JPS6192568A - フエノ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なフェノールオキシダーゼオ６よびその製
造方法に関するものである。本発明のコチ素はリグニン
に作用して５、これを低分子化または分解する性質を有
するため、木材等のりグノセルロ−ス材料を原料とする
紙パルプ製造工程における種々の工程で利用できる。す
なわちパルプ化工程、パルプ漂白工程、排水処理工程等
におけるリグニ・　ンの低分子化または分解を行わせる
ことに利用できる。さらに木材の糖化において、糖化の
前段の処理としてリグニンを分解することによって、セ
ルラーセ作用を高めるといういわゆるセルロース系バイ
オマス利用の分野にも適用でき為。

〔従来技術〕

木材等のリグノセルロース物質に白色腐朽菌を接種、培
養することによってリグニンを分解し、セルロースパル
プを製造する試みがなされているＣ特開昭５０−’４６
９０３号公報参照）。しかし、この方法の白色腐朽菌は
共存する炭水化物をも分解してしまい、またセルラーゼ
欠損変異株を用いた場合には、本来のリグニン分解力が
弱まってしまうこと等の問題点があり、実用化されるに
至っていない。

一方、このような問題点を解決するため、白色腐朽菌の
リグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作用させ、
リグニンのみを選択的に分解させようとする試みがなさ
れている（サイエンス第２２１巻、第６６１〜第６６２
頁、１９８３年１２月）。この報告は、主としてリグニ
ンモデル化合物を基質としたものであるが、世界で最初
にリグニン分解酵素を単離、精製したものである。

この酵素はファネロケーテ・クリソススポリウム（Ｐｈ
ａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ
）が生産する菌体外酵素であり、主な特徴は鉄含有酵素
であること、分子量が４２，０００であること、酵素作
用に過酸化水素が必要であること、リグニンモデル化合
物の４位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった
化合物に対して作用することが確認されていること等で
ある。

さらに、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎ
ｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が
生産する菌体外酵素としては、２つの酵素が報告されて
いる（フエデレーション・オブ・ヨーロピアン　バイオ
ケミカル　ンサイエテーズ　レターズ　第１６９巻、第
２号第２４７〜第２５０頁、１９８４年）。

これらの酵素の１つは分子量が４１，０００以下である
こと、もう１つの酵素は分子量が４６，０００以下であ
ること、さらにいずれの酵素も鉄含有酵素であると推定
されていること、酵素作用に過酸化水素が必要であるこ
と、リグニンモデル化合物の４位のフェノール性水酸基
がエトキシル基になった化合物に対して作用することが
確認されていること等である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明が解決しようとする問題点は白色腐朽菌をリグノ
セルロース物質に作用させるときに生ずるリグニンの分
解の他に共存する炭水化物の分解を起こすというような
問題点の解決であり、従来公知のりゲニン分解酵素の酵
素作用には過酸化水素が必要であり、工業的適用におい
てはコスト高となる問題点があった。

〔本発明の目的〕

本発明の目的は新規なフェノールオキシダーゼおよびそ
の製造方法を提供することであり、他の目的は主として
クリソセルロース物質中のりゲニンを低分子化または分
解する新規酵素およびその製造方法を提供することであ
る。また他の目的は過酸化水素依存性のない新規酵素お
よびその製造方法を提案することである。また別の他の
目的は以下の記載から明らかになるであろう。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は新規なフェノールオキシダーゼおよびその製造
方法に関するものである。

リグニ／は木材腐朽菌と呼ばれる担子菌によって良（分
解されることが知られている。しかしながら、高分子化
合物であるリグニンの化学構造は複雑であり、現在でも
その化学構造が決定されていないという阻害もあって、
リグニン分解酵素に関する知見は非常に少ないのが実情
である。

本発明者らは、摩砕リグニン（ＭＷＬ）およびリグニン
２モデル化合物を基質として鋭意研究の結果、微生物を
°増殖させ、その培養物から得た菌体外粗酵素を、硫安
分画、ゲル濾過、イオン交換体等を使用し、高度に精製
して標品を得て、本発明に到達した。

すなわち、本発明は微生物から生産され、下記性質を有
する新規なフェノールオキシダーゼである。

（１）作用 （ｉ）　　シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに作用して、２．６−シメトキシフエノールを生
成する。

（ｉｉ）　　グアイアコールに作用して、４２０ｎｍ付
近に最大吸収を有する着色物質を生成する。

（２）基質特異性 ７リンギルグリセロールーβ−アリルエーテルに対して
作用するが、シリンギルグリセロール−β−アリルエー
テルの４位のフェノール性水酸基がメトキシル基になっ
た化合物に対して作用しない。

（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ４，０〜５．５付近で、グアイアコールヲ着色物質
に変化させる作用が至適であり、その安定ｐＨは３．０
〜９．０である。

（４）至適温度および熱安定性５０’Ｃ付近でグアイア
コールを着色物質に変化させる作用が至適であり、５０
℃までの熱に安定である。

（５）等電点は３．５付近である。

（６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を呈
する。

（力　本酵素の作用には酸素を必要とする。

また本発明はカワラタケ属に属するフェノールオキシダ
ーゼ生産菌を培地に培養し、培養物から該フェノールオ
キシダーゼを採取することを特徴とするフェノールオキ
／ダーゼの製造方法に存する。

次に本酵素の作用機序を確認するために、リグニンモデ
ル化合物としてシリンギルグリセロール−β−シリ／ギ
ルエーテル（以下ＳＯ８と称する）を用いて試験を行な
った。

少量のジオキサンを含有する２０ｍＭ　　リン酸緩衝液
（ｐＨ４，ｏ　）　Ｋ　ＳＯ３を溶解し、１７０　ｍＭ
としたＳＯ８溶液２０ｍｇに実施例１で得た本発明の酵
素溶液４ｍｌを無菌的に加え、２５℃で３０秒間、８時
間反応させた。

得られた酵素反応液をＴＬＣ、ガスクロマトグラフィー
、マススはクトルグラフイーで分析した。

■　ＴＬＣ分析 酵素添加後３０秒でＳＯ８・のスポットが消滅しており
ＳＯ８は速やかに分解される。

■　ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルグラ
フィー亦析 ＳＯ８と本発明酵素を８時間反応させた酵素反応液をガ
スクロマトグラフィーにて分析したところ第１図に示す
ようなピークが認められ、マススペクトルよりピークエ
は２．６−シメトキシフエノールであることが判明した
（第２図）。

以上の結果より、本発明の酵素によりシリンギルクリセ
ロ−ルーβ−シリンギルニー　テルハβ−アリルエーテ
ル結合が切断されることが確認された。

なおＳＯ８のフェノール性水酸基をメトキシル基に変え
た基質に対しては本発明の酵素は全く作用を示さない。

このことより本発明の酵素はフェノール性水酸基を有す
る基質に対して特異的洸作用するものと考えられる。

これらの点より、本発明酵素が天然リグニンに作用する
機構は次のように考えられる。

リグニンのフェノール性水酸基を有する骨格に対して本
発明酵素が特異的に作用しβ−アリルエーテル結合を切
断する。その結果２．６−シメトキシフエノールに相当
する構造を有しその４位に更にリグニン基本骨格が結合
したフェノール性水酸基を有する化合物が生成する。こ
のようにβ−アリルエーテル結合の切断により新たにフ
ェノール性水酸基が生成するためリグニンは本発明酵素
により引き続き分解を受は反応が進行する。

なお、天然リグニン中ではβ−アリルエーテル結合が約
５０％存在することから、本発明酵素がβ−アリルエー
テル結合を切断することは天然リグニンの分解において
極めて意義がある。

本発明酵素を主要成分とする実施例１（後出）で得た精
製酵素液をブナ摩砕木粉に３５℃で３日間反応させたと
ころ、リグニン中の遊離フェノール単位の約６０％が分
解しており、全芳香核の約１３％が芳香性を失なうよう
な変化（分解）を受け、アルキル−アリルエーテル結合
も１０％程度開裂していた。

本発明酵素は反応に際し、酸素を必要とするが、反応は
大気中より純酸素雰囲気中の方が望ましく振とり、攪拌
することにより酵素反応速度を更に高めることができる
。

本発明の酵素を生産する微生物は特にカワラタケ属に属
するフェノールオキシダーゼ生産菌が好ましいが同様の
白色腐朽菌であればいかなるものであってもよい。

カワラタケ属に属するフェノールオキシダーゼ生産菌と
しては、たとえばコリオラス・ヴエルシカラ−（Ｃｏｒ
ｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）　工Ｆ’０　３０
３４０゜ｌＰＯ３７５４などが挙げられるが、本発明は
明細書に例示される微生物に限定されるものではない。

上記菌体の培養形態は、液体培養、固体培養のいずれで
あっても良い。培地の栄養源としては、微生物の培養に
通常用いられているものが広く使用することができる。

炭素源としては同化可能な炭素源であれば良く、例えば
木粉、グルコース、シュークロス、ラクトース、糖蜜な
どが使用される。

特にリグノセルロース成分からなる木粉培地で培養する
と本発明のフェノールオキ／ダーゼを純度高く生産する
ことができるため有利である。窒素源としては利用可能
な窒素化合物であれば良く、例エバペプトン、肉エキス
、大豆粉、カゼイン加水分解物などが用いられる。その
他、リン酸塩、硫酸、塩、マグネシウム、カルシウム、
カリウム、ナトリウム、銅、マンガン、亜鉛などの塩類
が必要に応じて使用される、特に本酵素は銅含有酵素で
あり、銅塩の添加は有効である。培養温度は菌カ発育し
、該フェノールオキシダーゼを生産する範囲内で適宜変
更し得るが、好ましくは２３〜２７℃程度が良く、また
培養時間は条件によって異なるが、液体培養では５〜１
０日間、固体培養は１〜３ケ月程度である。次いで、こ
のようにして得られた培養物からフェノールオキシダー
ゼを採取するのであるが、本酵素は主として菌体外に分
泌されるので、本酵素を採取するには、液体培養におい
ては菌体を遠心分離等で除去した培養Ｐ液、また固体培
養においては培養物から抽出した抽出液を用いて、酵素
含有溶液を濃縮するか、または濃縮することなく可溶性
塩類、例えば硫安などを用いて塩析せしめるかピ、親水
性溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、イ
ンプロパツールなどの添加により本酵素を沈澱せしめれ
ば良い。次いで、この沈澱物は水または緩衝液に溶解し
、半透膜にて透析せしめて低分子量の不純物を除去する
ことができる。また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによ
るクロマトグラフィーによりフェノールオキシダーゼを
精製する。さらにこれらの手段により得られた酵素溶液
は減圧濃縮、限外濾過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処
理により精製されフェノールオキシダーゼを得る。

以下本発明を実施例によって説明するが、本発明は必ず
しも実施例に限定されるものではない。

実施例１′ グルコース３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１５
％、Ｍｇ５ｏ、、・７Ｈ２００，０５％、塩酸チアミン
０．０００２％、ＣｕＳＯ４’　５Ｈ２００，００１６
％を含有する培地（ｐＨ５，０）５　ｅを１０ｅ容ジヤ
ー７フーメ７ターに入れ、１２０℃、２０分間加熱殺菌
した後、カワラタケ（コリオラス・ヴエルシカラー（Ｃ
ｏｒ　１ｏｌｕｓＶｅｒ３ｉｃｏｌｏｒ　）　Ｆ’ＥＳ
　　１０３０　（Ｋ、Ａｏｓｈｉｍａ　；　Ｐｓ−４ａ
　）、ＩＦ’０３０３４０）を接種し２８℃、８日間、
１５０ｒｐｍ（′４ｉ拌速度）。５１／分（通気量）ノ
条件下で培養を行なった。

培養終了後、遠心分離して得た培養Ｐｉを０．９飽和硫
安にて塩析後、透析し粗酵素液を得た。

次にこの粗酵素液についてセファデックスＧ−５０を用
いたカラムクロマトグラフィーを行ない（カラム：　５
−７　Ｘ　８４ｃｒｒＬ、溶出：ｅ、：蒸留水、流速：
９０ｍ１／ｈｒ１１）２クション：１５ｍｆり、活性画
分を回収し、限Ｒ濾過後、１００ｍＭＩＪン酸−クエン
酸緩衝液（１）Ｈ６，０）　で緩衝化したＤＥＡＦ−セ
ファデックスＡ−２５カラム（カラム：２．６ｘｔ４ｃ
ｍ）に通して酵素を吸着せしめた後ｐＨ４，０の１００
ｍＭ　　リン酸クエン酸緩衝液を用いて溶出せしめた。

限外ｐ過にて濃縮後蛋白質をその等電点に従って分離す
るカラムクロマトグラフィー法であるクロマトフオーカ
シング（カラム：１×２０ｃｍ、ゲル：　ＰＢＥ　９４
開始バッファー：２５ｍＭピペラジン−ＨＣｄ溶出液：
ポリバツファ−７４（ｐＨろＯ）、流速：　１０ｍｅ／
ｈｒ、１フラクション：１　ｍｌ；　）　ＫでｐＨ４，
５〜３．０のｐＨ勾配を用いて溶出せしめ濃縮した。

次に高速液体クロマトグラフィー（カラム商品名５ｈｏ
ｄｃｘ　ＯＨｐａｋ　Ｂ−２００３昭和電工製、溶出液
１００ｍＭリン＆２００ｍＭ食塩緩衝１ｆｆｌｐＨ７，
０、目時井 流速４ｍ／！／ｍｉｎ、室温ル行ない活性画分を回収し
、１０ｍＡ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で緩衝化したＤＥ
ＡＥトヨパール６５０−Ｍ　　カラム（ＩＸ３０ｃｍ）
に通して酵素を吸着せしめた後、Ｃ〜３００　ｍＭ食塩
のイオン強度勾配を用いて溶出せしめ（流速１０ｍｅ／
ｈｒ、　１フラクシヨン１ｍｇ）、活性画分ヲ得た。こ
の活性画分を５０ｍＭ　ト’Ｊス・塩酸−１００ｍＭ食
塩緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したセファクリルＳ−
２００カラム（カラム２．２Ｘ９０ｃＩｎ、流速１５ｍ
ｌ／ｈ　ｒ、１フラクション１．５ｍｅ）に通し精製酵
素を得た。

次に本発明酵素の力価の測定法および性質などについて
述べる。

（１）　　力価の測定法 ５０ｍＭ酢酸緩衝Ｈ緩衝ｐＨ４，３）　　を用いて調装
した１ｍＭグアイアコール溶液３．５　ｍｌｉから成る
反応液に本発明酵素２００１Ｌｅを６７°Ｃで反応させ
吸光度４２０ｎｍにおける吸光度の増加を測定する。

酵素活性は１分間に０．０１の吸光度増加を１単位とす
る。

（２）　　木酢Ｘはシリンギルグリセロール−β−シリ
ンギルエーテルに作用して、２．６−シメトキシフエノ
ール （３）　　シリンガ酸に作用して、カルボキシル基の脱
離反応が起こり、２，６−ジメトキシ−ｐ−ベンゾキノ
ン、並びにシリンガ酸のフェノール性水酸菟の脱水素反
応に伴うラジカルを生成し、引続きラジカル重合による
６−メドキシー４−　（２’、６’−ジメトキ７−４′
−カルボキシフェノキシ）ベンゾキノン（１，２）を生
成する。

（４）　　グアイアコールに作用して、４２０ｎｍ付近
に最大吸収を有する着色物質を生成する。

（５）　　シリンギルグリセロール−β−アリルエーテ
ルに対して作用するが、シリンギルグリセロール−β−
アリルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメトキシ
ル基になった化合物に対しては作用しない。

（６）至適ｐＨ ５０ｍＭ酢酸緩衝Ｕ　（ｐＨ’　３〜５．５　）、５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）、５０ｍＭ　グリシン
緩衝液（ｐＨ８〜１１）を用いて本発明酵素に対する酵
素活性を測定した結果第３図に示す通りであってその至
適ｐＨは４〜５，５付近と認められる。

（力　ｐＨ安定性 ５０　ｍＭ酢ν緩衝液（ｐＨ３〜５．５）、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）５０ｍＭグリシン緩衝＠　（
ｐＨ８〜１１）中に本発明酵素を５０℃で３０分間放置
し酵素活性を測定した。

その結果は第４図に示す通りであってそのｐＨ安定性は
ｐＨ７〜８付近である。

（８）至適温度 温度条件を変えて酵素反応を行ない本発明酵素の活性を
測定した結果、第５図に示す通りであってその至適温度
は５０°Ｃ付近と認められる。

（９）熱安定性 ５０　ｍＭ　リン酸緩衝ａ（ｐＨ７，０）　中、３０〜
７０℃の各温度で本発明酵素を１０分間放置し酵素活性
を測定した。

その結果は第６図に示す通りであってその熱安定性にお
いて本発明酵素は５０°Ｃまで安定である。

ＱＯ）　　種々の物質の影響 種々の物質を添加して本発明酵素の酵素活性を測定した
結果は次の通りである。なお添加濃度は１ｍＭである。

００　分子景は約５５０００±５０００である。（島速
液体りロ叫グラフィー（カラム商品名ＴＳＫ””−３０
００ＳＷ東洋ソーダ製）による〕Ｈ等電点は３．５付近
である（セルパライトを用いる電気泳動法により測定） ０３）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を呈
する。

０４）本酵素の作用には酸素を必要とする。

【図面の簡単な説明】

３図は至適ｐＨ１第４図はｐＨ安定性、第５図は至適温
度、第６図は熱安定性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物から生産され、下記性質を有するフェノール
   オキシダーゼ （１）作用 （ｉ）シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテ
   ルに作用して、２，６−ジメトキシフェノールを生成す
   る。 （ｉｉ）グアイアコールに作用して、４２０ｎｍ付近に
   最大吸収を有する着色物質を生成す る。 （２）基質特異性 シリンギルグリセロール−β−アリルエー テルに対して作用するが、シリンギルグリセロール−β
   −アリルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメトキ
   シル基になつた化合物に対しては作用しない。 （３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ４．０〜５．５付近で、グアイアコールを着色物質
   に変化させる作用が至適であり、その安定ｐＨは３．０
   〜９．０である。 （４）至適温度および熱安定性。 ５０℃付近でグアイアコールを着色物質に変化させる作
   用が至適であり、５０℃までの熱に安定である。 （５）等電点は３．５付近である。 （６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を呈
   する。 （７）本酵素の作用には酸素を必要とする。 ２、カワラタケ属に属するフェノールオキシダーゼ生産
   菌を培地に培養し、培養物から該フェノールオキシダー
   ゼを採取することを特徴とするフェノールオキシダーゼ
   の製造方法。