JPS62220190A - リグニン分解酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なリグニン分解酵素およびその製造方法に
関するものである。本発明の酵素はリグニンに作用して
、これを低分子化または分解する性質を有するため、木
材等のリグノセルＤ−ス材料を原料とする紙パルプ製造
工程における種々の工程で利用することができる。たと
えば、パルプ化工程、パルプ漂白工程、排水処理工程等
におけるリグニンの低分子化または分解を行わけること
に利用できる。又、木材の糖化において、糖化の前段の
処理としてリグニンを分解することによって、セルラー
ゼ作用を高めるといういわゆるセルロース系バイオマス
利用の分野にも適用できる。

［従来の技術］ 木材等のリグノセル０−ス物質に白色腐朽菌を接種、培
養することによってリグニンを分解し、セルロースパル
プを製造する提案がなされている（特開昭５０−４６９
０３号公報参照）。しかし、この方法の白色腐朽菌は共
存する炭水化物をも分解してしまい、またセルラーゼ欠
損変異株を用いた場合には、本来のリグニン分解力が弱
まってしまうことなどの問題点があり、実用化されるに
至っていない。

一方、このような問題点を解決するため、白色腐朽菌の
リグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作用させ、
リグニンのみを選択的に分解させようとすることも提案
されている（サイエンス第２２１巻、第６６１〜第６６
２頁、１９８３年１２月）。

この酵素はファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａ
ｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）
が生産する菌体外酵素であり、主な特徴は鉄含有酵素で
あること、分子量が４２．０００であること、酵素作用
に過酸化水素が必要であること、リグニンモデル化合物
の４位のフェノール性水ＷＩ基がメトキシル基になった
化合物に対して作用することが確認されていること等で
ある。

さらに、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎ
ｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が
生産する菌体外酵素として、２つの酵素が報告されてい
る（フェデレーション・オブ・ヨーロピアン　バイオケ
ミカル　ソサイエテーズ　レターズ　第１６９巻、第２
号第２４７〜第２５０頁、１９８４年）。これらの酵素
の１つは分子量が４１，０００以下である。他方の酵素
は分子ｍが４６．Ｇｏｏ以下である。そして両酵素とも
鉄含有酵素であると推定されていること、酵素作用に過
酸化水素が必要であること、リグニンモデル化合物の４
位のフェノール性水酸基がエトキシル基になった化合物
に対して作用することが確認されていること等の性質を
有することが報告されている。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は、白色腐朽菌をリグノセルロース物質に作用さ
せるときに生ずるリグニンの分解の他に共存する炭水化
物の分解を起こすという問題点を解決することを意図す
るものであり、又、従来公知のリグニン分解酵素の酵素
作用には過酸化水素が必要であり、工業的適用において
はコスト高となる問題点があったのを解決しようとする
ものである。

従って、本発明の目的は新規なリグニン分解酵素および
その製造方法を提供することにあり、他の目的は主とし
てリグノセルロース物質中のリグニンを低分子化または
分解する新規酵素およびぞの製造方法を提供することに
ある。また他の目的は過酸化水素依存性のない新規酵素
およびその製造方法を提案することにある。

［問題点を解決するための手段工］ 本発明は新規なリグニン分解酵素およびその製造方法に
関するものである。

リグニンは木材腐朽菌と呼ばれる担子菌によって良く分
解されることが知られている。しかしながら、高分子化
合物であるリグニンの化学構造は複雑であり、現在でも
その化学構造が決定されていないため、リグニン分解酵
素に関する知児は非常に少ないのが実情である。

本発明者らは木材腐朽菌として知られている菌の中から
、クラフトパルプ晒廃液およびリグニンの主要骨格構造
の代表的なモデル化合物シリンギルグリセ０−ルーβ−
シリンギルエーテルを分解する酵素活性を指標として、
酵素の探索を行なった結果、カワラタケ属の菌の培養物
中から得られた菌体外酵素を高度に精製して標品を得た
。

リグニン分解酵素生産菌としてはカワラタケ属に属する
コリオラスヒルスツエ（ＣＯｒｉｏｌｕｓｈｉｒｓｕｔ
ｕｅ）　　ＩＦＯ４９１７，Ｃ，ｔ：ルス’／　Ｉ　Ｉ
ｒ０４９２０　。

Ｃ，ヒルスツエＩＦＯ７０３８，コリオラス　ベルシカ
ラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）　Ｉ
ＦＯ３０３４０、Ｃ，ベルシカラーＩＦ０８７５４など
が使用できる。

本発明のリグニン分解酵素の主な特徴は銅含有酵素であ
ること、等電点が３．５付近であること、酵素作用に酸
素が必要であること、分子但が約６３、０００±５，０
００　［ＳＯ３電気泳動法による］であること、リグニ
ンモデル化合物の４位のフェノール性水酸基がメトキシ
ル基になった化合物に対して作用しないこと等であり、
前記のファネロケーテ−クリソスポリウム（ｐｈａｎｅ
ｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ　ｉｕｍ）の生
産する菌体外酵素とは全く性質が異なるＮ累である。

本発明のリグニン分解酵素は、下記の性質を有する。

（＋）作用 （ｉ）　　シリンギルグリｔ＝ｏ−ルーβ−シリンギル
エーテルに作用して、２，６−ジメトキー　ジフェノー
ルを生成する。

（ｉｉ）　　化学パルプＶ′＃ｉの多段漂白工程からの
排液中に含まれるリグニンを低分子化する。

（２）　　基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテルに対
して作用するが、シリンギルグリセロール−β−シリン
ギルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメトキシル
基になった化合物に対しては作用しない。

（３）　　至適ｐＨおよびｐｌ＋安定性Ｄ１１４．５〜
５．０付近が至適であり、安定Ｄ１１は６．０〜９．０
である。

（４）　　至適温度および熱安定性 ５０℃付近が至適であり、５０℃までの熱に安定である
。

（５）　　等電点は３．５付近である。

（６）　　本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
を呈する。

（７）　　本酵素の作用には酸素を必要と覆る。

次に本酵素の作用機序を確認するために、リグニンモデ
ル化合物としてシリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテル（以下ＳＯ８と称する）を用いて試験を行な
った。

少量のジオキサンに溶解した０、４Ｍ　ＳＯ８を含有す
る２００１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）４−
中に実施例１で得た本発明の酵素溶液０・４ｄを含む反
応液を２５℃で３０秒間及び８時局反応させた。

得られた酵素反応液をＴＬＣガスクロマトグラフィー、
マススペク１〜ルグラフィーで分析した。

■　ＴＬＣ分析 醇素添加後３０秒でＳＯ８のスポットが消滅しておりＳ
Ｏ８は速やかに分解される。

■　ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルグラ
フィー分析 ＳＯ８と本発明酵素を８時間反応させた酵素反応液をガ
スクロマトグラフィーで分析したところ第１図に示ずよ
うなピークが認められ、マススペクトルよりビークエは
２，６−シメトキシフエノールであることが判明した（
第２図）、。

以上の結果により、本発明の酵素によってシリンギルグ
リセロール−β−シリンギルエーテルのβ−アリルエー
テル結合が切断されることが確認された。

なおＳＯ８のフェノール性水１！ｍをメトキシル基に変
えた基質に対しては本発明の酵素は全く作用を示さない
。このことから本発明の酵素はフェノール性水酸基を有
する基質に対して特異的に作用するものと考えられる。

［作　用］ 本発明ＷＩ素が天然リグニンに作用するＩＩ構は次のよ
うに考えられる。

リグニンのフェノール性水ｊＩｉｌｉを有する骨格に対
して本発明酵素が特異的に作用しβ−アリルエーテル結
合を切断する。その結果２．６〜ジメトキシフエノール
に相当する構造を有しその４位に更にリグニン基本骨格
が結合したフェノール性水酸基を有する化合物が生成す
る。このようにβ−アリルエーテル結合の切断により新
たにフェノール性水酸基が生成するためリグニンは本発
１１１１酵素により引き続き分解を受は反応が進行する
。

［問題点を解決するための手段■］ なお、天然リグニン中ではβ−アリルエーテル結合が約
５０％存在することから、本発明の酵素がβ−アリルエ
ーテル結合を切断することは天然リグニンの分解におい
て極めて意義がある。

本発明酵素を主要成分とする実施例１（侵出）で得た精
製酵素液をブナ摩砕木粉に３５℃で３日間反応させたと
ころ、ヅグニン中の遊離フエー７１−ル単位の約６５％
が分離しており、全芳香各の約１５％が芳香性を失なう
ような変化（分解）を受け、アルキル−アリルエーテル
結合も１０％程度開裂していた。

本発明の酵素は反応に際し、酸素を必要とするが、反応
は大気中より純酸素雰囲気中の方が望ましく振どう、攪
拌することなどにより酵素反応速度を更に高めることが
できる。

また本発明はカワラタケ属に属するリグニン分解酵素オ
キシダーゼ生産菌を培地に培養し、培養物から該リグニ
ン分解Ｗ素を採取することを特徴とするリグニン分解酵
素の製造方法に存する。

上記菌体の培養形態は、液体培養、固体培養のいずれで
あっても良い。培地の栄養源としては、微生物の培養に
通常用いられているものが広く使用することができる。

炭素源としては同化可能な炭素源であれば良く、例えば
木粉、グルコース、シュークロス、ラクトース、糖蜜な
どが使用される。特にリグノセルロース成分からなる木
粉培地で培養すると本発明のリグニン分解酵素を純度高
く生産することができるため有利である。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン
、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物などが用いら
れる。その他、リン酸塩、硫酸、塩、マグネシウム、カ
ルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、マンガン、亜鉛
などの塩類が必要に応じて使用される、特に本ｌＩｌ累
は銅含有酵素であり、銅塩の添加は有効である。

培！Ｉ温度は菌が発育し、該リグニン分Ｉ！ｇ酵素を生
産する範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは２３〜２
７℃程度が良い。培養時間は条件によって異なるが、液
体培養では５〜１０日間、固体培養は１〜３ケ月程度で
ある。

次いで、このようにして得られた培養物からリグニン分
解酵素を採取するのであるが、本酵素は主として菌体外
に分泌されるの芒、本酵素を採取するには、液体培養に
おいては菌体を遠心分１等で除去した培養炉液、また固
体培養においては培養物から抽出した抽出液を用いて、
酵素含有溶液を濃縮するか、または濃縮することなく可
溶性塩類、例えば硫安などを用いて塩析せしめるか、親
水性溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、
イソプロパツールなどの添加により本酵素を沈澱往しめ
れば良い。

次いで、この沈澱物は水またはａｌｌ液に溶解し、半透
膜にて透析眩しめて低分子量の不純物を除去することが
できる。、また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるり
Ｏマドグラフィーにより、リグニン分解酵素を精製する
。さらにこれらの手段により得られた酵素溶液は減圧濃
縮、限外濾過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により
精製され≠キリゲニン分解酵素を得る。

［実　施　例］ 以下本発明を実施例によって説明する。

実施例　１ 〔実　　験　　１　〕　　゛ グルコース３％、ペプトン１％、ＫＮ２ＰＯ４０，１５
％、Ｍ（１３０・７１−１２０　Ｇ、０５％、塩酸チア
ミ’／　０．０００２％、Ｃｕ　５ｏ４ｅ　５　Ｈ２０
０，００１６％を含有する培地（ｐＨ！ｉ、　ｏ）　５
４１を１０１容ジ１シーファーメンタ−に入れ、１２０
℃、２０分間加熱殺菌した後、アラゲカワラタケ（コリ
オラス・ヒルスツエ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｈｉｒｓｕｔ
ｕｅ）　ＩＦＯ／１９１７゜（Ｋ、Ａｏｓｈｉｍａ　；
　Ｐｓ−４ａ）　）を接種し２８℃、８０間、１５０（
＄）ｌ　（＠拌ｉ度）、５．ｌｌ／分（通気■）の条４
１下で培養を行なった。

培養終了後、炉布で濾過して除菌し粗酵素液を得た。

次にこの粗酵素液を１０ｍＭリン酸カリウムｖｉ雨液（
ｐ１１７．０）で緩衝化した口［＾１ヨパール力ラム（
２０Ｘ　５　ａｓ　）に通した。ＦＰｆＸは吸着される
ので同じ緩衝液で吸着されない不純蛋白を洗い流した後
、３０％硫安を含む１０ｍＨす＞ＭカリウムＭＷＪ液（
ｐＨ１７，０）で溶出した。活性画分を集め、５０％飽
和ｔｉｎアンモニウムで沈澱する不純蛋白を遠心分離で
除き、７０％飽和硫酸アンモニウムで沈澱する部分を遠
心分離で集めた。少ωの水に溶解し、蒸留水２Ｊｌに対
し透析した。透析外液は１日に数回交換し、−晩透析シ
タ後限外が過（Ａｍｉｃｏｎ社、０Ｈ−１０）ＦｆＪ縮
した。ＺＯｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｌ＋７．０）
を加えて限外濾過する操作を２回くり返した後、同じ！
！衝液で平衡化した旺酊トヨパールカラム（１，５ｘ２
０α）にのせた。同じａ耐液４００耐で洗滌した後、溶
出は８０−Ｈの同緩衝液で行ない、５ｄずつ分画した。

活性のある自分からそれぞれ一部をポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にがけ°Ｃ均一性を検討し、電気泳動の結
果で均一な画分を集めた。この両分はさらにＳＤＳを含
むポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一性を確めた。

次に本発明酵素の力価の測定法および性質などについて
述べる。

（１）力価の測定法 少量のジオキサンに溶解した０、４ｍＨＳＤＳを含有す
る２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）溶液
４ｄ中に本発明酵素溶液０．４７を含む反応液ヲ３０℃
に保温し、２９０ｒＩｒ！Ｒにおける吸光度の増加を測
定する。

酵素活性は１分間に０．０１の吸光度増加を１単位とす
る。

（２）本酵素はシリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテルに作用して、２．６−シメトキシフエノール を生成する。

（３）シリンガ酸に作用して、カルボキシル基の脱離反
応が起こり、２，６−ジメｊ・キシ−ｐ−ベンゾキノン
、並びにシリンガ酸のフェノール性水酸基の脱水素反応
に伴うラジカルを生成し、引続きラジカル重合による６
−メドキシー４−　（２’　、６’　　−ジメトキシ−
４′　−カルボキシフェノキシ）ベンゾキノン（１，２
）を生成する。

（４）シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテ
ルに対して作用するが、シリンギルグリセロール−β−
シリンギルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメト
キシル基になった化合物に対しては作用しない。

（５）至適ｐＨ ５０ａＨＦｉ￥酸緩衝液（ｐＨ３〜５．５）　、５０１
Ｍリン酸ＰＩ衝液（ＤＩ１５〜９　）　、５０１ＲＨＴ
ｒｉｓ−ＨＮ　Ｏ３緩衝液（ｐＨ８〜９）を用いて本発
明酵素に対する酵素活性を測定した結果第３図に示す通
りであってその至適ｐＨは４．０〜５，０付近と認めら
れる。

（６）　ｐＨ安定性 ５ｈ＋Ｈ酢酸緩衝液（Ｄｔ１３〜５．５＞　、５０ｍＨ
リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９　）　、５０ＩＲ１丁とｉ′
ダーＨＩ１１／Ｑ３緩衝液（ｐ１１８〜９）中に本発明
酵素を５０’Ｃで３０分間放置し酵素活性を測定した。

その結果は第４図に示す通りであってそのｐｌ＋安定性
はＤ１１６〜９付近である。

（γ）至適温度 温度条件を変えて酵素反応を行ない本発明酵素の活性を
測定した結果、第５図に示す通りであってその至適温度
は５０℃付近と認められる。

（８）熱安定性 ５０ｍＨリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中、３０〜７０℃
の各温度で本発明酵素を１０分間放置し酵素活性を測定
した。

その結果は第６図に示す通りであってその熱安定性にお
いて本発明酵素は５０℃まで安定である。

（９）種々の物質の影響 種々の物質を添加して本発明酵素の酵素活性を測定した
結果は次の通りである。なお添加温度は１＋Ｈである。

（１０）　分　　子　　徹 約６３，０００±５，０００　（５Ｏ８−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（分子「マーカー：［にＢ社製、
分子量範囲１２，３００〜７８．０００　）にて測定）
（１１）等電点は３．５付近である（アンホラインを用
いる等電点電気泳動法により測定） （１２）本酵素は銅含有窒素であり、水溶液は深青色を
呈する。

（１３）本ＷＩ素の作用には酸素を必要とする。

〔実　＃１２〕 実験１のＣ，ヒルスツエＩＦＯ４９１７の代りにアラゲ
カワラタケ（Ｃ，ヒルスツエ１Ｆ０４９２Ｇ　）を用い
て、実験１と同じ条件で酵素液をｓｇｌ製した。得られ
た酵素は実験１の場合と同じ性質を示した。

ダグラスファーのチップを常法によりクラフト蒸解し、
蒸解度（カッパ価）３０の未漂白パルプを得、該パルプ
を多段漂白（ＣＥＨＥＤ）　Ｌ、、白色度８１ポイント
の漂白パルプを得た。塩素処理後の第一次アルカリ抽出
液を５Ｎｌｉｌｌ酸でｐ］１５に調製し、このｗ４製液
１０ＩＩ１１に本発明で得た酵素液１−を加えて３７℃
で５時間反応を行なった後、２ｄをセファデックスＧ　
−５０（径２４Ｘ　２５０ｊｗ）のカラムにのせ、蒸留
水で溶出した。コントロールとして酵素液の代わりに水
を加えたものを同様に行なうと、・第７図に示す通り、
酵素処理により分子量約１　、０００〜５．０００のリ
グニンが低分子化している。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素反応液のガスクロマトグラム、第２図はビ
ークエのマススペクトルであり、第３図は至適ｐＨ、第
４図はｐＨ安定性、第５図は至適温度第６図は熱安定性
を示すグラフである。第７図は本発明の酵素をパルプ漂
白廃水に適用した場合のゲル濾過曲線のグラフである。 、／−／ Ｈ ミ 年＝ボぐ 纂５凹 本６１２Ｉ 手　　続　　補　　正　　書 特許庁長官　　宇　買　道　部　　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許［１６０２７ａ号 ２、発明の名称 リグニン分解酵素およびその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名称王子製紙株式会社 ４、代理人 説明Ｊの欄 （別紙） １、特許請求の範囲を次のように補正する。 「【特許請求の範囲１ １、微生物から生産され、下記性質を有するリグニン分
解酵素 （１）作用 （ｉ）　　シリンキルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに作用して、２．６−シメトキシフエノールを生
成する。 （ｉｉ）　　化学パルプ製造の多段漂白工程からの排液
中に含まれるリグニンを低分子化する。 （２）基質特異性 シリンギルグリセロール− テルに対して作用するが、シリンギルグリセロール−β
−シリンギルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメ
トキシル基になった化合物に対しては作用しない。 （３）　　至適ｐＨお上りｐＨ安定性 ｐＨ４．５〜５．０付近が至適であり、安定ｐＨは６．
０〜９．０である。 （４）至適温度および熱安定性 ６０　℃付近が至適温度であり、５０℃までの熱に安定
である。 （５）　　等電点は３．５付近である。 （６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を呈
する。 （７）本酵素の作用には酸素を必要とする。 ２、カワラタケ属に属するリグニン分解酵素生産菌を培
地に培養し、培養物から該リグニン分解酵素を採取する
ことをａｍとするリグニン分解酵素の製造方法、」 ２、　明細ｆ第６ベーノ下がら第２行、末社及び第７ベ
ージｔｔＳ１行の「ヒルスツエ」を「ヒルスタス」と補
正する。 ３、　同第６ベーノ末行ｒｈｉｒｓｕＬｕｅＪをｊｈｉ
ｒｓｕＬｕｓＪと補正する。 ４、　同第８ページ第１２行「５０℃」を「６０℃」と
補正する。 ５、　同第９ベーノ第７行ｒＴＬＣＪを「ＴＬｃ、Ｊと
補正する。 ６、　同第１１ベーノｔｉＳ９行「芳香各」を「芳香核
」と補正する。 ？、　　同第１５ベーノ第１１行「ヒルスツエ」を「ヒ
ルスタス」と、又ｒｌ＋１ｒｓｕｔｕｅＪをｊｌ＋１ｒ
ｓｕｔｕｓＪとそれぞれ補正する。 ８、　同第１５ベーノ第７行［ＵＭ−１０Ｊを「ＰＭ−
１０Ｊと補正する。 ９、　同第１６ペーノ第１行［５ＤｓＪをｒｓＯ８Ｊと
補正する。 １０、　　同第１８ページ第６行「５０°Ｃ」を「６０
℃」と補正する。 １１、　同第２０ページ第１１行及び第１２行「ヒルス
ツエ」をそれぞれ「ヒルスタス」と補正する。 以　　　　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物から生産され、下記性質を有するリグニン分
   解酵素 （１）作用 （ｉ）シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテ
   ルに作用して、２，６−ジメトキ シフェノールを生成する。 （ｉｉ）化学パルプ製造の多段漂白工程からの排液中に
   含まれるリグニンを低分子化する。 （２）基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギル エーテルに対して作用するが、シリンギルグリセロール
   −β−シリンギルエーテルの４位のフェノール性水酸基
   がメトキシル基になった化合物に対しては作用しない。 （３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ４．５〜５．０付近が至適であり、安定ｐＨは６．
   ０〜９．０である。 （４）至適温度熱安定性 ５０℃付近が至適であり、５０℃までの熱に安定である
   。 （５）等電点は３．５付近である。 （６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を呈
   する。 （７）本酵素の作用には酸素を必要とする。 ２、カワラタケ属に属するリグニン分解酵素生産菌を培
   地に培養し、培養物から該リグニン分解酵素を採取する
   ことを特徴とするリグニン分解酵素の製造方法。