JPH0352958B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なフエノールオキシダーゼおよび
その製造方法に関するものである。本発明の酵素
はリグニンに作用して、これを低分子化または分
解する性質を有するため、木材等のリグノセルロ
ース材を原料とする紙パルプ製造工程における
種々の工程で利用できる。すなわちパルプ化工
程、パルプ漂白工程、排水処理工程等におけるリ
グニンの低分子化または分解を行わせることに利
用できる。さらに木材の糖化において、糖化の前
段の処理としてリグニンを分解することによつ
て、セルラーゼ作用を高めるといういわゆるセル
ロース系バイオマス利用の分野にも適用できる。 〔従来技術〕 木材等のリグノセルロース物質に白色腐朽菌を
接種、培養することによつてリグニンを分解し、
セルロースパルプを製造する試みがなされている
（特開昭50−46903号公報参照）。しかし、この方
法の白色腐朽菌は共存する炭水化物をも分解して
しまい、またセルラーゼ欠損変異株を用いた場合
には、本来のリグニン分解力が弱まつてしまうこ
と等の問題点があり、実用化されるに至つていな
い。 一方、このような問題点を解決するため、白色
腐朽菌のリグニン分解酵素をリグノセルロース物
質に作用させ、リグニンのみを選択的に分解させ
ようとする試みがなされている（サイエンス第
221巻、第661〜第662頁、1983年12月）。この報告
は、主としてリグニンモデル化合物を基質とした
ものであるが、世界で最初にリグニング分解酵素
を単離、精製したものである。この酵素はフアネ
ロケーテ・クリソススポリウム（Phanerochaete
chrysosporium）が生産する菌体外酵素であり、
主な特徴は鉄含有酵素であること、分子量が
42000であること、酵素作用に過酸化水素が必要
であること、リグニンモデル化合物の４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物に
対して作用することが確認されていること等であ
る。 さらに、フアネロケーテ・クリソスポリウム
（Phanerochaete chrysosporium）が生産する菌
体外酵素としては、２つの酵素が報告されている
（フエデレーシヨン・オブ・ヨーロピアン バイ
オケミカル ソサイエテーズ レターズ第169巻、
第２号第247〜第250頁、1984年）。これらの酵素
の１つは分子量が41000以下であること、もう１
つの酵素は分子量が46000以下であること、さら
にいずれの酵素も鉄含有酵素であると推定されて
いること、酵素作用に過酸化水素が必要であるこ
と、リグニンモデル化合物の４位のフエノール性
水酸基がエトキシル基になつた化合物に対して作
用することが確認されていること等である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明が解決しようとする問題点は白色腐朽菌
をリグノセルロース物質に作用させるときに生ず
るリグニンの分解の他に共存する炭水化物の分解
を起こすというような問題点の解決であり、従来
公知のリグニン分解酵素の酵素作用には過酸化水
素が必要であり、工業的適用においてはコスト高
となる問題点があつた。 〔本発明の目的〕 本発明の目的は新規なフエノールオキシダーゼ
およびその製造方法を提供することであり、他の
目的は主としてグリノセルロース物質中のリグニ
ンを低分子化または分解する新規酵素およびその
製造方法を提供することである。また他の目的は
過酸化水素依存性のない新規酵素およびその製造
方法を提案することである。また別の他の目的は
以下の記載から明らかになるであろう。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は新規なフエノールオキシダーゼおよび
その製造方法に関するものである。 リグニンは木材腐朽菌と呼ばれる担子菌によつ
て良く分解されることが知られている。しかしな
がら、高分子化合物であるリグニンの化学構造は
複雑であり、現在でもその化学構造が決定されて
いないという障害もあつて、リグニン分解酵素に
関する知見は非常に少ないのが実情である。 本発明者らは、摩砕リグニン（MWL）および
リグニンモデル化合物を基質として鋭意研究の結
果、微生物を増殖させ、その培養物から得た菌体
外粗酵素を、硫安分画、ゲル過、イオン交換体
等を使用し、高度に精製して標品を得て、本発明
に到達した。 すなわち、本発明は微生物から生産され、下記
性質を有する新規なフエノールオキシダーゼであ
る。 (1) 作用 () シリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテルに作用して、２，６−ジメトキシ
フエノールを生成する。 () グアイアコールに作用して、420nｍ付近
に最大吸収を有する着色物質を生成する。 (2) 基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
に対しては作用しない。 (3) 至適PHおよびPH安定性 PH4.0〜5.5付近で、グアイアコールを着色物
質に変化させる作用が至適であり、その安定PH
は3.0〜9.0である。 (4) 至適温度および熱安定性50℃付近でグアイア
コールを着色物質に変化させる作用が至適であ
り、50℃までの熱に安定である。 (5) 等電点は3.5付近である。 (6) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶性は深青色
を呈する。 (7) 本酵素の作用には酸素を必要とする。 また本発明はカワラタケ属に属するフエノール
オキシダーゼ生産菌を倍地に培養し、培養物から
該フエノールオキシダーゼを採取することを特徴
とするフエーノールオキシダーゼの製造方法に存
する。 次に本酵素の作用機序を確認するために、リグ
ニンモデル化合物としてシリンギルグリセロール
−β−シリンギルエーテル（以下SOSと称する）
を用いて試験を行なつた。 少量のジオキサンを含有する20ｍＭリン酸緩衝
液（PH4.0）にSOSを溶解し、170ｍＭとしたSOS
溶液mlに実施例１で得た本発明の酵素溶液４mlを
無菌的に加え、25℃で30秒間、８時間反応させ
た。 得られた酵素反応液をTLCガスクロマトグラ
フイー、マススペクトルグラフイーで分析した。 TLC分析 酵素添加後30秒でSOSのスポツトが消滅して
おりSOSは速やかに分解される。 ガスクロマトグラフイーおよびマススペクト
ルグラフイー分析 SOSと本発明酵素を８時間反応させた酵素反応
液をガスクロマトグラフイーにて分析したところ
第１図に示すようなピークが認められ、マススペ
クトルによりピークは２，６−ジメトキシフエ
ノールであることが判明した（第２図）。 以上の結果より、本発明の酵素によりシリンギ
ルグリセロール−β−シリンギルエーテルはβ−
アリルエーテル結合が切断されることが確認され
た。 なおSOSのフエーノル性水酸基をメトキシル基
に変えた基質に対しては本発明の酵素は全く作用
を示さない。このことより本発明の酵素はフエノ
ール性水酸基を有する基質に対して特異的に作用
するものと考えられる。 これらの点より、本発明酵素が天然リグニンに
作用する機構は次のように考えられる。 リグニンのフエノール性水酸基を有する骨格に
対して本発明酵素が特異的に作用しβ−アリルエ
ーテル結合を切断する。その結果２，６−ジメト
キシフエノールに相当する構造を有しその４位に
更にリグニン基本骨格が結合したフエノール性水
酸基を有する化合物が生成する。このようにβ−
アリルエーテル結合の切断により新たにフエノー
ル性水酸基が生成するためリグニンは本発明酵素
により引き続き分解を受け反応が進行する。 なお、天然リグニン中ではβ−アリルエーテル
結合が約50％存在することから、本発明酵素がβ
−アリルエーテル結合を切断することは天然リグ
ニンの分解において極めて意義がある。 本発明酵素を主要成分とする実施例１（後出）
で得た精製酵素液をブナ摩砕木粉に35℃で３日間
反応させたところ、リグニン中の遊離フエノール
単位の約60％が分解しており、全芳香核の約13％
が芳香性を失なうような変化（分解）を受け、ア
ルキル−アリルエーテル結合も10％程度開裂して
いた。 本発明酵素は反応に際し、酵素を必要とする
が、反応は大気中より純酸素雰囲気中の方が望ま
しく振とう、撹拌することにより酵素反応速度を
更に高めることができる。 本発明の酵素を生産する微生物は特にカワラタ
ケ属に属するフエノールオキシダーゼ生産菌が好
ましいが同様の白色腐朽菌であればいかなるもの
であつてもよい。 カワラタケ属に属するフエノールオキシダーゼ
生産菌としては、たとえばコリオラス・ヴエルシ
カラー（Coriolus versicolor）IFO30340、
IFO8754などが挙げられるが、本発明は明細書に
例示される微生物に限定されるものではない。上
記菌体の培養形態は、液体培養、固体培養のいず
れであつても良い。倍地の栄養源としては、微生
物の培養に通常用いられているものが広く使用す
ることができる。炭素源としては同化可能な炭素
源であれば良く、例えば木粉、グルコース、シユ
ークロス、ラクトース、糖蜜などが使用される。
特にリグノセルロース成分からなる木粉培地で培
養すると本発明のフエノールオキシダーゼを純度
高く生産することができるため有利である。窒素
源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、
例えばペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加
水分解物などが用いられる。その他、リン酸塩、
硫酸、塩、マグネシウム、カルシウム、カリウ
ム、ナトリウム、銅、マンガン、亜鉛などの塩類
が必要に応じて使用される、特に本酵素は銅含有
酵素であり、銅塩の添加は有効である。培養温度
は菌が発育し、該フエノールオキジダーゼを生産
する範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは23〜
27℃程度が良く、また培養時間は条件によつて異
なるが、液体培養では５〜10日間、固体培養は１
〜３ケ月程度である。次いで、このようにして得
られた培養物からフエノールオキシダーゼを採取
するのであるが、本酵素は主として菌体外に分泌
されるので、本酵素を採取するには、液体培養に
おいては菌体を遠心分離等で除去した培養液、
また固体培養においては培養物から抽出した抽出
液を用いて、酸素含有溶液を濃縮するか、または
濃縮することなく可溶性塩類、例えば硫安などを
用いて塩析せしめるか、親水性溶媒、例えばメタ
ノール、エタノール、アセトン、イソプロパノー
ルなどの添加により本酵素を沈澱せしめれば良
い。次いで、この沈澱物は水または緩衝液に溶解
し、半透明にて透析せしめて低分子量の不純物を
除去することができる。また吸着剤あるいはゲル
過剤などによるクロマトグラフイーによりフエ
ノールオキシダーゼを精製する。さらにこれらの
手段により得られた酵素溶液は減圧濃縮、限外
過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により精製
されフエノールオキシダーゼを得る。 以下本発明を実施例によつて説明するが、本発
明は必ずしも実施例に限定されるものではない。 実施例 １ グルコース３％、ペプトン１％、KH₂PO₄0.15
％、MgSO₄・SH₂O0.05％、塩酸チアミン0.0002
％、CuSO₄・5H₂O0.0016％を含有する培地（PH
5.0）５を10容ジヤーフアーメンターに入れ、
120℃、20分間加熱殺菌した後、カワラタケ｛コ
リオラス・ヴエルシカラー（Coriolus
Versicolor）FES 1030（K.Aoshima；Ps−4a）、
IFO30340｝を接種し28℃、８日間、150rpm（撹
拌速度）。５／分（通気量）の条件下で培養を
行なつた。 培養終了後、遠心分離して得た培養液を0.9
飽和硫安にて塩析後、透析し粗酵素液を得た。 次のこの粗酵素液についてセフアデツクスＧ−
50を用いたカラムクロマトグラフイーを行ない
（カラム：5.7×84cm、溶出液：蒸留水、流速：90
ml／hr、１フラクシヨン：16ml）、活性画分を回
収し、限外過後、100ｍＭリン酸−クエン酸緩
衝液（PH6.0）で緩衝化したDEAE−セフアデツ
クスＡ−25カラム（カラム：2.6×14cm）に通し
て酵素を吸着せしめた後PH4.0の100ｍＭリン酸ク
エン酸緩衝液を用いて溶出せしめた。限外過に
て濃縮後蛋白質をその等電点に従つて分離するカ
ラムクロマトグラフイー法であるクロマトフオー
カシング（カラム：１×20cm、ゲル：PBE94開
始バツフアー：25ｍＭピペラジン−HCl溶出液：
ポリバツフアー74（PH3.0）、流速：10ml／hr、１
フラクシヨン：１ml）にてPH4.5〜3.0のPH勾配を
用いて溶出せしめ濃縮した。 次に高速液体クロマトグラフイー（カラム商品
名Shodex OH pakB−2003昭和電工製、溶出液
100ｍＭリン酸−200ｍＭ食塩緩衝液PH7.0、流速
４ml／min、室温）を行ない活性画分を回収し、
10ｍＡ、酢酸緩衝液（PH5.5）で緩衝したDEAE
トヨパール650−Ｍカラム（１×30cm）に通して
酵素を吸着せしめた後、Ｃ〜300ｍＭ食塩のイオ
ン強度勾配を用いて溶出せしめ（流速10ml／hr、
１フラクシヨン１ml）、活性画分を得た。この活
性画分を50ｍＭトリス・塩酸−100ｍＭ食塩緩衝
液（PH7.0）で緩衝化したセフアクリルＳ−200カ
ラム（カラム2.2×90cm、流速15ml／hr、１フラ
クシヨン1.5ml）に通し精製酵素を得た。 次に本発明酵素の力価の測定法および性質など
について述べる。 (1) 力価の測定法 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH4.0）を用いて調製し
た１ｍＭグアイアコール溶液3.5mlから成る反
応液に本発明酵素200μを37℃で反応させ吸
光度420nｍにおける吸光度の増加を測定する。 酵素活性は１分間に0.01の吸光度増加を１単
位とする。 (2) 本酵素はシリンギルグリセロール−β−シリ
ンギルエーテルに作用して、2.6−ジメトキシ
フエノール を生成する。 (3) シリンガ酸に作用して、カルボキシル基の脱
離反応が起こり、2.6−ジケトキシ−ｐ−ベン
ゾキノン、並びにシリンガ酸のフエノール性水
酸基の脱水素反応に伴うラジカルを生成し、引
続きラジカル重合による６−メトキシ−４−
（2′，6′−ジメトキシ−4′−カルボキシフエノキ
シ）ベンゾキノン（１，２）を生成する。 (4) グアイアコールに作用して、420nｍ付近に
最大吸収を有する着色物質を生成する。 (5) シリンギルグリセロール−β−アリルエーテ
ルに対して作用するが、シリンギルグリセロー
ル−β−アリルエーテルの４位のフエノール性
水酸基がメトキシル基になつた化合物に対して
は作用しない。 (6) 至適PH 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、50ｍＭリン
酸緩衝液（PH５〜９）、50ｍＭグリシン緩衝液
（PH８〜11）を用いて本発明酵素に対する酸素
活性を測定した結果第３図に示す通りであつて
その至適PHは４〜5.5付近と認められる。 (7) PH安定性 50ｍＭ酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、50ｍＭリン
酸緩衝液（PH５〜９）、50ｍＭグリシン緩衝液
（PH８〜11）中に本発明酵素を50℃で30分間放
置し酵素活性を測定した。 その結果は第４図に示す通りであつてそのPH
安定性はPH3.0〜9.0付近である。 (8) 至適温度 温度条件を変えて酵素反応を行ない本発明酵
素の活性を測定した結果、第５図に示す通りで
あつてその至適温度は50℃付近と認められる。 (9) 熱安定性 50ｍＭ酸緩衝液（PH7.0）中、30〜70℃の各
温度で本発明酵素を10分間放置し酵素活性を測
定した。 その結果は第６図に示す通りであつてその熱
安定性において本発明酵素は50℃まで安定であ
る。 (10) 種々の物質の影響 種々の物質を添加して本発明酵素の酵素活性
を測定した結果は次の通りである。なお添加濃
度は１ｍＭである。

【表】

【表】 (11) 分子量は約53000±5000である。〔高速液体
クラマトグラフイー（カラム商品名TSK −
3000SW東洋ソーダ製）による〕 (12) 等電点は3.5付近である（セルバライトを用
いる電気泳動法により測定） (13) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青
色を呈する。 (14) 本酵素の作用には酸素を必要とする。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素反応液のガスクロマトグラム、第
２図はピークと既存標品のマススペクトルであ
り、第３図は至適PH、第４図はPH安定性、第５図
は至適温度、第６図は熱安定性を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微生物から生産され、下記性質を有するフエ
   ノールオキシダーゼ (1) 作用 () シリンギルグリセロール−β−シリンギ
   ルエーテルに作用して、２，６−ジメトキシ
   フエノールを生成する。 () グアイアコールに作用して、420nｍ付近
   に最大吸収を有する着色物質を生成する。 (2) 基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
   ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
   ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
   ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
   に対しては作用しない。 (3) 至適PHおよびPH安定性 PH4.0〜5.5付近で、グアイアコールを着色物
   質に変化させる作用が至適であり、その安定PH
   は3.0〜9.0である。 (4) 至適温度および熱安定性 50℃付近でグアイアコールを着色物質に変化
   させる作用が至適であり、50℃までの熱に安定
   である。 (5) 等電点は3.5付近である。 (6) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
   を呈する。 (7) 本酵素の作用には酸素を必要とする。 ２ カワラタケ属に属するフエノールオキシダー
   ゼ生産菌を培地に培養し、培養物から下記の性質
   すなわち、 (1) 作用 () シリンギルグリセロール−β−シリンギ
   ルエーテルに作用して、２，６−ジメトキシ
   フエノールを生成する。 () グアイアコールに作用して、420nｍ付近
   に最大吸収を有する着色物質を生成する。 (2) 基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
   ーテルに対して作用するが、シリンギルグリセ
   ロール−β−シリンギルエーテルの４位のフエ
   ノール性水酸基がメトキシル基になつた化合物
   に対しては作用しない。 (3) 至適PHおよびPH安定性 PH4.0〜5.5付近で、グアイアコールを着色物
   質に変化させる作用が至適であり、その安定PH
   は3.0〜9.0である。 (4) 至適温度および熱安定性 50℃付近でグアイアコールを着色物質に変化
   させる作用が至適であり、50℃までの熱に安定
   である。 (5) 等電点は3.5付近である。 (6) 本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
   を呈する。 (7) 本酵素の作用には酸素を必要とする。 の性質を有するフエノールオキシダーゼを採取す
   ることを特徴とするフエノールオキシダーゼの製
   造方法。