JPS62220189A - リグニン分解酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なリグニン分解酵素およびその製造方法に
関するものである。本発明の酵素はリグニンに作用して
、これを低分子化または分解する性質を有するため、木
材等のリグノセルロース材料を原料とする紙パルプ製造
工程における種々の工程で利用できる。たとえば、パル
プ化工程、パルプ漂白工程、排水処理工程等におけるリ
グニンの低分子化または分解を行わせることに利用でき
る。さらに木材の糖化において、糖化の前段の処理とし
てリグニンを分解することによって、セルラーゼ作用を
高めるといういわゆるセルロース系バイオマス利用の分
野にも適用できる。

［従来の技術］ 木材等のリグノセルロース物質に白色践朽菌を接種、培
養することによってリグニンを分解し、セルロースパル
プを製造する方法が提案されている（特開昭５０−４６
９０３号公報参照）。しかし、この方法の白色腐朽菌は
共存する炭水化物をも分解してしまい、またセルラーゼ
欠損変異株を用いた場合には、本来のリグニン分解力が
弱まってしまうこと等の問題点があり、実用化されるに
至っていない。

一方、このような問題点を解決するため、白色腐朽菌の
リグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作用させ、
リグニンのみを選択的に分解させようとする試みがなさ
れている（サイエンス第２２１巻、第６６１〜第６６２
頁、１９８３年１２月）。

この酵素はファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａ
ｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）
が生産する菌体外酵素であり、主な特徴は鉄含有酵素で
あること、分子量が４２　、０００であること、酵素作
用に過酸化水素が必要であること、リグニンモデル化合
物の４位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった
化合物に対して作用することが確認されていること等で
ある。

さらに、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎ
ｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）が
生産する菌体外酵素として、２つの酵素が報告されてい
る（フエデレーション・オブ・ヨーロピアン　バイオケ
ミカル　ソサイエテーズ　レターズ　第１６９巻、第２
号第２４１〜第２５０頁、１９８４年）。これらの酵素
の１つは分子量が４１．Ｇｏｏ以下であること、もう１
つの酵素は分子量が４６．０００以下であること、さら
にいずれの酵素も鉄含有酵素であると推定されているこ
と、酵素作用に過酸化水素が必要であること、リグニン
モデル化合物の４位のフェノール性水酸基がエトキシル
基になった化合物に対して作用することが確認されてい
ること等である。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は、白色腐朽菌をリグノセルロース物質に作用さ
せるときに生ずるリグニンの分解の他に共存する炭水化
物の分解を起こすという問題点を解決することを意図す
る。又、従来公知のリグニン分解酵素の酵素作用には過
酸化水素が必要であり、工業的適用においてはコスト高
となる問題点があったのを解決しようとするものである
。

従って、本発明の目的は新規なリグニン分解酵素および
その製造方法を提供することにあり、他の目的は主とし
てリグノセルロース物質中のリグニンを低分子化または
分解する新ＪＪｉｗＪ素およびその製造方法を提供する
ことにある。また他の目的は過酸化水素依存性のない新
規酵素およびその製造方法を提案することにある。

［問題点を解決するための手段工］ 本発明は新規なリグニン分解酵素およびその製造方法に
関するものである。

リグニンは木材腐朽菌と呼ばれる担子菌によって良く分
解されることが知られている。しかしながら、高分子化
合物であるリグニンの化学構造は複雑であり、現在でも
その化学構造が決定されていないため、リグニン分解酵
素に関する知見は非常に少ないのが実情である。

本発明者らは、クラフトパルプ晒排液およびリグニンモ
デル化合物を基質として鋭意研究を行った結果、従来よ
り研究されている菌とは分類↓異った菌であり、木材腐
朽菌の１種であるカイガラタケ（レンチテス・ベツリナ
（Ｌｅｎｚｉｔｅｓｂｅｔｕｌｉｎａ）を増殖させ、そ
の培養物から得た菌体外酵素を、硫安分画、イオン交換
体等を使用し、高度にＩＩ製して標品を得て、本発明に
到達した。

本発明のリグニン分解酵素の主な特徴は銅含有酵素であ
ること、等電点が３．５付近であること、酵素作用に酸
素が必要であること、分子１が６５、Ｇｏｏ±ｓ　、　
ｏｏｏ　（ｓｏｓ電気泳動による〕であること、リグニ
ンモデル化合物の４位のフェノール性水酸基がメトキシ
ル基になった化合物に対して作用しないこと等であり、
前記のファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅ
ｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｎ＋）の
生産する菌体外酵素とは全く性質が異なる酵素である。

本発明のリグニン分解酵素は、カイガラタケがら生産さ
れ、下記性質を有する新規なリグニン分解酵素である。

（１）作用 ｍ　　シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテ
ルに作用して、２，６−ジメトキシフェノールを生成す
る。

（１１）　　化学パルプ製造の多段漂白工程からの排液
中に含まれるリグニンを低分子化する。

（２）　　基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテルに対
して作用するが、シリンギルグリセロール−β−シリン
ギルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメトキシル
基になった化合物に対しては作用しない。

＜３）　　至適ｐｌ＋およびｌ）Ｈ安定性ｐＨ４，０〜
５．θ付近が至適であり、安定ｐＨは７．５〜９．０で
ある。

（４）　　至適温度および熱安定性 ５０℃付近が至適であり、５０℃までの熱に安定である
。

（５）　　等電点は３．５付近である。

（６）　　本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色
を呈する。

（７）　　本酵素の作用には酸素を必要とする。

本酵素の作用機序を確認するために、リグニンモデル化
合物としてシリンギルグリセロール−β−シリンギルエ
ーテル（以下ＳＯ８と称する）を用いて試験を行なった
。

９伍のジオキサンに溶解した０、４ＨＳＯ３を含有する
２００ｍＮ酢酸ナトリウム！ｌｌｉ液（ｐＨ４，５）　
４　ｔｄ中に実施例１で得た本発明の酵素溶液０．４ｍ
ｌを含む反応液を２５℃で３０秒間及び８時間反応さビ
た。

得られたＷＩ素反応液をＴＬＣガスクロマトグラフィー
、マススペクトルグラフィーで分析した。

■　ＴＬＣ分析 酵素添加後３０秒でＳＯ８のスポットが消滅しておりＳ
Ｏ８は速やかに分解される。

■　ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルグラ
フィー分析 ＳＯ８と本発明酵素を８時間反応させた酵素反応液をガ
スクロマトグラフィーによって分析したところ第１図に
示すようなピークが認められ、マススペクトルよりビー
クＩは２，６−ジメトキシフェノールであることが判明
した（第２図）。

以上の結果により、本発明の醇索によってシリンギルグ
リセロール−β−シリンギルエーテルのβ−アリルエー
テル結合が＃Ｊ断されることが確認された。

なおＳＯ８のフェノール性水＠Ｍをメトキシル基に変え
た基質に対しては本発明の酵素は全（作用を示さない。

このことから本発明の醇゛素はフェノール性水酸基を有
する基質に対して特異的に作用するものと考゛えられる
。

［作　用１ 本発明酵素が天然リグニンに作用する機構は次のように
考えられる。

リグニンのフェノール性水酸基を有する骨格に対して本
発明酵素が特異的に作用しβ−アリルエーテル結合を切
断する。その結果２．６−ジメトキシフェノールに相当
する構造を有しその４位に更にリグニン基本骨格が結合
したフェノール性水酸基を有する化合物が生成する。こ
のようにβ−アリルエーテル結合の切断により新たにフ
ェノール性水１１が生成するためリグニンは本発明酵素
により引き続き分解を受は反応が進行する。

［問題点を解決するための手段■］ なお、天然リグニン中ではβ−アリルエーテル結合が約
５０％存在することから、本発明の酵素がβ−アリルエ
ーテル結合を切断することは天然リグニンの分解におい
て極めて意義がある。

本発明の酵素は反応に際し、酸素を必要とするが、反応
は大気中より純Ｒ素雰囲気中の方が望ましく振どう、攪
拌することなどにより酵素反応速度を更に高めることが
できる。

また本発明はレンチテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属に属す
るリグニン分解酵素生産菌を培地に培養し、培養物から
該リグニン分解酵素を採取することを特徴とするリグニ
ン分解酵素の製造方法に存する。

本発明の酵素を生産する微生物は特にレンチナス属に属
するリグニン分解酵素生産菌が好ましいが同様の白色腐
朽菌であればいかなるものであってもよい。

レンチナス属に属するリグニン分解酵素生産菌としては
、たとえばレンチテス　ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ　
ｂｅｔｕｌｉｎａ）などが挙げられるが、これに限られ
るものではない。

上記菌体の培養形態は、液体培養、固体培養のいずれで
あって６良い。培地の栄ｉ！源としては、微生物の１８
！！に通常用いられているものが広く使用することがで
きる。炭素源としては同化可能な炭素源であれば良く、
例えば木粉、グルコース、シュークロス、ラクトース、
糖蜜などが使用される。特にリグノセルロース成分から
なる木粉培地で培養すると本発明のリグニン分解酵素を
Ｉ１１度高く生産することができるため有利である。′
！Ｍ索源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、
例えばペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解
物などが用いられる。その他、リン酸塩、硫酸、塩、マ
グネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、
マンガン、亜鉛などの塩類が必要に応じて使用される、
特に本酵素は銅含有酵素であり、銅塩の添加は有効であ
る。

培養温度は菌が発育し、該リグニン分解酵素を生産する
範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは２３〜２７℃程
度が良い。培養時間は条件によって異なるが、液体培養
では５〜１０日間、固体培養は１〜３ケ月程度である。

次いで、このようにして得られた培養物からリグニン分
解酵素を採取するのであるが、本酵素は主として菌体外
に分泌されるので、本酵素を採取するには、液体培養に
おいては菌体を遠心分離等で除去した培！ｌ枦液、また
固体培養においては培養物から抽出した抽出液を用いて
、酵素含有溶液を濃縮するか、または濃縮することなく
可溶性塩類、例えば硫酸アンモニウムなどを用いて塩析
せしめるか、親水性溶媒、例えばメタノール、エタノー
ル、アセトン、イソプロパツールなどの添加により本酵
素を沈澱せしめれば良い。

次いで、この沈澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜
にて透析せしめて低分子量の不純物を除去することがで
きる。また吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるクロマ
トグラフィーにより、リグニン分解Ｆ１５索を精製する
。さらにこれらの手段により得られた酵素溶液は減圧濃
縮、限外濾過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により
精製されポリリグニン分解酵素を得る。

［実　施　例］ 以下本発明を実施例によって説明する。

実施例　１ グルコース３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１５
％、Ｍ（ｌ　ＳＯ２・７　Ｈ２００，０５％、塩酸チア
ミン０．０００２％、Ｃｕ５Ｏ−５Ｈ２００，００１６
％を含有する培地（＋）ｌｌｓ、０）　５　Ｊｌを１０
４１容ジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃、２０分
間加熱殺菌した後、カイガラタケ（レンチテス・ベツリ
ナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ　ｂｅｔｕｌｉｎａ））を接種し
２８℃、８日間、１５０ｒｐ−（攪拌速度）。５ｊ／分
（通気量）の条件下で培養を行なった。

培養終了後、炉布で濾過して除菌し粗酵素液を得た。

次にこの粗酵素液を１０１１８リン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７．０）で緩衝化したＯＥ＾［トヨバールカラム（
２０Ｘ５ｃｍ）に通した。酵素は吸着されるので同じ緩
で溶出した。活性画分を集め、５０％飽和硫酸アンモニ
ウムで沈澱する不純蛋白を遠心分離で除き、７０％飽和
硫酸アンモニウムで沈澱する部分を遠心分離で集めた。

９市の水に溶解し、蒸留水２１に対し透析した。透析外
液は１日に数回交換し、−晩透析した後限外濾過（八−
１ｃｏｎ社、０Ｈ−１０）で濃縮した。３０ｍＨリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を加えて限外濾過する操
作を２回くり返した後、同じ緩衝液で平衡化した口Ｅ＾
〔トヨパールカラム（１，５Ｘ２０．　）にのせた。同
じ緩衝液４００ｄで洗滌した後、溶出は４５＋＋Ｈの同
緩衝液で行ない、２．２Ｉｄｌずつ分画した。活性のあ
る両分からそれぞれ一部をポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけて均一性を検討し、電気泳動の結果で均一な
両分を集めた。この画分はさらにＳＯ３を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動で均一性を確めた。

次に本発明酵素の力価の測定法および性質などについて
述べる。

（１）力価の測定法 少量のジオキサンに溶解した０、４ｓＨＳＯ８を含有す
る２０Ｇ＋ｅＨ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）溶
液４＃Ｉ！中に本発明酵素溶液０．４７を含む反応液を
３０℃に保温し、２９０ｍ＋における吸光度の増加を測
定する。

酵素活性は１分間に０．０１の吸光度増加を１単位とす
る。

（２）本酵素はシリンギルグリセロール−β−シリンギ
ルエーテルに作用して、２．６−ジメトキシフェノール を生成する。

（３）シリンガ酸に作用して、カルボキシル塁の脱離反
応が起こり、２．６−ジメ１〜キシ−ｐ−ベンゾキノン
、並びにシリンガ酸のフェノール性水酸基の脱水素反応
に伴うラジカルを生成し、引続きラジカル重合による６
−メドキシー４−　（２’　、６’　　−ジメトキシ−
４′　−力ルボキシフエノキシ）ベンゾキノン（１，２
＞を生成する。

（４）シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテ
ルに対して作用するが、シリンギルグリセロール−β−
シリンギルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメト
キシル基になった化合物に対しては作用しない。

（５）至適ｐＨ ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｔ１３〜５．５）　、５０１Ｈ
リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９　）　、５０１８　　Ｔｒｉ
Ｓ−ＨＮ　０３緩衝液（ｐＨ８〜９）を用いて本発明酵
素に対する酵素活性を測定した結果第３図に示す通りで
あってその至適ｐＨは４．０〜５．０付近と認められる
。

（６）　９１１安定性 ５０ｉＨ酢酸緩衝液（９１１３〜　５．５）　、５０ｍ
１４リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９　）　、５０ｅＨグリシ
ン緩衝液（Ｄ１１８〜１０）中に本発明酵素を５０℃で
３０分間放置し酵素活性を測定した。

その結果は第４図に示す通りであってそのｐＨ安定性は
ｐＨ７，５〜９付近である。

（７）至適温度 温度条件を変えて酵素反応を行ない本発明酵素の活性を
測定した結果、第５図に示す通りであってその至適温度
は５０℃付近と認められる。

（８）熱安定性 ５０−■リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中、３０〜７０℃
の各温度で本発明酵素を６０分間放置し酵素活性を測定
した。

その結果は第７図に示す通りであってその熱安定性にお
いて本発明酵素は５０℃まで安定である。

（９）梗々の物質の影響 種々の物質を添加して本発明酵素の酵素活性を測定した
結果は次の通りである。なお添加淵喰は１１Ｈである。

（１０）分子団 約６５，０００±５．０００（５Ｏ８−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（分子団マーカー；　ＬＫＢ社製、
分子量範囲１２　、３００〜７８，０００）にて測定）
（１１）等電点は３．５付近である（アンホラインを用
いる等電点電気泳動法により測定） （１２）　　本酵素は銅含有窒素であり、水溶液は深青
色を呈する。

（１３）　　本ＷＪ素の作用には酸素を必要とする。

実施例　２ ダグラスファーのチップを常法によりクラフト蒸解し、
蒸解度（カッパ価）３０の未漂白パルプを得、該パルプ
を多段漂白（ＣＥＩＩＥＤ）　Ｌ／、白色度８１ポイン
トの漂白パルプを得た。塩素処理後の第一次７Ｒｔ力Ｉ
Ｊ　抽出ｌｅ　５　Ｎ　ＩＩ！ＩテｐＨ５１ｃＷ４Ｍ　
Ｌ、、、この調製液１０ｄに本発明で得た酵素液１−を
加えて３７℃で５時間反応を行なった後、２ｄをセファ
デックスＧ−５０（径２４Ｘ　２５０ａｇ＞のカラムに
のせ、蒸留水で溶出した。コントロールとしてＰＩＩ素
液の代わりに水を加えたものを同様に行なうと、第７図
に示す通り、酵素処理により分子ｍ約ｉ、ｏｏｏ〜５．
０００のリグニンが低分子化している。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素反応液のガスクロマトグラム、第２図はビ
ークエのマススペクトルであり、第３図は至適ｐＨ，第
４図はｐＨ安定性、第５図は至適温度、第６図は熱安定
性を示すグラフである。第７図は本発明の酵素をパルプ
漂白廃水に適用した場合のゲル濾過曲線のグラフである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物から生産され、下記性質を有するリグニン分
   解酵素 （１）作用 （ｉ）シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテ
   ルに作用して、２，６−ジメトキ シフェノールを生成する。 （ｉｉ）化学パルプ製造の多段漂白工程からの排液中に
   含まれるリグニンを低分子化する。 （２）基質特異性 シリンギルグリセロール−β−シリンギル エーテルに対して作用するが、シリンギルグリセロール
   −β−シリンギルエーテルの４位のフェノール性水酸基
   がメトキシル基になった化合物に対しては作用しない。 （３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 ｐＨ４．０〜５．０付近が至適であり、安定ｐＨは７．
   ５〜９．０である。 （４）至適温度および熱安定性 ５０℃付近が至適であり、５０℃までの熱に安定である
   。 （５）等電点は３．５付近である。 （６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を呈
   する。 （７）本酵素の作用には酸素を必要とする。 ２、レンチテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属に属するリグニ
   ン分解酵素生産菌を培地に培養し、培養物から該リグニ
   ン分解酵素を採取することを特徴とするリグニン分解酵
   素の製造方法。