JP2001514513A - ラッカーゼを含んで成る貯蔵安定性液体製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は（ｉ）ラッカーゼ、（ii）少なくとも一種のポリアルコールを含んで成るラッカーゼを含んで成る貯蔵安定液体製剤であって、当該ラッカーゼの至適pHよりもアルカリ性であるpHを有する製剤に関する。本発明の更なる目的はラッカーゼを含んで成る液体製剤の貯蔵安定性を改善するための方法、及び当該液体製剤のパーソナルケア用途、又は漂白もしくは繊維用途、例えば布帛の染色のための利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ラッカーゼを含んで成る貯蔵安定性液体製剤 発明の分野 本発明はラッカーゼを含んで成る貯蔵安定性液体製剤、ラッカーゼを含んで成 る液体製剤の貯蔵安定性を改善するための方法、及びパーソナルケア用途のため の、又は漂白のための、又は繊維用途、例えば布帛の染色のための当該液体製剤 の利用に関する。 発明の背景 工業用酵素は一般に粒状固体（例えば、任意的に何らかのコーティングの施さ れた粉末又は顆粒形態）又は水性溶液として製剤化されている。 多くの固体製剤（例えば酵素粉末）はダスト形成が容易に起こるという欠点を 有する。これは特別な注意を払わない限り、周囲環境の汚染をもたらすことがあ り、その結果かかる組成物を取り扱う者の健康に危険を及ぼす。 水性液体酵素製剤は本質的にダスト形成の危険性がない。事実上全ての酵素が 水の存在下でその活性を発揮するという事実に基づき、遊離（例えば未封入又は 未コート）酵素を含んで成る貯蔵安定性製剤を調製することは一般に不可能であ る。 現在有用な水性液体酵素製剤は操作することが可能な時間枠が比較的短く、な ぜなら酵素活性は冷却しながら貯蔵しないと数週間の貯蔵を経て許容されない程 の低いレベルにまで低下するからである。 Feng Xuら（1996）Biochimica et Biophysica Acta，1292，p． 303-311は様々なラッカーゼの安定性が、ABTSとの１時間の予備インキュベーシ ョン後にpH及び温度依存性であることを示す。 Palmiertら(1993)，Applied Microbiol，Biotechnol.，39，p．632-636は25℃ でインキュベーションした特異的なラッカーゼがpH３でよりもpH７で300分の間 （即ち６時間）安定であることを示す。 かくして、１日よりも長い時間貯蔵安定性であるラッカーゼを含んで成る液体 製剤についてのニーズがある。本発明はかかるニーズを充足させる製剤を提供す る。 発明の概要 本発明の目的は長期間にわたり10〜60℃で貯蔵安定性であるラッカーゼを含ん で成る貯蔵安定性液体製剤を提供する。 液体製剤は（ｉ）ラッカーゼ及び（ii）少なくとも一種のポリアルコールを含 んで成り、当該製剤はラッカーゼの至適pHよりもアルカリ性のpHを有し、注目の ラッカーゼの至適pHのpHを有するポリアルコール抜きの対応の製剤と比べて改善 された貯蔵安定性又は棚寿命を有する。 ラッカーゼ ラッカーゼ（ベンゼンジオール：酸素オキシドリダクターゼ）Enzyme Nomencl ature（1992）Academic Press，Inc．に従うと、Ｅ．Ｃ．クラス１．10．３．２ ）はフェノール類の酸化を触媒する多重銅含有酵素である。ラッカーゼ媒介酸化 は適当なフェノール系基質からのアリールオキシ基中間体の生成をもたらす；こ のようにして生成された中間体の最終的なカップリングは二量体、オリゴ及びポ リマー反応生成物の組合せを供する。所定の反応生成物はケラチン質繊維、例え ば毛髪、ウール及び繊維の染色のために適当な染料を 生成するのに利用されうる。 ラッカーゼは様々な微生物起源、特に細菌及び真菌（糸状菌類及び酵母等）か ら得られ、そしてラッカーゼの適当な例はとりわけ真菌から得られ、例えばアス ペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ（Neurospora）（例えばＮ．クラッ サ(N．crassa)）、ポドスポラ(Podospora)、ボツリチス（Botrytis）、コリビア （Collybia）、フォメス(Fomes)、レンチヌス（Lentinus）、プレウロトゥス(Pl eurotus)、トラメテス（Trametes）〔その一部の種／株は様々な名称により知ら れているか及び／又は過去に別の属内に分類されていた：例えば、トラメテス・ ビロッサ（T．villosa）＝Ｔ．ピンシトゥス(T．pinsitus)＝ポリポルス・ピン シチス（Polyporus pinsitis）（Ｐ．ピンシチス又はＰ．ビロッサス(P．villos us)としても知られる）＝コリオルス・ピンシトゥス（Coriolus pinsitus）〕、 ポリポルス、リゾクトニア（Rhizoctonia）（例えば、Ｒ．ソラニ）、コプリヌ ス（Coprinus）、（例えば、Ｃ．プリカチリス(C．plicatilis)、コプリヌス・ シネレウス(C．cinereus)）、プサチレッラ（Psatyrella）、ミセリオフソラ（M yceliophthora）、(例えば、Ｍ．サーモフィラ(M．thermophila))、シタリジウ ム（Schytalidium）、フレビア(Phlebia)（例えばＰ．ラジタ（P．radita）；WO 92/01046参照）、コリオルス（Coriolus）（例えば、Ｃ．ハーストゥス(C．hirs utus)；特開平第２−238885号参照）、ピリキュラリア(Pyricularia)又はリジド ポルス(Rigidoporus)の株から得られるラッカーゼである。 本発明との関係において好適なラッカーゼにはミセリオフソラ・サーモフィラ （Myceliophthora thermophila）から入手できるラッカーゼ及びポリポルス・ピ ンシトゥス(P．pinsitus)から入手できるラッカーゼが挙げられる。 本発明の液体製剤はその他の成分を含んでも含まなくてもよい。その他の考え られる成分には、ラッカーゼの基質又は媒介剤（mediator）、pH調節剤、抗微生 物剤、分散剤及び／又は粘度調節剤が挙げられる。 本発明は更にラッカーゼの貯蔵安定性を改善するための方法であって、ラッカ ーゼをポリアルコールの存在下で、ラッカーゼの至適pHよりも0.5〜5.5pH単位ア ルカリ性であるpHで貯蔵することによる方法にも関連する。 最後に、本発明はパーソナルケア用途、例えば毛髪染色、漂白、及び繊維用途 、例えば布帛の染色のための本発明の液体製剤の利用に関連する。 図面の簡単な説明 図１はミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ(120LAMU／ｇ)及び30％のPEG 6,000を含んで成る本発明の液体製剤のpH9.0での一週間の貯蔵期間における比 残留酵素活性を示す。 図２はミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ及びポリアルコール、並びに 種々のバッファーを含んで成る液体製剤のパーセンテージ残留活性を示す。 図３はミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ原材料のポリアルコール及び 低温殺菌の効果を示す。 図４はミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼのpH9，9.5及び10の残留活性 を示す。 図５は40℃で１〜16日の期間の間に残留活性として測定したバッファー中のミ セリオフソラ・サーモフィララッカーゼ及びポリポルス・ピンシトゥスラッカー ゼの安定性を示す。 図６は１）10％ ｗ／ｗのプロピレングリコール及び２）10％ ｗ／ｗのプロピレングリコールと３％ ｗ／ｗのグリコースとの組合せを含んで 成る液体製剤中での40℃で21週間のミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼの 長期貯蔵安定性を示す。 発明の詳細な説明 本発明の目的は改善された貯蔵安定性を有するラッカーゼを含んで成る液体製 剤を提供し、かかる製剤は10〜60℃、好ましくは20〜45℃の温度で保存したとき に大半の割合の残留酵素活性を維持する。 本発明者は、ラッカーゼ及びポリアルコールを含んで成る液体製剤であってpH がラッカーゼの至適pHよりもアルカリ性である製剤が改善された貯蔵安定性又は 棚寿命を有することを見い出した。 １日超から数週間、そして更にある場合には数週間の範囲において長い棚寿命 を有する改善された貯蔵安定性液体製剤を得るには、pHは注目のラッカーゼの至 適pHよりも0.5〜5.5pH単位、典型的には１〜４pH単位アルカリ性でなくてはなら ない。 「改善された貯蔵安定性液体製剤」は少なくとも本発明との関連においては、 一定のpHで所定の期間後の注目のラッカーゼの残留酵素活性の４℃で冷却下での 同じ一定のpHでの同じ所定の期間後の酵素活性との対比におけるパーセンテージ を基準に決定される。４℃での冷却はラッカーゼ、例えばミセリオフソラ・サー モフィララッカーゼを含んで成る液体製剤の貯蔵の慣用の手段である。 「大半の残留酵素活性」とは、対応の条件下で４℃で保存した注目のラッカー ゼの酵素活性の少なくとも20％、より良好には30％以上、例えば50％又は60％以 上、更に良好には70％以上、好ましくは80％以上、特に90％以上、そして更には 100％まで維持された酵素活性を意味する。pH 本発明の液体製剤のpH（それは注目のラッカーゼの至適pHよりもアルカリ性で ある）は製剤の成分に由来する「天然」pHであってよい。もしこの液体製剤のこ の「天然」pHが本発明の仕様に従っていないなら、そのpHはpH調節剤、例えばバ ッファーの利用により所望のpHにまで調整しなくてはならない。その液体製剤が 特にどのようなpHを有さなくてはならないかは特定のラッカーゼに依存するもの と理解され、なぜならラッカーゼの至適pHは４〜８と様々であるからである。 特定のラッカーゼの至適pHは基質、安定剤（即ち、本件ではポリアルコール） 、バッファー及びその他の成分の存在に依存する。従って、当該ラッカーゼの至 適pHはそれが貯蔵される製剤に相当する製剤の中で測定しなくてはならない。当 業者は注目のラッカーゼの至適pHを容易に決定することができ、そしてその情報 から本発明の貯蔵安定性液体製剤を容易に調製できる。ラッカーゼ 注目のラッカーゼは上記の任意のラッカーゼであってよい。ラッカーゼはかな り様々な起源から得られ、そしてその構造（分子量、組成）及びその特性（基質 に関する特異性、至適pH、等電点（pI）等）との関連で比較的不均質なグループ である。 本発明に関して特に考慮されるラッカーゼの例には植物起源、例えばラス（Rh us）種のラッカーゼ、ラッカー樹木由来のラッカーゼ、並びに微生物起源由来の ラッカーゼ、例えば細菌及び真菌ラッカーゼ、例えばリゾクトニア・プラクトコ ラ（Rhizoctonia practicola）ラッカーゼ（Reinhammar，B.B.A，205，35-47（1 970）；Bollagら（1978）、Can．J．Microbiol，25，229-233)、ミセリオフソラ 由来のラッカーゼ、特にミセリオフソラ・サーモフィラ株由来の ラッカーゼ（WO95/33836参照）、ポリポルス、特にポリポルス・ピンシトゥス株 由来のラッカーゼ（WO96/00290参照）、シタリジウム(Scytalidium)種、特にＳ ．サーモフィルム(S．thermophilum)由来のラッカーゼ（WO95/33837参照）、ピ リコラリア（Pyricolaria）種、特にＰ．オリザ(P．oryzae)由来のラッカーゼ、 コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)由来のラッカーゼが挙げられる。本発明の液体製剤中のラッカーゼの濃度 本発明の液体製剤中のラッカーゼの濃度はその意図する用途に依存し、それ故 低濃度から高濃度に至るまで様々である。注目の用途（例えば毛髪染色、布帛漂 白、布帛染色、等）の当業者はどの程度のラッカーゼの最終濃度が必要であるか を知っている。技術的に認められる本発明の液体製剤の改善された調製安定性又 は棚寿命は、製品１ml当り少なくとも１mgの酵素タンパク質の濃度から、製品の 混合が不可能となるまで粘度が上昇するに至るまでの濃度のラッカーゼの濃度と は独立して得られる。ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ製剤 組換ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼの至適pHはWO95/33836（Novo N ordisk）によれば、基質としてシリンガルダジンを用い、6.5である。従って、 このラッカーゼを含んで成る製剤の場合、そのpHは本発明に従うとトリスバッフ ァーの存在下で6.5よりもアルカリ性であるべきであり、そして好ましくは7〜12 、特に7.5〜11の範囲にあるべきである。 0.25Ｍのグリシンバッファー、pH9.0中の10％のモノプロピレングリコール(MP G)、0.2％のProxel（商標）の中でのミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ は40℃で４週後に84％の酵素活性を維持する。pH9.0では、パーセンテージ残留 活性はpH9.5よりも高いことが認められた。 pHをpH９からpH10に高める効果は実施例５に記載し、そして図４に示す。ミセ リオフソラ・サーモフィララッカーゼはpH9.0で一層安定であるようであり、25 ℃及び40℃で４週間貯蔵した後にそれぞれ93％及び84％の活性が維持される。ポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼ製剤 更に、組換ポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼはWO96/00290（Novo Nordisk ）に開示の通り、基質としてシリンガルダジンを用い、５〜5.5の至適pHを有す る。 本発明に従って、ポリポルス・ピンシトゥス由来のラッカーゼ及びポリアルコ ールを含んで成る液体製剤は５又は5.5よりもアルカリ性であるべきであり、そ して約5.5〜11、特に６〜9.5にあるべきことが好ましい。 60％のPEG 6,000，pH6.0液体中のポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼは実施 例１に示す通りに40℃において、14日後に100％の残留活性を有し、そして４週 間後に65％の残留活性を有した。ポリアルコール ラッカーゼを含んで成る液体製剤の改善された貯蔵安定性を得るには、少なく とも一種のポリアルコールがこの製剤の安定化のために存在していなくてはなら ない。 何ら理論に拘束されるわけではないが、ポリアルコールは水活性を弱め、そし て更にはラッカーゼが沈殿しないこと及び熱変性に委ねられないことを確保する ものと信じられている。 本発明者はポリマー及びそのモノマー、並びに単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖 類が当該製剤の所望の安定性を得るのに適当であることを見い出した。 本発明の液体製剤に利用し得るポリアルコールの例には、ポリアルキレンオキ シド(PAO)、例えばポリアルキレングリコール（PAG） 、例えばポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール（PEG）、メトキシ ポリエチレングリコール（mPEG）及びポリプロピレングリコール、ポリビニルア ルコール(PVA)、ポリエチレンー無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン−リン ゴ酸無水物共重合体、デキストラン、例えばカルボキシメチルデキストラン、セ ルロース、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセル ロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース及びヒドロ キシプロピルセルロース、キトサンの加水分解物、デンプン、例えばヒドロキシ エチルデンプン及びヒドロキシプロピルデンプン、グリコーゲン、アガロース及 びその誘導体、グアーゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナ ン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、バイオポリマー、ソルビトール、グルコ ース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、グロース、キシロース、スレ オース、ソルボース、フルクトース、グリセロール、マルトース、セロビオース 、スクロース、アミロース、アミロペクチン、モノプロピレングリコール(MPG) が挙げられる。 好適な態様において、当該製剤はポリマー及び／又は糖をポリアルコールとし て含んで成る。適当なポリマーはポリアルキレンオキシド(PAO)、好ましくはポ リアルキレングリコール(PAG)、特にプロピレングリコールである。好適な糖は グルコースである。 本発明の態様において、ポリアルコールは100da〜8,000da、好ましくは200〜7 ,000daの範囲、例えば6,000の分子量を有し、そして本発明の液体製剤の５〜75 ％、好ましくは10〜60％、特に20〜50％を占めることがある。 本発明の態様において、この液体製剤は水性製剤である。ラッカーゼは液状又 は固体（非晶質及び／又は結晶質）、一般には粒状、例えば液相に分散された状 態（即ち、スラリー）で存在していてよ い。更なる成分 本発明の液体製剤はラッカーゼ基質又は媒介剤を含んでいてもいなくてもよい 。 本発明の液体製剤の態様においては、ラッカーゼ基質又は媒介剤、例えば染料 前駆体を更に含んで成る（最終製品が染料組成物又は製品の場合）。これは、当 該製剤が酵素消費型であること、及びそのpHが注目のラッカーゼの至適pHを超え る特定の範囲内にあることを要する。 更なる成分には抗微生物剤、pH調節剤、分散剤、粘度調節剤及び／又は抗酸化 剤が挙げられる。抗微生物剤 ：抗微生物剤は微生物、例えば細菌、真菌生物、例えば糸状菌及び／ 又は酵母の増殖を阻害又は阻止する物質である。適当な抗微生物剤には、安息香 酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、ニパギン、パラベン等が挙げられる。Pr oxel（商標）は適当な抗微生物剤の商標である。分散剤 ：分散剤（即ち、分散固体物質の分離（例えば沈殿）を阻止又は遅延させ るのに役立つ物質）には、例えば所定の細く分割された粘土質（例えばカオリン （チャイナクレー）、ベントナイト、フラー土等）、いわゆる「解凝集ポリマー 」、並びに陰イオン型ポリマーの両親媒性材料が挙げられる。粘度調節剤 ：本発明の組成物の態様の粘度を上昇させるのに適当な物質の例には 様々なグレードのヒュームドシリカ（例えば、商標Aerosil，Cab-O-Sil又はTix- O-Silで販売）、ベントナイト、カオリン、細く分割された炭酸カルシウム、有 機粘土（例えばClaytone（登録商標））、並びにポリマー材料、例えばヒドロキ シプロピルセルロース（例えばNatrosil（商標））及びキサンタンゴムが挙げら れる。pH 調節剤 ：本発明の組成物の一定の態様の中に組込むために適当なpH調節剤（即 ち、本発明の組成物を水性媒体と接触させるとき、その媒体のpHを調整及び／又 は維持（即ち、緩衝）するのに役立ち、当該製剤のpH感受性成分（例えば、その 中に存在するラッカーゼ）と適合するpH値を供する）の例には、様々な無機及び 有機塩類、例えばリン酸二水素カリウム（KH₂PO₄）、炭酸水素ナトリウム（NaHC O₃）、酢酸カリウム(CH₃COOK)、酢酸ナトリウム（CH₃COONa）及びクエン酸二水 素カリウム、グリシンバッファー、トリス−Na−バッファーが挙げられる。抗酸化剤 ：本発明の製剤の所定の態様では、その製剤の中に、その製剤の酸化感 受性成分を酸化（例えば雰囲気酸素による）から守ることができる物質（抗酸化 剤）を組込むことが好都合でありうる。かかる物質には、例えば、塩類、例えば 有機系抗酸化剤、例えばメチオニン及びレシチンが挙げられる。本発明の液体製剤の調製 本発明の液体製剤の調製に関し、その中に組込むラッカーゼが当初とる形態に 主として依存して、数多くのアプローチが適用可能である。 ラッカーゼが不溶性な固体酵素調製品、例えば凍結乾燥又はスプレードライ微 顆粒の形態である場合、又は少なくとも液体の中での溶解度が低い形態として得 られる場合、それは単に水に分散させて水性液相とし、スラリーを形成すること ができる。 ラッカーゼ水性溶液として得られる場合、それは本発明の液体製剤の中に直接 用いてよい。ラッカーゼ基質 本発明との関係で使用する語「基質」とは、酵素により触媒され る反応における反応体である物質を意味する。 ラッカーゼ基質を本発明の製剤の中に組込むのが適当な場合、この目的のため に適当な酵素基質の種類は、注目のラッカーゼだけでなく、製剤の意図する用途 にも依存するであろう。 （ｉ）媒介剤：本発明の態様において、この液体製剤はラッカーゼを、媒介剤と して機能する可酸化性基質と一緒に含んで成る。この媒介剤は採用するラッカー ゼと一緒に利用するために適当な任意の媒介剤であってよい。媒介剤の例には下 記のものが挙げられる：ハライドイオン（例えば、クロリド及びブロミド）；一 定の金属イオン（例えばMn^2-）；フェノール系物質〔例えばアセトシリンゴン、 シリンガルデヒド、シリンジン酸、アルキルシリンゲート（例えばメチル、エチ ル、プロピル、ブチル、ヘキシル又はオクチルシリンゲート）、及びその他のシ リンジン酸エステル〔例えば、様々な分子量のポリエチレングリコール(PEG)の シリンゲートエステル、例えばPEG 4,000シリンゲート〕、エチル３−（４−ヒ ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）アクリレート、ｐ−ヒドロキシシンナ ミン酸、２，４−ジクロロフェノール、バニリン、７−ヒドロキシクマリン、６ −ヒドロキシ−２−ナトイン酸、及びｐ−ヒドロキシベンゼン−スルホネート〕 ；２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート） （ABTS；例えば、WO94/12620参照）；並びに10−メチル−、10−エチル−及び10 −プロピルフェノチアジン（例えば、WO94/12621参照）が挙げられる。その他の 適当な媒介剤は例えば、WO94/12619，WO94/12620及びWO94/12621に開示されてい る。 シリンゲート、フェノキサジン又はフェノチアジン型の媒介剤が本発明との関 連において一般に極めて適当であり、そしてそのいくつかの例はアセトシリンゴ ン、メチルシリンゲート、10−フェノチ アジンプロピオン酸、10−エチルフェノチアジン−４−カルボン酸、10−フェノ キサジンプロピオン酸及び10−メチルフェノキサジンである（WO94/12621に記載 ）。 媒介剤は一般に本発明の組成物の中に、当該組成物の10^-7〜10^-2mol／ｇの量 で、そして往々にして当該組成物の10^-5〜10^-3mol／ｇの量で存在する。 （ii）染料前駆体：本発明の製剤の更なる重要な態様はラッカーゼ（例えば上記 のラッカーゼのいずれか）を、水の存在下でラッカーゼ触媒型酸化（一般には酸 化性ラジカル形成）を受け、その後重合して特定の色の色素を形成する染料前駆 体の形態における１又は複数種の可酸化性基質と共に含んで成る製剤である。か かるラッカーゼ媒介型染料形成は繊維（例えばウール、綿及び／又は合成品）、 糸、毛皮、獣皮等の染色において、並びに例えば毛髪染色の如き利用に良好に適 することの見い出されたヒトパーソナルケアの分野における重要な工業的用途を 有する。 本明細書及び請求の範囲に用いる語「染料前駆体」とは、ラッカーゼの存在下 での酸化により強く発色した染料を供する個々の物質のみならず、対応の状況で の酸化によりそれ自体単独では強い色彩を有する生成物を供しないが、前記カテ ゴリーの強力に発色する物質存在下で酸化に委ねられたときに染料が発色する色 彩の改変をもたらす個々の物質をも包含することを意図する。染料の色彩全体に 対してかかる改変効果を及ぼす可酸化性物質（かかる物質は時折り「改質剤」と 称される）はかくして本発明との関連において採用する語「染料前駆体」の意味 の中に含まれる。 本発明の製剤の中に組込むために適当な染料前駆体の例には、限定することな く、芳香族ジアミン；ジ−アミノ置換化芳香族カルボン酸及びそのエステル類； アミノフェノール類；フェノール類；ナ フトール類；並びにシンナミン酸のフェノール系誘導体及びそのエステル類が含 まれる。 芳香族ジアミンの例には以下のものが挙げられる： ２−メチル−１，４−ジアミノベンゼン、 ４−メチル−ｏ−フェニレンジアミン、 １，４−ジアミノ−ベンゼン（ｐ−フェニレンジアミン）、 ２−メトキシ−ｐ−フェニレンジアミン、 ２−メチル−１，４−ジアミノベンゼン（ｐ−トルイレンジアミン）、 ２−クロロ−１，４−ジアミノベンゼン（ｏ−クロロ−ｐ−フェニレンジアミ ン）、 ４−アミノジフェニルアミン（Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン）、 １−アミノ−４−β−メトキシエチルアミノベンゼン（Ｎ−β−メトキシエチ ルｐ−フェニレンジアミン）、 １−アミノ−４−ビス−（β−ヒドロキシエチル）−アミノベンゼン、 （Ｎ，Ｎ−ビス−（β−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン、 １，３−ジアミノーベンゼン（ｍ−フェニレンジアミン）、 ２−メチル−１，３−ジアミノ−ベンゼン（２，６−ジアミノトルエン）、 ２，４−ジアミノトルエン及び ２，６−ジアミノピリジン。 ジ−アミノ置換化芳香族カルボン酸及びそのエステルの例には以下のものが含 まれる： ２，３−ジアミノ安息香酸、 ３，４−ジアミノ安息香酸、 及びそのエステル、例えば低級アルキルエステル（例えばメチル、エチル、プ ロピル、２−プロピル又はブチルエステル）。 アミノフェノール類の例には以下のものが含まれる： １−ヒドロキシ−２−アミノベンゼン（ｏ−アミノフェノール）、 １−ヒドロキシ−３−アミノベンゼン（ｍ−アミノフェノール）、 １−メチル−２−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン（３−アミノｏ−クレゾー ル）、 １−メチル−２−ヒドロキシ−４−β−ヒドロキシエチルアミノベンゼン（２ −ヒドロキシ−４−β−ヒドロキシエチルアミノートルエン）、 １−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン（ｐ−アミノフェノール）、 １−ヒドロキシ−４−メチルアミノベンゼン（ｐ−メチルアミノフェノール） 、 １−メトキシ−２，４−ジアミノベンゼン（２，４−ジアミノアニソール）、 １−エトキシ−２，３−ジアミノベンゼン（２，４−ジアミノフェネトール） 及び １−β−ヒドロキシエチルオキシ−２，４−ジアミノベンゼン（２，４−ジア ミノフェノキシエタノール）。 フェノール類及びナフトール類の例には以下のものが挙げられる： １，２−ジヒドロキシベンゼン（ピロカテコール）、 １，３−ジヒドロキシベンゼン（レゾルシノール）、 １，３−ジヒドロキシ−２−メチルベンゼン（２−メチルレゾルシノール）、 １，３−ジヒドロキシ−４−クロロベンゼン（４−クロロレゾルシノール）、 １，２，３−トリヒドロキシベンゼン（ピロガロール）、 １，２，４−トリヒドロキシベンゼン、 １，２，４−トリヒドロキシ−５−メチルベンゼン（２，４，５−トリヒドロ キシトルエン）、 １，２，４−トリヒドロキシトルエン、 １，５−ジヒドロキシナフタレン、 １，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）及び １−ヒドロキシナフタレン（α−ナフトール）。 シンナミン酸のフェノール系誘導体及びそのエステルの例には以下のものが含 まれる： ｐ−クマリン酸（即ち、４−ヒドロキシシンナミン酸）、 カフェイン酸（即ち、３，４−ジヒドロキシシンナミン酸）、 シナピニン酸（シナピン酸；即ち、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシシン ナミン酸）、 フェルリン酸（即ち、４−ヒドロキシ−３−メトキシシンナミン酸）、 及び任意のこれらのエステル、例えば低級アルキルエステル（例えば、メチル 、エチル、プロピル、２−プロピル又はブチルエステル）。 本発明との関連における染料前駆体としてのその他の注目の物質にはサリチル 酸（即ち、２−ヒドロキシ安息香酸）及びそのエステル（例えば、低級アルキル エステル、例えばメチル、エチル、プロピル、２−プロピル又はブチルエステル ）が含まれる。 特に考慮される染料前駆体の例には下記の化合物を含んで成る群の化合物が挙 げられる：ｐ−フェニレン−ジアミン(PPD)、ｐ−トルイレン−ジアミン(PTD)、 クロロ−ｐ−フェニレン−ジアミン、ｐ−アミノフェノール、ｏ−アミノフェノ ール、３，４−ジアミノトルエン、２−メチル−１，４−ジアミノベンゼン、４ −メチル−ｏ−フェニレンジアミン、２−メトキシ−ｐ−フェニレンジアミン、 ２−クロロ−１，４−ジアミノ−ベンゼン、４−アミノジフェニルアミン、１− アミノ−４−β−メトキシエチルアミノ−ベンゼン、１−アミノ−４−ビス（β −ヒドロキシエチル）−アミノベンゼン、１，３−ジアミノベンゼン、２−メチ ル−１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノ ピリジン、１−ヒドロキシ−２−アミノベンゼン、１−ヒドロキシ−３−アミノ ベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン、１−メチル−２ −ヒドロキシ−４−β−ヒドロキシエチルアミノベンゼン、１−ヒドロキシ−４ −アミノベンゼン、１−ヒドロキシ−４−メチルアミノベンゼン、１−メトキシ −２，４−ジアミノベンゼン、１−エトキシ−２，３−ジアミノベンゼン、１− β−ヒドロキシエチルオキシ−２，４−ジアミノベンゼン、フェナジン、例えば ４，７−フェナジンジカルボン酸、２，７−フェナジンジカルボン酸、２−フェ ナジンカルボン酸、２，７−ジアミノフェナジン、２，８−ジアミノフェナジン 、２，７−ジアミノ−３，８−ジメトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３− メトキシフェナジン、２，７−ジアミノ−３−メトキシフェナジン、３−ジメチ ル−２，８−フェナジンジアミン、２，２’−〔（８−アミノ−７−メチル−２ −フェナジル）イミノ〕ビスエタノール、２，２’−〔（８−アミノ−７−メト キシ−２−フェナジル）イミノ〕ビスエタノール、２，２’−〔（８−アミノ− ７−クロロ−２−フェナジル）イミノ 〕ビスエタノール、２−〔（８−アミノ−７−メチル−２−フェナジル）アミノ 〕エタノール、２，２’−〔（８−アミノ−２−フェナジル）イミノ〕ビスエタ ノール、３−アミノ−７−（ジメチルアミノ）−２，８−ジメチル−５−フェニ ルークロリド、９−（ジエチルアミノ）−ベンゾ〔α〕フェナジン−１，５−ジ オール、Ｎ−〔８−（ジエチルアミノ）−２−フェナジニル〕−メタンスルホン アミド、Ｎ−（８−メトキシ−２−フェナジニル）−メタンスルホンアミド、Ｎ ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−２，７−フェナジンアミド、３，７−ジメチ ル−２−フェナジンアミン、ｐ−アミノ安息香酸、例えばｐ−アミノ安息香酸エ チル、ｐ−アミノ安息香酸グリセリド、ｐ−アミノ安息香酸イソブチル、ｐ−ジ メチルアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸オクチル、ｐ−ジエ トキシアミノ安息香酸アミル、ｐ−ジプロポキシアミノ安息香酸エチル、アセチ ルサリチル酸、イサチン誘導体及び２，３−ジアミノ安息香酸。 （iii）ラッカーゼのためのその他の基質：ラッカーゼは食品用途又は高度に吸 水性の材料の調製のためのフェノール系置換基を含む多糖類（例えばコムギもし くはもみがら由来のアラビノキシラン又はテンサイ及び近縁植物由来のペクチン ）のゲル化を引き起こすために極めて適切であることが証明されている（例えば WO96/03440参照）。同様に、ラッカーゼはリグノセルロース材料（例えば木材パ ルプ）からのリグノセルロースベース製品及びフェノール系多糖類、例えば上記 のアラビノキシラン又はペクチンの調製において極めて有用な用途を有すること が証明されている（例えば、WO96/03546参照）。 例えば、適当なレベルのラッカーゼと、フェノール系多糖の形態におけるラッ カーゼ基質を含んで成る本発明の製剤を提供すること が適当であろう。かかる簡単に製造できる貯蔵安定製剤は上記の用途に利点のた めに採用できうる。 材料と方法 材料酵素 ： ４℃で保存した任意の副次的な活性をもたず、且つ20mMのトリスバッファーの 中で約pH7.0又は8.0で保存した高度に精製された組換ポリポルス・ピンシトゥス ラッカーゼ（3525LACU／ml）。 低温殺菌済み及び未低温殺菌組換ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ（ Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmarkより製造された水性濃縮物；Mettler乾 燥物質含有量18.5％ ｗ／ｗ；濃縮物１ｇ当り約50mgの純粋ラッカーゼタンパク 質）。 MESバッファー：（２−Ｎ−モルホリノ−エタンスルホン酸）（Sigma 8250） 。pHは３ＮのNaOH(Merck 1.06498)を用いて5.5に調整。マレイン酸1.0Ｍ マレイン酸37％paM^*）800380 23.2ｇ 脱ミネラル水、Milli-Q 200mlまで 23.2ｇのマレイン酸を秤量ボートの中で秤量し、そして150mlの水を連続撹拌 しながら加える。溶解するまで撹拌する。 定量的にこの溶液を200mlのメスフラスコに移し、そして水で目印まで増量さ せる。 ^*）pro analysi Merckトリスバッファー1.0Ｍ；ストック溶液 トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン 121.1ｇSigma T-1378 脱ミネラル水、Milli-Q 1.1ｌまで トリスバッファーを秤量ボートで秤量し、そして800mlの水を連続撹拌しなが ら加える。溶解するまで撹拌する。 定量的にこの溶液を１ｌのメスフラスコに移し、そして水で目印まで増量する 。トリスバッファー25mM；pH7.50 トリスバッファー1.0Ｍ 25.0ml マレイン酸、1.0Ｍ 5.0ml 脱ミネラル水 １ｌまで pHを7.50±0.05に調整 50mlのトリスバッファー1.0Ｍ（メスシリンダー）を１ｌのメスフラスコの中 に注ぎ、そして約700mlの水を加える。ここで５mlのマレイン酸１Ｍを加える。p Hを7.50±0.05に調整し、そして水で目印まで増量する。（pHはHClでは調整せず 、その理由はラッカーゼ酵素に対する阻害効果にある）。希釈培地 PEG 6000 paM 807491 25.0ｇ トリトンX-100，Sigma T-9284 5.0ｇ Milli-Q水 0.5ｌまで 25.0ｇのPEG 6000及び5.0ｇのトリトンＸ−100を秤量ボートで秤量し、そして 連続撹拌しながら400mlの水を加える。溶解するまで撹拌する。 定量的にこの溶液を0.5ｌのメスフラスコに移し、そして水で目印まで増量す る。シリンガルダジン0.56mM；ストック溶液 シリンガルダジン無水物Sigma S-7896 10.0mg エタノール96％ 50ml シリンガルダジンを50mlのメスフラスコの中で秤量し、そして50 mlのエタノールを加える。溶解するまで撹拌する（約３時間）。シリンガルダジン0.28mM；48％エタノール シリンガルダジン0.56mM 25.0ml 脱ミネラル水 Milli-Q 50mlまで 25mlのシリンガルダジン0.56mM（ピペット一杯分）を50mlのメスフラスコに移 す。水で目印まで増量する。試験の検定：シリンガルダジン0.056mM；48％エタノール シリンガルダジン0.28mM 2ml エタノール 96％ 4ml 脱ミネラル水 Milli-Q 10mlまで この溶液は６％のエタノールに対して測定して、360nnで約2.2の吸収を有すべ きである。エタノール６％ エタノール 96％ 62.5ml 脱ミネラル水 Milli-Q 1000mlまで 62.5mlのエタノール96％（メスシリンダー）を１ｌのメスフラスコに移す。水 で目印まで増量する。 トリスNa−バッファー（製剤中20mM） グリシンバッファー リン酸バッファー ソルビトールシロップ（製剤中60％の乾燥物質） PEG 6,000(製剤中30％又は60％の乾燥物質) PEG 600(製剤中30％又は60％の乾燥物質) Proxel バッファー用イオン水 トリトン X-100 シリンガルダジン（Sigma S-7896） マレイン酸（Merck 800 380） トリス（SIGMA 7-9 T-1378）装置 <COBAS>FARA遠心分析器（Roche） 光度計 島津UV 2101 PC 方法ラッカーゼ活性の測定（LACU） LACU法はポリポルス・ピンシトゥス及びその他のラッカーゼの酵素活性の測定 のために利用できる。 ラッカーゼ活性は好気的条件下でのシリンガルダジンの酸化により測定する。 発色する紫色を530nmで光学測定する。分析条件は19mMのシリンガルダジン、23. 2mMの酢酸バッファーpH5.5，30℃，１分の反応時間とする。 １ラッカーゼ単位（LACU）はこれらの条件下で１分当り1.0マイクロモルのシ リンガルダジンの変換を触媒する酵素の量である。ラッカーゼ活性の測定（LAMU） LAMU法はミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼの活性を測定するために用 いる。１ラッカーゼ単位（LAMU）は下記の条件下で１分当り1.0マイクロモルの シリンガルダジンの変換を触媒する酵素の量である。 ラッカーゼはテトラメトキシ−アゾ−ビスメチレンキノンを形成するシリンガ ルダジンの酸化を好気条件下で触媒する。発色する紫色を530nmで光学測定する 。分析条件は16.5マイクロモルのシリンガルダジン、20.3mMのトリス／マレイン 酸バッファーの反応溶液中でpH7.5，30℃、反応時間１分とし、酵素活性域は0.0 006〜0.0028LAMU／mlである。 検出限界（LOD） ：0.005LAMU／ml 定量検出限界（LOQ） ：0.01LAMU／ml 測定域 ：0.01〜0.044LAMU／ml この計算は１分当りの吸収変化に基づき、これは酵素活性と比例し、反応時間 及び酵素濃度と直接関係にある。 安定で均質なサンプルを活性レベルの決定のためのレベルコントロールサンプ ルとして用いる。レベルコントロールサンプルを希釈剤(１リットルにMilli-Qメ スアップした50ｇのPEG 6,000)で0.025LAMU／mlの予測活性にまで希釈する。サ ンプルは分析前15分保存する。未知のラッカーゼ試験サンプルの分析を例えば<C OBAS>FARA遠心分析器で実施する。 <COBAS>FARAプログラム オペレーションＴ：空ローターをセルキャビティー内の温度に至るまで回転させ る。 オペレーションＰ：25μｌのレベルコントロールサンプル又は試験サンプル、20 μｌの脱ミネラル水(Milli-Q)及び325μｌのバッファー(即ち、25mMのトリス／ マレイン酸バッファー，pH7.5)をローター内の対応キャビティーに導入する。 オペレーションＩ：ローターが加速すると、バッファー及びサンプルはセル内で 混合される。 オペレーションSR：30μｌの基質（即ち、0.56mMのシリンガルダジン）をロータ ー内の最小キャビティーに導入する。 オペレーションＡ：ローターが加速し、そして遠心すると、気質はセル内で混合 される。レベルコントロールサンプル及び未知のラッカーゼ試験サンプルの双方 で25回の吸収測定を行う（５秒間隔）。12回目 及び24回目の吸収測定値（60〜120秒）をΔABS／分の計算のために用いる。活性 は<COBAS>FARA測定値に基づき〔Ｕ／ml〕として計算する。 以下の計算を行う： Ａ＝<COBAS>FARA測定平均値の〔Ｕ／ml〕〔LAMU／ml〕 Vol−サンプル希釈のために用いたチューブ〔ml〕 Ｄ＝溶解サンプルの希釈率〔ml／ml〕 Ｗ＝重量〔ｇ〕 この活性値は下記の計算により活性値へと換算する。 Ａ＝Ｆ×ΔABS／min ΔABS／min＝<COBAS>FARAにより計算した、530nmで１分当りの吸収変化 Ｆ＝0.154^{**) *}）10^-3＝マイクロモル／リッターからマイクロモル／mlへの変換 ^**）1.6cmのサンプル経路にて Ｖ＝<COBAS>FARA中の反応混合物の総容量〔Ｌ〕 ｖ＝反応混合物中の試験容量〔Ｌ〕 Ｅ＝530nmでのマイクロモラー励起係数〔0.065／ｌcmのサンプル経路（Baeur ，R．ら（1971）Anal．Chem．43（3）421-5 ）〕。 ｂ＝サンプル経路（cm）。総容量Ｖは、1.6cmのセル内サンプル経路ｂに対応 して400mlである。 実施例 実施例１至適pHでのバッファー中のポリアルコール抜きでのＭ．サーモフィララッカーゼ 及びポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼの貯蔵安定性 Ｍ．サーモフィララッカーゼ及びポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼをその 至適pH（即ち、pH6.5及び5.5、それぞれ）で40℃で16日保存した。 Ｍ．サーモフィララッカーゼを25mMのトリス／HClバッファーに溶かし、そし てこのpHをpH6.5に調整し、1000LAMU／mlの活性にした。ポリポルス・ピンシト ゥスラッカーゼを25mMのMESバッファーに溶かし、そしてpHをpH5.5に調整し、10 00LAMU／mlの活性にした。 溶解した酵素を４℃及び40℃にそれぞれ置き、そしてサンプルを24時間、３日 、７日及び16日目に分析するために取り出した。 比残留活性は４℃に保った対応の製剤に関連する（ブラインド）、即ち、４℃ での残留活性が100％の残留活性と考える。この試験の結果を図５に示す。 16日後、40℃でのＭ．サーモフィララッカーゼ及びポリポルス・ピンシトゥス の比残留活性はそれぞれ３％及び８％であった。 実施例２ポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼの貯蔵安定性（14日） 高度に精製されたポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼ（10LACU ／ｇ）及び２種類のポリアルコールを含んで成る液体製剤の貯蔵安定性をpH7.0 ，8.0及び9.0において試験した。 表１及び表２に示すサンプルを調製し、そして14日間保存した。保存後の残留 ラッカーゼ活性を対応の条件下での４℃のサンプルのラッカーゼ活性を基準に試 験した。 表１及び表２からポリアルコールの存在下で改善された貯蔵安定性が得られる ことがわかる。 実施例３ポリポルス・ピンシトゥスラッカーゼの貯蔵安定性（４週間） 実施例１記載の試験をPEG6,000について40℃で繰り返したが、貯蔵期間は４週 間とした。 表３からわかる通り、４週間後では高めのpH値で大半の残留活性が保持されて いた。 実施例４ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼの貯蔵安定性 組換ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ(120LAMU／ｇ)と30％又は60％ のPEG 6,000及びPEG 600とを含んで成る液体溶液の貯蔵安定性をpH7.0，8.0及び 9.0において試験した。 下記の成分をこの試験において用いた： ＡＩ：PEG 6000を30又は60％として ＡII：PEG 600を30又は60％として Ｂ ：20mMのトリス／マレイン酸バッファーでpH8.0又は9.0 貯蔵：製剤をゴムシール蓋の付いた20mlのサンプル容器の中で保存した。蓋を閉 める前にこの容器を真空にし、そして真空はアルゴンで破った。このようにして 製剤を不活性ガス雰囲気下で保存した。 貯蔵温度：４，25及び40℃ サンプリング時期：１，２及び４週間 表４はPEG 6000を含んで成る製剤の貯蔵安定性試験の結果を示す PEG 600を含んで成る製剤の貯蔵安定性試験の結果を表５に示す。 表４及び表５からわかる通り、ポリアルコールとしてミセリオフソラ・サーモ フィララッカーゼ及びPEG 6,000又はPEG 600をポリアルコールとして含んで成る 液体製剤は改善された貯蔵安定性を有する。更に、図１から、大半の残留酵素活 性が30％のPEG 6,000を含んで成るpH9.0の製剤に関して維持される。 実施例５ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼの貯蔵安定性 ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ、モノプロピレングリコール(MPG) 又はグリセロール及びバッファーを含んで成る液体製剤のpH９及び10での貯蔵安 定性。 表６に示す下記の製剤は全て ・ 320〜370LAMU／ｇ ・ 0.2％のProxel を含んで成る。 ^*製剤no．９は低温殺菌済み原材料を基礎とする。製剤no．１〜８は未処理原 材料を基礎とする。結果 ： ４週間の貯蔵後の残留活性を図２に示す。 活性値は全て同一期間内で４℃に保存した対照サンプルの平均値の活性のパー センテージとして計算した（０，２及び４週目の結果に基づく平均値）。 これらの結果は、全ての製剤が25℃で４週間貯蔵後に活性の80％以上を維持す ることを示した。40℃で貯蔵後では、ボラックスpH９を含んで成る製剤及びブラ インド（pHを９に調整し、そしてその他のバッファーは加えていないNaOH製剤） を除く全ての製剤も、初期活性の少なくとも80％を維持した。 実施例６貯蔵安定性に対する様々なパラメーターの効果 ・MPGをグリセロールに置き換える、及び ・MPGの量を増やす、及び ・低温殺菌済みの原材料を適用する、 ことの残留酵素活性に対する影響を試験した。 下記の製剤（表７に示す）を試験し、全て ・320〜370LAMU／ｇ ・0.2％のProxel（商標） を含んで成る。 ^*製剤４は低温殺菌済み原材料を基礎とする。結果 ： 試験の結果を図３に示す。ミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼを含んで 成る全ての液体製剤が４週間後に80％以上の残留活性を有していた。 実施例７様々なpHでのＭ．サーモフィララッカーゼの貯蔵安定性 10％のMPG及び0.2％のProxel（商標）を含んで成る0.25Ｍのグリシンバッファ ーを含んで成る液体製剤中のミセリオフソラ・サーモフィララッカーゼ(250LAMU ／ｇ)の残留活性を試験した。 この試験の結果を図４に示す。ラッカーゼはpH9.0で最も安定であり、25℃及 び40℃のそれぞれでの４週間の貯蔵後に93％及び84％の活性が維持される。 実施例８40 ℃で21週間のＭ．サーモフィララッカーゼの貯蔵 Ｍ．サーモフィララッカーゼを液体製剤１及び２それぞれの中で40℃で21週間 保存した(pH9.0)。 製剤１： 250LAMU／ｇ（又はｇ当り3.1mgの酵素タンパク質） 10％のｗ／ｗのプロピレングリコール 0.2％のProxel（商標） 0.25Ｍのグリシンバッファー（２Ｍのグリシンバッファー由来、pHは４ＮのNaOH でpH9.0に調整） 成分は全てよく撹拌し、pHはpH9.0±0.1に調整し、そして脱ミネラル水を最終 容量となるまで加える。 製剤２： 250LAMU／ｇ（又はｇ当り3.1mgの酵素タンパク質） 10％ ｗ／ｗのプロピレングリコール ３％ ｗ／ｗのグルコース ３％ ｗ／ｗのProxel（商標） 0.25Ｍのグリシンバッファー（２Ｍのグリシンバッファー由来、pHは４ＮのNaOH でpH9.0に調整） 成分は全てよく撹拌し、pHはpH9.0±0.1に調整し、そして脱ミネラル水を最終 容量となるまで加える。 この試験の結果を４℃に保った対応の製剤（ブラインド）と関連させ、即ち、 ４℃での残留活性を100％の残留活性と考慮した。 図６からわかる通り、40℃で20週間の貯蔵後、残留活性は製剤１（10％ ｗ／ ｗのプロピレングリコール）において約65％であり、そして製剤２（10％ ｗ／ ｗのプロピレングリコール＋３％ ｗ／ｗのグリコース）では約90％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ヘンリクセン，ロッテ ルグホルム デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体製剤であって： （ｉ）ラッカーゼ； （ii）少なくとも一種のポリアルコール； を含んで成り、当該ラッカーゼの至適pHよりもアルカリ性であるpHを有する液 体製剤。 ２．前記ポリアルコールがポリマーもしくはそのモノマー、又は糖、例えば単 糖、二糖、オリゴ糖もしくは多糖である、請求項１記載の液体製剤。 ３．前記ポリアルコールがポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリメチレ ングリコール(PMG)、ポリエチレングリコール（PEG）を含むポリアルキレングリ コール類(PAG)、メトキシポリエチレングリコール類（mPEG）及びポリプロピレ ングリコール類、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレン−マレイン酸無水 物共重合体、ポリスチレン−リンゴ酸無水物共重合体、カルボキシメチル−デキ ストラン類を含むデキストラン類、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロ ース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセル ロース及びヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース類、キトサンの加水 分解物、デンプン、例えばヒドロキシエチルデンプン及びヒドロキシプロピルデ ンプン、グリコーゲン、グリセロール、ソルビトール、アガロース及びそれらの 誘導体、グアーゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペ クチン、アルギン酸加水分解物、バイオポリマー、ソルビトール、グルコース、 マンノース、ガラクトース、アラビノース、グロース、キシロース、トレオース 、ソルボース、フルクトース、グリセロール、マルトース、セロビオース、スク ロース、アミ ロース、アミロペクチン、モノプロピレングリコール(MPG)である、請求項２記 載の液体製剤。 ４．前記ポリアルコールとしてポリマー及び／又は糖を用いる、請求項２〜３ のいずれか１項記載の液体製剤。 ５．前記ポリマーがポリアルキレンオキシド(PAO)、好ましくはポリアルキレ ングリコール(PAG)、特にプロピレングリコールである、請求項２〜４のいずれ か１項記載の液体製剤。 ６．前記糖がグルコースである、請求項２〜４のいずれか１項記載の液体製剤 。 ７．前記ポリマー及び／又は糖が200da〜8,000da、好ましくは400〜7,000da、 特に6,000の分子量を有する、請求項２〜６のいずれか１項記載の液体製剤。 ８．前記ポリアルコールが当該液体製剤の５〜75％、好ましくは10〜60％、特 に20〜50％を占める、請求項１〜７のいずれか１項記載の液体製剤。 ９．当該液体製剤のpHを調節するためにpH調節剤を添加している、請求項１〜 ８のいずれか１項記載の製剤。 10．当該液体製剤のpHが前記ラッカーゼのpHよりも0.5〜5.5pH単位、好ましく は１〜４pH単位アルカリ性である、請求項１〜９のいずれか１項記載の製剤。 11．前記ラッカーゼが植物又は微生物起源、特に細菌又は真菌起源である、請 求項１〜10のいずれか１項記載の液体製剤。 12．前記ラッカーゼがミセリオフソラ属の種の糸状菌、特にミセリオフソラ・ サーモフィラに由来する、請求項11記載の製剤。 13．当該製剤のpHが７〜12、好ましくは7.5〜11である、請求項12記載の製剤 。 14．前記ラッカーゼがポリポルス属の種の糸状菌、特にポリポル ス・ピンシトゥスに由来する、請求項11記載の製剤。 15．当該製剤のpHがpH5.5〜11、好ましくは6.5〜9.5の範囲に属する、請求項1 4記載の製剤。 16．抗微生物、分散剤及び／又は粘度調節剤を更に含んで成る、請求項１〜15 のいずれか１項記載の製剤。 17．水性製剤である、先の請求項のいずれか１項記載の製剤。 18．ラッカーゼの貯蔵安定性を改善するための方法であって、当該ラッカーゼ の至適pHよりも0.5〜5.5pH単位アルカリ性であるpHにおいてポリアルコールの存 在下で当該ラッカーゼを貯蔵することによる方法。 19．パーソナルケア用途、例えば毛髪染色のための請求項１〜17のいずれか１ 項記載のラッカーゼを含んで成る液体製剤の利用。 20．布帛の漂白又は染色のための請求項１〜17のいずれか１項記載のラッカー ゼを含んで成る液体製剤の利用。