WO2004078958A1

WO2004078958A1 - 中性フェノールオキシダーゼ

Info

Publication number: WO2004078958A1
Application number: PCT/JP2004/002725
Authority: WO
Inventors: Yoshio Tsujino; Katsunori Endo; Abul Khaer Mohamad Quamrul Hasan; Kaori Otsuka
Original assignee: Mandom Corporation
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-04
Publication date: 2004-09-16
Also published as: EP1602718B1; JP4156625B2; ATE411382T1; US20060021152A1; JPWO2004078958A1; EP1602718A1; EP1602718A4; DE602004017139D1

Description

明細書

中性フエノールォキシダーゼ技術分野

本発明は、種々の基質に対して、基質による至適 p Hの変動が小さく、中性付近で高い酵素活性を有する中性フエノ一ルォキシダ一ゼ及ぴその生産方法並びに該中性フエノールォキシダ一ゼに対する抗体に関する。より詳しくは、繊維や毛髪の染色等に有用な中性フエノ一ルォキシダ一ゼ及びその生産方法、並びに該中性フエノ一ルォキシダーゼを特異的に認識する抗体に関する。背景技術

フエノール化合物、ポリフエノール化合物等の種々の基質に対して酸化作用を有する酸化酵素は、主に、ペルォキシダーゼとフエノールォキシダ一ゼとの 2つのグループに分類される。

前記ペルォキシダーゼは、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、反応系中に過酸化水素の存在を必要とする。一方、フエノールォキシダーゼは、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、分子状酸素の存在を必要とする。

したがって、既知の酸化酵素類の中でも、前記フエノールォキシダーゼは、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で中間体としてのラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適している。

それゆえ、臨床分析、バイオセンサ一、パルプ及び繊維の漂白、合成板の製造、木質の改善フエノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造、有機化合物の合成染色及び抜染、洗濯時の色移り防止、廃液中のフエノール及びァニリン化合物の除去、毒性化合物の解毒、内分泌撹乱物質の分解、ジュースの混濁防止、食品の苦渋味の除去、家畜飼料の体内消化の促進、悪臭の抑制、化石燃料の脱硫、有害環境物質の分解処理等の多方面へのフエノールォキシダーゼの幅広い応用が期待されている。

また、 1ーヒドロキシベンゾトリアゾール、 2, 2' —アジノービス（3—ェチルベンゾチアゾリン— 6—スルホン酸) (以下、 ABTSと略す）、 1一二卜ロソー 2 _ナフ 1 ^一ルー 3, 6—ジスルホン酸（以下、 NNSと略す）等のメデイエ一夕一を用いて反応を行なうことにより、従来触媒されにくかった（あるいは、触媒されなかった）反応をも効率よく行なうこともできる〔国際公開第 96/16165号パンフレツト〕。例えば、メデイエ一夕一としてフエノチアジン— 10—プロピオン酸を用いた場合、フエノールォキシダ一ゼによるインジゴの分解反応を効率よく行なうことができることが知られている。また、フエノールォキシダ一ゼ含有物と、フエノールォキシダーゼ · メデイエ一ターを含有する組成物とを併用することにより、ダイォキシンの分解を行なうことができることが開示されている〔特開 2001-037465号公報〕。

多くの潜在的な工業的利用については、反応効率等の観点から、反応 PHは中性及びアルカリ性領域が適しており、特に中性での利用は、環境や人体等に対する影響が少ない温和な条件下での反応が可能である等の、数多くの利点を有する。

前記フエノールォキシダーゼとしては、ラッカーゼ、チロシナ一ゼ、ポリフエノールォキシダーゼ（カテコールォキシダーゼ）ァスコルビン酸ォキシダーゼ、又はピリルビンォキシダーゼ等が挙げられる。

ただし、チロシナーゼは、モノフエノール化合物、及び、オルト—ジフエノール化合物の直接的な酸化（発色）を触媒するが、パラ—ジフエノール化合物及びパラージアミン（フエ二レンジァミン）化合物の酸化を触媒しないという特徴がある〔メイヤー (M a ye r ) 及び/、レル (Ha r e 1 )， Phy t o c liem. 18, 193— 215, 1979〕。前記フエノールォキシダ一ゼは、従来から種々の植物、細菌類及び真菌類等に見出されている。例えば、植物では、ウルシ科（An ac a r d i a c e a e)の分泌性導管、祧類、栗類、マキ科（Podo c a r p ac e a e) 等において、前記フエノ一ルォキシダ一ゼが見出されている。真菌類では不完全菌亜門（D e u t e r omy c o t i n a) に属する、ァスペルギルス（As ρ e r g i 1 1 u s)、ボ卜リテイス (B o t r y t i s)、ミロセシウム (My r o t h e c i um)、ぺニシリウム (P e n i c i 1 1 i um)、ぺスタ口チア（P e s t a 1 o t i a)、リゾクトニア（Rh i z o c t o n i a) 等；担子菌亜門（B a s i d i omy c o t i n a) に属する、プロイロ一タス（P 1 e u r o t u s；)、レンティナス（Len t i nu s)、ポリポラス（Po l y p o r u s) トラメテス（T r ame t e s),コリオラス (C o r i o 1 u s)等；子嚢菌亜門（A s c omy c o t i n a)に属するポドスボラ（P o d o s p o r a)、ノイロスポラ（Ne u r o s p o r a)、モノシリウム（Mo n o c i 1 1 i urn) 等において、前記フエノールォキシダ一ゼが見出されている。細菌では、バチルス（B a c i 1 1 u s)、ァゾスピリゥム (Az o s p i r i 1 1 um)、ストレプトミセス (S t r e p t omy c e s )、ァェロバクタ（Ae r ob ac t e r) 等において、前記フエノールォキシダ一ゼが見出されている〔ヨシダ（Yo s h i d a)， J. Ch em. S o c. 43， 472, 1883〕。

これらの中で、担子菌（B a s i d i omy s e t e s) (木材腐朽菌類等、中でも白色腐朽菌等) であるキノコでは、例えば、スェヒロタケ (S c h i z ophy l 1 u m c ommu ne)、力ワラタケ (Co r i o 1 u s v e r s i c o l o r)、ヒイロ夕ケ (Pyc nopo r u s c o c c i neu s)、ヒラ夕ケ (P l e u r o t u s o c t r e a t u s )、べッコゥ夕ケ（F om i t e 1 1 a f r a x i n e a)等において、前記フエノールォキシダ一ゼが見出されている〔ゥラ一（U 1 1 a h)及びエバンス（E v an s), Αρ ρ 1. M i c r o i o l. B i o t e c no l., 53, 230— 234, 2000〕。

しかし、フエノールォキシダーゼの多くは、種々の基質に対する酵素活性の至適 pH を酸性側に有し、使用用途が限定されるという欠点がある。また中性やアルカリ性に至適 p Hを有するフエノ一ルォキシダーゼでも、用いる基質によつて至適 p Hが大きく変動し、中性付近で種々の基質に対して効率よく作用しないという欠点がある。

また、ィルペックス ·ラクテウス ( I r p e X 1 a c t e u s)、ォゥリキユラリア、ポリ卜リカ (Au r i c u 1 a r i a p o 1 y t r i c h a ) ガノデルム ·ルシダム (G anod e r m l uc i d um)、コプリナス ·ミカセウス（C o p r i n u s m i c a c e u s )> タエダレオフ。ンス ·スチラシナ (Dae d a l e op s i s s t y r a c i n a) 及びフラムリナベレティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 t i p e s) には、ラッカーゼが見出されており、なかでも、ィルペックス ·ラクテウス（I r p e x 1 a c t e u s) のラッカーゼは、 pH6. 0付近の反応条件下に、 4ーァミノアンチピリンとフエノ一ルとを酸化縮合して発色する活性を示すことが見出されている（特開昭 60— 156385号公報）。

しかしながら、前記ラッカーゼは、酸性条件で培養することにより見出される酵素でめる。

発明の開示

本発明は、繊維や毛髪の染色等を可能にし、さらには、環境、人体等への影響を低減させることができる手段を提供することを目的とする。本発明は、種々の化合物、特に、フエノール化合物、アミノフエノール化合物及びジアミン化合物に対して中性付近に至適 p Hを有すること中性 p Hから弱アル力リ性 p Hまでの広範囲で高い安定性を示すこと、基質による至適 p Hの変動が小さいこと等の特性を有するフエノールォキシダーゼ、具体的には、中性フエノールォキシダ一ゼを提供することを目的とする。また、本発明は、前記中性フエノールォキシダーゼを、効率よく、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができる生産方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記中性フエノールォキシダーゼの回収精製等を可能にする抗体を提供することを目的とする。また、本発明は、種々の染料、具体的には、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミン化合物等による染色が可能な染色方法及び取扱いが簡便である染色用組成物を提供することを目的とする。すなわち、本発明の要旨は、

〔 1〕以下の特性：

(1) 至適 pH : 5. 0〜7. 0

( 2 ) 基質特異性

i ) N, N—ジメチル一パラーフエ二レンジァミン、オルト一ァミノフエノール、 2, 6—ジメトキシフエノール、 1, 3—ジヒドロキシナフトール及び 4ーヒドロキシィンドールそれぞれの酸化による発色反応を p H 6. 5付近で触媒する

i i) リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する

を有する中性フェノ一ルォキシダーゼ、

〔2〕下記 (3) 〜 (7)：

(3) 28 kD a (S D S-P AGE法により算出)

(4) pH安定性： pH8. 0〜9. 0において、 30 °Cで 20時間のインキュベーション条件下、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持する

( 5 ) 至適温度： 30〜 50

(6) 熱安定性：

I) 0°C〜30 において、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィヾ一ション前の活性に対し、少なくとも 80 %の相対残存活性を維持する II) 0°C〜30 において、 PH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

(7) 等電点：約 7. 4

の特性、又は

下記（3') 〜（7') ：

(3，） 35 kD a (SDS- PAGE法により算出）

(4') pH安定性： pH7. 0〜10. 0において、 30 °Cで 20時間のインキュベーション条件下、少なくとも 75 %の相対残存活性を維持する

(5 ') 至適温度： 30〜60°C

(6') 熱安定性：

I ') 0°C〜5 O :において、 ρΗ7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

II') 0°C〜50°Cにおいて、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも 70 %の相対残存活性を有する

(7') 等電点：約 6. 8

の特性、又は

下記（3，，）〜（7'，）：

(3 ") 45 kD a (SDS- P AGE法により算出）

(4") pH安定性： pH8. 0-10. 0において、 30 °Cで 20時間のインキュベ一ション条件下、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持する

(5 ") 至適温度： 30〜60

(6") 熱安定性：

I ") 0°C〜30°Cにおいて、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも 80 %の相対残存活性を維持する II") 0°C〜40°Cにおいて、 ρΗ9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する (7") 等電点：約 6. 8

の特性

をさらに有する、前記〔1〕記載の中性フエノールォキシダ一ゼ、

〔3〕フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌が生産する、前記〔 1〕又は〔2〕記載の中性フエノールォキシダーゼ、

〔4〕フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌が、エノキタケ〔フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s：)〕に属する担子菌である、前記〔1〕〜〔3〕いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダーゼ、

〔5〕エノキ夕ケ〔フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s)〕に属する担子菌が、フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s)] I F〇 30601株である、前記〔1〕〜〔4〕いずれか 1項に記載の中性フェノールォキシダーゼ、

〔6〕フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌を、 pH6. 0〜12. 0で培養することを特徴とする、中性フエノールォキシダーゼの生産方法、

〔7〕中性フエノールォキシダ一ゼが、前記〔1〕又は〔2〕記載の中性フエノールォキシダーゼである、前記〔6〕記載の生産方法、

〔8〕前記〔1〕〜〔5〕いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダーゼに対する抗体、

〔9〕前記〔1〕〜〔5〕いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダ一ゼを含有してなる染色用組成物、

〔10〕染料をさらに含有してなる、前記〔9〕記載の染色用組成物、並びに〔1 1〕前記〔1〕〜〔5〕いずれか 1項に記載の中性フエノ一ルォキシダーゼの存在下に、染色対象物と染料とを接触させて、該染色対象物を染色することを特徴とする、染色方法、

に閧する。図面の簡単な説明

図 1は、フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s )

1 FO 30601株の DEAE—セルロース溶出画分の活性染色の結果を示す。図中、レーン 1は、パラ一フエ二レンジアミンを用いた活性染色の結果、レーン 2は、 2, 6 ージメトキシフエノールを用いた活性染色の結果、レーン 3は、オルト—アミノフエノールを用いた活性染色の結果をそれぞれ示す。

図 2は、イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図 2中、菱形は、

28 Onmにおける吸光度（A280) に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、三角は、 40 Onmにおける吸光度（A400) に基づく、各フラクション中の糖質量の変化を示し、四角は、 47 Onmにおける吸光度（A470) に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示し、十字は、塩化ナトリウム濃度（M) を示す。

図 3は、中性フェノールォキシダーゼ Iのゲル濾過クロマトグラフィ一のクロマトグラムを示す。図 3中、菱形は、 28 Onmにおける吸光度（A280) に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、 470 nmにおける吸光度（A470) に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示す。

図 4は、中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iのゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図 3中.. 菱形は、 28 Onmにおける吸光度（A280) に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、 470 nmにおける吸光度 (A470) に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示す。図 5は、中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iの精製スキームを示す。

図 6は..中性フエノールォキシダーゼ I I Iのイオン交換クロマトグラフィ一（DE AE—セルロース) のクロマトグラムを示す。図 6中、菱形は、 280 nmにおける吸光度（A 280) に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、 470 η mにおける吸光度 (A470) に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示し、直線は、塩化ナトリウム濃度（M) を示す。

図 7は、中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iのイオン交換クロマトグラフィー（Q— セファロ一ス）のクロマトグラムを示す。図 7中、菱形は、 28 Onmにおける吸光度 (A280) に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、 47 Onmにおける吸光度（A470) に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示し、直線は、塩ィ匕ナトリウム濃度（M) を示す。

図 8は、中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの精製スキームを示す。

図 9は、中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I I Iのゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図 9中、菱形は、 28 Onmにおける吸光度（A280) に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、 470 nmにおける吸光度（A470) に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示す。

図 10は、中性フエノールォキシダーゼ Iの至適 pHの結果を示す。図 10において、最大活性を 100とした場合の相対活性で示す。また、図 10において、パネル Aは、 2, 6ージメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、オルトーァミノフエノールを基質とした場合を示し、パネル Cは、パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合を示し、パネル Dは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。

図 11は、中性フエノールォキシダ一ゼ I Iの至適 pHの結果を示す。図 11において、最大活性を 100とした場合の相対活性で示す。また、図 1 1において、パネル A は、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、オルト—ァミノフエノールを基質とした場合を示し、パネル Cは、パラ一フエ二レンジアミンを基質とした場合を示し、パネル Dは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。

図 1 2は.,中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの至適 p Hの結果を示す。図 1 2において、最大活性を 1 0 0とした場合の相対活性で示す。また、図 1 2において、パネル Aは、 2 , 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、オルト― ァミノフエノールを基質とした場合を示し、パネル Cは、パラ一フエ二レンジアミンを基質とした場合を示し、パネル Dは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。図 1 3は、中性フエノールォキシダーゼ Iの p H安定性の結果を示す。なお、図 1 3 において、最大活性を 1 0 0とした相対残存活性で示す。また、図 1 3中、パネル A及び Bは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル C及び Dは、パラ一フエ二レンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図 1 3中、パネル A及び Cは、 1時間後の p H安定性を示し、パネル B及び Dは、 2 0時間後の p H安定性を示す。

図 1 4は、中性フエノールォキシダーゼ I Iの p H安定性の結果を示す。なお、図 1 4において、最大活性を 1 0 0とした相対残存活性で示す。また、図 1 4中、パネル A 及び Bは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル C及び Dは、パラ一フエ二レンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図 1 4中、パネル A及び Cは、 1時間後の p H安定性を示し、パネル B及び Dは、 2 0時間後の p H安定性を示す。

図 1 5は., 中性フエノールォキシダーゼ I I Iの p H安定性の結果を示す。なお、図 1 5において、最大活性を 1 0 0とした相対残存活性で示す。また、図 1 5中、パネル A及び Bは 2 , 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル C及ぴ D は、パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図 1 5中、パネル A 及び Cは、 1時間後の p H安定性を示し、パネル B及び Dは、 2 0時間後の p H安定性を示す。

図 1 6は、中性フエノ一ルォキシダーゼ I 中性フエノールォキシダ一ゼ I I , 及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの等電点電気泳動の結果を示す。

図 1 7は、中性フエノールォキシダーゼ Iの至適温度の結果を示す。なお、図 1 7において、最大活性を 1 0 0とした相対活性で示す。また、図 1 7中、パネル Aは、 2 , 6ージメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、パラーフエ二レンジァミンを基質とした場合を示す。

図 1 8は、中性フエノールォキシダ一ゼ I Iの至適温度の結果を示す。なお、図 1 8 において、最大活性を 1 0 0とした相対活性で示す。また、図 1 8中、パネル Aは、 2， 6ージメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、パラ—フエ二レンジァミンを基質とした場合を示す。

図 1 9は、中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの至適温度の結果を示す。なお、図 1 9において、最大活性を 1 0 0とした相対活性で示す。また、図 1 9中、パネル Aは、 2 , 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、パラ—フエニレンジァミンを基質とした場合を示す。

図 2 0は、中性フエノールォキシダーゼ Iの熱安定性の結果を示す。なお、図 2 0において、最大活性を 1 0 0とした相対残存活性で示す。また、図 2 0中、パネル A及び Bは、 p H 7 . 0における熱安定性を示し、パネル C及び Dは、 p H 9 . 0における熱安定性を示す。さらに、図 2 0中、パネル A及び Cは、 2 , 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル B及び Dは、パラ—フエ二レンジアミンを基質とした場合を示す。

図 2 1は、中性フエノールォキシダーゼ I Iの熱安定性の結果を示す。なお、図 2 1 において、最大活性を 1 0 0とした相対残存活性で示す。また、図 2 1中、パネル A及び Bは、 pH7. 0における熱安定性を示し、パネル C及び Dは、 pH9. 0における熱安定性を示す。さらに、図 21中、パネル A及び Cは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し .,パネル B及び Dは、パラーフエ二レンジァミンを基質とした場合を示す。

図 22は、中性フエノールォキシダーゼ I I Iの熱安定性の結果を示す。なお、図 2 2においてィンキュベ一ション前の酵素活性を 100とした場合の、相対残存活性で示す。また、図 22中、パネル A及び Bは、 pH7. 0における熱安定性を示し、パネル C及び Dは、 H9. 0における熱安定性を示す。さらに、図 22中、パネル Aおよび Cは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル B及び Dは、パラ—フエ二レンジァミンを基質とした場合を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の中性フエノールォキシダ一ゼは、以下の特性：

(1) 至適 pH： 5. 0〜7. 0

(2) 基質特異性

i ) N, N_ジメチルーパラ一フエ二レンジァミン、オルトーァミノフエノール、 2， 6—ジメトキシフエノール、 1， 3—ジヒドロキシナフトール及び 4—ヒドロキシィンドールそれぞれの酸化による発色反応を P H 6. 5付近で触媒する

i i) リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する

を有するフエノ一ルォキシダーゼである。

本発明の中性フェノールォキシダーゼは、基質の種類による至適 p Hの変動が小さいという優れた性質を有する。したがって、本発明の中性フエノ一ルォキシダーゼによれ «\多基質に対し、実質的に同一の反応 pH条件での反応を行なうことができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の中性フエノールォキシダーゼによれば、複数の化合物を基質として用いる場合でも、反応 pH条件の変更の工程を簡略化させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の中性フエノールォキシダーゼを繊維や毛髪の染色等に用いることにより、反応 pH条件の変更の工程を簡略化することができる。

本発明の中性フエノールォキシダ一ゼは、より具体的には、前記 (1) 及び (2) の特性に加え、下記 (3) 〜 (7)：

(3) 28 kD a (S D S- PAGE法により算出）

(4) 11安定性： 118. 0〜9. 0において、 30°Cで 20時間のインキュベーション条件下、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持する

(5) 至適温度： 30〜50°C

( 6 ) 熱安定性：

I) 0°C〜30°Cにおいて、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 80 %の相対残存活性を維持する

II) 0°C〜3 O において、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

(7) 等電点：約 7. 4

の特性、又は

下記（3') 〜（7')：

(3，） 35 kD a (SDS- PAGE法により算出）

(4') 11安定性： 0^^. 0~10. 0において、 30°Cで 20時間のインキュベ一ション条件下、少なくとも 75 %の相対残存活性を維持する

(5 ') 至適温度： 30〜60

(6') 熱安定性：

I ') 0°C〜50。Cにおいて、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する II') 0 〜 501において、 PH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 70 %の相対残存活性を有する

(7') 等電点：約 6. 8

の特性、又は

下記 (3") 〜 (7") ：

(3，，) 45 k D a (S D S- P AGE法により箅出)

(4") 11安定性： 118. 0〜： L 0. 0において、 30°Cで 20時間のインキュベーション条件下、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持する

(5 ") 至適温度： 30〜60°C

(6") 熱安定性：

I ") 0°C〜30°Cにおいて、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 80 %の相対残存活性を維持する

II") 0T：〜 40°Cにおいて、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

(7") 等電点：約 6. 8

の特性

をさらに有する、中性フエノールォキシダーゼである。なお、本明細書においては、前記（1)及び（2) と（3)〜（7) との特性を有する中性フエノールォキシダーゼを、「中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I」といい、前記 (1) 及び (2) と（3，）〜 (7 ') との特性を有する中性フエノ一ルォキシダーゼを「中性フエノ一ルォキシダーゼ I I J といい、前記 (1) 及び (2，) と (3") 〜 (7 ") との特性を有する中性フエノールォキシダーゼを「中性フエノールォキシダ一ゼ I I I」という。

本明細書において、「フエノールォキシダーゼ」とは、酸素存在下で、フエノ一ル化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミン化合物、複素環化合物等を基質として、触媒的に直接酸ィ匕する酸ィ匕酵素をいう。より具体的には、前記「フエノールォキシダーゼ」とは、パラーフエ二レンジァミン、 2 , 6—ジメトキシフエノール、カテコール.. A B T S、シリンガルダジンを直接酸化するが Lーチロシンを直接酸化しないフエノールォキシダ一ゼをいう。

また、本明細書において、「中性フエノールォキシダ一ゼ」とは、至適 p H 5 . 0〜 7 . 0、好ましくは、至適 p H 5 . 5〜7 . 0のフエノ一ルォキシダ一ゼをいう。前記フエノ一ル化合物としては、例えば、 2—メトキシフエノール、 2 , 6—ジメ卜キシフエノール、カテコール、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、 1一ナフトール、カテキン等が挙げられる。また、前記アミノフエノール化合物としては、例えば、オルト一ァミノフエノール、パラーァミノフエノール等が挙げられる。さらに、前記ジァミン化合物としては、例えば、オルト一フエ二レンジァミン、パラーフエ二レンジァミン等が挙げられる。前記複素環化合物としては、 4ーヒドロキシインド一ル、 5 ーヒドロキシインドール等が挙げられる。

本発明の中性フエノールォキシダーゼの酵素活性は、基質に対する酸化活性、染料に対する脱色活性等を測定することにより評価されうる。

本発明の中性フエノールォキシダーゼによる基質に対する酸化活性は、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミン化合物等を水素供与体として用いて酸素分子を還元する、基質の直接的な酸化反応を測定することによって求められうる。水素供与体としては、例えば、 2 , 6—ジメトキシフエノ一ル、オルトーァミノフエノール、パラーフエ二レンジアミン等を挙げることができる。前記酸化活性は、例えば、シリンガルダジン（5 3 0 n m)、 2 , 6ージメトキシフエノール及びパラ一フエ二レンジアミン ( 4 7 0 n m) , オルトーァミノフエノール ( 4 2 0 n m における吸光度の変化により測定される。具体的には、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0) 0. 896mlに、 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. lm 1を添加し、基質溶液を得る。この基質溶液と中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I又は中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I Iの酵素溶液 0. 004mlとを混合して、 2, 6—ジメトキシフエノールの酸化反応を開始させる。ついで、この 2, 6—ジメトキシフエノールの酸化反応を、 470 nmにおける吸光度の変化により測定することによって、前記酸化活性を求められうる。前記酸化活性は、各基質に応じた波長における吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U :ユニット）として定義される。

また、本発明の中性フエノールォキシダーゼによる染料に対する脱色活性は、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iの存在下、染料の吸収スベクトルの極大値（Amax) の減少を測定することによって求められうる。前記染料としては、例えば、ァシッドバイオレツド 17、エバンスブルー、ァシッドブルー 80等を挙げることができる。染料の脱色活性は、例えば、ァシッドバイオレツド 17 (55 0 nm)、エバンスブル一及びアシッドブル一 80 (630 nm) における吸光度の減少により測定される。

具体的には、ァシッドバイオレツド 17を用いる場合、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iを含む酵素溶液 0. 8mlに、 1. 0M リン酸ナトリゥム緩衝液（ p H 6. 5) 0. 1mlを添加し、ついで、 0. 2mg/m 1のァシッドバイオレツド 17水溶液 0. 1mlを混合して、得られた混合液について、 550 nmにおける吸光度の減少を測定することによって、脱色活性を求められうる。なお、前記脱色反応に関する酵素活性は、各染料に応じた波長における吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U :ユニット）として定義される。

本発明の中性フエノールォキシダーゼである中性フエノールォキシダーゼ I及ぴ中性フエノールォキシダ一ゼ I Iは、ゲル濾過法により算出した場合、いずれも約 72 k Daの分子量、 SDS— PAGEにより算出した場合、中性フエノールォキシダーゼ I は、 28 kD aの分子量、中性フエノールォキシダーゼ I Iは、 35 kD aの分子量を有する。また、本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼである中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I I Iは、ゲル濾過法により算出した場合約 45 kD aの分子量について SDS 一 PAGEにより算出した場合、 45 kD aの分子量を有する。本明細書において、前記分子量は、ゲル濾過ク口マトグラフィーを用いたゲル濾過法又は SDS— PAGE法により算出された値をいう。前記分子量は、例えば、目的のタンパク質を、ゲル濾過ク口マトグラフィ一に供して、一定流速の下での溶出液量を測定し、得られた測定値又は SDS— PAGE法に供して、移動度を測定し、得られた測定値と、分子量が既知である分子量マーカーを用いて作成された検量線とを比較することにより算出されうる。本発明の中性フエノールォキシダーゼである中性フエノールォキシダーゼ I、中性フェノールォキシダーゼ I I及び中性フェノールォキシダーゼ I I Iは、いずれも p H 5. 0〜7. 0の範囲で、高い酵素活性を有し、かかる pHの範囲において、最大活性に対して、少なくとも 50 %の相対活性を示す。

本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼは、前記 p H範囲で優れた酵素活性を示すため、水ベースの反応溶液を用いることができ、効率よく酵素反応を行なうために特別な p H 調整が必要とされないという優れた効果を発揮する。また、本発明の中性フエノールォキシダーゼは、水ベースの反応溶液を用いることができ、具体的には、例えば、特別な pH調整を行なっていない基質と酵素との水溶液でも効率よく反応を行なうことができるため、反応溶液による人体、環境への影響が少ないという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の中性フエノールォキシダーゼは、種々の基質、特に、フエノール化合物、アミノフエノール化合物及びジァミン化合物のいずれに対しても至適 p Hに大きな変動がなく中性付近の p Hで効率よく基質を酸化させることができる。

本発明の中性フエノールォキシダーゼは、具体的には、フエノール化合物、アミノフェノール化合物及びジァミン化合物を基質とする酸化反応において、中性付近、具体的には、 pH5. 0〜7. 0、好ましくは、 pH5. 5〜7. 0に至適 pHを有する。より具体的には、. 中性フエノールォキシダーゼ Iは.. 2, 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは約 5. 0〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 7. 0であり、オルトーァミノフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 5であり、パラーフエ二レンジアミンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 5であり、さらに至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 0であり、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 5、特に、約 6. 5である。一方、中性フエノールォキシダーゼ I Iは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 0〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 7. 0、さらに至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 0であり、オルトーァミノフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 0であり、パラ—フエ二レンジアミンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 5、さらに至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 0であり、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜約 7. 0、より至適な範囲として、約 5. 5〜約 6. 5である。また、中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 0〜約 7. 0、より至適な範囲として約 5. 5であり、オルトーァミノフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 0〜7. 0であり、パラーフエ二レンジアミンを基質として用いた場合、至適 pH は約 5. 0〜7. 0、より至適な範囲として、約 5. 0〜6. 0であり、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 0〜7. 0であり、より至適な範囲として、約 6 . 0である。

本発明の中性フエノールォキシダーゼである中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iは、いずれも、 i ) N, N—ジメチル一パラ一フエ二レンジァミン、オルトーァミノフエノール 2 , 6—ジメトキシフエノール、 1 , 3—ジヒドロキシナフトール及び 4—ヒドロキシィンドールそれぞれの酸化による発色反応を p H 6 . 5付近で触媒する

i i ) リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する

という基質特異性を示す。具体的には、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iは、いずれも、中性（p H 6 . 5 ) 条件下で、下記基質特異性：

1 ) オルト一フエ二レンジァミン、パラ一フエ二レンジァミン、 N, N—ジメチルーパラーフエ二レンジァミン、トリレン一 3， 4ージァミン、パラ一アミノジフエニルァミン、 2 —クロロー 1 , 4—フエ二レンジァミン、 2， 5—ジァミノトルエン等のジァミン化合物の酸化反応を触媒し、特に、 N， N—ジメチルーパラ—フエ二レンジァミンの酸化反応を強く触媒する

2 ) オルト一ァミノフエノール、パラアミノフエノール、 5—アミノー 2—メチルフェノール等のアミノフエノ一ル化合物の酸化反応を触媒し、特に、オルトーァミノフエノールの酸化反応を強く触媒する

3 ) 2—メトキシフエノール、 2 , 6—ジメトキシフエノール、カテコール、プロト力テク酸等のフエノール化合物の酸化反応を触媒し、特に、 2 , 6—ジメトキシフエノールの酸化反応を強く触媒する

4 ) 1 一ナフトール、 1 , 3—ジヒドロキシナフ！ル、 1 , 5ージヒドロキシナフトール等のナフト一ル化合物の酸化反応を触媒し持に、 1 , 3—ジヒドロキシナフ夕レンの酸化反応を強く触媒する 5) 4_ヒ.ドロキシィンドール、 5—ヒドロキシィンドール等のィンドール化合物の酸化反応を触媒する

6) カテキン（緑茶抽出物）、リグニンアルカリ抽出物（稲由来)、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）等の化合物（抽出物）の酸化反応を触媒する

を示す。なお、前記基質特異性に関して、本発明の中性フエノールォキシダーゼ Iは、リグニンアルカリ抽出物 (針葉樹由来）を基質とした場合., 中性 (pH6. 5) 条件及びアルカリ性 (pH9. 0) 条件の両方で同等の強い触媒活性がみられ、その他のジァミン化合物、アミノフエノール化合物、フエノール化合物、ナフトール化合物、インドール化合物、カテキン (緑茶抽出物) 及びリグニンアルカリ抽出物 (稲由来) のそれぞれを基質とした場合、中性（pH6. 5) 条件下での比活性のほうが、アルカリ性（p H9. 0) 条件下での比活性よりも高いという特性を有する。一方、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I Iは、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹）を基質とした場合以外は、様々な基質において、中性（pH6. 5) 条件下での比活性のほうが、アルカリ性 (pH9. 0) 条件下での比活性よりも高いという特性を有する。また、中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、様々な基質に対して、中性（pH6. 5) 条件下での比活性のほうが、アル力リ性（ p H 9. 0)条件下での比活性よりも高いという特性を有する。また、本発明の中性フエノールォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フェノールォキシダーゼ I I Iは、いずれも、フエノールォキシダーゼ ·メディエーターである ABTS、 NNSを基質として酸化する。

本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼは、中性 p Hから弱アル力リ性 p Hまでの広範囲で高い pH安定性を示すという優れた性質を有する。具体的には、中性フエノールォキシダーゼ Iは、 pH 7. 0-10. 0において、 30°Cで 20時間のインキュベーシヨン条件下ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 25%の相対残存活性好ましくは、 pH8. 0〜9. 0において、 30°Cで 20時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持する。一方、中性フエノールォキシダーゼ I Iは、 pH4. 0-10. 0において、 30°C で 20時間のィンキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも 50 %の相対残存活性 pH7. 0-10. 0において、 30°Cで 20時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 75 %の相対残存活性を維持する。また、中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、 pH 7. 0〜； L 1. 5において、 30°Cで 20時間のィンキュベ一ション条件下、最大活性に対し、少なくとも 30 %以上の相対残存活性、好ましくは、 pH8. 0〜10. 0において、 30 °C で 20時間のインキュベーション条件下、最大活性に対し、少なくとも 70%の相対残存活性を維持する。

本発明の中性フエノ一ルォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iは、それぞれ、 30〜50°Cの範囲、 30〜 60 の範囲及び 30〜60°Cの範囲で、高い酵素活性を示す。すなわち、本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フノ一ルォキシダ一ゼ I I Iは、前記温度範囲において優れた酵素活性を有するため、特別な温度条件に調整することなく、日常の生活温度（室温、水温、体温、気温等）で高い酵素活性を示す。したがって、本発明の中性フエノールォキシダーゼによれば、染色、廃液処理、高分子化合物の合成等を簡便に行なうことができる。具体的には、本発明の中性フエノールォキシダーゼ Iは、

I) 0°C〜40 において、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 50 %の相対残存活性を維持し、好ましくは、 0^〜30 において、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し少なくとも 80 %の相対残存活性を維持する

II) 0° (：〜 40 において、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィ；ーション前の活性に対し、少なくとも 50 %の相対残存活性を維持し、好ましくは、 0°C〜30 において、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持するという熱安定性を示す。一方、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I Iは、

I ') 0°C〜60°Cにおいて、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 15 %の相対残存活性を維持し 0 〜50°Cにおいて、 H7. 0で 1時間のインキュべ一ション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

II ') 0 〜 50°Cにおいて、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一シヨン前の活性に対し、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持し、好ましくは、 0°C〜40°Cにおいて、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーシヨン前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持するという熱安定性を示す。

また、中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、

I ") 0°C〜5 O において、 ρΗ7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 50 %の相対残存活性を維持し、好ましくは、 0 〜 30 において、 ρΗ7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも 80 %以上の相対残存活性を維持する

II") 0°C~50 において、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも 40 %の相対残存活性を維持し、好ましくは、 0°C〜40 において、 H9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持するという熱安定性を示す。

本発明の中性フエノールォキシダーゼである中性フエノールォキシダ一ゼ I、中性フェノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、具体的には、フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌により生産される。前記フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌としては具体的にはエノキタケ〔フラムリナベレティぺス (F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s ) 3 に属する担子菌が挙げられ、より具体的には、フラムリナベルティぺス (F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s)] I F030601株が挙げられる。本発明の中性フエノールォキシダーゼである中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I 及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、特に、前記エノキダケより得ることができるため、供給源の入手が容易であり、取扱いの容易性にも優れる。

本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼである中性フエノ一ルォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌を培養することによって生産することができる。かかる中性フエノールォキシダーゼの生産方法も本発明に含まれる。

本発明の生産方法は、フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌を、 p H6. 0~12. 0で培養することを 1つの特徴とする。

本発明の生産方法においては、担子菌を pH 6. 0〜12. 0で培養するため、本発明の中性フエノ一ルォキシダーゼである中性フエノールォキシダーゼ I、フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iが誘導され、驚くべく効率よくかつ高い収率で本発明の中性フエノ一ルォキシダーゼをえることができるという優れた効果を発揮する。

本発明の生産方法としては、具体的には、 1) フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌を、 PH6. 0-12. 0で培養する工程、及ぴ

2 ) 前記工程 1 )で得られた培養物の培養液上清又は該培養物より得られた抽出物から中性フエノ一ルォキシダーゼを分離する工程、を含む方法が挙げられる。

前記培地の pHは、フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌を十分に生育させ、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I 及び中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iを生産するに適した p Hであればよく、 p H 6. 0-12. 0、好ましくは、 pH7. 0〜11. 0、更に好ましくは pH8. 0〜10. 0に調製し、滅菌して使用することが望ましい。

なお、本発明においては、中性フエノールォキシダーゼの生産量を向上させる観点から、前記工程 1 ) において、

i) 担子菌の菌糸体を増やすための培養工程、及び

i i ) 前記培養工程 i )で得られた菌糸体中において、酵素の発現を誘導して生産量を増やすための培養工程

を行なってもよい。この場合、前記培養工程 i )において、菌糸体の増殖に適した pH、具体的には、例えば、 pH2. 0〜13. 0、好ましくは、 pH4. 0〜： L 0. 0、特に好ましくは、 pH5. 2での培養を行ない、ついで、前記培養工程 i i) において、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iを生産するに適した pH、具体的には、 pH6. 0-12. 0、好ましくは、 pH7. 0〜1 1. 0、更に好ましくは pH8. 0~10. 0での培養を行なってもよい。また、前記培養工程 i)においては、菌糸体の培養量をスケールアップする操作を適宜行なってもよい。

前記工程 1) において、フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌は、液体培養、又は固体培養のいずれにおいても培養することができる。

フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌の培養には、この菌が生育可能な、通常の液体培地又は固体培地のいずれを用いてもよい。

なお、フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌を液体培養する場合は、通気培養又は振盪培養が望ましい。

炭素源としては、例えば、フラムリナ（F 1 a mmu 1 i n a )属に属する担子菌が同化しうるものであれば何でもよく、グルコース、ショ糖、糖蜜、でんぷん等の糖類、ふすまみかんパルプ等が挙げられ、前記炭素源は、単独で、又は、 2種類以上を組み合わせて用いることができる。また、窒素源としては、例えば、おから、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸、酵母エキス、麦芽エキス、脱脂大豆粉、コーンスティ一プリカ一、尿素等の有機窒素源のほか、硝酸カリウム、硫酸アンモニゥム等の無機窒素等も挙げられ、単独で、又は、 2種類以上を組み合わせて用いることができる。また、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I Iを生産するための培地には、必要に応じて、リン酸塩、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、カリウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト等の無機塩類、ビタミン類等を添加してもよい。これらの培地中における前記炭素源、窒素源等の濃度は、フラムリナ（F 1 a mmu 1 i n a ) 属に属する担子菌を十分に生育させ、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれを生産するに適した濃度であればよく、炭素源は 0 . 1 〜2 0重量％、好ましくは 1〜1 0重量％、窒素源は 0 . 1〜1 0重量％、好ましくは 1〜 5重量％である事が望ましい。

培養温度は、糸状菌が生育する温度であればよく、実用上、 1 0〜4 0 °C、好ましくは 2 0〜3 5 °Cであることが望ましい。

培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通気培養の場合は、通常 2〜1 0日間が望ましい。また、前記培養時間は、培養液の酵素活性値が最大になることを指標として、設定することもできる。

前記工程 1 ) の具体例としては、例えば-,

― フラムリナ（F 1 a mmu 1 i n a ) 属に属する担子菌を、液体培養用培地 1 〔組成： 2. 4重量％ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（D i f c o) 社製〕、残部水（pH5. 2)； 121°Cで 15分間滅菌したもの〕に播種し、 25でで 7 日間往復振盪培養（150往復/分）を行ない得られた培養液全量を 2L容の三角フラスコ中 500m 1の前記液体培養用培地 1に添加し. 25 °Cで 3週間、往復振盪培養 (100往復 Z分) を行なう工程 (前記培養工程 i ) に対応)、及び

― 得られたペレツト状の菌糸体を静置沈殿させ、上清の培養液を除去し、残部の菌糸体に、液体培養用培地 2 〔組成： 1. 0重量％グルコース、 0. 1重量％酵母ェキス、 0. 14重量％ (NH₄) ₂S0₄、 0. 36重量％ K₂HP0₄、 0. 02重量％ MgS0₄ · 7H₂0、 0. 10重量％ミネラル混合液（組成： 1. 0重量％ Cu S0₄ · 5H₂〇、 1. 0重量％ ZnC l₂、 0. 7重量％ FeC l₃' 6H₂0、 0. 5重量％ C o S0₄ · 7H₂0、 0. 5重量％ MnC 1₂■ 4H₂0)、 pH9. 2 ； 1 21 で 15分間滅菌したもの〕 500mlを添加し、さらに 25 °Cで 3日間培養する工程（前記培養工程 i i) に対応）

を行なうこと等が挙げられる。

ついで、前記工程 1)で得られた培養物の培養液上清又は該培養物より得られた抽出物から中性フエノ一ルォキシダ一ゼを分離する工程〔工程 2)〕を行なう。

本発明の中性フエノールォキシダーゼは、菌体外に分泌生産され、培養液中に蓄積される。したがって、前記工程 2) において、前記工程 1) で得られた培養物から、菌体等の不溶物を遠心分離、濾紙又は濾布等による濾過等により除去し、本発明の中性フエノールォキシダ一ゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iを包含する培養上清を得ることができる。

また、前記工程 2) において、フラムリナ (F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌の菌床、又は栽培後の廃菌床から抽出し、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I I Iそれぞれを包含する抽出物を得ることもできる。

得られた培養上清又は抽出物を、脱色、濃縮、塩析（例えば、硫安分画)、透析、各種クロマトグラフィー、ゲル濾過ク口マトグラフィ一等の一般に用いられるタンパク質の精製法に供することにより、中性フェノ一ルォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iを分離精製することができる。

例えば、得られた培養上清又は抽出物を凍結乾燥し、再度溶解させ、得られた産物を濾過することによって不溶物を取り除き、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク口マトグラフィ一等に順次供試することにより、精製され、かつ高い比活性を有する本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノ一ルォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iを含有する画分が得られる。 . 具体的には、中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iは、例えば、

一得られた培養液の pHを 7. 5に調整し、 pH調整後の培養液 1Lに対して、 5 g (乾燥重量）の DEAE—セルロース〔シグマ（S i gma)社製〕担体を添加して、タンパク質を吸着させ、

一該担体に吸着したタンパク質を、 3倍容量の 1M 塩化ナトリウムを含有した 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH6. 5) で溶出させ、得られたタンパク質溶液を凍結乾燥させ

- 得られた凍結乾燥物を 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) に溶解させ、 ― 得られた溶液を、 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) で平衡化された商品名： Q—セファロースカラム〔2. 6 X 10 cm、フアルマシア (Ph a rma c i a)社製〕に供し., 0〜1M 塩化ナトリウムによる勾配溶出法で中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iそれぞれを溶出し、それぞれ凍結乾燥させ、一得られた凍結乾燥物を、 0. 1M 塩ィ匕ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) に溶解させ、

一得られた産物を 0. 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液 (pH8. 0) で平衡化した商品名：セフアクリル S— 100 HRカラム〔1. 6 X 60 c m、フアルマシア（Ph a rma c i a) 社製〕に供し、 0 · 1 M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) を用いて、溶出を行なうこと

により、得られうる。

一方、中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iは、例えば、

一前記培養液を濃縮し、 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) に対して 4 °Cでー晚透析し

― 得られた濾液を、 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0) で平衡化した DEAE—セルロースカラム〔シグマ（S i gma) 社製、 2. 6 X 60 cm〕に供し、

一 0〜1M 塩ィ匕ナトリウムによる勾配溶出法で、前記カラムに吸着された中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iを溶出し、

― 得られた画分を、 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) に対して 4°Cで一晚透析し、

一得られた溶液を、 0. 05 M トリス塩酸緩衝液（ p H 8. 0 ) で平衡化された商品名： Q—セファロースカラム〔2. 6 X 10 cm、フアルマシア (Ph a rma c i a) 社製〕に供し、 0. 2〜0. 5M 塩化ナトリウムによる勾配溶出法で中性フエノールォキシダーゼ I I Iを溶出し.,

- 得られた画分を 0.05M リン酸ナトリゥム緩衝液（ p H 7.0 )に対して 4 、 3時間透析し、 ― 得られた溶液を、 0. 05 M リン酸ナトリゥム緩衝液（ p H 7. 0 ) で平衡化した DEAE—セルロースカラム〔シグマ（S i gma) 社製、 1. 5X 5. 5 cm) に供し、 1M 塩ィ匕ナトリウムを含む 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) で中性フエノールォキシダーゼ I I Iを溶出させること

により得られうる。

本発明において、中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I 及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iの精製度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (n a t i v e -PAGE), SDS—ポリアクリルアミド電気泳動 (SDS-PAG E) 及びこれらの電気泳動後のゲルを用いた活性染色により評価されうる。

本発明において、前記 n a t i V e— PAGE及び SDS— PAGEの際、共に、泳動用サンプルを加熱せずに電気泳動を行なう。

n a t i V e— PAGEを行なった後に、パラーフエ二レンジアミンを基質として用いる活性染色を行なう場合、例えば、 n a t i V e— PAGE後に得られたゲルを、 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0) で 20分間振盪撹拌し、その後、 0. 0 01M パラ—フエ二レンジアミンを含む 0.1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0 ) 中で 5分間振盪撹拌することによって行なえばよい。

n a t i V e— PAGEを行なった後、クーマシ一ブリリアントブルーによりタンパク質の染色を行なう場合、例えば、 0. 5 gのクーマシーブリリアントブル一 R25 0を、 500mlのメタノールと 100mlの酢酸との混合溶液（全 600ml) に溶解し、蒸留イオン交換水で全量を 1000mlに調整して得られた染色用溶液に、電気泳動後のゲルを浸すことにより染色を行なえばよい。その後、 250mlのメタノールと 70 m 1の酢酸との混合溶液（320ml)を蒸留イオン交換水で全量を 1000m 1に調整して得られた脱色用溶液で、脱色を行なう。

SDS— PAGEを行なつた後、パラ—フエ二レンジァミンにより活性染色を行なう場合、例えば、 SDS— PAGE後に得られたゲルを、 2. 5w/v% Tr i t on X— 100を含む 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 中で 60分間振盪撹拌し、その後、 0. 001M パラーフエ二レンジアミンを含む 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（PH7. 0) 中でゲルを 5分間振盪撹拌することによって行なえばよい。

SDS-PAGEを行なつた後、クーマシ一ブリリアントプル一による夕ンパク質の染色を行なう場合、例えば、 0. 5 gのク一マシーブリリアントブル一 R 250を、 5 00mlのメタノールと 100mlの酢酸との混合溶液（全 600ml) に溶解し、蒸留イオン交換水で全量を 1000mlに調整して得られた染色用溶液に、電気泳動後のゲルを浸すことにより染色を行なえばよい。その後、 250mlのメタノールと 70m 1の酢酸との混合溶液（320ml)を蒸留イオン交換水で全量を 1000mlに調整して得られた脱色用溶液で、脱色を行なう。

本発明の中性フエノールォキシダーゼである中性フエノールォキシダーゼ I、中性フェノールォキシダーゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iは、 S D S— P A G E後のクーマシーブリリアントブルー染色による純度の評価において、それぞれ実質的に均一な精製度を示すため、本発明により、該中性フエノールォキシダ一ゼに対する抗体も提供される。

本発明の抗体は、本発明の中性フエノールォキシダーゼである中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I I Iに特異的に結合する能力を有するものであればよぐポリクロ一ナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。

本発明の抗体は、本発明の中性フェノ一ルォキシダ一ゼである中性フェノールォキシダーゼ I 中性フエノ一ルォキシダーゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iのそれぞれについて、例えば、カレント ·プロトコルズ'イン ·ィムノロジ一〔Cu r r en t P r o t o c o l s i n I mm u n o 1 ogy、ジョン ·Ε·コリガン（J ohn E. Co l i g a n) 編集、 1992年、ジョン'ワイリー &サンズ社 ( J o h n Wi e l y & S on s, I nc.) 発行〕等に記載の方法にしたがい、ゥサギ、マウス等の動物を免疫し匱用の方法で精製することにより、容易に作製されうる。また、本発明においては、本発明の中性フエノールォキシダーゼに結合するものであれぱ、前記モノク口一ナル抗体の一部、すなわち、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、 Fab、 F (ab') ₂ 、 F ab'、 Fv等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ぺプチダ一ゼ等により、モノク口一ナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、 F abフラグメントは、前記モノクローナル抗体をパパインにより処理することにより得られ、 F (ab') ₂ フラグメントは、前記モノクローナル抗体をペプシンにより処理することにより得られうる。

本発明の抗体は、例えば、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iそれぞれに対する結合性、親和性等について、 EL I S A法、 Ouch t e r l on y法、免疫電気泳動法等により測定することにより評価されうる。

本発明の抗体は、本発明の中性フエノールォキシダ一ゼの精製のためのァフィ二ティ —クロマトグラフィー、該中性フェノ一ルォキシダーゼのスクリ一二ング等に用いることができる。

本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼによれば、種々の染料、色素等と共に用いることにより、ケラチン繊維等の染色を行なうことができる。したがって、本発明により、染色方法及び染色用組成物が提供される。

また、本発明の中性フエノールォキシダーゼによれば、該中性フエノールォキシダ一ゼの存在下で、染色対象物と染料とを接触させることにより、染色を行なうことができる。本発明の中性フエノールォキシダーゼによれば、繊維や毛髪の染色等において、特別な温度条件、 p H条件に調整することなく、外界環境条件下において行なうことができ、人体、環境等への影響を低減させることができるという優れた効果を発揮する。本発明の染色方法を適用しうる染色対象物としては、例えば、綿、ジアセテート、亜麻., リンネル、リオセル、ポリアクリル-, ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーエン、テンセル、トリアセテート、毛皮、獣皮、皮革、絹又はウール製の布帛、糸、繊維、衣料、フィルム、木材、毛髪等が挙げられる。

前記染料としては、医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料ゃィンドリン及びインドール化合物等が挙げられ、かかる染料は、単独又は複数を組み合わせて用いることができる。また、カップリング剤を用いることもできる。また、直接染料も用いられうる。

インドリン及びインドリン化合物としては、具体的には、インドリン、 5 , 6—ジヒドロキシインドリン、 N—メチルー 5， 6ージヒドロキシインドリン、 N—ェチルー 5， 6—ジヒドロキシインドリン、 N—ブチル一 5， 6—ジヒドキシインドリン、 4—ヒド口キシ一 5—メトキシインドリン、 6—ヒドロキシ一 7—メトキシインドリン、 6， 7 —ジヒドロキシインドリン、 4， 5—ジヒドキシインドリン、 4ーメトキシ一 6—ヒド口キシィンドリン、 N—へキシル一 5 , 6—ジヒドロキシィンドリン、 2—メチルー 5， 6—ジヒドロキシインドリン、 3—メチルー 5 , 6—ジヒドロキシインドリン、 4—ヒドロキシインドリン、 2 , 3—ジメチルー 5， 6—ジヒドロキシインドリン、 2—メチル— 5—ェチル— 6—ヒドロキシィンドリン、 2—メチルー 5—ヒドロキシー 6— j3— ヒドロキシェチルインドリン、 4—ヒドロキシプロピルインドリン、 2—ヒドロキシ一 3—メトキシインドリン、 6—ヒドロキシ一 5—メトキシインドリン、 6—ヒドロキシインドリン、 5—ヒドロキシインドリン 7—ヒドロキシインドリン、 7—ァミノインドリン、 5—ァミノインドリン、 4ーァミノインドリン、 5， 6—ジヒドロキシインドリンカルボン酸、 1一メチル— 5， 6—ジヒドキシインドリン、並びにこれらの塩類等を例示されうる。

インドール化合物として、具体的には、 4ーヒドロキシインドール、 5—ヒドロキシインドール、 5， 6—ジヒドロキシインド一ル、 5 , 6—ジヒドロキシインド一ルー 2 一力ルボン酸 5 , 6—トリ（ t 一ブトキシカルボニルォキシ）インドール、 5， 6 - ジ ( tープトキシカルボ二ルォキシ)インドール、 5一 t—ブトキシカルボニルォキシ一 6—ヒドロキシインドール、 6一 tープトキシカルボニルォキシー 5—ヒドロキシィンドール、 5， 6—ジ（エトキシカルポニルォキシ）インドール、 5， 6—ジ（ェチル力ルバモイルォキシ）インドール、 1ーピバロイルー 5一 (ビバロイルォキシメトキシ） - 6 -ピバロィルォキシィンドール、 1一ピバロイルー 5一ピバロィルォキシメトキシ —6—ヒドロキシインドール、 5， 6— (ォキシカルポニルメトキシ）インドール等が挙げられる。

医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料としては、具体的に、 5—アミノー o 一クレゾール、 0—ァミノフエノール、 m—ァミノフエノール、 p—ァミノフエノール、 2 , 6—ジァミノピリジン、 5 - ( 2—ヒドロキシェチルァミノ) 一 2—メチルフエノール、 N， N—ビス（j8—ヒドロキシ）一 p—フエ二レンジァミン'硫酸塩、 p—二トロー o—フエ二レンジァミン、 p -二トロー 2，， 4 ' ージアミノアゾベンゼン ·硫酸ナトリウム、トルエン一 2， 5—ジァミン、 5—ァミノ一 o—クレゾール ·硫酸塩、 p —ァミノフエノール'硫酸塩、 o—クロロー p—フエ二レンジァミン'硫酸塩、 4 , 4 ' —ジアミノジフエニルァミン'硫酸塩、 p—メチルァミノフエノール'硫酸塩、 p—フェニレンジァミン '硫酸塩、 m—フエ二レンジァミン'硫酸塩、トルエンー2， 5—ジアミン ·硫酸塩、 2 , 4ージァミノフエノキシエタノール ·塩酸塩、トルエン— 2 , 5 ージァミン。塩酸塩、 m—フエ二レンジアミン'塩酸塩、 2， 4ージァミノフエノール- 塩酸塩、 3 , 3 ' —イミノジフエノール. p—フエ二レンジアミン'塩酸塩、 N—フエ二ルー p—フエ二レンジァミン '塩酸塩、 N—フエ二ルー p—フエ二レンジァミン ·酢酸塩、 1 , 5—ジヒドキシナフ夕レン、トリレン一 3， 4—ジァミン、 p—メチルアミノフエノール、 N， N，一ビス（4—ァミノフエニル）一 2， 5—ジァミノ一 1， 4— キノンジィミン-, 0—ァミノフエノール'硫酸塩 2 , 4—ジァミノフエノール。硫酸塩、 m—アミノフエノ一ル '硫酸塩等を例示されうる。

また、本発明においては、 2—ァミノ一4—ニトロフエノール、 2—アミノー 5—二トロフエノール、 1—ァミノ一 4—メチルァミノアントラキノン、ニトロ一 p—フエ二レンジアミン*塩酸塩、 1， 4—ジァミノアントラキノン、ニトロ一 p—フエ二レンジァミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、 2—アミノー 5—二トロフエノール · 硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ一 p—フエ二レンジアミン'硫酸塩、 p—二トロー o 一フエ二レンジァミン ·硫酸塩、 p—二トロ— m—フエ二レンジァミン ·硫酸塩等の直接染料も用いられうる。

本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの存在下における染色対象物と染料との接触は、例えば、染料と該中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iとを使用時に混合して染色対象物と接触するか、あるいは嫌気性条件下で保存した染料と該中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iとの混合物を使用時に大気中で染色対象物と接触することにより行なわれる。本発明の染色方法は、本発明の中性フエノールォキシダーゼを、染色用組成物として用いることにより行なわれうる。

本発明の染色用組成物としては、本発明の中性フエノールォキシダーゼと染料とを含有した組成物;本発明の中性フエノールォキシダーゼを含有した組成物 Aと染料等を含有した組成物 Bとの組み合わせ等が挙げられる。

本発明の染色用組成物には、酵素活性を阻害しない範囲で、チォ乳酸、亜硫酸ナトリゥム、 N _ァセチルー L一システィン等の還元剤を配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲で、前記成分の他に、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、香料等を適宜配合することもできる。

本発明の中性フエノールォキシダーゼは高い安定性を示し、種々の基質、特に、フエノ一ル化合物、ァミノフエノール化合物及びジァミン化合物のいずれに対しても至適 p Hに大きな変動がなく、中性付近の p Hで効率よく基質と作用するという優れた効果を奏する。また、本発明の中性フエノールォキシダーゼの生産方法によれば、本発明の中性フエノールォキシダーゼを、効率よく、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の抗体によれば、本発明の中性フエノールォキシダーゼを、簡便に、回収、精製できるという優れた効果を奏する。また、本発明の染色方法によれば、種々の染料、具体的には、フヱノール化合物、アミノフエノ —ル化合物、ジアミノフヱノール化合物等により、簡便に、効率よく、繊維や毛髪を染色することができ、さらには、環境、人体等への影響が低減するという優れた効果を奏する。さらに染色用組成物は、取扱いが簡便であり、簡便に、効率よく、繊維や毛髪を染色することができ、さらには、環境、人体等への影響が低減するという優れた効果を奏する。以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により、何ら限定されるものではない。実施例 1 エノキダケ〔フラムリナベルティぺス（F 1 a mm u 1 i n a v e 1 u t i p e s )〕 I F O 3 0 6 0 1株のフエノールォキシダーゼの検索及び調製

( 1 ) 培養条件の検討

フエノールォキシダーゼの誘導のための培養条件のうち、培養 p H条件の検討を例として挙げる。

ラッカーゼの製造法については、特公昭 60 - 156385号公報において、ィルべックス ·ラリテウス ATCC 20123を用い、 pH6. 0で 3日間培養を行なうことにより、至適 pHが 4. 5付近の酸性ラッカ一ゼを得る方法が開示されている。本実施例においては、フラムリナベルティぺス (F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s) I FO 30601株において、フエノールォキシダ一ゼを誘導する培養方法の決定するために、培地の]? Hを 4. 0から 9. 0の範囲で任意に調整し、培養を行なうことにより、培養 pH条件を検討した。

以下に示す播種、菌糸体の切り分け、及び培地の添加の各操作をクリーンベンチ内で行なった。

固体培養用寒天培地〔組成： 2. 4重量％ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（D i f c o) 社製〕、 2. 0重量％寒天、残部水〕 10mlを含む滅菌シャーレに、フラムリナべレティぺス (F 1 ammu l i n a v e 1 u t i p e s I F〇 30601株を 1白金耳相当量播種し、 25°Cで 10日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて 5mm四方に切り分け、小片を得た。

前記小片 10片を、液体培養用培地 1 〔組成： 2. 4重量％ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（D i f c o) 社製〕、残部水； 121°Cで 15分間滅菌したもの〕に播種し、 25 で 7日間、往復振盪培養（150往復/分）を行なった。なお、前記液体培養用培地 1として、 pHを 4. 0から 9. 0の範囲で任意に調整された培地のそれぞれを用いた。

それぞれ培養 p Hの異なる培養液サンプルを毎日サンプリングし、その酵素活性の変化を求めることにより、培養 pH条件による酵素誘導の違いを明らかにした。

酵素活性（酸化活性）は、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5. 0) 又はトリス塩酸緩衝液（pH8. 0) を緩衝液とし、パラーフエ二レンジアミンを基質として用いて、 47 0 nmにおける吸光度の変化により測定した。

具体的には、 9 6穴のマイクロプレート〔コ一ニング（C o r n i n g) 社製., C o s t e r (登録商標） 3 36 8〕のゥエル内で、 0. 2M 緩衝液 0. 1m lに、 0. 0 2 5M パラ—フエ二レンジァミン水溶液 0. 08m lを添加し、基質溶液を調製した。この基質溶液と各サンプリングした培養液 0. 0 2m lとを混合して、 47 0 n mにおける吸光度の変化を、 Mu 1 t i S p e c t r ome t e r 〔大日本製薬株式会社製、商品名： V i e n t o〕を用いて測定することにより、酵素活性を求めた。なお、酵素活性は、 47 O nmにおける吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U :ユニット）として定義した。

各培養 p H条件で 7日間培養を行なつた結果、 pH5. 0及び pH8. 0のそれぞれの反応 pHにおける酵素活性測定は、共に、培養日数が 7日目で酵素活性が最も高く、すべての培養 pH条件で、培養日数の経過により、酵素活性の増加を示した。

PH5. 0にて酵素活性を測定した結果、 pH4. 0から 9. 0の pH範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性がみられなかった。具体的には、最も高い酵素活性を示したのは、 PH9. 0の培養 pH条件で 7日間培養することにより得られた培養液だったが、反応開始から 1 7時間後の 47 0 nmにおける吸光度の変化は、わずか 0. 1 2であった。また、 pH6. 0の培養 pH条件で 7日間培養することにより得られた培養液について、 1 7時間後の 47 0 nmにおける吸光度の変化は、 0. 0 6 であった。

一方、 pH8. 0にて酵素活性を測定した結果、 pH5. 0から 9. 0の pH範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性が示された。なお、 PH4. 0で培養することにより得られた培養液は、明らかな酵素活性を示さなかったが培養日数による酵素活性の増加はみられた。また、培養 pHがより高い pHである培養液ほど、高い酵素活性を示した。最も高い酵素活性を示した培養液は、 PH9. 0の培養 pH条件で 7日間培養することにより得られた培養液で 17時間後の 470 nmにおける吸光度の変化は 1.27であった。また PH6.0の培養 pH条件で 7日間培養することにより得られた培養液について 17時間後の 470 nmにおける吸光度の変ィ匕は、 0. 78であった。

以上の結果から、フラムリナベルティぺス CF 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i e s) I FO30601株において、前記培養条件により誘導されるフエノールォキシダーゼは、中性フエノ一ルォキシダ一ゼであり、また、酸性側に至適 p Hを有する酸性ラッカーゼ又は酸性フエノールォキシダーゼは誘導されないことがわかった。また、フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s) I FO 3 0601株においては、前記培養条件により、多量の酵素が誘導され、 pH8. 0での酵素活性では、 PH9. 0の培養 pH条件で 7日間培養することにより得られた培養液の酵素活性は、 PH6. 0の培養 pH条件で 7日間培養することにより得られた培養液の酵素活性と比較して、約 1. 6倍も高くなることがわかった。

このように、前記培養条件により、中性フエノールォキシダーゼを誘導することができ、該中性フエノ一ルォキシダ一ゼを収率よく生産することができる。

(2) 培養法の検討

以下に示す播種、菌糸体の切り分け、及び培地の添加の各操作をクリーンベンチ内で行なった。なお、かかる培養では、まず、菌体を生育させる培養を行ない、ついで、酵素生産量を増加させる培養を行なう方法を検討した。

固体培養用寒天培地〔組成： 2. 4重量ポテトデキス卜ロースブロス〔ディフィコ（D i f c o) 社製〕 2. 0重量％寒天、残部水〕 10mlを含む滅菌シャーレに、エノキダケ〔フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s)〕 I FO 30601株を 1白金耳相当量播種し、 25 °Cで 10日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて 5 mm四方に切り分けた。

前記小片 10片を、液体培養用培地 1 〔組成： 2. 4重量％ポテトデキストロ一スプロス〔ディフィコ（D i f c o) 社製〕、残部水 (pH 5. 2)； 121 で 1 5分間滅菌したもの〕に播種し、 25°Cで 7日間、往復振盪培養（150往復/分）を行なった。

得られた培養液全量を、 2 L容の三角フラスコ中 500mlの前記液体培養用培地 1 に添加し、 25°Cで 3週間、往復振盪培養（100往復/分）を行なった。

その後、成長したペレツト状の菌糸体を静置沈殿させ、培養液を取り去り、残部の菌糸体に、液体培養用培地 2 〔組成： 1. 0重量％グルコース、 0. 1重量％酵母ェキス、 0. 14重量％ (NH₄) ₂S0₄、 0. 36重量％ K₂HP〇₄、 0. 02重量％ MgS0₄- 7H₂0, 0. 10重量％ミネラル混合液（組成： 1. 0重量％ Cu S 0₄· 5H₂〇、 1. 0重量％ ZnC l₂、 0. 7重量％ FeC l₃' 6H₂〇、 0. 5 重量％ C o S0₄ · 7H₂0、 0. 5重量％ MnC 1₂ · 4H₂0)、 pH9. 2 ; 12 1°Cで 15分間滅菌したもの〕 500mlを添加し、さらに 25 で 3日間培養した。その後、成長したペレツト状の菌糸体を静置沈殿させ、デカンテーションにより培養液を回収した。

回収された培養液は、淡黄色若しくは黄褐色の清澄又は濁った液体であった。回収された培養液は、全容量 3060mし総力価 13100U、総タンパク質量 778mg、比活性 16. 8UZmgタンパク質であった。

(3) 粗酵素液の調製

前記（2) で回収された培養液を減圧濾過し、濾液を得た。前記濾液の p Hを 1 M 水酸化ナトリゥム水溶液により 7. 5に調整した。 p H調整後の濾液 1 Lに対して、 5 g (乾燥重量）の DEAE—セルロース〔シグマ（S i gm a) 社製〕担体を添加し、で 30分間振盪撹拌した。その後、 10分間静置し上清を除去した。

回収された D E A E—セル口一ス担体を、該担体の 3倍容量の 1 M 塩化ナトリウムを含有した 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH6. 5) に添加した。得られた混合溶液を 5分間振盪撹拌して、 DEAE—セルロース担体に吸着したタンパク質を溶出させた。得られた DEAE—セルロース溶出液を、減圧濾過にて回収し、 4°Cで脱ィォン水に対して透析し、得られた産物を凍結乾燥し、凍結乾燥物を得た（全重量 630m g、総力価 7326U、総タンパク質量 11 Omg、比活性 66. 4UZmgタンパク質）。なお、、凍結乾燥物の力価は、該凍結乾燥物 lmgに対して、 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（PH7. 0) lm 1に溶解させ、ついで、得られた溶液 0. 0 lmlと、 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 0. 089mlに、 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール 0. lml (終濃度 0. 005mM) を添加して得られた基質溶液とを混合し、得られた混合物について、前記（1) に記載の手法と同様に、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を求めた。また、前記凍結乾燥物の水溶液について、 Fo lm—Lowr y法により、タンパク質量を定量した。

前記 DEAE—セルロースで得られた凍結乾燥物を再度溶解させた溶液を、 n a t i v e _ P A G Eに供し、電気泳動後に得られたゲルを、 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0) で 20分間振盪撹拌した。その後、 0. 005M 2, 6—ジメトキシフエノール、 0. 005M オルトーアミノフエノール及び 0 - 001M パラ一フエ二レンジァミンのいずれかを含む 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 中でゲルを 5分間振盪撹拌することにより活性染色を行なった。活性染色の結果を図 1 に示す。

図 1に示すように、活性染色の結果より、フラムリナベルティぺス（F 1 ammu

1 i n a v e 1 u t i p e s) I FO 30601株を前記（ 2 ) に示される培養方法にしたがって培養することによって生産される培養液には-,少なくとも 3つの中性フノ一ルォキシダ一ゼが含まれることがわかった。

(4) 中性フエノ一ルォキシダ一ゼの精製〔イオン交換クロマトグラフィー (Q—セファロースカラム）〕

前記（3) で得られた凍結乾燥物 63 Omgを、 0. 05M トリス塩酸緩衝液（p H8. 0) 10mlに溶解させ、商品名： D I SMI C— 13 P 〔アドバンテック（A DVANTEC) 社製〕を用いて、遠心濾過により不溶物を除去し、濾液を得た。前記濾液 49m 1を、 F PLCシステム〔フアルマシア（P h a r m a c i a)社製〕を用いて、 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) で平衡化された商品名： Q—セファロ一スカラム〔2. 6 X 10 cm、フアルマシア (P h a rma c i a) 社製〕に供した。塩ィ匕ナトリウム水溶液を 0から 1Mの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記力ラムに吸着された中性フエノ一ルォキシダーゼのうちの 2種（中性フエノールォキシダ一ゼ I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I)を溶出した。中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iの画分は、得られた各溶出画分について、 470 nmにおける 2, 6—ジメトキシフエノールに対する酵素活性と、 n a t i v e—PAGE後のパラーフエ二レンジァミンによる活性染色とを行なうことにより決定された。

2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の酵素活性は、 0. 2M リン酸ナトリウム（pH7。 0) 0. 896mlに.， 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1mlを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と、溶出画分 0. 004mlとを混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。

イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムを図 2に示す。図 2において、 28 0 nmにおける吸光度（図 2中、 A280) の変化は各画分中のタンパク質量の変化を示し、 400 nmにおける吸光度 (図 2中、 A 400) の変化は、各フラクション中の糖質量の変化を示し、 470 nmにおける吸光度（図 2中、 A470) の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。

中性フエノールォキシダ一ゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iの各画分について、 n a t i v e— PAGE後のパラ—フエ二レンジァミンによる活性染色は単一のパンドを示したが、 n a t i v e—PAGE後のクーマシ一ブリリアントブルー染色では、複数のバンドがみられた。得られた中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I Iのそれぞれの画分を回収し、透析後、凍結乾燥を行なった。得られた中性フエノールォキシダ一ゼ Iの画分は、全容量 7. 5ml、総力価 250 5U、総タンパク質量 5. 4mg、比活性 463. 9 UZmgタンパク質であった。また、中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iの画分は、全容量 10. 5mし総力価 3630 U、総タンパク質量 41. 0mg、比活性 88. 5 U/mgタンパク質であった。

(5) 中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iの精製〔ゲル濾過クロマトグラフィー〕

前記（3) で得られた中性フエノールォキシダーゼ Iの凍結乾燥物を、 0. 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) 1. 5mlに溶解させた。得られた産物を、 FPLCシステム〔フアルマシア (P h a rma c i a) 社製〕を用いて、 0. 1 M 塩化ナトリゥムを含む 0. 05 M トリス塩酸緩衝液 ( H 8. 0) で平衡化した商品名：セフアクリル S— 100 HRカラム〔1. 6X60 cm、フアルマシア（Ph a rma c i a) 社製〕に供した。ついで、 0. 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) を用いて、前記カラムに吸着された中性フエノールォキシダーゼ Iを溶出させた。

中性フエノ一ルォキシダーゼ Iについてゲル濾過ク口マトグラフィ一のクロマトグラムを図 3に示す。図 3において、 280 nmにおける吸光度 (図 3中、 A280) の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、 470 nmにおける吸光度（図 3中、 A 470) の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。

中性フエノールォキシダ一ゼ Iの画分は、得られた画分について、 470 nmにおける 2, 6—ジメトキシフエノールに対する酵素活性の測定と、 SDS— PAGE後のパラ一フエ二レンジァミンによる活性染色と、 SDS— PAGE後のクーマシ一プリリアントブルー染色とを行なうことにより決定された。 SDS— PAGE後のパラフエニレンジァミンによる活性染色及びクーマシープリリアントブルー染色の結果、単一のバンド示した。

2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の酵素活性は、 0. 2M リン酸ナトリウム（pH7. 0) 0. 896mlに、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1mlを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と中性フ: nノールォキシダーゼ Iの画分 0. 004mlとを混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより求めた。

酵素活性を示し、活性染色により染色された画分を、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I として回収した。得られた中性フエノールォキシダ一ゼ Iの画分は、全容量 10ml、総力価 1530U、総タンパク質量 1. 6mg、比活性 956. 3U/mgタンパク質であった。

一方、前記（3) で得られた中性フヱノ一ルォキシダーゼ I Iの凍結乾燥物を 0. 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) 1. 5m 1に溶解させた。得られた産物を、 F PLCシステム〔フアルマシア (P h a rma c i a) 社製〕を用いて、 0. 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（PH8. 0) で平衡化した商品名：セフアクリル S— 100 HRカラム〔1. 6X 60 cm フアルマシア（Pha rma c i a) 社製〕に供した。ついで 0. 1 M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) を用いて前記カラムに吸着された本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I Iを溶出した。

中性フエノールォキシダーゼ I Iについて、ゲルクロマトグラフィーのクロマトグラムを図 4に示す。図 4において、 280 nmにおける吸光度（図 4中、 A280) の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、 47 Onmにおける吸光度（図 4中、 A

470) の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。

本発明の中性フエノールォキシダ一ゼ I Iの画分は、得られた画分について、 470 nmにおける 2， 6—ジメトキシフエノールに対する酵素活性の測定と、 SDS— PA GE後のパラ一フエ二レンジァミンによる活性染色と、 SDS— PAGE後のクーマシ一ブリリアントブルー染色とを行なうことにより決定された。 S D S— P A G E後のパラ—フエ二レンジァミンによる活性染色、及び、クーマシ一プリリアン卜ブル一染色の結果、単一のバンドを示した。

2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の酵素活性は、 0. 2M リン酸ナトリウム（PH7. 0) 0. 896mlに 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. lmlを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と中性フエノールォキシダーゼ I Iの画分 0. 004m 1とを混合し、得られた混合物について、 470 n mにおける吸光度の変化により測定することにより求めた。

酵素活性を示し、活性染色により染色された画分を、中性フエノールォキシダーゼ I Iとして回収した。得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I Iの画分は全容量 11.

5 m 1、総力価 742 U、総夕ンパク質量 5. 3 m g、比活性 140 U/m 夕ンパク質であった。

上記の抽出 '精製のスキームを図 5に示す。また、各精製工程における中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フェノールォキシダーゼ I Iの精製度、比活性を表 1に示す。

精製工程総タン Λ°ク質量総力価比活性収率

(mg) (U) (U/mg夕ンハ °ク質） (¾) 培養液 778 13100 16.8 100.0

DEAE-セルロース 110 7326 66.4 55.9

Q-セファロース中性フエノ-ル才キシダ -セ' I 5.4 2505 463.9 19.1

中性フエノ-ルォキシタ' -セ' II 41.0 3630 88.5 27.7 セフアクリル S- 100 HR 中性フエノ-ルォキシダ -セ' I 1.6 1530 956.3 11.7

中性フエノ-ルォキシダ -セ' II 5.3 742 140.0 5.7

(6) 中性フエノールォキシダーゼ I I Iの精製〔イオン交換クロマトグラフィー（D EAE—セルロースカラム）〕

前記実施例 1の（2) に記載の方法と同様に、培養液を回収した。回収された培養液は、全容量 4 O O Oml, 総力価 26800U、総タンパク質量 1188mg、比活性 22. 5U/mgタンパク質であった。

回収された培養液を、透析膜〔商品名： D i a l y s i s memb r an e, S i z e 36 (和光純薬（WAKO) 社製)〕に、 250mlずつ入れた。得られたチューブを、ビニール袋に入れ、該チューブに、約 120 gのポリエチレングリコール 20 000 〔和光純薬株式会社製〕をまぶした後、該チューブが入つたビニール袋を氷中で約 48時間保持して、培養液を濃縮した。濃縮培養液を、小型高速冷却遠心機〔トミー (TOIvlY) 社製-. ローター No. 8. 1〕を用いて 4で、 10, 000回転にて 20 分間遠心分離して沈殿を除去した。得られた培養液濃縮物は全容量 229mし総力価 9814U、総タンパク質量 193. 6mg、比活性 50. 7U/mgタンパク質であった。

前記培養液濃縮物を、 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) に対して 4 °Cで一晩透析した。小型高速冷却遠心機〔トミー（TO MY) 社製、口一ター No. 8. 1〕を用いて 4°C、 12000回転にて 30分間遠心分離した上清を商品名： D i s po s ab l e s y r i nge f i l t e r un i tしセレロースァセテ一ト、 0. 45 m、アドバンテック (ADVANTEC) 社製〕を用いて濾過して、不溶物を除去し、それにより、濾液を得た。

前記濾液 229mlを、 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（p H 7. 0) で平衡化した DEAE—セルロースカラム〔シグマ（S i gma)社製、 2. 6X60 cm〕に供した。塩ィ匕ナトリウムを 0から 1Mの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記力ラムに吸着された中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iを溶出した。中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分は、得られた溶出画分について、 470 nmにおける 2, 6—ジメトキシフエノ一ルに対する酵素活性と、 SDS— PAGE後のパラーフエ二レンジァミンによる活性染色とを行なうことにより決定された。

中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iについて、 DEAE—セルロースカラムクロマトグラフィ一のクロマトグラムを図 6に示す。図 6において 280 nmにおける吸光度 (図 6中、 A280) の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、 47 Oniri おける吸光度（図 6中、 A470) の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。

2, 6—ジメトキシフエノ一ルを基質とした場合の酵素活性は、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 0. 895mlに、 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1mlを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分 0。 005mlとを混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。

得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分は、全容量 18m 1、総力価 11 0 2U、総タンパク質量 3. 6mg、比活性 3 0 3U/mgタンパク質であった。

(7) 中性フエノールォキシダーゼ I I Iの精製〔イオン交換クロマトグラフィー (Q —セファロースカラム）〕

得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分を回収し-. 得られた画分を、 0. 0 5M トリス塩酸緩衝液（ p H 8. 0 ) に対して 4 °Cで一晩透析した。商品名： D i s p o s a b 1 e s y r i n g e f i l t e r un i t〔セル'ロースァセテ一ト.. 0. 45 ,"m、 Ύドバンテック (ADVANTEC) 社製〕を用いて濾過して、不溶物を除去し、それにより、濾液を得た。

前記濾液 2 1. 5m lを、 FPLCシステム〔フアルマシア（Ph a rma c i a) 社製〕を用いて、 0. 0 5M トリス塩酸緩衝液（pH8. 0)で平衡化された商品名： Q—セファロースカラム〔2. 6 X 1 0 cm、フアルマシア（Ph a rma c i a) 社製〕に供した。塩ィ匕ナトリウムを 0. 2から 0. 5 Mの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iを溶出した。中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの画分は、得られた溶出画分について、 47 0 nmにおける 2, 6—ジメトキシフエノールに対する酵素活性と、 SDS— PAGE後のパラーフェニレンジァミンによる活性染色とを行なうことにより決定された。

中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iについて、 Q—セファロースカラムクロマトグラフィ一のクロマトグラムを図 7に示す。図 7において 2 8 0 nmにおける吸光度 (図 7 中、 A2 8 0) の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、 470 nmにおける吸光度 (図 7中、 A 47 0 ) の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。

2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の酵素活性は、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（PH7. 0) 0. 8 9 5m lに、 0. 0 5M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1m lを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分 0. 005mlとを混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。

得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの画分は、全容量 18m 総力価 1 1 5U、総タンパク質量 lmg、比活性 117. 4U/mgタンパク質であった。

前記中性フェノ一ルォキシダーゼ I I Iの画分は、 0. 05 M リン酸ナトリウム緩衝液（PH7. 0) に対して 4°C 3時間透析した。商品名： D i s p o s a b 1 e s y r i nge f i l t e r un i t 〔セリレロースァセテ一卜、 0. 45 ,"m、ァドバンテック（ADVANTEC)社製〕を用いて濾過し、不溶物を除去して濾液を得た。得られた濾液を、 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（PH7. 0) で平衡化した DEAE—セル口一スカラム〔シグマ（S i gma) 社製、 1. 5X5. 5 cm〕に供した。ついで、 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（p H7. 0) を用いて、前記カラムに吸着された中性フエノールォキシダーゼ I I Iを溶出させた。

中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分は、得られた画分について、 2， 6—ジメトキシフエノ一ルに対する酵素活性の測定と、 S D S— P A G E後のパラーフエ二レンジァミンによる活性染色と、 SDS— PAGE後のクーマシ一プリリアントブルー染色とを行うことにより決定された。 SDS— PAGE後のパラーフエ二レンジァミンによる活性染色の結果では、メジャーな一本のバンドと、マイナ一な二本のバンドが認められた。 SDS— PAGE後のクーマシーブリリアントブルー染色の結果、単一のバンド示した。

2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の酵素活性は、 96穴のマイクロプレート〔コ一ニング (Co r n i ng) 社製、 Co s t e r (登録商標） 3368] のゥエル内で、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（ρΗ 7. 0) 0. 1781111に0. 05Μ 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 02mlを添加して、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分 0. 002mlとを混合し、その結果得られた混合物の色の変化を、目視によって確認した。

酵素活性を示し、活性染色により染色された画分を中性フエノールォキシダーゼ I I Iとして回収した。得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの画分は、全容量 3. 3m 1、総力価 242 U、総タンパク質量 0. 6mg、比活性 423. 3U/mgタンパク質であった。

上記の中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの抽出、精製のスキームを図 8に示す。また、各精製工程における中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iの精製度、比活性を表 2に示す。

表 2

総タンパク質量総力価比活性収率

ung) (U) (U/mgタンパク質） (¾)

培養液 PEG濃縮物 194 9814 50.7 100.0

DEAE-セルロース 3.6 1102 303.0 11.2

Q-セファロ一ス 1.0 115 117.4 1.2

DEAE-セルロース 0.6 242 423.3 2.5

実施例 2 中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iの分子量

実施例 1で得られた中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I及び中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I Iのそれぞれ分子量を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過法により測定した。

ゲル濾過クロマトグラフィーには、 FPLCシステム〔フアルマシア（P h a rma c i a) 社製〕を用いて、 0. 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（PH8. 0)で平衡化した商品名：セフアクリル S— 100 HRカラム〔1. 6 X 60 cm、フアルマシア (Ph a rma c i a) 社製〕を用いた。

前記実施例 1の（ 5 )で得られた中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iの溶液 3 m 1を、 FPLCシステム〔フアルマシア（P h a r m a c i a) 社製〕を用いて、 0. 1M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（PH8. 0) で平衡化した商品名：セフアクリル S— 100HRカラム〔1. 6 X 60 cm、フアルマシア（Ph a rma c i a) 社製〕に供した。 0. 1 M 塩化ナトリウムを含む 0. 05M トリス塩酸緩衝液（PH8. 0) を用いて、前記カラムでゲル濾過クロマトグラフィーを行ない、中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダ一ゼ I Iを溶出させ、溶出液量を測定した。なお、中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iは、それぞれ別々に、ゲル濾過クロマトグラフィ一により分子量を決定した。また、前記と同じ条件下で、分子量マーカーとして、分子量既知の 4種のタンパク質（分子量約 67 k、 43 k、 25 k, 及び 13. 7 kDa) をそれぞれ単独で添加し、それぞれの溶出液量を測定した。

中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iの溶出時間と、分子量マーカーの溶出液量から得られた検量線とにより、中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I Iのそれぞれの分子量を決定した。

その結果、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I Iの分子量は、共に、約 72 kD aであった。

また、実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの分子量を、ゲル濾過ク口マトグラフィーを用いたゲル濾過法により測定した。

前記実施例 1の（ 7 )で得られた Q—セファロースカラム後の中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの画分（全容量 12ml、総力価 262 U、総タンパク質量 3. 8mg, 比活性 69UZmgタンパク質）を、商品名 ·· U 1 t r a f r e e (登録商標）一 MC 30, 00 ONMWL F i 1 t e r Un i t 〔ミリポア（M I LL I PORE)社製〕を用いて遠心濾過することにより濃縮した。

得られた濃縮液 0. 855m 1を、商品名：セフアデックス G— 100 〔アマシャムバイオサイエンシーズ (Ame r s ham B i o s c i e nc e s)社製〕を充填し 0. 05M リン酸ナトリゥム緩衝液（ p H 7. 0) で平衡化したカラム（ 2. 6 X 60 cm) に供した。ついで、 0. 05M リン酸ナトリウム緩衝液（p H 7. 0) を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、中性フエノールォキシダーゼ I I Iを溶出させ、溶出液量を測定した。また、前記と同じ条件で、分子量マ一力一として、分子量既知の 5種のタンパク質（分子量約 73 kDa、 61 kDa、 47 kDa、 37 kD a、および 24 kD a) をそれぞれ単独で添加し、それぞれの溶出液量を測定した。中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iについて、ゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを図 9に示す。図 9において 280 nmにおける吸光度（図 9中、 A280) の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、 470 nmにおける吸光度（図 9中、 A470) の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。

2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の酵素活性は、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 0. 895mU 、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1mlを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分 0. 005mlとを混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。

その結果、中性フエノールォキシダーゼ I I Iの分子量は約 45 kD aであった。前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iのそれぞれの溶液 5 1と、分子量マーカー〔アマシャムバイオサイエンシーズ Am a r s h am B i o s i enc e s)社、商品名： LMW c a 1 i b r a t i o n k i t) 15 1 とを同時に 12. 5% SDS- PAGEに供した。 S DS- PAGE後のゲルを、 2. 5 % T r i t o n (登録商標） X— 100を含む 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0) 中で 60分間振擾撹拌し、その後、 lm M パラフエ二レンジアミンを含む 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0)中でゲルを 5分間振盪撹拌することによって活性染色を行なった。その後、蒸留水で 5分間洗浄し、染色用溶液〔0. 5 gのクーマシープリリアントプル一 R250を、 50 0mlのメタノールと 100mlの酢酸との混合溶液（600ml) に溶解し、得られた混合溶液を蒸留イオン交換水で全量を 1000mlに調整〕に、電気泳動後のゲルを浸すことにより染色を行なった。その後、脱色用溶液〔250mlのメタノールと 70 m 1の酢酸との混合溶液（320ml)を蒸留イオン交換水で全量を 1000m 1に調整〕で、脱色を行なった。

前記 SDS- PAGE法により、本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれは、単一のバンドを示した。前記 S D S_P AG E法による本発明の中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iそれぞれの分子量は、それぞれ 28 kDa、 35 kD a及び 45 kD aであった。実施例 3 中性フェノールォキシダーゼ I、中性フェノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの至適 pH

中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダ一ゼ I Iと各基質との反応において、緩衝液として、 pHに応じて、 0. 2M グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pHl l. 5、 10. 5及び 9. 5)、 0. 2M トリス塩酸緩衝液（p H 10. 0、 9. 0、 8. 0及び 7. 0)、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 5, 7. ( 6。 5 6. 0及び 5, 5)、 0. 2M 酢酸ナトリウム緩衝液（ p H 5. 5, 5. 0、 4. 5、 4. 0及び 3. 5)、 0. 2M グリシン塩酸緩衝液（pH3. 5、 3. 0及び 2. 0) を用いた。

2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合、前記実施例 1の（5) で得られた中性フェノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iの画分 0.02 m 1と、前記緩衝液のいずれか 0. 88m 1と， 0. 05M 2, 6—ジメ卜キシフェノール水溶液 0. 1mlとをマイクロキュべット中にて十分混合し、得られた混合物について、 470 n mにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ (J a s c o) 社製、商品名： v— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。また、オルト一ァミノフエノールを基質とした場合、前記 2， 6ージメトキシフエノ —ルを基質とした場合の評価法において、 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 05M オルトーァミノフエノールのジメチルスルホキシド溶液を用レ同様の操作を行ない、 42 Onmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合、前記 2， 6 -ジメトキシフエノールを基質とした場合の評価法において、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 05M パラーフエ二レンジァミン水溶液を用い、同様の操作を行ない、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。シリンガルダジンを基質とした場合、前記 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の評価法において、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 005M シリンガルダジンのエタノール溶液を用い、同様の操作を行ない、 530 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

なお、酵素活性は、各基質に対して適切な波長における吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U :ユニット）とした。

中性フェノールォキシダーゼ I及ぴ中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I Iそれぞれの至適 pHの結果を、図 10及び図 11にそれぞれ示す。なお、図 10及び図 11において、最大活性を 100とした場合の相対活性で示す。また、図 10及び図 1 1のそれぞれにおいて、パネル Aは、 2， 6ージメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、オルトーアミノフエノ一ルを基質とした場合を示し、パネル Cは、パラ一フエ二レンジアミンを基質とした場合を示し、パネル Dはシリンガルダジンを基質とした場合を示す。

その結果、図 10に示されるように、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ Iは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜7. 0, オルトーァミノフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜7. 0、パラ— フエ二レンジアミンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜6. 0、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 6. 5であることがわかった。また、図 1 1に示されるように、中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜6. 0、オルト— ァミノフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜7. 0、パラ—フェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5〜6. 0、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適 pHは、約 6. 5であることがわかった。中性フエノールォキシダーゼ I I Iと各基質との反応において、緩衝液として、 pH に応じて、 0. 2 M ダリシン水酸化ナトリゥム緩衝液 (pH 1 1. 5、 1 1、 10.

5、 10及び 9. 5)、 0. 2M トリス塩酸緩衝液（pH 10、 9. 5、 9、 8. 5、 8、 7. 5及び 7)、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 5、 7、 6. 5、

6、 5. 5及び 5 )、 0. 2M 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5. 5、 5、 4. 5、 4 及び 3. 5)、 0. 2M グリシン塩酸緩衝液（pH4、 3. 5、 3、 2. 5及び 2) を用いた。

2, 6—ジメ卜キシフエノ一ルを基質とした場合前記実施例 1の (7) で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分 0.04mlと、前記緩衝液のいずれか 0. 86m 1と、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1mlとをマイクロキュべット中にて充分混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

また、オルト—ァミノフエノールを基質とした場合、前記実施例 1の（7) で得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの画分 0. 005m 1と、前記緩衝液のいずれか 0. 895m 1と、 0. 05M オルトーアミノフエノ一ルのジメチルスルホキシド溶液 0.1mlとをマイクロキュべット中にて充分混合し、得られた混合物について、 420 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o)社製、商品名： V- 530) を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合、前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iの画分 0. 01mlと、前記緩衝液のいずれか 0. 8 9mlと、 0. 05M パラーフエ二レンジァミン水溶液 0. 1mlとをマイクロキュべット中にて充分混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

シリンガルダジンを基質とした場合、前記実施例 1の（7)で得られた中性フ： nノールォキシダーゼ I I Iの画分 0.02mlと、前記緩衝液のいずれか 0.96 m 1と、 0. 005M シリンガルダジンのエタノール溶液 0. 02mlとをマイクロキュべット中にて充分混合し、得られた混合物について、 530 n mにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ ( J a s c 0 ) 社製、商品名： V— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

なお、酵素活性は、各基質に対して適切な波長における吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U :ユニット）とした。中性フエノールォキシダーゼ I I Iの至適 pHの結果を、図 12に示す。なお、図 1 2において、最大活性を 100とした場合の相対活性で示す。また、図 12におけるパネル Aは、 2， 6ージメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、オルトーアミノフエノールを基質とした場合を示しパネル Cは、パラ—フエ二レンジアミンを基質とした場合を示し、パネル Dは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。その結果、図 12に示されるように、中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iは、 2， 6 ージメトキシフエノールを基質として用いた場合、至適 pHは、約 5. 5、オルト—ァミノフエノールを用いた場合、至適 pHは、約 5. 0〜7. 0、パラーフエ二レンジァミンを用いた場合、至適 pHは、約 5. 0〜6. 0、シリンガルダジンを用いた場合、至適 pHは、約 6. 0であることがわかった。実施例 4 中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iそれぞれの p H安定性

中性フノールォキシダーゼ I、中性フノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれと各基質との反応において、緩衝液として、 pHに応じて、 0. 2M グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pHl 1. 5)、 0. 2M トリス塩酸緩衝液（PH10. 0、 9. 0及び 8. 0)、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 0及び 6. 0)、 0. 2M 酢酸ナトリウム緩衝液（p H 5. 0及び 4. 0)、 0. 2M グリシン塩酸緩衝液 (pH3. 0及び 2. 0) を用いた。

前記実施例 1の (5)で得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの画分 0. 02m 1と、前記緩衝液のいずれか 0. 18mlとを混合して 30 で 1時間又は 20時間インキュベートすることにより、前処理を行なった。ついで、前処理後の精製酵素液 0. 02mlと前記緩衝液 0. 88mlと、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. lm 1とを、マイクロキュべット中にて十分混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合、前記 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合において、 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 05M パラーフエ二レンジァミン水溶液を用い、同様の操作を行ない同じく、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。なお、酵素活性は、各基質で定めた波長における吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素活性を 1単位（U：ュニット）として定義した。

中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iそれぞれの p H安定性の結果を、図 13、図 14及び図 15にそれぞれ示す。なお、図 13、図 14及び図 15それぞれにおいて、最大活性を 100とした相対残存活性で示す。また、図 13、図 14及び図 15それぞれにおいて、パネル A及び Bは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル C及び D は、パラ一フエ二レンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図 13、図 14及び図 15それぞれにおいて、パネル A及び Cは、 1時間後の pH安定性を示し、パネル B 及び Dは、 20時間後の p H安定性を示す。

その結果、図 13に示されるように、中性フエノールォキシダーゼ Iは、 1時間処理の場合、 pH7. 0-10. 0で安定であり、最大活性に対し、 75%以上の相対残存活性が保持されていた。また、 20時間処理の場合、 pH8. 0〜9. 0で安定であり、最大活性に対し、 70%以上の相対残存活性が保持されていた。

また図 14に示されるように中性フエノールォキシダ一ゼ I Iは、 1時間処理の場合、 PH6. 0-10. 0で安定であり、最大活性に対し、 75%以上の相対残存活性が保持されていた。また、 20時間処理の場合、 pH7. 0-10. 0で安定であり、最大活性に対し、 75%以上の相対残存活性が保持されていた。

図 15に示されるように、中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、 1時間処理の場合、 pH7. 0〜11. 5で安定であり、最大活性に対し、 50%以上の相対残存活性が保持されていた。また、 20時間処理の場合、 pH8. 0-10. 0で安定であり、最大活性に対し、 70%以上の相対残存活性が保持されていた。実施例 5 中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの等電点

前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iそれぞれの等電点を調べるため、ポリアクリルアミドゲルを用いて等電点電気泳動を行なった。具体的には、終濃度 2%になるように、商品名： Pha rma l y t e (p H3- 10；フアルマシア（Ph a rma c i a)社製）をアクリルアミド中に溶解し、過硫酸アンモニゥム及び N， N, Ν', Ν' —テトラメチル—エチレンジァミン（ΤΕΜ ED) を添加することにより、終濃度 5%のポリアクリルアミドゲルを調製した。電極液としては、 1. 0Μ 水酸化ナトリウム水溶液を陰極液として、 0. 5Μ 酢酸を陽極液として用いた。 50Vの定電圧で 6時間泳動を行なった。ゲル上の活性染色は、 0. 001M パラーフエ二レンジアミンを含む 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（ρΗ 7. 0) に、泳動後のゲルを浸潰し、振盪撹拌することにより行なった。等電点の測定は、泳動後、ゲル上の試料を泳動していない部分の両端を、 2. 5 mmの幅で切り出し、得られた小片を脱イオン水に浸して、 4°Cで抽出した液の p Hを測定することにより行なつ/こ。

中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iそれぞれの等電点電気泳動の結果を図 16に示す。その結果、図 16に示されるように、ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動により、中性フェノールォキシダーゼ I 中性フエノ一ルォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの等電点は.，それぞれ 7. 4、 6. 8及び 6. 8と決定された。実施例 6 中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iそれぞれの至適温度

前記実施例 1の (5)で得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iについて、それぞれの酵素活性を、種々の温度条件（20、 30、 40、 50、 60、 70、及び 80°C) 下にて、それぞれ別々に測定した。

具体的には、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質として用いる場合、マイクロセントリフュージチューブ〔ポレックスバイォプロダクツインコーポレティッド（P o r e xB i oP r oduc t s I nc.)社製〕中、 0. 2 M リン酸ナトリゥム緩衝液（p H6. 5) 0. 88m 1と、 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1 m 1と、中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フェノ一ルォキシダ一ゼ I Iの画分 0. 02mlとを混合し、得られた混合物について、各反応温度にて 5分間反応を行なつた。その後、得られた反応液に、 2M グリシン塩酸緩衝液（pH3. 0) 0. 1 mlを添加することにより、酵素反応を停止させた。

また、パラーフエ二レンジァミンを基質とした場合、前記 2， 6—ジメトキシフエノ一ルを基質とした場合の酵素活性の測定法において、 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 05 M パラ—フエ二レンジァミン水溶液を用いて同様に操作を行なった。ついで、得られた反応産物について、分光光度計〔ジヤスコ（J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕により、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合及びパラ一フエ二レンジアミンを基質とした場合共に 470 nmにおける吸光度を測定することにより、酵素活性を評価した。

なお、酵素活性は、 470 nmにおける吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1 単位（U :ユニット）として定義した。

中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iの至適温度の結果を、図 17及び図 18にそれぞれ示す。なお、図 17及び図 18において、最大活性を 100とした相対活性で示す。また、図 17及び図 18のそれぞれにおいて、パネル Aは、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合を示す。

その結果、図 17に示されるように、中性フエノールォキシダーゼ Iの至適温度は、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、 20〜50"Όで、最大活性に対し、 80%以上の相対活性を有しており、パラーフエ二レンジアミンを基質として用いた場合、 30〜60°Cで最大活性に対し、 60%以上の相対活性を有していることがわかった。

また、図 18に示されるように、中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iの至適温度は、 2， 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、 30〜60°Cで、最大活性に対し、 70%以上の相対活性を有しており、パラーフエ二レンジアミンを基質として用いた場合、 40〜70°Cで、最大活性に対し、 80 %以上の相対活性を有していることがわかつた。

一方、前記実施例 1の（ 7 )で得られた中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iについて、種々の温度条件（20、 30、 40、 50 60 70、及び 80°C)下にて測定した。具体的には、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質として用いる場合、キュベット中で、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 5) 0. 88mlと、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフヱノール水溶液 0. lm 1とを混合し、得られた混合物について、各反応温度にて 10分間加温したものを基質溶液とした。

実施例 1の (7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分を、蒸留ィォン交換水で 10倍に希釈し、酵素溶液を得た。得られた酵素溶液 0. 02m 1を、前記基質溶液に添加し、十分混合した。

得られた混合物について、各反応温度にて 5分間反応を行なった。ついで、得られた反応産物について、 470 n mにおける吸光度を分光光度計〔ジャスコ ( Jas c o) 社製、商品名： v— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。パラ—フエ二レンジアミンを基質とした場合、前記 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合における、 0. 05M 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 05M パラ—フエ二レンジァミン水溶液を用い、同様の操作を行い、同じく、 470 nmにおける吸光度を測定することにより、酵素活性を評価した。

なお、酵素活性は、 47 Onmにおける吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素活性を 1単位（U :ユニット）として定義した。

中性フエノールォキシダーゼ I I Iの至適温度の結果を、図 19に示す。なお、図 1 9において、最大活性を 100とした相対活性で示す。また、図 19において、パネル Aは、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル Bは、パラーフェニレンジアミンを基質とした場合を示す。

その結果、図 19に示されるように、中性フエノールォキシダーゼ I I Iの至適温度は、 2, 6—ジメトキシフエノールを基質として用いた場合、 20〜50°Cで最大活性に対し、 70%以上の相対活性を有しており、パラ一フエ二レンジアミンを基質として用いた場合、 20〜60°Cで最大活性に対し、 60%以上の相対活性を有していることがわかった。実施例 7 中性フエノ一ルォキシダーゼ I、中性フノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの熱安定性

PH7. 0及び] ?H9. 0のそれぞれにおいて、中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I Iの熱安定性を調べた。

前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iの画分 0. 005m 1を、種々の温度（20、 30、 40、 50、 60、 70、及び 80°C) 下にて、 0. 045mlの 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（ p H 7. 0 ) (全量 0. 005ml) 中で、種々の時間（5、 10、 20、 40、及び 60分間）インキュベートすることにより、前処理を行なった。

2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合、前処理を行なった酵素溶液 0. 02mlと、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（p H 6. 5 ) 0. 88mlと、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. lm 1とを、マイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

また、パラーフエ二レンジァミンを基質とした場合、前記 2， 6—ジメトキシフエノ一ルを基質とした場合の評価法において、 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 05M パラ—フエ二レンジアミン水溶液を用いて同様に操作を行ない、同じく、 470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。なお、酵素活性は、 470 nmにおける吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1 単位（U :ユニット）として定義した。

中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iのそれぞれの PH9.0における熱安定性を求める場合、前記 pH 7.0における前処理の代わりに、前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iの画分 0. 048 m 1を、種々の温度（30、 40、 50、 60、 7

0、及び 80°C)下にて、 0. 0121111の0. 5M トリス塩酸緩衝液（ p H 9. 0) 中で，種々の時間（5、 10、 20, 40、及ぴ 60分間）インキュベートすることにより、前処理を行なった。

中性フエノ一ルォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iの熱安定性の結果を、図 20及び図 21にそれぞれ示す。なお、図 20及び図 21において、最大活性を 100とした相対残存活性で示す。また、図 20及び図 21のそれぞれにおいて、パネル A及び Bは、 pH7. 0における熱安定性を示し、パネル C及び Dは、 pH9. 0における熱安定性を示す。さらに、図 20及び図 21のそれぞれにおいて、パネル A 及び Cは、 2， 6—ジメトキシフエノ一ルを基質とした場合を示し、パネル B及び Dは、パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合を示す。

その結果、図 20に示されるように、中性フエノールォキシダーゼ Iの pH 7. 0における熱安定性は、 1時間後の結果において、 30 まで、最大活性に対して、 80% 以上の相対残存活性を有していることがわかった。また、本発明の中性フエノールォキシダーゼ Iの pH9. 0における熱安定性は、 1時間後の結果において、 30°Cまで、最大活性に対して、 90%以上の相対残存活性を有していることがわかった。

また、図 21に示されるように、中性フエノールォキシダーゼ I Iの pH7. 0における熱安定性は、 1時間後の結果において、 50°Cまで、最大活性に対して、 90%以上の相対残存活性を有していることがわかった。また、中性フエノールォキシダーゼ I の PH9. 0における熱安定性は、 1時間後の結果において、 50°Cまで、最大活性に対して、 70 %以上の相対残存活性を有していることがわかった。

また、 pH7. 0及び pH9. 0のそれぞれにおいて、中性フエノール才キシダーゼ

1 I Iの熱安定性を調べた。中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの pH7. 0における熱安定性を調べる場合、前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分 0. 012 5 m 1を、種々の温度（20、 30、 40、 50、 60、 70、及び 80 V) 下にて、 0. 0375mlの 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（p H 7. 0) (全量 0. 05 ml) 中で、種々の時間（5、 10、 20、 40、及び 60分間）インキュベートすることにより、前処理を行った。

2, 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合、前処理を行なった酵素溶液 0. 02mlと、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH6. 5) 0. 88m 1、 0. 05M 2, 6—ジメトキシフエノール水溶液 0. 1m 1とをキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、 470 nmにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

パラーフエ二レンジアミンを基質とした場合、前記 2， 6—ジメトキシフエノールを基質とした場合の評価法において、 2， 6—ジメトキシフエノール水溶液の代わりに、 0. 05M パラーフエ二レンジァミン水溶液を用いて同様に操作を行ない、同じく、

470 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iの pH9. 0における熱安定性を求める場合、前記 pH7. 0における前処理の代わりに、前記実施例 1の（7) で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分 0. 0125m 1を、種々の温度 (20、 30、 40、

50、 60、 70、及び 80 V) 下にて、 0. 0375mlの 0. 2M トリス塩酸緩衝液（pH9. 0) (全量 0. 05ml) 中で-. 種々の時間（5 10、 20, 40_¾ 及び 60分間）インキュベートすることにより、前処理を行なった。中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iの熱安定性の結果を、図 22に示す。なお、図 2 2において、ィンキュベ一シヨン前の酵素活性を 100とした相対残存活性で示す。また、図 22のパネル A及び Bは、 pH7. 0における熱安定性を示し、パネル C及び D は pH9. 0における熱安定性を示す。さらに.，図 22において、パネル A及び Cは 2, 6_ジメトキシフエノールを基質とした場合を示し、パネル B及び Dは、パラーフェニレンジアミンを基質とした場合を示す。

その結果、. 図 22に示されるように、中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iの pH7. 0における熱安定性は、 1時間後の結果において、 30°Cまで、インキュベーション前の酵素活性に対して、 80%以上の相対残存活性を有していることがわかった。また、中性フエノールォキシダーゼ I I Iの pH9. 0における熱安定性は、 1時間後の結果において、 40°Cまで、インキュベーション前の酵素活性に対して 90%以上の相対残存活性を有していることがわかった。実施例 8 本発明の中性フエノールォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I 及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの基質特異性

本発明の中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの基質特異性を調べるために、パラ—フエニレンジァミン、 4—ヒドロキシインドール、 2—メトキシフエノール、 2, 6—ジメトキシフエノール、カテコール、パラーァミノフエノール、オルト一ァミノフエノール、シリンガルダジン、ピリルビン、 ABTS、 NNS、及び L—チロシンを基質として用い、基質特異性を調べた。

本発明の中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I Iそれぞれについてパラ一フエ二レンジァミン、 4ーヒドロキシインドール、 2—メトキシフエノール、 2， 6—ジメトキシフエノール、カテコール、 ABTS、 NNSを基質として用いた場合、前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iの画分 0. 02mlと、 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液（PH6. 5) 0. 88mlと、 0. 05M 基質水溶液 0. 1mlとをマイクロキュべット内で十分混合し、得られた混合物について各基質で定めた波長における吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ ( J a s c o)社製、商品名： V- 530] を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

パラ—ァミノフエノール又はオルトーァミノフエノールを基質とする場合、前記酵素活性の評価法において、前記 0. 05M 基質水溶液の代わりに、 0. 05M ジメチルスルホキシド溶液を用いて同様に操作を行ない、各基質で定めた波長における吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

シリンガルダジンを基質とした場合、前記酵素活性の評価法において、前記 05 M 基質水溶液の代わりに、 0.005M シリンガルダジンのエタノール溶液を用い、前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I Iそれぞれの画分 0. 02mlと、 0. 1M リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH6. 5) 0. 96mlと、 0. 005M シリンガルダジンエタノール溶液 0. 02mlとをマイクロキュべット内で十分混合し、得られた混合物について、 53 0 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

ピリルビンを基質とする場合、前記酵素活性の評価法において、前記 0. 05M 基質水溶液の代わりに、 0. 01M ジメチルスルホキシド溶液を用いて、同様に操作を行ない、 450 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

Lーチロシンを基質とした場合、前記酵素活性の評価法において、前記 0. 05M 基質水溶液の代わりに、 0. 001M Lーチロシンを含む 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH6 5) を用い _¾ 前記実施例 1の（5) で得られた中性フエノ一ルォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iそれぞれの画分 0.02 m 1と、 0. 001M L—チロシンを含む 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液 0. 98mlとをマイクロキュべッ卜内で十分混合し、得られた混合物について、 490 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

中性フエノールォキシダーゼ I I Iについて、パラ一フエ二レンジァミン、 4ーヒドロキシインドール、 2—メトキシフエノ一ル、 2, 6—ジメトキシフエノール、カテコール、 ABTSを基質として用いた場合、前記実施例 1の（7) で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分 0. 04 m 1と.. 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6. 5) 0. 86mlと、 0. 05M 基質水溶液 0. 1mlとをキュべット中で十分混合し、得られた混合物について、各基質で定めた波長における吸光度の変化を分光光度計〔ジヤスコ（ J a s c o) 社製、商品名： V— 530〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。

パラ一アミノフエノール又はオルトーアミノフエノ一ルを基質として用いた場合、前記酵素活性の評価法において、前記 0. 05M 基質水溶液の代わりに、 0. 05M 基質のジメチルスルホキシド溶液を用いて同様に操作を行ない、各基質で定めた波長における吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

NNSを基質として用いた場合、前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分 0. 04mlと、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（p H 6. 5) 0. 94mlと、 0. 005M NNS水溶液 0. 02mlとをキュべット中で十分混合し、得られた混合物について、 410 nmにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

シリンガルダジンを基質として用いた場合、前記実施例 1の (7)で得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの画分 0. 04mlと、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（PH6. 5) 0. 861111と 0. 005]^ シリンガルダジンのエタノール溶液 0. lmlとをキュべッ卜中で十分混合し、得られた混合物について、 530 η mにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

ピリルビンを基質として用いた場合、前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iの画分 0. 04mlと、 0. 2M リン酸ナトリゥム緩衝液（ p H 6. 5) 0. 94m lと、 0. 0005 M ビリルピンのジメチルスルホキシド溶液 0. 02mlとをキュべット中で十分混合し、得られた混合物について、 450 η mにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

なお、酵素活性は、各基質で定められた波長における吸光度を 1分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U :ユニット）として定義した。

中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれについて、各基質における測定波長及び結果を、表 3、表 4及び表 5に示す。

表 3 中性フエノールォキシダーゼ I 測定波長 (nm) (U)

パラフエ二レンジァミン 470 0.038

4-ヒドロキシインドール 470 0.005

2 -メトキシフエノール 470 0.022

2, 6-ジメトキシフエノール 70 0.234

カテコール 400 0.016

パラアミノフエノール 400 0.032

オルトァミノフエノール 420 0.072

シリンガルダザイン 530 0.596

ピリルビン 530 -0.215

ABTS 420 0.320

丽 S 490 - 0.017

L -チロシン 490 0.000 表 4 中性フエノ—ルォキシダ一ゼ 11

活

測定波長（nm) (U)

パラフエ二レンジァミン 470 0. 070

4-ヒドロキシインド一ル 470 0. 016

2-メトキシフエノール 470 080

2, 6 -ジメトキシフエノール 470 676

カテコール 400 032

パラアミノフエノール 400 068

オルトァミノフエノール 420 130

シリンガルダザイン 530 014

ピリルビン 530 -0. 458

ABTS 420 0. 752

NNS 490 -0. 032

L -チロシン 490 0. 000

表 5

中性フエノ一ルォキシダ一ゼ 111

測定波長 (nm) 活性（U)

パラフエ： 470 0. 080

4 -ヒドロキシインドール 470 0. 022

2-メトキシフエノール 470 0. 075

2, 6-ジメトキシフエノール 470 0. 557

カテコール 400 0. 025

パラアミノフエノール 400 0. 072

オル卜ァミノフエノール 420 0. 174

シリンガルダザイン 530 1. 142

ピリルビン 530 -0. 100

ABTS 420 0. 847

NNS 490 -0. 015

L-チロシン 490 0. 000

表 3、表 4及び表 5のそれぞれの結果より、中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノ一ルォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、フエノールォキシダーゼ活性を有することがわかった。より詳しくは、中性フノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iは、共にシリンガルダジン及び A B T Sの直接酸化（発色）反応を触媒することから、ラッカーゼ活性を有し、加えて、ピリルビンの直接酸化による分解反応を触媒することから、ビリルビンォキシダーゼ活性をも有することが示される。しかし、中性フエノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iは共に Lーチロシンの直接酸化（発色）反応を触媒しないことから、チロシナ一ゼ活性は有していない。

また、中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノ一ルォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダ一ゼ I I Iは、フエノールォキシダーゼ ·メディエー夕一である A B TS、 NNSを基質として酸化することから、これらの基質をメデイエ一夕一として仲介することによる、酵素反応の増強や、従来触媒されにくかった（触媒されなかった）反応をも効率よく行なうこと等ができる。実施例 9 中性フエノールォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iの基質特異性（直接的酸化反応）

上記実施例 1の (5)で得られた中性フエノ一ルォキシダーゼ I及び中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iのそれぞれについて、種々の化合物に対する基質特異性（直接的酸化反応）を、基質の酸化重合による発色反応で測定した。

基質としては、ジァミン化合物、ァミノフエノール系化合物、フエノール化合物及びその他の化合物（抽出物）を用いた。基質溶液として、 1. 0% (V/V) 〔パラーァミノフエノール、トリメチルヒドロキノン、ナフトール化合物、及びインドール化合物は、 10% (V/V)] のジメチルスルホキシドを含む 0 - 01M 基質水溶液 (その他の化合物については、 2. Omg/m 1の基質水溶液) を用いた。

詳細には、前記酵素を含む酵素水溶液 0. 8mlに、 1. 0M リン酸ナトリウム緩衝液（pH6. 5) 0. 11!11又は1. 0M トリス塩酸緩衝液（p H 9. 0) 0. 1m 1を添加し、得られた混合物に、 0. 01M 基質溶液（その他の化合物については、 2. Omg/m 1 ) 0. 1 m 1を混合した。ついで、得られた混合物について、紫外可視分光光度計（島津製作所社製、商品名： UV— 2450) を用いて、 P及光度の変化を測定し、酵素活性（発色活性）を調べた。なお、酵素活性は、吸光度を、 1 分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U ;ユニット）として定義した。比較のために、ミロセシウム属菌類由来ビリルピンォキシダーゼについても、同様に、 H6. 5及び 9. 0それぞれにおける基質特異性を調べた。

実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの、種々の化合物に対する基質特異性（直接的酸化反応）を、基質の酸化重合による発色反応で測定した。基質としては、ジァミン化合物、ァミノフエノール化合物、フエノール化合物、ナフトール化合物、インドール化合物及びその他の化合物（抽出物）を用いた。基質溶液として、 1% (V/V) 〔パラ一アミノフエノ一ル、トリメチルヒドロキノン、ナフ！ ^一ル化合物、及びインドール化合物は 10% (V/V)] のジメチルスルホキシドを含む 0. 01M 基質水溶液（その他の化合物については、 2. OmgZm 1の基質水溶液）を用いた。

具体的には、前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iの画分 0. 005mlと、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（p H 6. 5) 又は 0. 2M トリス塩酸緩衝液（pH 9. 0) 0. 5m 1と、蒸留イオン交換水 0. 39 5mlと、前記基質水溶液 0. 1mlと十分混合した。得られた混合物について、紫外可視分光光度計〔島津製作所社製、商品名： UV— 2450〕を用いて、各基質で定めた波長における吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。

なお、酵素活性は、各基質で定めた波長における吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素量を 1単位（U :ユニット）として定義した。

直接的酸化反応の結果を、比活性で表 6に示す。表 6

測定波長比活性 (U/mg夕ンパク質）

I nm") フエノ-ル才キシタ' -セ' I

pH6. 5 pH9. 0 ί 合輪

オルトーフ r二レンジァ ^ン 430 6. 2 0. 4 ゾ^ラレンジァ ^、/ 470 5. 0 0. 8

N N-ジ、乂キ z-ペラ-フエ.二レンジァ 470 15. 9 0. 4 ト 1 1レン- 3 Λ—、アン 470 3. 0 0. 3

7 —アミノ、マ： r二 Jレア^ 470 2. 9 0. 4

2 - ロロ- 1 4 フエニレ、パマ、 450 7. 8 0. 2

[J—ジアノ卜 JI ン 470 4. 3 0. 2 アミフエー Ϊレヒ合物

ォ Jレ卜—ァノフてノー Jレ 450 20. 9 2. 9

^~γ ^ノフノー JI 405 7. 0. 1

5—7 ノ— 2— キ Jレフエノ一 Jレ 405 0. 5 0. 1 フエノー Jレヒ合物

450 8. 1 0. 3

？ υ 、" ト 1 キシフ：：ノー Jレ 470 33. 9 0. 1 カテコ—）レ 405 2. 1 0. 2 。 D卜 1 ¾亍クノ酸 405 0. 5 0. 0

+フ 1^ ル含物

1ー+フ卜 1 Jレ 405 0. 9 0. 4

450 20. 9 6. 0

470 2. 9 1. 0 ィンドール化合物

4-ヒドロキシインドール 405 3. 2 0. 6

5-ヒドロキシインドール 405 1. 1 0. 1 その他の化合物

カテキン (緑茶抽出物） 405 0. 8 0. 2 リグニンアル力リ抽出物 (稲由来） 450 2. 5 0. 4 リグニンアル力リ抽出物 (針葉樹由来） 450 1. 9 1. 8

表 6続き

测县比活性（ϋ/mgタンパク質）ノエノ iv Vy 1! 11 ynv. 0 riy. U

^ ^ 、ノ ^ i¾

Π 1—フ丫 — * 1 - A.O ¾nU に L U. Z

/、ノ―ノェ < -レノン z ¾ A■ IΠ u b。 o (i。 ό 丄， 1 ノノ？、キノ―ノ Π /、ノ一ノ丄丫■— * 1 ノノ ^ I U u.0 U.0

11 1ノ、ノ一 3 Α-^^ ^ 、ノ 470 4.4 U, 4

j^^ -y ノフ丫

ゾ一 ^ J- -一 ~~ *ノ）レァ ^ ヽノ

ノ ~- - 4： ί U 0. U U,

9-/ Γ 1—Τ！ ΓΙ-1 I, 4 f·—ノ丄丫<一 >~ - 1 zノ- Yノ - ^ ノヽノ' Do L U. L ώ, ンノべノにノ Α Π c b.7 / U. I

^r 1 ノノゾフノ ~r ノーノ ¾u u 01. 0 厶 1

/パヽノー ^

ノ ^ ^ / っノ丄ノ / ノ Jレ！ two 7

0. ί u.丄

5 d—ァノ ^ . ノ -9- 午ノ Πレノフノ τ ノ一ノ Jし ¾Ud U. 1 ノノノ Ίし口^！/

？―ノ、 1 \ シフてノーノ Ϊレ U. o

ϋ ノ、 J、つノノノ Α:7 iΠ U 00.4 U. 丄

っ， )し 1 1

ノ」ノ U. 丄

ノ I-¹ ノノ U. o U. U ノノ Γ* ノ 1し口 ·¾/

1 1—十ノノ k P―ノ πノ

レ n U. 7 ( Π 9 丄, 1 ΓΐΦシ十ノフノ卜 1一ノ Jレレ 18.7 1.9

1, 5-ジヒドロキシナフトール 470 4.2 0.3 インド一ル化合物

4-ヒドロキシインド一ル 405 5.1 0.4

5 -ヒドロキシインド一ル 405 2.6 0.1 その他の化合物

カテキン (緑茶抽出物） 405 0.6 0.2 リグニンアル力リ抽出物 (稲由来） 450 1.3 0.5 リグニンアル力リ抽出物 (針葉樹由来） 450 1.1 2.4

表 6続き

基質測定波長比活性 (U/mgタンパク質）

(nm) フエノ-ルォキシタ" -セ' II I

pH6. 5 pH9. 0 ジアミン化合 3

才 Jレ卜フ " 二レンジアミン 430 8, 7 0„ 2 ゾヽ °ラ -フエ二レンジァミン 470 7 0 0 2

N, N—ジメチリレ—八 ^aラ—フエ二レンジァ、ミン 470 3. 6 0. 0 卜リレン- 3 4一ジァン 470 0. 8 0. 0 パラ—アミノジフエニルァン 470 2. 9 0. 0

2-ク口口- 1, 4-フエ二レンジァミン 450 10. 1 0. 0

2, 5-ジアミノトルェン 470 5. 2 0. 0 アミ》了ノー JW匕合物

オルト-アミノフエノ一ル 450 24. 1 2. 3 ゾヽ。ラ一マミノフ； Γ ノー^ 405 10. 4 0. 0

5—ア^ノー 2—メチ）レフェノール 405 1 4 0. 0 フエ一Π ヒ合物

2 -メキシフエノール 450 2. 0 0. 2

2 6—ジトキシフ： rノール 470 63. 3 0. 2 カテコーレ 405 4. 4 0. 0 プロ卜力テク酸 405 2. 1 0. 9 ナフ 1 Jレ ίヒ合物

1一ナフ 1 リレ 405 0. 7 0. 1

450 15. 5 1. 9

1, 5-ジヒドロキシナフ 1 ル 470 2. 8 0. 0 インドール化合物

4-ヒドロキシインドール 405 3. 8 0. 0

5-ヒドロキシインドール 405 2. 6 0. 0 その他の化合物

カテキン (緑茶抽出物） 405 0. 7 0. 0 リグニンアルカリ抽出物 (稲由来） 450 3. 3 0. 0 リグニンアル力リ抽出物 (針葉樹由来) 450 3. 7 0. 0

表 6糸冗さ

—基測定波長比活性 (U/mgタンパク質）

ビリルビンォキシダ -セ'

n 1JH ifiu, 0

ジァ化合輪

ォ ζ k --/ -r レンジアン 430 U. u Π υ. Πリ

パラ—フて一レンジアン 470 Q A

チ Jレラ-フて—レ 1, ァ Sン 470 9 δ

卜リレン— 3 4—ジァ 5ン 470 リ， υ π υ. 1

-アノ、フ二 JJア^ン 470 1 4-

2— ロ口— 1 4—フ： r レンジァ、 450

2 ^ノ卜レエ、 470 Q 9 η υ. 1

y ^ノフ： ϋノー Jl i合

オルト—アミノフエノーレ 450 1 R Q ϋ ¾

η =,-γ ¾ノフエノー / J1/ 405 η υ. ο Π 9

5—ァ；；ノ -2-ヌチ π ノ一レ 405 Π 1

マ； rノー Jレ i~J

2—メトキノフ： rノール 450 π η

？ ώ， u 、、、卜キシフ rノール 470 η A 1 7

ノ fl亍コ—）レ 405 Π 9

プロ卜 , ¾テク酸 405 υ. υ υ. υ

十フ } ^一 Jレ含物

1一十フ K― ϊし 405 0. 1 1. 0

1 3-ジヒドロキシ十フトール 450 12. 6 16. 7

470 3. 3 5. 1

ィンドール化合物ル

4-ヒドロキシインドール 405 1. 8 2. 7

5-ヒドロキシインドール 405 0. 1 0. 1

その他の化合物

カテキン (緑茶抽出物） 405 0. 6 1. 4

リグニンアル力リ抽出物 (稲由来） 450 0. 6 1. 6

リグニンアル力リ抽出物 (針葉樹由来） 450 3. 5 3. 8

その結果、表 6に示されるように、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、中性条件（ ρ Η 6 . 5 ) 下で、ジァミン化合物、ァミノフエノール化合物、フエノール化合物等の様々な基質の酸化反応を強く触媒した。また中性フエノールォキシダ一ゼ Iは、以下に示すような基質特異性を示した： 1 ) ジァミン化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性 ( ρ Η 6 . 5 ) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、 Ν, Ν ジメチル—パラ —フエ二レンジァミンの酸化反応を強く触媒した。

2) アミノフエノ一ル化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（p

H6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、オルト一アミノフェノールの酸化反応を強く触媒した。

3) フエノ一ル化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（PH6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、 2, 6—ジメトキシフエノールの酸化反応を強く触媒した。

4) ナフトール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（p H 6.

5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、 1， 3—ジヒドロキシナフタレンの酸化反応を強く触媒した。

5) インドール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（pH6.

5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。

6) その他の化合物（抽出物）を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性 (pH6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。

さらに、中性フエノールォキシダーゼ Iは、中性（pH6. 5) 条件下とアルカリ性 (pH9. 0)条件下での比活性を比較した場合、様々な基質において、中性（pH6. 5) 条件下での比活性のほうが、アルカリ性（pH9. 0) 条件下での比活性よりも高いことがわかった。

また、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ Iは、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）を基質とした場合、中性 (pH6. 5) 条件下でも強い触媒活性を示したが、アルカリ性 (pH9. 0) 条件下でも同等の強い触媒活性がみられた。

また、ミロセシウム属菌類由来ピリルビンォキシダ一ゼは、中性 (pH6. 5) 条件下での比活性とアルカリ性（pH9. 0) 条件下での比活性とを比較した場合ジアミン化合物及びカテコール以外の基質では、中性（PH6. 5) 条件下での比活性よりもアルカリ性 (pH9. 0) 条件下での比活性が高く、前記中性フェノ一ルォキシダーゼ Iとは大きく異なっていることがわかった。

中性フエノールォキシダ一ゼ I Iは、以下に示すような基質特異性を示した：

1) ジァミン化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ PH6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、 N, N—ジメチルーパラ —フエ二レンジァミンの酸化反応を強く触媒した。

2) アミノフエノ一ル化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（P H6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、オルト-アミノフェノールの酸化反応を強く触媒した。

3) フエノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（pH6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、 2, 6—ジメトキシフエノールの酸化反応を強く触媒した。

4) ナフトール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ρΗ6·

5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、 1， 3—ジヒドロキシナフ夕レンの酸化反応を強く触媒した。

5) インドール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ΡΗ6.

5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。

6) その他の化合物（抽出物）を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性 (ρΗ6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。

さらに、中性フエノールォキシダーゼ I Iは、中性（ Ρ Η 6. 5) 条件下での比活性とアルカリ性（ρΗ9. 0) 条件下での比活性とを比較した場合、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）を基質とした場合以外は、様々な基質において、中性（ρΗ6· 5) 条件下での比活性のほうがアルカリ性（ρΗ9. 0) 条件下での比活性よりも高いことがわかった。また、中性フエノールォキシダーゼ I Iは、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）を基質とした場合、中性（PH6. 5) 条件下でも強い触媒活性を有していたが、アルカリ性（pH9. 0) 条件下でさらに強い触媒活性がみられた。

一方、ミロセシウム属菌類由来ビリルピンォキシグーゼは、中性（pH6. 5) 条件下での比活性とアル力リ性 (pH9. 0) 条件下での比活性とを比較した場合、ジアミン化合物及び力テコール以外の基質では、中性（pH6. 5) 条件下での比活性よりもアルカリ性 (pH9. 0) 条件下での比活性が高く、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I とは大きく異なっていることがわかった。

また、中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、以下に示すような基質特異性を示した。

(1) ジァミン化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（pH6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、 2—クロロー 1, 4—フェニレンジァミンの酸化反応を強く触媒した。

(2) ァミノフエノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性 (pH6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒し。なかでも、特に、オルト一アミノフエノールの酸化反応を強く触媒した。

(3) フエノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（pH 6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、 2, 6—ジメトキシフエノールの酸化反応を強く触媒した。

(4) ナフトール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（pH 6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、 1, 3—ジヒドロキシナフタレンの酸化反応を強く触媒した。

(5) インドール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性 (pH 6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。

(6) その他の化合物（抽出物）を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（pH6. 5) 条件下で、基質の酸化反応を触媒した。

さらに、中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iは、中性（PH6. 5) 条件下とアル力リ性（PH9. 0) 条件下での比活性を比較した場合中性（pH6. 5) 条件下での比活性のほうが、アルカリ性（pH9. 0)条件下での比活性よりも高いことがわかつた。

一方、ミロセシウム属菌類由来ビリルピンォキシダーゼは、中性（pH6. 5) 条件下での比活性とアルカリ性 (pH9. 0) 条件下での比活性とを比較した場合、ジアミン化合物及びカテコール以外の基質では、中性 (pH6. 5) 条件下での比活性よりもアルカリ性（pH9. 0) 条件下での比活性が高く、中性フエノールォキシダーゼ I I Iとは大きく異なっていることがわかった。

前言 3フラムリナべレティぺス〔F 1 ammu l i na v e 1 u t i p e s ; I FO 30601株の中性フエノールォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダーゼ I I 及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iによれば、所望の基質に対する反応に応じて反応 p H条件を変更することなく、中性条件下で様々な基質を効率よく酸化させることができる。これにより、環境、人体等に対する影響が少ない温和な条件下での反応が可能であり、前記中性フエノールォキシダ一ゼ I、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、フエノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造、有機化令物の合成、染色、廃液処理、毒性化合物の解毒、木質の改善、合成版の製造、土壌の改良等の多方面への幅広い応用が期待される。実施例 10 中性フエノ一ルォキシダーゼ I、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iそれぞれの脱色活性

前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iについて、種々の染料に対する脱色活性を、染料が持つ紫外可視吸収スぺクトルの極大値の変化により測定した。

詳細には前記前記実施例 1の（5)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iを含む酵素水溶液 0. 8 m 1に 1. 0 M リン酸ナトリウム緩衝液（PH6. 5) 0. 1 m 1を添加し、得られた混合物に、 0. 2mg Zml 染料水溶液 0. lmlを混合した。ついで、得られた混合物について、紫外可視分光光度計（島津図製作所社製、商品名： UV— 2450) を用いて、吸光度の変化を測定し、酵素活性（脱色活性）を調べた。

前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iについて、種々の染料に対する脱色活性を、染料が持つ紫外可視吸収スぺクトルの極大値の変化により測定した。

詳細には、前記実施例 1の（7)で得られた中性フエノールォキシダーゼ I I Iの画分 0. 005m 1と、蒸留イオン交換水 0. 395m 1と、 0. 2M リン酸ナトリウム緩衝液（PH6. 5) 0. 5mlと、 0. 2mgZml 染料水溶液 0. 1 mlとを十分混合し、得られた混合物について紫外可視分光光度計〔島津製作所社製、商品名： UV— 2450) を用いて吸光度の変化を測定し、酵素活性（脱色活性）を調ベた。

なお、酵素活性は、吸光度を、 1分間で 1増加させる酵素活性を 1単位（U ;ュニット）として定義した。比較のために、ミロセシウム属菌類由来ピリルビンォキシダ一ゼについても、同様に、脱色活性を調べた。

各染料の測定波長及び脱色活性の結果を比活性で表 7に示す。表 7

染料測定波長比活性 (U/mgタンパク質）

(nm) 中性フエノ-ル才キシタ' -セ

ミロセシウム属菌-類由来 I I I I I I ビリルリン才キシダ -セ' ナチュラルオレンジ 6 450 -0. 06 0. 04 0. 00 0. 01

ァシッドオレンジ 8 480 0. 14 0. 19 0. 00

ァシッドバイォレツト 1 7 550 - 0. 17 - 0。 12 0. 55 0. 09

レマゾ一ルブリリアントブル '一 R 600 0. 11 0. 02 0. 00 -0. 06 エバンスプル一 630 -0. 86 - 0. 23 -0. 31 1. 03

ァシッドプル一 8 0 630 - 0. 50 -0. 07 -0. 31 - 0· 37

その結果、表 7に示されるように、中性フエノールォキシダ一ゼ Iは、ナチュラルォレンジ 6、アシッドバイオレット 1 7、エバンスブルー及びァシッドブルー 8 0に対して、脱色活性を示した。

また、表 7に示されるように、中性フエノールォキシダーゼ I Iは、アシッドバイオレット 1 7、エバンスブル一及びァシッドブル一 8 0に対して、脱色活性を示した。また、表 7に示されるように、中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iは、エバンスブル一卜

及びァシッドブルー 8 0に対して、脱色活性を示した。

さらに、中性フエノールォキシダーゼ Iは、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iと比較して、ナチュラルオレンジ 6に対する脱色活性が異なっていることがわかつた。

また、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I I Iは、中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I及び中性フエノ一ルォキシダ一ゼ I Iと比較して、ァシッドバイオレツト 1 7に対する脱色活性が異なっていることがわかった。

一方、ミロセシウム属菌類由来ピリルビンォキシダーゼは、前記中性フエノールォキシダーゼ Iとは., ナチュラルオレンジ 6、ァシッドオレンジ 8、ァシッドバイオレツト 1 7、レマゾールブリリアントブルー R、エバンスブルーにおいて大きく異なっていた。また、前記中性フエノ一ルォキシダーゼ I Iとは、ァシッドオレンジ 8、ァシッドバイォレツト 1 7、レマゾールブリリアントブルー R、エバンスブルーにおいて大きく異なつていた。また、前記中性フエノールォキシダーゼ I I Iとは., アシッドオレンジ 8、レマゾールブリリアントブルー R、エバンスブル一において大きく異なっていた。

中性フェノ—ルォキシダーゼ I、中性フェノ一ルォキシダーゼ I I及び中性フエノ一ルォキシダーゼ I I Iは、中性条件下で染料を効率よく脱色することができる。これにより、前記中中性フエノ一ルォキシダーゼ I、中性フエノールォキシダ一ゼ I I及び中性フエノールォキシダーゼ I I Iは、廃液処理、脱色、洗濯時の色移り防止等の多方面への幅広い応用が期待される。実施例 1 1 中性フノールォキシダーゼ I及び中性フエノールォキシダーゼ I Iによる染毛試験

上記実施例 1の（ 5 )で得られた中性フエノールォキシダーゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iを用いた染毛試験は、パラーフエ二レンジアミンを染料として用いて、ャク毛束及び羊毛布を酸化重合によつて染色することにより行なった。

詳細には、染毛試験においては、染料としてパラーフエ二レンジァミン 0 . 5 gと、増粘剤としてヒドロキシェチルセルロース 0 . 7 5 gと、界面活性剤として硬化ヒマシ油 1 . 0 gと、高級アルコールとしてセタノール 0 . 2 5 gと、ミリスチルアルコール 0 . 2 5 gとを添加し、得られた混合物の p Hを、乳酸 0 . 5 gとモノエタノールァミンとにより、 7 . 0に調整し、イオン交換水により重量を 5 0 gとすることにより得られた組成物を用いた。また、ャク毛束 1 gと羊毛布 1枚 ( 2 X 3 c m) に対して、この組成物を 2 gと、中性フエノールォキシダ一ゼ I又は中性フエノールォキシダ一ゼ I Iの酵素液を p H 7 . 0においてパラーフエ二レンジァミンに対して合計 1 . 0 Uになるように添加した混合物を塗布し、 3 0 °Cで 1時間保持した。その結果、ャク毛束及び羊毛布は、中性フエノールォキシダ一ゼ I又は中性フエノールォキシダーゼ I Iを用いることにより、黒く染色された。産業上の利用可能性

本発明の中性フエノールォキシダーゼは、安定的に、種々の基質、特に、フエノール化合物、アミノフエノ一ル化合物及びジァミン化合物に対して.,中性付近の p Hで効率よく反応させる際に用いられぅる。また、本発明の中性フエノールォキシダ一ゼの生産方法によれば、本発明の中性フエノールォキシダーゼを、効率よく、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができる。さらに、本発明の抗体によれば、本発明の中性フエノ一ルォキシダーゼを、簡便に、回収、精製できる。また、本発明の染色方法によれば、種々の染料、具体的には、フエノール化合物、ァミノフエノール化合物、ジァミノフエノール化合物等による、簡便で、効率よい繊維や毛髪の染色を可能にし、さらには、環境、人体等への影響を低減させることができる。さらに染色用組成物によれば、簡便で、効率のよい、繊維や毛髪の染色を可能にし、さらには、環境、人体等への影響を低減させることができる。

Claims

請求の範囲

1. 以下の特性：

(1) 至適 pH： 5. 0〜7. 0

(2) 基質特異性

i ) N, N—ジメチルーパラ一フエ二レンジァミン、オルト一ァミノフエノール、

2, 6—ジメトキシフエノール、 1， 3—ジヒドロキシナフトール及び 4—ヒドロキシィンドールそれぞれの酸化による発色反応を pH 6. 5付近で触媒する

i i) リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する

を有する中性フエノールォキシダーゼ。

2. 下記（3) 〜（7)：

(3) 28 kD a (S D S- PAGE法により算出）

(4) 11安定性： 118. 0〜9. 0において、 30°Cで 20時間のインキュべ一ション条件下、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持する

( 5 ) 至適温度： 30〜 50 °C

( 6 ) 熱安定性：

I) 0° (：〜 30°Cにおいて、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 80 %の相対残存活性を維持する

II) 0°C〜30°Cにおいて、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

(7) 等電点：約 7· 4

の特性、又は

下記（3 ') 〜（7 ')： (3，） 35 kD a (SDS- PAGE法により算出）

(4') ρΗ安定性： pH7. 0〜10. 0において、 30 °Cで 20時間のインキュベーション条件下、少なくとも 75 %の相対残存活性を維持する

(5 ') 至適温度： 30〜60

(6') 熱安定性：

I ') 0°C〜50°Cにおいて、 H 7. 0で 1時間のィンキュベ一ション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

II') 0° (：〜 50°Cにおいて、 pH9. 0で 1時間のィンキュベーション条件下、ィンキュベーション前の活性に対し、少なくとも 70 %の相対残存活性を有する

(7') 等電点：約 6. 8

の特性、又は

下記（3，，）〜（7，，）：

(3 ") 45 kD a (SDS- PAGE法により算出）

(4'，）《[安定性： 118. 0~10. 0において、 30°Cで 20時間のインキュベーション条件下、少なくとも 70 %の相対残存活性を維持する

(5 ") 至適温度： 30〜60°C

(6") 熱安定性：

I ") 0°C〜30 において、 pH7. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一ション前の活性に対し、少なくとも 80 %の相対残存活性を維持する

II") 0°C〜40°Cにおいて、 pH9. 0で 1時間のインキュベーション条件下、ィンキュベ一シヨン前の活性に対し、少なくとも 90 %の相対残存活性を維持する

(7 ") 等電点：約 6. 8

の特性

をさらに有する、請求項 1記載の中性フエノ一ルォキシダーゼ。

3. フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a)属に属する担子菌が生産する、請求項 1又は 2記載の中性フエノールォキシダーゼ。

4. フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌が、エノキタケ〔フラムリナベルティぺス (F 1 ammu 1 i n a ve l u t i p e s)] に属する担子菌である、請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダーゼ。

5. エノキタケ〔フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e 1 u t i p e s)] に属する担子菌が、フラムリナベルティぺス（F 1 ammu 1 i n a v e l u t i p e s)〕 I F〇 30601株である、請求項 1〜 4いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダーゼ。

6. フラムリナ（F 1 ammu 1 i n a) 属に属する担子菌を、 pH6. 0-12. 0で培養することを特徴とする、中性フエノールォキシダーゼの生産方法。

7. 中性フエノ一ルォキシダーゼが、請求項 1又は 2記載の中性フエノ一ルォキシダーゼである、請求項 6記載の生産方法。

8. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダーゼに対する抗体。

9. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダーゼを含有してなる染色用組成物。

1 0 . 染料をさらに含有してなる、請求項 9記載の染色用組成物。

1 1 . 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の中性フエノールォキシダ一ゼの存在下に、染色対象物と染料とを接触させて、該染色対象物を染色することを特徵とする、染色方法。