JPH0870861A

JPH0870861A - ラッカーゼおよびその生産方法

Info

Publication number: JPH0870861A
Application number: JP21028894A
Authority: JP
Inventors: Akira Shimizu; 昌清水; Masato Nakaya; 端人仲谷
Original assignee: Daiwa Kasei KK
Current assignee: Daiwa Kasei KK
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1996-03-19
Anticipated expiration: 2014-11-29
Also published as: JP2984552B2

Abstract

(57)【要約】【目的】高い耐熱性を有するラッカーゼおよびその安
価で大量な生産方法を提供する。【構成】ホウロクタケ属に属する新菌株から得られ
る、以下の特性：(1)分子量：約６２,０００；(2)作用
適温の範囲：至適温度は約７０℃である；(3)熱安定
性：ｐＨ７.０で３０分間保持した場合に、約６５℃ま
で安定である；(4)至適ｐＨ：約５.０；(5)安定ｐＨ範
囲：３０℃で３時間処理する場合において、ｐＨ７.０
〜１０.０；および(6)等電点：約３.０；を、有するラ
ッカーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、耐熱性の高いラッカー
ゼおよびこのようなラッカーゼを担子菌培養物から生産
する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラッカーゼは、フェノールオキシダーゼ
またはリグニン分解酵素とも呼ばれ、酸素の存在下、フ
ェノール性化合物を酸化する酵素である。ラッカーゼ
は、リグニン分解作用、ウルシオールなどのフェノール
性物質の酸化重合作用を有するため、例えば、コンクリ
ート混和剤の合成、パルプ製造処理等におけるリグニン
除去、人工漆の製造への用途が期待されている。特に、
人工漆製造には、漆の指触乾燥の効果を高めるため、酸
化力が強く、かつ高温での失活がないラッカーゼが、特
に必要である（寺田ら、塗装工学、Vol.２６、No.６、
（１９９１））。また、パルプ製造処理におけるリグニ
ン除去でも、屋外で夏期に実施する場合には高温となる
ため、耐熱性に優れるラッカーゼが必要とされる。

【０００３】従来から、種々の菌類に由来するラッカー
ゼが知られている。例えば、担子菌類のコリオラス・ヒ
ルスタス、コリオラス・ベルシカラー（特開昭６２−２
２０１９０号公報）、木材腐朽菌であるピクノポラス・
コクネシウス（寺田ら、塗装工学、Vol.２６、No.６、
（１９９１））、接合菌類のムコール・メイヘイ（特開
昭６１−１１５４８８号公報）に由来するラッカーゼが
知られている。この他、動物、植物にもラッカーゼの存
在が知られている。

【０００４】しかしながら、いずれのラッカーゼも熱的
に不安定であること、酵素の大量精製が困難であること
などから、上記用途への実用化がなされていないのが現
状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的とするところは、
耐熱性に優れたラッカーゼ、その生産方法および生産菌
を提供することである。これまで高い耐熱性を有する、
ラッカーゼおよびこれを生産する菌類は知られていな
い。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ホウロク
タケ（Trametes）属に属する、新たに単離した担子菌か
ら、新規なラッカーゼを見いだし、本発明を完成するに
至った。

【０００７】本発明のラッカーゼは、次の特性を有す
る。 (1)分子量：約６２,０００である。 (2)作用適温の範囲：至適温度は約７０℃である。 (3)熱安定性：ｐＨ７.０で３０分間保持した場合に、約
６５℃まで安定である。 (4)至適ｐＨ：約５.０である。 (5)安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合におい
て、ｐＨ７.０〜１０.０である。 (6)等電点：約３.０である。このことによって上記目的が達成される。

【０００８】本発明のラッカーゼは、ホウロクタケ属の
担子菌、特に平成６年８月１２日に工業技術院生命工学
工業技術研究所（生命研と略称する）に寄託したTramet
es sp. Ha1株（生命研菌寄第１４４７２号；FERM P-１
４４７２）により生産される。このことによって上記目
的が達成される。

【０００９】上記担子菌より生産される本発明のラッカ
ーゼの種々の特性を表１に示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】上記特性を有する、ホウロクタケ属担子菌
由来のラッカーゼは、これまで知られていない。

【００１２】本発明のラッカーゼの生産方法は、上記生
産菌を培養し、培養物より該ラッカーゼを分離精製する
工程を包含する。このことによって上記目的が達成され
る。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明のラッカーゼは、ホウロクタケ属の
担子菌、特にTrametes sp. Ha1株（生命研菌寄第１４４
７２号；FERM P-１４４７２）により生産される。この
菌株は、発明者らが土壌、海水および淡水、ならびに腐
朽物からラッカーゼを生産する菌類を広くスクリーニン
グした結果、新たに竹の枯葉から単離された新菌株であ
る。

【００１４】（１）形態および培養本発明のラッカーゼ生産菌（以下、本菌という）は、リ
グニン分解能を有する白色腐朽菌であること、培養菌糸
に骨格菌糸およびかすがい連結（clamp connection）を
有するがシスチジアおよび剛毛状菌糸などの異形細胞は
存在しないこと、ならびに培養菌糸に分生胞子が形成さ
れないこと、等の菌学的性質を有することにより、ホウ
ロクタケ（Trametes）属に属する担子菌と同定され、Tr
ametes sp. Ha1と命名した。

【００１５】本菌のさらに詳細な菌学的性質は、以下の
通りである。

【００１６】（ポテト・グルコース寒天培地）培養開始
後７日目において、コロニーの表面および裏面は共に白
色であり、直径５〜１０ｍｍに成長し、気中菌糸は短く
密で綿毛状である。菌糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、
少数の骨格菌糸が認められ、かすがい連結を有する。菌
糸の表面は、平坦であり、幅は２〜６μｍである。シス
チジアおよび剛毛状菌糸は認められない。分生胞子の形
成は認められない。

【００１７】（サブロー寒天培地）培養開始後７日目に
おいて、コロニーの表面は白色、裏面は薄茶色であり、
直径３〜７ｍｍに成長し、気中菌糸は短く疎である。菌
糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、少数の骨格菌糸が認め
られ、かすがい連結を有する。菌糸の表面は、平坦であ
り、幅１〜４μｍである。分生胞子の形成は認められな
い。

【００１８】（フェノールオキシダーゼ反応）０.５％
の没食子酸または０.５％のタンニン酸を含むサブロー
寒天培地に本菌を接種し、３０℃で培養条件下、菌体の
周囲が褐変する反応陽性が認められる。従って、本菌は
リグニン分解性木材腐朽菌（白色腐朽菌）の一種であ
る。

【００１９】本菌の生育範囲は、ポテトグルコース寒天
培地（ポテトエキス末４g、ブドウ糖２０gおよび寒天２
０gを、１リットルの蒸留水中に溶解する。）におい
て、約４〜４０℃、ｐＨは約２〜１２であり、生育好適
温度は２５〜３５℃、生育好適ｐＨは４.０〜８.０であ
る。特に好ましい生育条件は、３０℃でｐＨが約５.５
である。

【００２０】次に、本菌から本発明のラッカーゼを生産
するための条件について説明する。本菌は、液体培養ま
たは固体培養のいずれでも培養し得る。本菌を生育させ
る培地としては、特に限定されず、通常の液体培地また
は固体培地が用いられる。炭素源としては、本菌が同化
し得るものならなんでもよく、グルコース、ショ糖、糖
蜜等の糖類、澱粉、木粉などが用いられ得る。窒素源と
しては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキ
ス、大豆分解物、尿素などの有機窒素源の他、硝酸アン
モニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素源も使用し得
る。必要に応じてリン酸塩、硫酸マグネシウム、カリウ
ム、カルシウム、銅、ナトリウム、マンガン、亜鉛等の
無機塩類、ビタミン類等が添加され得る。これら培地成
分は、本菌の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素
源は０.１〜２０重量％、好ましくは５〜１０重量％、
窒素源は０.０１〜５重量％、好ましくは０.１〜２重量
％である。

【００２１】培地のｐＨを、２.０〜１２.０、好ましく
は４.０〜８.０に調製し、滅菌して使用する。培養温度
は、担子菌類が生育し得る温度であればよく、実用上、
１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。本菌を
液体培養する場合は、通気培養または振盪培養が好まし
い。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通
気または振盪培養の場合は、通常２〜１０日間が好まし
い。

【００２２】（２）培養液からのラッカーゼの分離精製本菌の培養液から本発明のラッカーゼ（以下、本ラッカ
ーゼという）を分離精製するには、既知の精製法、例え
ば透析、塩析、各種カラムクロマトグラフィー、等電点
沈澱、ゲル濾過が単独もしくは併用して利用され得る。

【００２３】本ラッカーゼは、菌体外に分泌生産され、
培養液中に蓄積される。従って、培養後、菌体等の不溶
物を遠心分離、濾紙または濾布などによる濾過等により
除去し、本ラッカーゼを含む培養液（粗酵素液）を回収
する。得られた粗酵素液を、濃縮、硫安分画（塩析）、
透析、各種クロマトグラフィー、ゲル濾過などの一般的
に用いられる酵素の精製方法により、本ラッカーゼが精
製され得る。例えば、上記得られた粗酵素液を硫安分画
後、透析、各種クロマトグラフィー、限外濾過に順次供
試することにより、精製された高活性の本ラッカーゼを
含有する画分が得られる。

【００２４】（３）ラッカーゼ活性の測定本発明において本ラッカーゼ活性は、本ラッカーゼが触
媒する、4-アミノアンチピリンと、水素供与体との酸化
縮合による発色反応で測定する。水素供与体としてはフ
ェノール、N,N-ジエチルアニリン（DEA）が挙げられ
る。酸化縮合による発色反応系において、５０５ｎｍ
（フェノール）あるいは５５５ｎｍ（DEA）における吸
光度を測定し、本願においては、７.５マイクロモルの
フェノールおよび１.２５マイクロモルの4-アミノアン
チピリンを含む１９０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４.５）５２０μｌを３０℃にて１分間プレインキュベ
ートした後、酵素液２０μｌを混合して、５０５ｎｍの
吸光度の変化を測定し、１分間に吸光度を０.０１増加
させる酵素活性を１単位（Ｕ；ユニット）とする。

【００２５】以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。

【００２６】

【実施例】実施例１（Trametes sp. Ha1の培養）１０ｍｌの培地（５％グル
コース、０.５％ペプトン、０.１％酵母エキス、０.２
％KH₂PO₄、０.１％K₂HPO₄、０.０２％MgSO₄・7H₂O、ｐＨ
６.０）を含む６０ｍｌ容試験管にTrametes sp. Ha1の
一白金耳を接種し、２８℃で４日間、振盪培養した。次
いでこの培養液２０ｍｌを、２.５ｌの上記培地を含む
５ｌ容ミニジャーファーメンターに植菌し、２８℃で７
日間、通気撹拌培養した。

【００２７】実施例２（本ラッカーゼの精製）上記実施例１で得られた培養液
を濾紙で濾過して除菌し、回収した濾液を粗酵素液とし
た。

【００２８】この粗酵素液をエバポレーションまたは限
外濾過により濃縮後、５０％飽和硫安で塩析し、沈澱し
たタンパク質を遠心分離により除去した。次に７５％飽
和硫安で沈澱する部分を遠心分離により回収した。この
回収画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）に
対して透析し、透析内液を得た。

【００２９】上記透析内液を、上記緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ-セファセルカラム（5.0×5.1cm；Pharmacia社
製）に供試した。上記カラムを同緩衝液で洗浄後、同緩
衝液に塩化ナトリウム濃度を０Ｍから１Ｍへの濃度勾配
をかけた溶出により、上記カラムに吸着された本ラッカ
ーゼを溶出し、分画回収した。本ラッカーゼは、約０.
２Ｍで溶出した。

【００３０】得られた各画分の一部を本ラッカーゼ活性
の測定に供試し、活性を有する画分を合せて１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５.７）に対して透析し、透
析内液を得た。

【００３１】上記透析内液を、ハイドロキシアパタイト
充填カラム（2.6×18.8cm；生化学工業製）に供試し、
非吸着物質を洗浄溶出後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む上
記緩衝液により、本ラッカーゼを溶出した。本ラッカー
ゼを含む溶出液は、限外濾過により濃縮し、０.２Ｍ塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７.５）で平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラ
ム（2.6×86cm；Pharmacia社製）に供試し、さらに分画
精製された酵素精製液を得た。

【００３２】この酵素精製液の一部をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供試し、クマーシーブリリアントブル
ー染色によるタンパク質の検出、およびフェノールおよ
び4-アミノアンチピリンを用いる上記発色反応系でラッ
カーゼの活性染色を行なった。結果を図１に示す。レー
ンＡは、染色により検出されたタンパク質バンド、レー
ンＢは、上記発色反応系により検出されたラッカーゼ活
性バンドを示す。図中の矢印で示されるように、検出さ
れた均一なタンパク質バンドとラッカーゼ活性バンドと
の位置は一致し、本ラッカーゼが上記工程により、酵素
活性を失うことなく精製され得ることが確認された。ま
た、上記泳動後のゲルをシッフの染色法に供試し、本ラ
ッカーゼが糖タンパク質であることを確認した。

【００３３】上記の各精製工程における本ラッカーゼの
精製度およびタンパク質当りの比活性を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】実施例３（本ラッカーゼの分子量）ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS-PAGE）法（Laemmli,U.K.、Nature、22
7、680(1970)）で本ラッカーゼの分子量を測定した。

【００３６】上記実施例２で得られた精製ラッカーゼお
よび分子量マーカーとして既知の６種のタンパク質（分
子量約97,400、66,300、42,400、30,000、20,100および
14,400）を同時に泳動した。泳動終了後、クーマシーブ
リリアントブルーで染色し、本ラッカーゼと各分子量マ
ーカーとの相対泳動距離より、本ラッカーゼの分子量を
測定した。結果を図２に示す。右側のレーンは、本ラッ
カーゼ、左側のレーンは、同時に泳動した各分子量マー
カーである。左外側の数値は分子量サイズ（kDa）を表
す。本SDS-PAGEにより、本ラッカーゼは、単一バンドを
示した。本ラッカーゼのSDS-PAGEにおける分子量は、約
６２,０００である。上記酵素精製液を高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ分子量を測定した結
果、上記と同様、約６２,０００である。

【００３７】実施例４（本ラッカーゼの作用適温範囲および熱安定性）（１）作用適温の範囲上記実施例２で得られた精製された本ラッカーゼの活性
を、上記発色反応系において種々の温度条件（16、30、
40、50、60、70、75、80℃）下で測定した。結果を図３
に示す。図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は最
大活性値を100とした場合の相対活性（％）を表す。本
ラッカーゼの至適温度は、約７０℃である。

【００３８】（２）熱安定性上記実施例２で得られた精製された本ラッカーゼを種々
の温度条件（0、30、40、45、50、55、60、65、70、80
℃）下、リン酸緩衝液（pH7.0）中で３０分間インキュ
ベートした後、活性を測定した。結果を図４に示す。図
中の横軸は処理温度（℃）を表し、縦軸は最大活性値を
100とした場合の相対残存活性（％）を表す。本ラッカ
ーゼは、処理温度条件が６５℃の場合においても酵素活
性の７０％以上が保持され、安定である。本ラッカーゼ
は、処理温度条件が６０℃では、酵素活性は１００％保
持される。

【００３９】実施例５（本ラッカーゼの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲）（１）至適ｐＨｐＨ領域に応じて、５０mM酢酸緩衝液、５０mMリン酸緩
衝液、５０mMトリス塩酸緩衝液または５０mMトリス硝酸
緩衝液を用いて、ｐＨを２.５〜９.０（2.5、3.5、4.
4、5.0、5.7、6.3、7.3、8.0、9.0）に調整し、上記実
施例２で得られた精製された本ラッカーゼの活性を測定
した。結果を図５に示す。図中の横軸は反応ｐＨを表
し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対活性
（％）を表す。本ラッカーゼの至適ｐＨは、約５.０で
ある。

【００４０】（２）安定pH範囲実施例２で得られたラッカーゼ溶液のｐＨを１.０〜１
２.０（1.0、1.9、4.1、5.0、6.1、7.0、7.5、8.0、8.
2、9.2、10.0、10.3、10.9、12.0）に調整し、３０℃で
３時間インキュベートした。次いで、各pH処理液中の活
性を測定した。結果を図６に示す。図中の横軸は処理pH
を表し、縦軸は、最大活性値を100とした場合の相対残
存活性（％）を表す。本ラッカーゼの安定pH範囲は、
７.０〜１０.０である。

【００４１】実施例６（本ラッカーゼの等電点）常法の等電点電気泳動法によ
り本ラッカーゼの等電点を測定した。測定の結果、本ラ
ッカーゼの等電点は、約3.0である。

【００４２】実施例７（本ラッカーゼの基質特異性）上記実施例２で精製され
た本ラッカーゼの基質特異性を、カテコール、レゾルシ
ノール、ヒドロキノン、カフェイン酸、ヒドロカフェイ
ン酸、ピロガロール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾー
ル、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェノ
ール、ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−トルイジン、N,N-
ジメチルアニリン、N,N-ジエチルアニリン、またはN-エ
チル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチル
アニリンを基質として供試し、これらの基質の酸化に伴
う酸素消費量を酸素電極により電気信号に変換する酸素
電極法を用いて調べた。詳細には、１０マイクロモルの
上記基質を含む２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４.５）１９８０μｌを、３０℃で、１０分間、空気で
平衡化した後、酵素液２０μｌを添加することで反応を
開始し、クラーク型酸素電極で酸素の消費量を測定し
た。比較のために、ピクノポラス・コクシネウス、およ
びコリオラス・ベルシカラー由来のラッカーゼについて
も同様に調べた。カテコールを基質とした場合の測定値
を１００とした、相対値（％）を表３に示す。

【００４３】

【表３】

【００４４】本ラッカーゼは、カフェイン酸に対して特
に高い特異性を示し、ヒドロカフェイン酸に対する特異
性も他のラッカーゼと異なる。

【００４５】実施例８（培養条件の検討）綿栓をした６０ｍｌ容試験管と５０
０ｍｌ容フラスコとを用い、培地液量を少しずつ変え
て、酸素供給量の変化によるラッカーゼの生産性の変動
を調べた。培地液量は、６０ｍｌ容試験管では、５、１
０および１５ｍｌ、５００ｍｌ容フラスコでは、２５、
５０、７５および１００ｍｌとした。各培地液量につい
て、ラッカーゼ活性を測定し、ラッカーゼの生産量とし
た。それぞれの結果を、図７および図８中に示す。

【００４６】いずれの容器を用いた場合も、培地液量を
増加させることで、酸素供給量を減少させるとラッカー
ゼの生産量が低下した。２リットル容のフラスコを用い
た実験でも、同様の結果が得られた。

【００４７】これらの培養結果から、本菌の酵素の生産
は、菌体への酸素供給量により変動することが示唆され
た。

【００４８】そこで、さらに綿栓をシリコ栓に変えて酸
素供給量を減少させた５００ｍｌ容フラスコ中に、１０
０ｍｌの培地液を入れ、２８℃で培養しラッカーゼ活性
の経時変化を調べた。図９中に、菌体乾燥重量、pH、お
よびラッカーゼ活性の変化をそれぞれ、−□−、−●
−、および−○−で示す。

【００４９】ラッカーゼ活性は、６日目に最高活性に達
したが、綿栓を用いて培養したものと比較して約１０分
の１の活性であった。これにより、本菌は、酸素供給量
を多くすることで、ラッカーゼの生産性が高まることが
明らかになった。

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、高い耐熱性を有する新
規ラッカーゼ、およびその生産方法が提供される。本ラ
ッカーゼは従来のラッカーゼに比べ、高い耐熱性を有す
る為、人工漆の生産、パルプ製造処理工程等に有用であ
る。本ラッカーゼは、担子菌の培養によって生産される
ため、安価に大量に本ラッカーゼを提供することがで
き、試薬または工業用途に広く利用され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本ラッカーゼのポリアクリルアミドゲル電気泳
動による泳動パターンを示す、ゲル電気泳動写真であ
る。

【図２】本ラッカーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動（SDS-PAGE）による泳動パターンを示す、ゲル
電気泳動写真である。

【図３】16〜80℃の範囲で本ラッカーゼ活性を測定した
場合の相対活性を示す。

【図４】本ラッカーゼを０〜80℃の条件下、30分インキ
ュベーション後に測定した相対残存活性を示す。

【図５】pH2.5〜9.0の範囲で本ラッカーゼ活性を測定し
た場合の相対活性を示す。

【図６】本ラッカーゼをpH1.0〜12.0の条件下、30℃で
３時間インキュベーション後に測定した相対残存活性を
示す。

【図７】60ｍｌ容試験管による本菌培養時の本ラッカー
ゼ生産量に対する酸素供給効果を示す。

【図８】500ｍｌ容フラスコによる本菌培養時の本ラッ
カーゼ生産量に対する酸素供給効果を示す。

【図９】500ｍｌ容フラスコによる本菌培養における菌
増殖量、本ラッカーゼ活性および培養液ｐＨの経時変化
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の特性： (1)分子量：約６２,０００； (2)作用適温の範囲：至適温度は約７０℃である； (3)熱安定性：ｐＨ７.０で３０分間保持した場合に、約
６５℃まで安定である； (4)至適ｐＨ：約５.０； (5)安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合におい
て、ｐＨ７.０〜１０.０；および (6)等電点：約３.０；を、有するラッカーゼ。
【請求項２】ホウロクタケ（Trametes）属に属する担
子菌、Trametes sp.Ha1株（生命研菌寄第１４４７２
号）が生産する、請求項１に記載のラッカーゼ。
【請求項３】以下の特性： (1)分子量：約６２,０００； (2)作用適温の範囲：至適温度は約７０℃である； (3)熱安定性：ｐＨ７.０で３０分間保持した場合に、約
６５℃まで安定である； (4)至適ｐＨ：約５.０； (5)安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合におい
て、ｐＨ７.０〜１０.０；および (6)等電点：約３.０；を有するラッカーゼを生産する方
法であって、該ラッカーゼを生産するホウロクタケ属に
属する担子菌を培養する工程、及び、培養物より該ラッ
カーゼを分離精製する工程を包含する、方法。