FR2732593A1 - Compositions cosmetiques a base d'enzymes proteases ou beta-glucosidases immobilisees pour favoriser l'elimination des cellules superficielles de la peau - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne des compositions cosmétiques pour application sur la peau humaine comprenant un agent accélérant l'élimination des cellules superficielles de la peau, caractérisées en ce que ledit agent est une enzyme protéase et/ou bêta-glucosidase immobilisée de manière covalente sur un support pulvérulent insoluble. Application dans l'industrie des cosmétiques.
Description
L'invention concerne des compositions cosmétiques à base d'enzymes protéases ou B-glucosidases immobilisées pour favoriser l'élimination des cellules superficielles de la peau.
Selon l'invention, on a trouvé que des enzymes protéases et g-glucosidases immobilisées de manière covalente sur un support pulvérulent insoluble sont utiles en cosmétique pour accélérer l'élimination des cellules superficielles de la peau humaine, c'est-à-dire le processus de desquamation et stimuler ainsi le renouvellement cellulaire avec les effets bénéfiques qu'il induit (souplesse accrue de la peau, meilleur éclat du teint, tonicité améliorée de la peau, et atténuation des rides et ridules, notamment).
Ainsi, l'invention concerne des compositions cosmétiques pour application sur la peau humaine comprenant un agent accélérant l'élimination des cellules superficielles de la peau, caractérisées en ce que ledit agent est une enzyme protéase et/ou g-glucosidase immobilisée sur un support pulvérulent insoluble.
Du fait de l'immobilisation de l'enzyme sur un support insoluble, on peut obtenir des compositions cosmétiques d'une excellente stabilité, qui contraste avec la stabilité médiocre de compositions contenant des enzymes libres solubles. Egalement du fait de la taille du dérivé enzymesupport, on évite que l'enzyme pénètre jusqu'aux couches inférieures de l'épiderme, voire jusqu'au derme, et ainsi, on évite ou minimise fortement le risque de réactions allergiques.
Comme support pulvérulent insoluble, on peut utiliser tout matériau insoluble dans l'eau, les huiles ou autres ingrédients inclus dans la composition cosmétique. Les particules constituant ledit support peuvent avoir une grosseur de 0,2 ym à 500 ym. Une taille minimale de 0,2 ym est nécessaire pour éviter que le dérivé enzyme-support ne puisse pénétrer profondément dans l'épiderme. Au-delà de 500 m les particules de support seraient trop grossières pour pouvoir formuler une composition cosmétique commercialement acceptable. On préfère une gamme de grosseur de particules de 1 à 50 ym.
L'enzyme immobilisée peut être produite par un procédé d'immobilisation d'enzyme connu quelconque, l'invention n'étant pas liée à l'utilisation d'un procédé particulier.
Le choix des support s insolubles et les procédés d'immobilisation des enzymes ont donné lieu à de nombreuses publications. On peut citer, à titre d'exemples seulement
a) O.R. ZABORSKY (1973) - Covalent attachment to waterinsoluble functionalized supports in "Immobilized Enzymes,
CRC Press, Cleveland Ohio, pages 5-48.
a) O.R. ZABORSKY (1973) - Covalent attachment to waterinsoluble functionalized supports in "Immobilized Enzymes,
CRC Press, Cleveland Ohio, pages 5-48.
b) A.M. FILBERT (1975), Controlled pore glasses for enzyme immobilization. In "Immobilized enzymes for industrial reactors" R.A. Messing éd. Academic Press, San
Francisco, pages 39-61.
Francisco, pages 39-61.
c) P. MONSAN, G. DURAND (1975). Les enzymes immobilisées, Apria, Massy (F).
d) H.H. WEETALL (1993) - Preparation of immobilized proteins covalently coupled through silane coupling agents to inorganic supports, Appl. Biochem. Biotechnol. 41, pages 157-188.
e) P. MONSAN (1977), Optimization of glutaraldehyde activation of a support for enzyme immobilization, J. Mol.
Catalysis, 3, pages 371-384.
f) P. MONSAN (1978) Influence of the conditions of trypsin immobilization on to Spherosil on coupling efficiency, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 5, pages 1-11.
Les enseignements de ces documents sont incorporés ici par référence.
A titre indicatif, la production de l'enzyme immobilisée (appelée aussi greffée ou fixée) peut être réalisée par toute méthode d'insolubilisation d'enzymes connue par l'homme de l'art entraînant la formation de liaison(s) covalente(s) entre l'enzyme et un support insoluble, d'une part, ou entre plusieurs molécules d'enzyme par réticulation, d'autre part.
Les supports peuvent être constitués par
- un polymère réactif directement avec l'enzyme
- un polymère non réactif directement avec l'enzyme mais fonctionnalisé de façon à pouvoir réagir avec un agent de couplage bifonctionnel qui est également réactif avec l'enzyme
- un polymère ou une matière minérale (silice, verre) non réactif directement avec l'enzyme et non fonctionnalisé, auquel cas des étapes de fonctionnalisation et d'activation du polymère sont alors nécessaires pour permettre l'immobilisation covalente de l'enzyme.
- un polymère réactif directement avec l'enzyme
- un polymère non réactif directement avec l'enzyme mais fonctionnalisé de façon à pouvoir réagir avec un agent de couplage bifonctionnel qui est également réactif avec l'enzyme
- un polymère ou une matière minérale (silice, verre) non réactif directement avec l'enzyme et non fonctionnalisé, auquel cas des étapes de fonctionnalisation et d'activation du polymère sont alors nécessaires pour permettre l'immobilisation covalente de l'enzyme.
Comme supports polymères, on peut utiliser des polymères naturels ou synthétiques. Des exemples de polymères naturels sont des polysaccharides insolubles à l'état natif tels que la cellulose et l'amidon, ou rendus insolubles après traitement chimique (par exemple le Sephadex) ; des polypeptides réticulés, notamment à l'aide de glutaraldéhyde.
Des exemples de polymères synthétiques sont des polyacrylamides, polymaléates, polyméthacrylates, polystyrènes, etc...
A ce jour, on préfère utiliser des particules de silice comme support insoluble.
Comme agents de couplage utilisables pour le greffage d'une enzyme sur un support présentant des groupes fonctionnels (amine, acide carboxylique, hydroxyle, aldéhyde) on citera le glutaraldéhyde, les carbodiimides, le réactif K de Woodward, le bromure de cyanogène, le chlorure de cyanuryle, le 4-4'-diaminodiphénylméthane, des silanes bifonctionnels, etc...
Les protéases et ss-glucosidases peuvent être d'origine animale, végétale ou microbienne. On préfère les protéases d'origine microbienne, telles que celles disponibles dans le commerce sous des désignations commerciales Neutrasee et Esperase0, vendues par la Société NOVO NORDISK A/S.
Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent être formulées sous forme de compositions de toute consistance désirée, c'est-à-dire liquide, pâteuse ou solide. Elles peuvent être de nature aqueuse ou non aqueuse, en une partie ou en deux parties à combiner juste avant l'emploi.
L'enzyme immobilisée peut représenter aussi peu que 0,1t du poids de la composition. En dessous de 0,1%, l'efficacité de la composition est non significative. La proportion maximale d'enzyme immobilisée n'est limitée que par la possibilité d'application de la composition sur la peau et le coût de la composition. Habituellement, il n'y aura pas d'avantages à dépasser une proportion de 15% en poids d'enzyme immobilisée. On préfère une proportion de 0,5 à 10% en poids d'enzyme immobilisée.
Bien que l'immobilisation de l'enzyme sur le support insoluble améliore fortement sa stabilité, on peut encore fortement accroître cette dernière en incorporant dans la composition cosmétique, des substances telles que des polyols monomères (éthylène glycol, glycérol, érythritol, xylitol et sorbitol) ou polymères (polyéthylène-glycols) connues pour accroître la stabilité des enzymes libres. Voir
P. MONSAN et D. COMBES (1987) - Methods Enzymol., K. MOSBACH ed. 137, pages 584-598 ; P. MONSAN et al. (1984) Biotechnol.
P. MONSAN et D. COMBES (1987) - Methods Enzymol., K. MOSBACH ed. 137, pages 584-598 ; P. MONSAN et al. (1984) Biotechnol.
Bioeng., 26, pages 658-664; D. COMBES et P. MONSAN (1984),
Ann. N.Y. Acad. Sci., 434, pages 61-63 ; et P. MONSAN et D.
Ann. N.Y. Acad. Sci., 434, pages 61-63 ; et P. MONSAN et D.
COMBES (1984) Ann. N.Y. Acad. Sci., 434, pages 48-60).
Cependant, il a été trouvé, selon l'invention, que l'utilisation de ces substances conjointement avec une enzyme protéase immobilisée leur conférait une stabilité nettement supérieure à ce qu'on aurait pu attendre, due à un effet de synergie surprenant.
Ainsi, la demi-vie de l'enzyme libre ou immobilisée dans l'eau à 400C est de 2 jours dans chacun des cas.
Par contre, la demi-vie, dans une solution aqueuse de sorbitol à 20% en poids, est de 6 jours pour l'enzyme libre et de 24 jours pour l'enzyme immobilisée.
On observe d'après les résultats obtenus, que le gain de stabilité obtenu en combinant l'immobilisation et l'agent stabilisant (sorbitol) va bien au-delà de ce qu'on aurait pu attendre sur la base d'un simple effet cumulatif. I1 est donc incontestable qu'un effet de synergie important existe entre les deux moyens précités.
A ce jour, le sorbitol et des associations de sorbitol et de polyéthylène-glycol constituent des stabilisants préférés.
De préférence, la ou les substances stabilisantes précitées représente(nt) au moins 20% du poids de la composition cosmétique, en particulier, au moins 35%, dans le cas d'une composition cosmétique aqueuse.
S'il s'agit d'une composition cosmétique non aqueuse, la ou les substances stabilisantes représentent, de préférence au moins 25%, avantageusement au moins 50%, de la composition.
Egalement, dans le cas où la protéase utilisée est une métallo-enzyme, on peut améliorer la stabilité de cette enzyme en ajoutant une petite quantité d'un sel de métal approprié, par exemple un sel de calcium soluble dans l'eau pour la Neutrases utilisée dans les exemples 1 et 2.
Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent contenir n'importe lequel des ingrédients usuellement utilisés pour la formulation des compositions cosmétiques, pourvu qu'il n'affecte pas défavorablement l'activité de l'enzyme immobilisée ce dont on pourra facilement s'assurer par des essais préalables simples à mettre en oeuvre. On indique ci-après quelques exemples non limitatifs d'ingrédients de formulation convenables : silicones (par exemple la cyclométhicone, le diméthiconol), paraffines, alcool dodécylique et alcools supérieurs, alcools polyéthoxylés, alkylpolyglucosides, polysorbates, esters de sorbitanne, SEPIGELs 305 (vendu par la Société SEPPIC,
France) PHENONIPs (agent conservateur vendu par la Société
NIPA Laboratories, Grande-Bretagne) , et lthydroxydthylcellulose.
France) PHENONIPs (agent conservateur vendu par la Société
NIPA Laboratories, Grande-Bretagne) , et lthydroxydthylcellulose.
L'invention concerne également une composition utile pour la formulation d'une composition cosmétique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle consiste essentiellement en une enzyme protéase et/ou ss-glucosidase immobilisée sur un support pulvérulent insoluble et au moins une substance stabilisante choisie parmi les polyols monomères et polymères, ladite composition étant sous forme sensiblement sèche (lyophilisée) ou aqueuse.
De préférence, ladite composition est sous forme sensiblement sèche et/ou ladite substance stabilisante représente au moins 20% du poids de la composition sèche ou aqueuse.
Les polyols utilisables sont les mêmes que ceux décrits ci-dessus pour les compositions cosmétiques finales.
L'expression "sensiblement sèche" n'exclut pas la présence possible de quelques pourcents d'humidité.
L'invention est encore illustrée par les exemples non limitatifs suivants
ExemPle 1 : Préparation et caractérisation d'une protéase immobilisée sur silice.
ExemPle 1 : Préparation et caractérisation d'une protéase immobilisée sur silice.
La préparation commerciale de protéase utilisée provenait de la Société NOVO NORDISK A/S (BAGSVAERD,
DANEMARK). Elle est produite par une souche sélectionnée de
Bacillus subtilis et est disponible sous le nom commercial de Neutrases 1,5 MG (EC 3.4.24.28).
DANEMARK). Elle est produite par une souche sélectionnée de
Bacillus subtilis et est disponible sous le nom commercial de Neutrases 1,5 MG (EC 3.4.24.28).
La silice utilisée provenait de la Société AKZO
CHEMICALS SARL (COMPIEGNE, FRANCE). Les caractéristiques étaient les suivantes : surface spécifique : 180 m2/g teneur en dioxyde de silicium : 98% ; diamètre moyen des particules : 10 ym.
CHEMICALS SARL (COMPIEGNE, FRANCE). Les caractéristiques étaient les suivantes : surface spécifique : 180 m2/g teneur en dioxyde de silicium : 98% ; diamètre moyen des particules : 10 ym.
L'immobilisation de la protéase sur la silice a été effectuée comme suit
- étape de silanation : 901 d'eau déminéralisée sont préchauffés à 800C ; 18 kg de silice, puis 0,251 de triéthoxysilyl-3-propylamine (agent de couplage) sont ajoutés sous agitation. Le pH de la suspension est alors ajusté à 3,5 avec 11 d'acide acétique à 80%. La température est maintenue à 800C pendant 3 heures, tandis que la suspension reste agitée.
- étape de silanation : 901 d'eau déminéralisée sont préchauffés à 800C ; 18 kg de silice, puis 0,251 de triéthoxysilyl-3-propylamine (agent de couplage) sont ajoutés sous agitation. Le pH de la suspension est alors ajusté à 3,5 avec 11 d'acide acétique à 80%. La température est maintenue à 800C pendant 3 heures, tandis que la suspension reste agitée.
Une fois la réaction de silanation terminée, la température de la suspension est ramenée à 25OC
- étape d'activation : à la suspension aqueuse de silice silanée, sont ajoutés successivement 1,1 kg de dihydrogénophosphate de sodium anhydre et 2,0 1 de solution commerciale de glutaraldéhyde (teneur en glutaraldéhyde 25% p/p) ; le pH de la suspension est ajusté à 7,0 avec 1,8 1 de soude 10N.La suspension est maintenue sous agitation à 250C pendant 2 heures
- étape d'immobilisation : à la suspension aqueuse de silice activée, est ajoutée la solution aqueuse d'enzyme préparée comme suit : 360 g de dihydrogénophosphate de sodium sont solubilisés dans 301 d'eau déminéralisée ; le pH est ajusté à 7,1 avec 0,241 de soude 10N, puis on disperse dans cette solution 1,5 kg de Neutrases 1,5 MG l'immobilisation de la protéase sur la silice activée s'effectue sous agitation pendant 2 heures à 250C
- étape de rinçage : on ajoute d'abord à la suspension d'enzyme immobilisée une solution aqueuse concentrée de disulfite de sodium (2,6 kg ajoutés à 5,5 1 d'eau, puis la suspens ion de protéase immobilisée est filtrée sur des plaques filtrantes d'une porosité de 10 m : les réactifs en excès sont ainsi éliminés dans le jus de filtration, la protéase immobilisée sur silice ne traversant pas la membrane filtrante. La protéase immobilisée est ensuite lavée avec 3801 d'eau déminéralisée puis avec une solution composée de 1801 d'eau déminéralisée, 0,24 kg de dihydrogénophosphate de sodium, 0,40 kg de disulfite de sodium, 25 kg de solution de sorbitol à 70% p/p (Neosorb, vendu par la Société ROQUETTE). Le tout est ajusté à pH 7,0 avec de la soude 10N. Le liquide de lavage est éliminé et la protéase immobilisée est récupérée.
- étape d'activation : à la suspension aqueuse de silice silanée, sont ajoutés successivement 1,1 kg de dihydrogénophosphate de sodium anhydre et 2,0 1 de solution commerciale de glutaraldéhyde (teneur en glutaraldéhyde 25% p/p) ; le pH de la suspension est ajusté à 7,0 avec 1,8 1 de soude 10N.La suspension est maintenue sous agitation à 250C pendant 2 heures
- étape d'immobilisation : à la suspension aqueuse de silice activée, est ajoutée la solution aqueuse d'enzyme préparée comme suit : 360 g de dihydrogénophosphate de sodium sont solubilisés dans 301 d'eau déminéralisée ; le pH est ajusté à 7,1 avec 0,241 de soude 10N, puis on disperse dans cette solution 1,5 kg de Neutrases 1,5 MG l'immobilisation de la protéase sur la silice activée s'effectue sous agitation pendant 2 heures à 250C
- étape de rinçage : on ajoute d'abord à la suspension d'enzyme immobilisée une solution aqueuse concentrée de disulfite de sodium (2,6 kg ajoutés à 5,5 1 d'eau, puis la suspens ion de protéase immobilisée est filtrée sur des plaques filtrantes d'une porosité de 10 m : les réactifs en excès sont ainsi éliminés dans le jus de filtration, la protéase immobilisée sur silice ne traversant pas la membrane filtrante. La protéase immobilisée est ensuite lavée avec 3801 d'eau déminéralisée puis avec une solution composée de 1801 d'eau déminéralisée, 0,24 kg de dihydrogénophosphate de sodium, 0,40 kg de disulfite de sodium, 25 kg de solution de sorbitol à 70% p/p (Neosorb, vendu par la Société ROQUETTE). Le tout est ajusté à pH 7,0 avec de la soude 10N. Le liquide de lavage est éliminé et la protéase immobilisée est récupérée.
L'activité massique de la préparation de protéase immobilisée peut être mesurée en déterminant l'activité protéolytique contenue dans une quantité déterminée du dérivé insoluble obtenu.
La mesure de l'activité protéolytique est réalisée comme suit : 4,0 ml d'une solution de caséine (caséine à 12,5 g/l dans une solution aqueuse de tampon 2-(Nmorpholino)éthane sulfonate de sodium, pH 6,20 + 0,05 préincubée à 400C) sont ajoutés à 1,0 ml de préparation d'enzyme immobilisée, à 400C. La préparation d'enzyme immobilisée est obtenue après deux lavages consécutifs à l'aide de 10 ml d'eau déminéralisée d'un échantillon de préparation contenant l'équivalent sec de 50 mg d'enzyme immobilisée. La réaction d'hydrolyse de la caséine est réalisée à 40 + 10C pendant 10 minutes sous agitation douce.
La réaction d'hydrolyse est ensuite arrêtée en ajoutant 5,0 ml d'une solution aqueuse d'acide trichloroacétique à 20% p/v. Le mélange est conservé à 40C pendant 30 minutes puis est centrifugé (10 minutes, 4000 G, 200C). Le surnageant est collecté puis soumis à une seconde centrifugation dans les mêmes conditions que la première. L'absorbance du second surnageant est mesurée à 280 nm, en prenant comme référence un surnageant obtenu comme décrit précédemment mais en ayant omis la protéase lors de la réaction d'hydrolyse. Une unité d'activité protéolytique (U) correspond à la quantité d'enzyme qui, en libérant des peptides de caséine solubles dans 10% d'acide trichloroacétique, permet d'obtenir par minute une absorbance égale à 0,001 à 280 nm, dans les conditions définies précédemment.
L'activité massique de la protéase immobilisée est calculée en divisant l'activité protéolytique mesurée dans l'essai par la quantité de protéase immobilisée utilisée dans l'essai. Elle est exprimée en U/g de protéase immobilisée.
La mesure de l'activité massique de la préparation de protéase immobilisée effectuée dans les conditions standards, c'est-à-dire après deux lavages extensifs à l'eau d'une fraction aliquote, a conduit à une valeur de 1670 U/g.
La mesure de l'activité massique de la préparation de protéase immobilisée sans avoir procédé au lavage extensif à l'eau d'une fraction aliquote (la préparation obtenue est celle directement obtenue en fin de procédé de fabrication de la protéase immobilisée) a conduit à une valeur de 1710
U/g.
U/g.
Ce résultat indique que la préparation de protéase immobilisée obtenue en fin de procédé de fabrication ne contient pas de protéase adsorbée sur la silice, protéase adsorbée qui serait éliminable par lavage à l'eau.
L'activité massique de la préparation a été enfin déterminée après deux lavages d'une fraction aliquote à l'aide de 10 ml de NaCl 1M. L'activité massique a été trouvée à 1660 U/g : ce résultat montre l'absence de protéase adsorbée sur la silice qui serait éliminable par lavage à l'aide d'une solution concentrée de chlorure de sodium.
L'ensemble de ces résultats permet donc de conclure qu'une protéase a été fixée de manière covalente sur un support insoluble tel que la silice et que la préparation obtenue ne contient pas d'enzyme qui pourrait être détachée de son support par désorption.
La stabilité au stockage à 400C de la protéase immobilisée conservée en milieu liquide a été comparée à la stabilité de la protéase native (non immobilisée) conservée dans les mêmes conditions.
Les deux préparations enzymatiques ont été conservées séparément dans une solution aqueuse de sorbitol à 20% p/p (150 U d'activité protéolytique pour 1 ml de solution de conservation contenant le sorbitol, du tampon 2- (N- morpholino) éthane sulfonate de sodium, pH 6,2 à 10 mM, et 3 mM de NaN3 (en tant que bactéricide conservateur).
L'évolution au cours du temps de l'activité protéolytique relative contenue dans chacun des milieux d'incubation est reportée dans le Tableau 1. Alors que la demi-vie de la protéase native (protéase non immobilisée) est de six jours, il apparaît que la demi-vie de la protéase immobilisée est de vingt-quatre jours. On remarque aussi que l'activité massique de la protéase immobilisée diminue fortement durant le premier mois de stockage puis se stabilise au cours du deuxième mois (il reste 35% de l'activité massique initiale après 70 Jours de conservation). Après 20 jours de stockage, il ne reste que 28% de l'activité protéolytique de l'enzyme native, et seulement 14% après 42 jours.
Dans des conditions de conservation identiques, il apparaît donc que la protéase immobilisée est bien plus stable que la protéase native en solution (non immobilisée).
TABLEAU 1
Comparaison de la stabilité de la protéase immobilisée et de la protéase native (non immobilisée) lorsqu'elles sont conservées à 400C dans une solution aqueuse de sorbitol à 20% p/p.
Comparaison de la stabilité de la protéase immobilisée et de la protéase native (non immobilisée) lorsqu'elles sont conservées à 400C dans une solution aqueuse de sorbitol à 20% p/p.
<tb>
<SEP> Activité <SEP> relative, <SEP> % <SEP>
<tb> Temps, <SEP>
<tb> jours <SEP> Protéase <SEP> native <SEP> Protéase
<tb> <SEP> (non <SEP> immobilisée) <SEP> immobilisée
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 57 <SEP> 87
<tb> <SEP> 10 <SEP> 34
<tb> <SEP> 15 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 57
<tb> <SEP> 20 <SEP> 29
<tb> <SEP> 27 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 44
<tb> <SEP> 42 <SEP> 14
<tb> <SEP> 47 <SEP> - <SEP> <SEP> 34
<tb> <SEP> 63 <SEP> - <SEP> 38
<tb> <SEP> 110 <SEP> - <SEP> 34
<tb>
Lorsque les préparations enzymatiques sont conservées à 400C dans une solution aqueuse contenant 25% p/p de sorbitol et 25% p/p de PEG 600 (150 U d'activité protéolytique pour 1 ml de solution de conservation contenant les additifs, du tampon 2-(N-morpholino)éthane sulfonate de sodium, pH 6,2 à 10 mM et 3 mM de NaN3), la protéase immobilisée est encore significativement plus stable que l'enzyme native (protéase non immobilisée) (Tableau 2). Alors que la demi-vie de la protéase native est de 26 jours, la demi-vie de la protéase immobilisée est supérieure à 1 an. En effet, après 120 jours de stockage, il reste plus de 80% de l'activité protéolytique de la protéase immobilisée. I1 est donc confirmé que l'immobilisation a permis de rendre l'enzyme beaucoup plus stable à la conservation en milieu liquide à 400C.
<tb> Temps, <SEP>
<tb> jours <SEP> Protéase <SEP> native <SEP> Protéase
<tb> <SEP> (non <SEP> immobilisée) <SEP> immobilisée
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 57 <SEP> 87
<tb> <SEP> 10 <SEP> 34
<tb> <SEP> 15 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 57
<tb> <SEP> 20 <SEP> 29
<tb> <SEP> 27 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 44
<tb> <SEP> 42 <SEP> 14
<tb> <SEP> 47 <SEP> - <SEP> <SEP> 34
<tb> <SEP> 63 <SEP> - <SEP> 38
<tb> <SEP> 110 <SEP> - <SEP> 34
<tb>
Lorsque les préparations enzymatiques sont conservées à 400C dans une solution aqueuse contenant 25% p/p de sorbitol et 25% p/p de PEG 600 (150 U d'activité protéolytique pour 1 ml de solution de conservation contenant les additifs, du tampon 2-(N-morpholino)éthane sulfonate de sodium, pH 6,2 à 10 mM et 3 mM de NaN3), la protéase immobilisée est encore significativement plus stable que l'enzyme native (protéase non immobilisée) (Tableau 2). Alors que la demi-vie de la protéase native est de 26 jours, la demi-vie de la protéase immobilisée est supérieure à 1 an. En effet, après 120 jours de stockage, il reste plus de 80% de l'activité protéolytique de la protéase immobilisée. I1 est donc confirmé que l'immobilisation a permis de rendre l'enzyme beaucoup plus stable à la conservation en milieu liquide à 400C.
TABLEAU 2
Comparaison de la stabilité de la protéase immobilisée et de la protéase native (non immobilisée) lesquelles sont conservées à 400C dans une solution aqueuse contenant du sorbitol à 25% p/p et du PEG 600 à 25% p/p.
Comparaison de la stabilité de la protéase immobilisée et de la protéase native (non immobilisée) lesquelles sont conservées à 400C dans une solution aqueuse contenant du sorbitol à 25% p/p et du PEG 600 à 25% p/p.
<tb>
<SEP> Activité <SEP> relative, <SEP> W <SEP>
<tb> Temps, <SEP> <SEP> ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP>
<tb> jours <SEP> Protéase <SEP> native <SEP> Protéase
<tb> <SEP> (non <SEP> immobilisée) <SEP> immobilisée
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 75 <SEP> 146
<tb> <SEP> 15 <SEP> 66
<tb> <SEP> 18 <SEP> 141
<tb> <SEP> 40 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 111
<tb> <SEP> 44 <SEP> 34
<tb> <SEP> 60 <SEP> 24
<tb> <SEP> 70 <SEP> 19 <SEP> 79
<tb> <SEP> 92 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 90
<tb> <SEP> 139 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 84
<tb>
L'association de sorbitol et de PEG 600 dans la solution de conservation de la protéase immobilisée apparaît particulièrement bénéfique pour maintenir la stabilité de l'enzyme au stockage. I1 a même été observé au début de la période de conservation une légère activation de l'activité enzymatique, activation observée aussi en présence de sorbitol à 50%, mais difficilement décelable lorsque l'enzyme immobilisée est conservée dans une solution aqueuse de PEG 600 à 50% ou de sorbitol à 35% (Tableau 3). La protéase immobilisée sera donc préférentiellement conservée dans une formulation cosmétique contenant un mélange de sorbitol et de PEG 600 (ou de PEG de masse molaire moyenne supérieure à 600) ou seulement du sorbitol.
<tb> Temps, <SEP> <SEP> ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP>
<tb> jours <SEP> Protéase <SEP> native <SEP> Protéase
<tb> <SEP> (non <SEP> immobilisée) <SEP> immobilisée
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 75 <SEP> 146
<tb> <SEP> 15 <SEP> 66
<tb> <SEP> 18 <SEP> 141
<tb> <SEP> 40 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 111
<tb> <SEP> 44 <SEP> 34
<tb> <SEP> 60 <SEP> 24
<tb> <SEP> 70 <SEP> 19 <SEP> 79
<tb> <SEP> 92 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 90
<tb> <SEP> 139 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 84
<tb>
L'association de sorbitol et de PEG 600 dans la solution de conservation de la protéase immobilisée apparaît particulièrement bénéfique pour maintenir la stabilité de l'enzyme au stockage. I1 a même été observé au début de la période de conservation une légère activation de l'activité enzymatique, activation observée aussi en présence de sorbitol à 50%, mais difficilement décelable lorsque l'enzyme immobilisée est conservée dans une solution aqueuse de PEG 600 à 50% ou de sorbitol à 35% (Tableau 3). La protéase immobilisée sera donc préférentiellement conservée dans une formulation cosmétique contenant un mélange de sorbitol et de PEG 600 (ou de PEG de masse molaire moyenne supérieure à 600) ou seulement du sorbitol.
TABLEAU 3
Stabilité de la protéase immobilisée dans divers milieux de stockage, à 400C.
Stabilité de la protéase immobilisée dans divers milieux de stockage, à 400C.
<tb>
<SEP> Activité <SEP> relative, <SEP> W <SEP> (a)
<tb> Temps, <SEP> Solution <SEP> Solution <SEP> Solution
<tb> jours <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> aqueuse <SEP> de
<tb> <SEP> sorbitol <SEP> à <SEP> PEG <SEP> 600 <SEP> à <SEP> sorbitol <SEP> à
<tb> <SEP> 50% <SEP> p/p <SEP> 50% <SEP> p/p <SEP> 35%
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 124 <SEP> 112 <SEP> 108
<tb> <SEP> 15 <SEP> 79
<tb> <SEP> 18 <SEP> 126 <SEP> 99
<tb> <SEP> 27 <SEP> 78
<tb> <SEP> 40 <SEP> 104 <SEP> 54
<tb> <SEP> 47 <SEP> 68
<tb> <SEP> 63 <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> 71
<tb> <SEP> 70 <SEP> 72 <SEP> 31
<tb> <SEP> 92 <SEP> 86 <SEP> 25
<tb> <SEP> 110 <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> 83
<tb> <SEP> 139 <SEP> 87 <SEP> 17
<tb> (a) protéase immobilisée à 150 U/ml ; ; tampon 2-(Nmorpholino)-éthanesulfonate de sodium 10 mM, pH 6,2 ; NaN3 3 mM.
<tb> Temps, <SEP> Solution <SEP> Solution <SEP> Solution
<tb> jours <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> aqueuse <SEP> de <SEP> aqueuse <SEP> de
<tb> <SEP> sorbitol <SEP> à <SEP> PEG <SEP> 600 <SEP> à <SEP> sorbitol <SEP> à
<tb> <SEP> 50% <SEP> p/p <SEP> 50% <SEP> p/p <SEP> 35%
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 124 <SEP> 112 <SEP> 108
<tb> <SEP> 15 <SEP> 79
<tb> <SEP> 18 <SEP> 126 <SEP> 99
<tb> <SEP> 27 <SEP> 78
<tb> <SEP> 40 <SEP> 104 <SEP> 54
<tb> <SEP> 47 <SEP> 68
<tb> <SEP> 63 <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> 71
<tb> <SEP> 70 <SEP> 72 <SEP> 31
<tb> <SEP> 92 <SEP> 86 <SEP> 25
<tb> <SEP> 110 <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> 83
<tb> <SEP> 139 <SEP> 87 <SEP> 17
<tb> (a) protéase immobilisée à 150 U/ml ; ; tampon 2-(Nmorpholino)-éthanesulfonate de sodium 10 mM, pH 6,2 ; NaN3 3 mM.
Finalement, la protéase immobilisée a été conservée dans une solution aqueuse de sorbitol à 50% p/p à 450C. Dans ces conditions, la demi-vie de la protéase immobilisée est supérieure à 1 an, avec la conservation de plus de 806 de l'activité protéolytique après 100 jours de stockage (Tableau 4).
TABLEAU 4
Stabilité de la protéase immobilisée dans une solution aqueuse de sorbitol à 500% p/p à 450C.
Stabilité de la protéase immobilisée dans une solution aqueuse de sorbitol à 500% p/p à 450C.
<tb>
Temps, <SEP> jours <SEP> Activité <SEP> relative, <SEP> % <SEP> (a) <SEP>
<tb> <SEP> 100 <SEP>
<tb> <SEP> 27 <SEP> 84
<tb> <SEP> 52 <SEP> 1 <SEP> 80
<tb> <SEP> 73 <SEP> 79
<tb> <SEP> 102 <SEP> 85
<tb> (a) Protéase immobilisée à 150 U/ml de solution aqueuse de sorbitol à 50% p/p : tampon 2-(N-morpholino)éthanesulfonate de sodium 10 mM, pH 6,2 ; NaN3 : 3 mM.
<tb> <SEP> 100 <SEP>
<tb> <SEP> 27 <SEP> 84
<tb> <SEP> 52 <SEP> 1 <SEP> 80
<tb> <SEP> 73 <SEP> 79
<tb> <SEP> 102 <SEP> 85
<tb> (a) Protéase immobilisée à 150 U/ml de solution aqueuse de sorbitol à 50% p/p : tampon 2-(N-morpholino)éthanesulfonate de sodium 10 mM, pH 6,2 ; NaN3 : 3 mM.
La stabilité au stockage à 40 ou 450C de la protéase immobilisée sous forme sèche (lyophilisée) dépend de la teneur en additifs stabilisants dans la préparation enzymatique globale. La protéase immobilisée a été lyophilisée en présence d'additifs de façon à obtenir des préparations sèches contenant
a) 15% p/p de sorbitol
b) 28% p/p de sorbitol
c) 28% p/p d'un mélange de sorbitol et de PEG 1500
d) 50% p/p de sorbitol.
a) 15% p/p de sorbitol
b) 28% p/p de sorbitol
c) 28% p/p d'un mélange de sorbitol et de PEG 1500
d) 50% p/p de sorbitol.
Lorsque la préparation de protéase immobilisée contenant 15% de sorbitol (les 85% restant étant constitués par de la silice sur laquelle est greffée la protéase et de moins de 2% d'eau) est conservée à 400C, la dénaturation de la protéase est rapide (demi-vie : 6 jours, Tableau 5). Par contre, lorsque la préparation de protéase immobilisée contient 28% d'additifs stabilisants, sorbitol ou mélange de sorbitol et de PEG 1500, l'activité protéolytique résiduelle après 83 jours de conservation à 400C est supérieure ou égale à 80% de l'activité protéolytique initiale. Lorsque la préparation de protéase immobilisée contient 50% (p/p) de sorbitol, aucune diminution de l'activité protéolytique n'a été observée après 83 jours de stockage à 450C (Tableau 5).
TABLEAU 5
Stabilité de la protéase immobilisée stockée à 40 et 450C sous forme lyophilisée.
Stabilité de la protéase immobilisée stockée à 40 et 450C sous forme lyophilisée.
<tb>
<SEP> Activité <SEP> relative, <SEP> t <SEP>
<tb> Temps, <SEP> Sorbitol: <SEP> Sorbitol: <SEP> Sorbitol: <SEP> Sorbitol:
<tb> jours <SEP> 15% <SEP> - <SEP> 400C <SEP> 28 <SEP> - <SEP> 400C <SEP> 14W <SEP> 50%-450C
<tb> <SEP> PEG <SEP> 1500
<tb> <SEP> 14% <SEP> - <SEP> 400C <SEP>
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 12 <SEP> 41 <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 16 <SEP> 35 <SEP> 83 <SEP> 83 <SEP> 103
<tb> <SEP> 26 <SEP> - <SEP> 83 <SEP> 90
<tb> <SEP> 46 <SEP> 37 <SEP> 86 <SEP> 90 <SEP> 100
<tb> <SEP> 70 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 93 <SEP> 102
<tb> <SEP> 83 <SEP> - <SEP> <SEP> 90 <SEP> 98 <SEP> 100
<tb>
Enfin, la stabilité de la protéase immobilisée a été étudiée dans un exemple de formule cosmétique en dispersant 100 g de protéase immobilisée lyophilisée dans 1 kg du mélange suivant
cyclométhicone et diméthiconol
(DOW CORNING 1401) : 10%
cyclométhicone et diméthicone
copolyol (DOW CORNING 3225C) : 10%
cyclométhicone (DOW CORNING 344) : 10%
glycérine : 5%
eau : 22,8%
chlorure de sodium : 2%
sorbitol à 70% p/p : 40%
Phénonips : 0, 2
L'activité de la protéase immobilisée a été déterminée au cours du stockage de la préparation à 400C après élimination des composants de la formule (Tableau 6).
<tb> Temps, <SEP> Sorbitol: <SEP> Sorbitol: <SEP> Sorbitol: <SEP> Sorbitol:
<tb> jours <SEP> 15% <SEP> - <SEP> 400C <SEP> 28 <SEP> - <SEP> 400C <SEP> 14W <SEP> 50%-450C
<tb> <SEP> PEG <SEP> 1500
<tb> <SEP> 14% <SEP> - <SEP> 400C <SEP>
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 12 <SEP> 41 <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 16 <SEP> 35 <SEP> 83 <SEP> 83 <SEP> 103
<tb> <SEP> 26 <SEP> - <SEP> 83 <SEP> 90
<tb> <SEP> 46 <SEP> 37 <SEP> 86 <SEP> 90 <SEP> 100
<tb> <SEP> 70 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 93 <SEP> 102
<tb> <SEP> 83 <SEP> - <SEP> <SEP> 90 <SEP> 98 <SEP> 100
<tb>
Enfin, la stabilité de la protéase immobilisée a été étudiée dans un exemple de formule cosmétique en dispersant 100 g de protéase immobilisée lyophilisée dans 1 kg du mélange suivant
cyclométhicone et diméthiconol
(DOW CORNING 1401) : 10%
cyclométhicone et diméthicone
copolyol (DOW CORNING 3225C) : 10%
cyclométhicone (DOW CORNING 344) : 10%
glycérine : 5%
eau : 22,8%
chlorure de sodium : 2%
sorbitol à 70% p/p : 40%
Phénonips : 0, 2
L'activité de la protéase immobilisée a été déterminée au cours du stockage de la préparation à 400C après élimination des composants de la formule (Tableau 6).
TABLEAU 6
Stabilité à 400C de la protéase immobilisée dans un exemple de formule cosmétique.
Stabilité à 400C de la protéase immobilisée dans un exemple de formule cosmétique.
<tb>
Temps, <SEP> jours <SEP> Activité <SEP> relative, <SEP> %
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> <SEP> 13 <SEP> 100
<tb> <SEP> 23 <SEP> 80
<tb> <SEP> 35 <SEP> 77
<tb>
Lorsque la formule cosmétique ci-dessus a été additionnée de 0,7 g de Cl2Ca par kg de composition, aucune perte d'activité enzymatique n'a été observée après 35 jours de stockage à 400C.
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> <SEP> 13 <SEP> 100
<tb> <SEP> 23 <SEP> 80
<tb> <SEP> 35 <SEP> 77
<tb>
Lorsque la formule cosmétique ci-dessus a été additionnée de 0,7 g de Cl2Ca par kg de composition, aucune perte d'activité enzymatique n'a été observée après 35 jours de stockage à 400C.
Exemple 2 : Préparation et caractérisation d'une B- alucosidase immobilisée sur silice.
La préparation commerciale de B-glucosidase d'amande (EC : 3.2.1.21) utilisée provenait de la Société SIGMA (St
Louis, MO, U.S.A.). La silice était la même que celle utilisée pour l'immobilisation de la protéase.
Louis, MO, U.S.A.). La silice était la même que celle utilisée pour l'immobilisation de la protéase.
L'immobilisation de la B-glucosidase sur la silice a été effectuée comme suit
- étape de silanation : 2,5 ml de triéthoxysilyl-3propylamine ont été dilués dans 250 ml d'eau déminéralisée; 50 g de silice sont introduits dans la solution et l'ensemble est chauffé à 800C pendant 3h 30 sous agitation.
- étape de silanation : 2,5 ml de triéthoxysilyl-3propylamine ont été dilués dans 250 ml d'eau déminéralisée; 50 g de silice sont introduits dans la solution et l'ensemble est chauffé à 800C pendant 3h 30 sous agitation.
Lorsque la réaction de silanation est terminée, la température de la suspension est ramenée à 250C
- étape d'activation : à la suspension aqueuse de silice silanée, on ajoute 17 ml de tampon phosphate de sodium 1,6 M, pH 7,0 puis 28 ml de solution commerciale de glutaraldéhyde (teneur en glutaraldéhyde : 25% p/p) ; le pH du mélange est égal à 7,2.
- étape d'activation : à la suspension aqueuse de silice silanée, on ajoute 17 ml de tampon phosphate de sodium 1,6 M, pH 7,0 puis 28 ml de solution commerciale de glutaraldéhyde (teneur en glutaraldéhyde : 25% p/p) ; le pH du mélange est égal à 7,2.
La suspension est maintenue sous agitation à 250C pendant 2 heures
- étape d'immobilisation : à la suspension aqueuse de silice activée ajustée à pH 6,5 avec HC1 1N, est ajoutée la solution aqueuse d'enzyme préparée en diluant 725 mg de Bglucosidase lyophilisée dans 20 ml d'eau déminéralisée ; l'immobilisation de la ss-glucosidase sur la silice activée s'effectue sous agitation pendant 2 heures à 250C
- étape de rinçage : on ajoute d'abord à la suspension d'enzyme immobilisée 32 ml d'une solution de disulfite de sodium à 200 g/l puis la suspension de B-glucosidase immobilisée est filtrée sur des plaques filtrantes de porosité 10 ym : les réactifs en excès sont ainsi éliminés dans le jus de filtration, la ss-glucosidase immobilisée ne traversant pas la membrane filtrante. La B-glucosidase immobilisée est ensuite lavée avec 500 ml d'eau déminéralisée, puis avec 250 ml de solution de NaCl 1M et enfin avec 500 ml de tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 6,0, contenant 1 g/l de disulfite de sodium. Le liquide de lavage est éliminé et la B-glucosidase immobilisée est récupérée.
- étape d'immobilisation : à la suspension aqueuse de silice activée ajustée à pH 6,5 avec HC1 1N, est ajoutée la solution aqueuse d'enzyme préparée en diluant 725 mg de Bglucosidase lyophilisée dans 20 ml d'eau déminéralisée ; l'immobilisation de la ss-glucosidase sur la silice activée s'effectue sous agitation pendant 2 heures à 250C
- étape de rinçage : on ajoute d'abord à la suspension d'enzyme immobilisée 32 ml d'une solution de disulfite de sodium à 200 g/l puis la suspension de B-glucosidase immobilisée est filtrée sur des plaques filtrantes de porosité 10 ym : les réactifs en excès sont ainsi éliminés dans le jus de filtration, la ss-glucosidase immobilisée ne traversant pas la membrane filtrante. La B-glucosidase immobilisée est ensuite lavée avec 500 ml d'eau déminéralisée, puis avec 250 ml de solution de NaCl 1M et enfin avec 500 ml de tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 6,0, contenant 1 g/l de disulfite de sodium. Le liquide de lavage est éliminé et la B-glucosidase immobilisée est récupérée.
L'activité massique de la préparation de ss-glucosidase immobilisée peut être déterminée en mesurant l'activité B- glucosidase contenue dans une quantité déterminée du dérivé insoluble obtenu. La mesure de l'activité B-glucosidase est réalisée comme suit : 3,0 ml d'une solution de salicine (salicine à 13,3 g/l dans du tampon acétate de sodium 67 mM, pH 5,00 i 0,05 pré-incubée à 400C) sont ajoutés à 1,0 ml de préparation d'enzyme immobilisée, à 400C. La préparation d'enzyme immobilisée est obtenue après deux lavages consécutifs à l'aide de 10 ml d'eau déminéralisée d'un échantillon de préparation contenant l'équivalent sec de 20 mg d'enzyme immobilisée. Une fraction aliquote de 0,1 ml de milieu réactionnel est prélevée dès la constitution du milieu d'hydrolyse complet et mélangée à 0,1 ml de H2SO4 0,05N (arrêt de la réaction). La réaction d'hydrolyse se poursuit dans le milieu réactionnel complet et après 10 minutes on prélève 0,1 ml de milieu réactionnel que l'on mélange avec 0,1 ml de H2SO4 0,05N (arrêt de la réaction).
Les deux solutions de 0,2 ml sont chauffées 5 minutes à 1000C et la quantité de glucose dans chacune des solutions est déterminée à l'aide du réactif de Trinder.
Une unité d'activité & glucosidase correspond à la quantité d'enzyme qui libère 1 ymole de glucose à partir de la salicine par minute dans les conditions définies précédemment.
L'activité massique de la B-glucosidase immobilisée est calculée en divisant l'activité hydrolytique mesurée dans l'essai par la quantité de B-glucosidase immobilisée utilisée dans l'essai. Elle est exprimée en U/g de B- glucosidase immobilisée.
L'activité massique de la préparation de B-glucosidase immobilisée a été mesurée à 81,7 U/g. La B-glucosidase a été fixée de manière covalente sur la silice, la présence de B- glucosidase adsorbée étant exclue du fait de l'intégration d'une étape de rinçage à l'aide de NaCl 1 M dans la préparation de l'enzyme immobilisée.
La stabilité au stockage à 400C de la B-glucosidase immobilisée dans du tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 6,0, contenant 3 mM de NaN3 a été comparée à celle de la B- glucosidase native (Tableau 7). La B-glucosidase native a perdu totalement son activité après 18 jours d'incubation alors qu'il restait 50% de l'activité de la B-glucosidase immobilisée après 24 jours, et 34% après 65 jours. Lorsque la B-glucosidase immobilisée a été incubée à 400C en présence de 50% p/p de sorbitol, la perte d'activité a été seulement de 20% après 2 mois.
L'immobilisation de la ss-glucosidase permet d'augmenter significativement sa résistance à la dénaturation thermique, notamment lorsque l'enzyme est conservée sans additif stabilisant.
TABLEAU 7
Stabilité à 400C de la ss-glucosidase native et de la ss- glucosidase immobilisée.
Stabilité à 400C de la ss-glucosidase native et de la ss- glucosidase immobilisée.
<tb>
<SEP> Activité <SEP> relative, <SEP> %
<tb> <SEP> B-glucosidase <SEP> B-glucosidase <SEP> B-gluco- <SEP>
<tb> Temps, <SEP> native, <SEP> sans <SEP> immobilisée <SEP> sidase
<tb> jours <SEP> stabilisant <SEP> sans <SEP> stabili- <SEP> immobili
<tb> <SEP> sant <SEP> sée, <SEP> dans
<tb> <SEP> 50% <SEP> p/p
<tb> <SEP> sorbitol
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 72 <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 8 <SEP> 80 <SEP> 109
<tb> <SEP> 10 <SEP> 50
<tb> <SEP> 14 <SEP> 103
<tb> <SEP> 15 <SEP> 30
<tb> <SEP> 18 <SEP> 0
<tb> <SEP> 22 <SEP> o <SEP> <SEP> 55 <SEP> 97
<tb> <SEP> 29 <SEP> 43 <SEP> 85
<tb> <SEP> 37 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 43 <SEP> 84
<tb> <SEP> 65 <SEP> 34 <SEP> 83
<tb>
Exemple 3 - Mise en évidence de l'efficacité de la protéase immobilisée lorsqu'elle est appliquée sur la peau.
<tb> <SEP> B-glucosidase <SEP> B-glucosidase <SEP> B-gluco- <SEP>
<tb> Temps, <SEP> native, <SEP> sans <SEP> immobilisée <SEP> sidase
<tb> jours <SEP> stabilisant <SEP> sans <SEP> stabili- <SEP> immobili
<tb> <SEP> sant <SEP> sée, <SEP> dans
<tb> <SEP> 50% <SEP> p/p
<tb> <SEP> sorbitol
<tb> <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <SEP> 5 <SEP> 72 <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 8 <SEP> 80 <SEP> 109
<tb> <SEP> 10 <SEP> 50
<tb> <SEP> 14 <SEP> 103
<tb> <SEP> 15 <SEP> 30
<tb> <SEP> 18 <SEP> 0
<tb> <SEP> 22 <SEP> o <SEP> <SEP> 55 <SEP> 97
<tb> <SEP> 29 <SEP> 43 <SEP> 85
<tb> <SEP> 37 <SEP> ~ <SEP> <SEP> 43 <SEP> 84
<tb> <SEP> 65 <SEP> 34 <SEP> 83
<tb>
Exemple 3 - Mise en évidence de l'efficacité de la protéase immobilisée lorsqu'elle est appliquée sur la peau.
L'efficacité de la protéase immobilisée lorsqu'elle est appliquée sur la peau a été mise en évidence à l'aide d'un marqueur visible des couches superficielles de la peau, la dihydroxyacétone (DHA) (G.E. PIERARD, C. PIERARD
FRANCHIMONT, DERMATOLOGY, 1993 ; 186 : pages 133-137). Le principe est le suivant : l'application de la DH sur la peau conduit à la formation de dérivés mélanoidiques bruns résultant de la réaction chimique de la DHA avec des amines des protides cutanés. Le résultat global est un brunissement visible de la zone ayant reçu la DHA. On recherche alors si l'application de la protéase immobilisée conduit à l'éclaircissement visible de la peau, dû à l'élimination des couches contenant les dérivés mélanoidiques bruns.
FRANCHIMONT, DERMATOLOGY, 1993 ; 186 : pages 133-137). Le principe est le suivant : l'application de la DH sur la peau conduit à la formation de dérivés mélanoidiques bruns résultant de la réaction chimique de la DHA avec des amines des protides cutanés. Le résultat global est un brunissement visible de la zone ayant reçu la DHA. On recherche alors si l'application de la protéase immobilisée conduit à l'éclaircissement visible de la peau, dû à l'élimination des couches contenant les dérivés mélanoidiques bruns.
Les préparations enzymatiques testées étaient les suivantes
- 4 préparations aqueuses : 3 contenant la protéase immobilisée en suspension dans l'eau à 10,0, 5,0 et 2,5 U/g de suspension, et une préparation témoin contenant de la silice à 0,7% p/p (équivalent à la quantité de silice contenue dans l'essai à 10,0 U/g)
- 4 formules contenant
cyclométhicone et diméthicone
copolyol (DC 3225 C) : 13,6%
cyclométhicone (DC 344) : 5,4%
paraffine : 13,6%
sorbitol 70% p/p : 15,0%
PEG 400 : 15,0%
NaCl : 2,0*
Phénonip : 0,2%
eau, qsp :: 100% et la protéase immobilisée aux doses de 10,0, 5,0 et 2,5 U/g de formule, ou de la silice à 0,7W p/p (témoin).
- 4 préparations aqueuses : 3 contenant la protéase immobilisée en suspension dans l'eau à 10,0, 5,0 et 2,5 U/g de suspension, et une préparation témoin contenant de la silice à 0,7% p/p (équivalent à la quantité de silice contenue dans l'essai à 10,0 U/g)
- 4 formules contenant
cyclométhicone et diméthicone
copolyol (DC 3225 C) : 13,6%
cyclométhicone (DC 344) : 5,4%
paraffine : 13,6%
sorbitol 70% p/p : 15,0%
PEG 400 : 15,0%
NaCl : 2,0*
Phénonip : 0,2%
eau, qsp :: 100% et la protéase immobilisée aux doses de 10,0, 5,0 et 2,5 U/g de formule, ou de la silice à 0,7W p/p (témoin).
Le déroulement du test a été le suivant
- jour 1 : application de la DHA (Vitidim@, Eumedis,
Bruxelles, Belgique) sur la face interne de l'avant-bras, protection pendant deux heures à l'aide d'un pansement semiocclusif ; quatre heures après la première application seconde application de DHA et protection pendant deux heures à l'aide d'un pansement semi-occlusif
- jours 2, 3 et 4 : 2 applications par jour de chacune des préparations, séparées l'une de l'autre par un intervalle de 6 heures.
- jour 1 : application de la DHA (Vitidim@, Eumedis,
Bruxelles, Belgique) sur la face interne de l'avant-bras, protection pendant deux heures à l'aide d'un pansement semiocclusif ; quatre heures après la première application seconde application de DHA et protection pendant deux heures à l'aide d'un pansement semi-occlusif
- jours 2, 3 et 4 : 2 applications par jour de chacune des préparations, séparées l'une de l'autre par un intervalle de 6 heures.
Les 4 préparations aqueuses ont été appliquées sous pansement occlusif (20 microlitres ; 0,85 cm de diamètre) pendant 1 heure, et les 4 formules ont été appliquées jusqu'à pénétration apparente. Cette évaluation a été effectuée à l'aide de 4 volontaires.
Lorsque les suspensions aqueuses ont été appliquées, une décoloration visible des zones traitées a été observée après 3 jours de traitement, avec l'effet le plus marqué correspondant à la zone ayant reçu la dose de 10 U/g. La zone ayant reçu la silice non modifiée était identique après 3 jours d'application à une zone ayant seulement reçu la
DHA.
DHA.
Lorsque les formules ont été appliquées, une décoloration visible de la zone ayant reçu la dose de 10 U/g était parfaitement visible après 3 jours de traitement. Avec des doses de protéase immobilisée plus faibles, la décoloration de la peau était faible et des durées de traitement supérieures à 3 jours sont nécessaires. La zone ayant reçu la formule contenant la silice non modifiée était identique après 3 jours à une zone ayant seulement reçu la
DHA.
DHA.
Ces résultats démontrent l'efficacité de la protéase immobilisée lorsqu'elle est appliquée sur la peau l'élimination des cellules superficielles étant obtenue, on peut attendre des effets bénéfiques quant au lissage de la peau et à l'accélération du renouvellement cellulaire.
Aucune sensation désagréable n'a été rapportée par les volontaires.
ExemDle 4 : Mise en évidence de l'efficacité de la ss- alucosidase immobilisée lorsqu'elle est appliquée sur la peau.
La mise en évidence de l'efficacité de la ss-glucosidase immobilisée lorsqu'elle est appliquée sur la peau a été effectuée selon le même protocole que pour la mise en évidence de l'efficacité de la protéase immobilisée lorsqu'elle est appliquée sur la peau.
La S-glucosidase immobilisée a été mise en suspension dans de l'eau à la concentration de 0,46 U/g de suspension.
L'application (25 y1) a été faite 2 fois par jour pendant 3 jours sous pansement occlusif (0,85 cm de diamètre) sur la peau traitée à la DHA.
Après trois jours de traitement, une décoloration visible de la zone traitée a été observée, la zone ayant reçu la silice non modifiée étant identique à une zone ayant seulement reçu la DHA.
Claims (10)
1. Compositions cosmétiques pour application sur la peau humaine comprenant un agent accélérant l'élimination des cellules superficielles de la peau, caractérisées en ce que ledit agent est une enzyme protéase et/ou ss-glucosidase immobilisée de manière covalente sur un support pulvérulent insoluble.
2. Compositions selon la revendication 1, caractérisées en ce que la grosseur des particules du support est de 0,2 ym à 500ym.
3. Compositions selon la revendication 2, caractérisées en ce que ladite grosseur de particules est de 1 à 50 ym.
4. Compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que le support pulvérulent est formé de particules de silice.
5. Compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles comprennent, en outre, une substance stabilisante.
6. Compositions selon la revendication 5, caractérisées en ce que la substance stabilisante est choisie dans le groupe formé par les polyols monomères et polymères.
7. Compositions selon la revendication 6, caractérisées en ce que la substance stabilisante est choisie parmi le sorbitol, les polyéthylène-glycols et leurs mélanges.
8. Compositions selon la revendication 5, 6 ou 7, caractérisées en ce que la substance stabilisante constitue au moins 20% du poids de la composition.
9. Composition utile pour la préparation de compositions cosmétiques, caractérisée en ce qu'elle consiste essentiellement en une enzyme protéase et/ou Bglucosidase immobilisée sur un support pulvérulent insoluble et au moins une substance stabilisante choisie parmi les polyols monomères et polymères, ladite composition étant sous forme sensiblement sèche (lyophilisée) ou aqueuse.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle contient au moins 20% en poids de substance stabilisante.
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| JPH0320232B2 (fr) |
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