５０％ジメチルホルムアミド水溶液および水で充
分洗浄し、コール酸セファロース吸着剤２５０ｍ１を得
る。

一方、ブレビバクテリウム・ステロリクムＫＹ３６４３
（ＡＴＣＣ２１３８７）１白金耳を２Ｊ三角フラスコ中
のコレステロール３？／ｄｌ、コーンスチーブリ力−〇
、 ５ ？ ／ｄｌ、 ＮａＮＯ３０，２？／ｄｉ、
Ｋ２ＨＰＯ４０，１ｆｌ／ｄｌ、 ＫＣＩ Ｏ，０５
？ ／ｄｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５グ／ｄ
ｌを含む培地（殺菌前ｐＨ７，３）３００ｍ１に植菌し
、３０℃で２４時間通気攪拌培養を行う。

培養終了後、培養液をｐＨ７，０に調整し、遠心分離し
て菌体を除去することにより１ｍｌ当り、３Ｕのコレス
テロールオキシダーゼを含有スる上清液を得る。

このようにして得られた上清液１１を前記コール酸セフ
ァロース吸着剤５０ ｒｎｌのカラムに通塔して、コレ
ステロールオキシダーゼを吸着させ、水および２５ ｍ
ｍｏｌ ／ｌコール酸ナトリウム水溶液それぞれ５０ｒ
ｎｌで洗浄して夾雑物を除去した後、３３ｍｍｏｌ／ｌ
コール酸ナト リウムおよび０．５ｍｏｌ ／ １食塩
を含むｐＨ９，０の０．０３ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液で
溶出し、３２４ ［Ｊ ／ｒｎｌのコレステロールオキ
シダーゼ含有画分６６ｒｎｌを得る。

この場合酵素の回収率は７２４％で比活性を６７倍にま
で精製することができる。

前記コレステロールオキシダーゼ含有画分６６ｒｎｌを
セファデックスＧ−２５（ファーマシア社製）１１のカ
ラムに通塔し、ｐＨ７，０の０．００１ｍｏｌ／ｌ’）
ン酸緩衝液で溶出し、溶出液を減圧下で濃縮した後、凍
結乾燥することにより、比活性２２Ｕ／ｍ９蛋白質の酵
素標品８５１ｎ９を得る。

実施例 ２ ガラス担体の１種であるアミノプロピルＣＰＧ（エレク
トローヌクレオニクス社製）１００ｗｌｌにコール酸ナ
トリウム３１含有の５０％ジメチルホルムアミド水溶液
１００ｒｎｌを加え、ｐＨを４．７に調整し、■−エチ
ルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩２，５ｙを加え、室温で１６時間反応させる。

反応後、５０％ジメチルホルムアミド水溶液および水で
充分洗浄し、コール酸ＣＰＧ吸着剤１００ｒｎｌを得る
ことができる。

ついで、実施例１と同様に調製した培養土清液（酵素量
３ Ｕ ／ｒｎｌ ） １１：に上記コール酸ＣＰＧ吸
着剤１００ｒｒｌｌを入れ、室温で約１時間静かに攪拌
し、コレステロールオキシダーゼを吸着剤に吸着させる
。

吸着剤を減圧１過で集めた後、水および２５ｍｍｏｌ／
ｌコール酸ナトリウム水溶液で夾雑物を除いた後、１％
のトリトンＸ−１００水溶液で溶出し、８．５ Ｕ ／
ｒｎｌのコレステロールオキシダーゼ画分１６０ｍＪを
得る。

この場合の回収率は４５％で、比活性７０倍にまで精製
することができる。

この溶出液をダイヤフローメンプランＰＭＩＯを装備し
たダイヤフローセルモデル４０２（４００ｍｌ容量；ア
ミコン・ファー・イースト社製）に入れ、さらに１０％
エタノールを含むｐＨ７，０の０．００１ ｍｏｌ ／
ｌリン酸緩衝液２００ｗ１ｌを加える。

ついで常法により限外を過を行い、５０ｒｒｌｌ以下に
まで濃縮し、さらに、同緩衝液を加え限外１過を３回繰
り返した後、濃縮液を凍結乾燥することにより、１７Ｕ
／ｗＩ９蛋白質の酵素標品７０ｍ９を得る。

参考例 １ ヘキサメチレンジアミンセファロースの製造；セファロ
ース４Ｂ（ファーマシア社製）２５０ｒＩＬｌを等量の
水に懸濁させ、１０規定の水酸化ナトリウムを加えｐＨ
１１〜１２とする。

該水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１１〜１２を維持しな
がら、かつ充分攪拌しながら臭化シアン２５ｇを徐々に
加える。

反応は３０℃以下で約１時間行う。

反応終了後、氷水ｌｌ中に反応物を入れ、吸引濾過する
。

得られた樹脂をさらに冷水１１で洗浄後、直ちにヘキサ
メチレンジアミン塩酸塩１５１を含むｐＨ１０の０．１
ｍｏｌ／ｌ炭酸緩衝液２５０ｍ７中に加え、室温で１６
時間反応させることによりヘキサメチレンジアミンセフ
ァロース２５０ｒＩＬｌを得る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コレステロールオキシダーゼの基質類似物を担体に
   結合させて得た水不溶性の吸着剤とコレステロールオキ
   シダーゼ含有溶液とを接触させて、コレステロールオキ
   シダーゼを該吸着剤に吸着させ、ついで吸着したコレス
   テロールオキシダーゼを溶出することを特徴とするコレ
   ステロールオキシダーゼの精製法。