FR2791059A1 - Proteine modifiee, procede de preparation de celle-ci et compositions pour une application externe contenant la proteine modifiee - Google Patents
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Abstract
Une protéine modifiée pour améliorer sa stabilité est fournie, ladite protéine modifiée étant couplée à une -1, 3-glucane ramifiée avec une liaison en -1, 6. Un procédé de production de celle-ci et une composition cosmétique ou dermatologique comprenant la protéine modifiée est également fourni. La protéine modifiée présente une stabilité améliorée tout en conservant son activité et ne provoque pas d'irritation de la peau.
Description
PROTEINE MODIFIEE, PROCEDE DE PREPARATION DE CELLE-CI
ET COMPOSITIONS POUR UNE APPLICATION EXTERNE CONTENANT
LA PROTEINE MODIFIEE
CONTEXTE DE L'INVENTION
1. Domaine de l'invention La présente invention se rapporte à une protéine modifiée pour améliorer sa stabilité et à un procédé pour produire celle-ci. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une protéine couplée à une P-1,3-glucane ramifiée avec une liaison en P-1,6, qui présente une stabilité améliorée tout en conservant son activité, à un procédé de production de celle-ci, et à une composition pour une application externe ou
topique comprenant les protéines stabilisées.
2. Description des techniques apparentées
Les protéines jouent divers rôles dans un corps vivant, par exemple en tant que biocatalyseur dans les métabolismes, en tant qu'agent de transmission d'un signal, ou analogue, et sont couramment utilisées avantageusement dans une variété d'applications, telles que l'industrie des lessives (par exemple les détergents), l'industrie des cosmétiques, les compositions pharmaceutiques (par exemple les agents de digestion, les médicaments anti- inflammatoires et analogues), l'industrie alimentaire (par exemple les agents d'attendrissement de la viande), etc. Toutefois, leurs utilisations ont été limitées en raison de leur instabilité, leur caractère antigène ou leurs problèmes d'innocuité. En fait, en plus de l'irritation de la peau, d'une efficacité insatisfaisante sur la peau et/ou d'une difficulté de production des compositions pour une application externe ou topique, telles que des compositions cosmétiques ou dermatologiques comprenant les protéines, la courte durée de conservation a limité
l'utilisation pratique de ces compositions.
Plusieurs essais, tels que l'immobilisation ou la modification chimique, ont été jusqu'à présent réalisés pour améliorer la stabilité des protéines. Bien que ces essais ne fournissent pas de résultats satisfaisants, des exemples représentatifs de ceux-ci sont expliqués
ci-dessous.
Le brevet américain 4 556 554 enseigne une composition cosmétique pour éliminer l'exudat de sébum de la peau, qui comprend des enzymes immobilisées dans des véhicules acceptables au plan cosmétique, et que les enzymes sont immobilisées sur des polymères fonctionnels de manières connues par des moyens chimiques et/ou physiques. Elles sont libérées de
l'immobilisation lors de l'application sur la peau.
Toutefois, cette immobilisation ne fournit pas une amélioration satisfaisante de la stabilité des enzymes
dans la composition.
Masunaga et al. (T. Masunaga et al., IFSCC, Yokohama, A205, pages 483501) indiquent des protéases
qui sont couplées chimiquement à du polyéthylèneglycol.
Les protéases présentent une stabilité améliorée et une irritation de la peau réduite. Mais elles présentent toujours des inconvénients, comme leur durée de conservation insuffisamment prolongée et leur
préparation complexe.
Le brevet américain 5 230 891, attribué à Kanebo Limited, enseigne une protéase modifiée et son procédé de production. Un polysaccharide, tel que le dextrane, des acides alginiques ou le carragheen est mis à réagir avec du trichlorure cyanurique pour donner un polysaccharide lié à un noyau triazine, qui est mis a réagir avec une protéase pour donner une protéase couplée à un polysaccharide par l'intermédiaire du noyau triazine. Ce procédé présente toujours
l'inconvénient d'être très compliqué.
Le brevet européen 0 803 257 A2 et le brevet japonais 4-141097A enseignent une stabilisation d'enzymes par un procédé d'oxydation utilisant des polysaccharides. Les enzymes ainsi stabilisées peuvent être, par exemple, fixées à des surfaces de dispositifs médicaux pour minimiser une réaction biologique indésirable associée aux dispositifs médicaux, ou fixées à la surface du réacteur. Toutefois, il n'est pas certain que les enzymes stabilisées puissent être incorporées dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques. Par conséquent, il existe un besoin pour fournir des protéines assez stabilisées pour être incorporées dans des compositions pour des applications externes ou topiques.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention fournit une protéine modifiée, qui présente une stabilité améliorée, ladite protéine étant couplée à un résidu en P-1,6 ramifié à
partir de P-1,3-glucane.
La présente invention fournit en outre un procédé de production de la protéine modifiée, qui comprend les étapes consistant à (a) faire réagir une glucane avec des periodates pour oxyder le résidu en P-1,6 de la glucane en un aldéhyde; (b) éliminer les periodates n'ayant pas réagi de la solution réactionnelle; (c) ajouter à la solution réactionnelle une protéine en une proportion de 0,00001 à 10,0% en poids et permettre à la protéine d'entrer en contact avec la glucane oxydée; et (d) ajouter à la solution réactionnelle un agent
réducteur en une proportion de 0,0001 à 1,0% en poids.
Le procédé peut en outre comprendre l'étape de lavage
du produit obtenu dans l'étape (d).
Selon l'invention, lorsque deux protéines ou plus sont modifiées, l'une d'elle est ajoutée au mélange réactionnel dans l'étape c) et l'autre est ajoutée au mélange
réactionnel dans l'étape d).
La présente invention propose aussi une composition pour une application externe ou topique, qui comprend la
protéine modifiée en tant qu'ingrédient actif.
La présente invention sera décrite en détail ci-
dessous.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Selon la présente invention, la protéine est stabilisée par couplage à une P-l,3-glucane ramifiée régulièrement par
une liaison en P-1,6 (appelée simplement "glucane" ci-
après). La glucane a un pH neutre en phase aqueuse, a la forme d'une triple hélice contribuant à sa stabilité, et
peut être uniquement modifiée au niveau de son résidu en P-
1,6 par des moyens chimiques. En revanche, des polysaccharides, tels que le dextrane, sont modifiés de façon aléatoire ou à chaque résidu. Par conséquent, la glucane permet une modification unique des protéines en termes d'indice de couplage entre la glucane et la protéine,
et de stabilité et d'activité de la protéine modifiée.
La glucane employée selon l'invention peut englober une schizophyllane provenant de Schizopyllum commune, une scléroglucane provenant de Sclerotinia
sp., une lentinane provenant de Lentinus edodes.
D'autres glucanes peuvent être employées tant qu'elles possèdent une chaîne en P-1,3 ramifiée avec une liaison en P-1,6 régulière. Les glucanes existant à l'état naturel ont habituellement une masse moléculaire s'échelonnant de
plusieurs centaines de milliers à plusieurs millions.
Elles peuvent être utilisées tel quelles ou traitées par des moyens mécaniques ou chimiques pour avoir une masse moléculaire d'environ 50 000 à plusieurs centaines de milliers. Par exemple, un dispositif de microfluidification, un dispositif acoustique ou un traitement avec de la P-glucanase peut être utilisé pour casser la glucane intacte pour donner des glucanes de masse moléculaire plus petite. Le terme "glucane" est utilisé ici pour définir les glucanes intactes
ainsi que les glucanes de petite masse moléculaire.
Les glucanes peuvent être utilisées dans une solution aqueuse ayant une concentration de 0,001 à ,2% en poids, et de préférence de 0,1 à 5, 0% en poids. Les protéines qui peuvent être modifiées pour améliorer leur stabilité selon la présente invention peuvent englober, mais sans y être limitées, les protéases, telles que la papaine, la broméléine, la ficine, la trypsine, la chymotrypsine, la collagénase, l'élastase, la plasmine ou la protéase bactérienne; les enzymes de sucre- lyse, telles que l'c-amylase, la glucoamylase, la cellulase, la pectinase, la xylanase, l'c-glucosidase,
la P-glucosidase, l'a-galactosidase, la p-
galactosidase, la 0-glucanase, la chitinase ou la mannannase; les lipases, telles que la phospholipase ou la triacylglycérolhydrolase; les enzymes d'acide nucléique-lyse, telles que la DNase ou la RNase; les phosphatases; les lysozymes; les catalases; les superoxyde dismutases; les transglutaminases; les peroxydases; les photolyases; les enzymes complexes provenant de micro-organismes; les cytokines; les facteurs de croissance; les hormones; les antigènes; les anticorps; les immunoglobulines; les lactoferrines; les métallothinéines; les thiorédoxines; les protéines antimicrobiennes; ou les protéines antioxydantes. Les protéines englobent aussi les peptides actifs de celles-ci et les conjugués avec des saccharides ou des lipides. Elles peuvent être
utilisées seules ou en combinaisons de celles-ci.
Le procédé de production des protéines modifiées
sera décrit en détail dans la suite.
Le procédé comprend les étapes consistant à (a) faire réagir une glucane avec des periodates pour oxyder la liaison en P-1,6 de la glucane en un aldéhyde; (b) éliminer les periodates n'ayant pas réagi de la solution réactionnelle; (c) ajouter à la solution réactionnelle une protéine en une proportion de 0,00001 à 10,0% en poids et permettre à la protéine d'entrer en contact avec la glucane oxydée; et (d) ajouter à la solution réactionnelle un agent réducteur en une proportion de 0,0001 à 1,0% en poids. Le procédé peut en outre comprendre l'étape de lavage du produit
recherché obtenu dans l'étape (d).
L'étape (a) consiste à oxyder le résidu en 3-1,6 de la glucane en un aldéhyde, ce qui permet un couplage entre la glucane et la protéine. Des periodates sont utilisés en une quantité de 0,1 à 50,0 équivalents molaires et, de préférence, de 2 à 5 équivalents molaires par rapport à une mole de glucane. On laisse réagir le mélange réactionnel dans le noir sous agitation. Les periodates peuvent englober, mais sans y être limités, HIO4, H5IO6, NaIO4, Na3H2IO4 ou KIO4. Après la réaction, de l'éthylèneglycol peut être ajouté au mélange réactionnel pour arrêter la réaction d'oxydation excessive, le cas échéant. L'éthylèneglycol peut être utilisé en une proportion de 0,01 à 10,0% en
poids.
L'étape (b) consiste à éliminer les periodates n'ayant pas réagi et peut être réalisée de manières connues telles que la dialyse ou l'ultrafiltration, à l'aide d'une membrane ayant une coupure moléculaire de
100 à 500 000 et de préférence de 10 000 à 100 000.
L'étape (c) consiste à faire réagir la glucane oxydée dans l'étape (a) et la protéine pour former une base de Schiff entre l'aldéhyde du résidu en P-1,6 de la glucane et un groupe amino de la protéine. La protéine est utilisée en une proportion de 0,00001 à ,0% en poids et, de préférence, de 0,001 à 5,0% en poids, par rapport à la solution de glucane obtenue
dans l'étape (b).
L'étape (d) consiste à réduire la base de Schiff et peut être réalisée par addition d'un agent réducteur en une proportion de 0,001 à 1,0% en poids et, de préférence, de 0,01 à 0,1% en poids, par rapport à la solution de base de Schiff de l'étape (c). L'agent réducteur peut englober, mais sans y être limité, le borohydrure de sodium (NaBH4), le cyanoborohydrure de sodium (NaCNBH4), l'amineborane ou analogue. Dans cette étape, de la lysine peut être ajoutée en une proportion de 0,01 à 10% en poids et, de préférence, de 0,1 à 1,0% en poids au mélange réactionnel pour neutraliser le
groupe aldéhyde n'ayant pas réagi.
Après l'étape (d), la protéine modifiée (stabilisée) obtenue dans l'étape (d) peut être lavée par des procédés connus, tels que la dialyse ou l'ultrafiltration l'aide d'une membrane ayant une coupure moléculaire de 1 000 à 500 000 et, de
préférence, de 10 000 à 100 000 (étape (e)).
Toutes les étapes sont de préférence réalisées dans des conditions qui n'entraînent aucune dégradation
ni aucune perte d'activité de la protéine à modifier.
Ces conditions peuvent comprendre, mais sans y être limitées, une temperature d'environ 0 C à la
température ambiante avec une agitation modérée.
Pour la présente invention, les différentes protéines peuvent être modifiées simultanément ou tour
à tour.
La protéine stabilisée peut être incorporée dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques pour une application topique ou externe, destinées à une utilisation dans l'élimination de la corne, la régulation du sébum, l'anti-inflammation, l'apaisement de la peau, la régulation de l'acné, l'anti-oxydation, l'élimination des toxines, l'élimination des ions métalliques, l'amélioration de l'élasticité de la peau, l'élimination des rides, l'anti- vieillissement, le blanchissement de la peau, le bronzage, la prévention et l'inhibition de l'épilation, l'élimination des cheveux, l'action anti-bactérienne ou antifongique, la désodorisation, la récupération d'une brûlure solaire, la cicatrisation d'une plaie, et analogues. La proportion de la protéine stabilisée à incorporer dans la composition peut être décidée par l'homme du métier
et peut être dans la gamme de 0,00001 à 100% en poids.
Ainsi, les compositions pour une application externe ou topique selon la présente invention comprennent de 0,00001 à 100% en poids de la protéine stabilisée et des véhicules acceptables au plan cosmétique ou dermatologique. Ces véhicules sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être choisis selon le type, la formulation et l'utilisation de la composition. La composition peut posséder une formulation cosmétique, telle qu'une lotion de démaquillage, une crème de démaquillage, un lait pour la peau, une lotion émolliente, une crème de massage, une crème émolliente, une base de maquillage, un rouge à lèvre, un masque facial, un gel facial, des shampooings, des produits de rinçage, des produits tonifiant les cheveux ou des savons, ou une composition dermatologique, telle que des lotions, des pommades, des gels, des crèmes, des
pansements ou des pulvérisations.
La présente invention va être décrite à l'aide de divers exemples de préparation et expérimentaux, mais ne doit pas être interprétée comme étant limitée à ces
exemples.
EXEMPLE DE PREPARATION 1
A 50 ml d'une solution aqueuse à 0,5% en poids de schizophyllane (Mp 2 000 000), on ajoute 2 g de peroxyde de sodium (NaIO4), et on laisse le mélange résultant reposer dans le noir à 4 C pendant 1 heure sous agitation. On soumet la solution de schizophyllane résultante à une dialyse sur membrane (coupure de Mp 000) dans le noir à 4 C pendant 48 heures. On réalise la dialyse en remplaçant 2500 ml d'eau toutes
les 12 heures.
Lorsque le volume de la solution de schizophyllane augmente à environ 100 ml, on ajoute 0,1% en poids de papaïne, et on agite la solution résultante pendant 2
heures dans le noir à 4 C.
On ajoute du borohydrure de sodium (0,05 g) à la solution de schizophyllane-papaine, puis on l'agite pendant 4 heures. On ajoute de la lysine (0,1 g) et on agite le mélange résultant pendant 2 heures dans le
noir à 4 C.
On soumet la solution de schizophyllane-papaïne résultante à une dialyse comme décrit ci-dessus pour obtenir une solution de papaine couplée à de la schizophyllane ("GE-1"). Le rendement en GE-1 est de
% par rapport à l'activité enzymatique.
EXEMPLE DE PREPARATION 2
A 50 ml d'une solution aqueuse à 1% en poids de scléroglucane que l'on traite avec un dispositif de microfluidification pour qu'elle ait une Mp de 300 000, on ajoute 2 g de peroxyde de sodium (KIO4), et on laisse le mélange résultant reposer dans le noir à 4 C pendant 1 heure sous agitation. On soumet la solution de scléroglucane résultante à une ultrafiltration sur membrane (coupure de Mp 30 000) dans le noir à la
température ambiante en utilisant 10 000 ml d'eau.
A la solution de scléroglucane ainsi obtenue (environ 50 ml), on ajoute 0,5% en poids de lysozyme, et on agite la solution résultante pendant 1 heure dans
le noir à 4 C.
On ajoute du borohydrure de sodium (0,05 g) à la solution de scléroglucane-lysozyme, puis on l'agite
pendant 2 heures dans le noir à 4 C.
On soumet la solution de scléroglucane-lysozyme résultante à une ultrafiltration comme décrit ci-dessus pour obtenir une solution de lysozyme couplée à de la scléroglucane ("GE-2"). Le rendement en GE-2 est de 93%
par rapport à l'activité enzymatique.
EXEMPLE DE PREPARATION 3
A 50 ml d'une solution aqueuse à 0,5% en poids de schizophyllane (Mp 1 000 000), on ajoute 2 g de peroxyde de sodium (NaIO4), et on laisse le mélange résultant reposer à la température ambiante pendant 1 heure sous agitation. On soumet la solution de schizophyllane résultante à une dialyse sur membrane (coupure de Mp 10 000) dans le noir à 4 C pendant 48 heures. On réalise la dialyse en remplaçant 2500 ml
d'eau toutes les 12 heures.
Lorsque le volume de la solution de schizophyllane augmente à environ 100 ml, on ajoute 0,1 g de papaïne, et on agite la solution résultante pendant 2 heures à
la température ambiante.
On ajoute du borohydrure de sodium (0,01 g) à la solution de schizophyllane-papaïne, puis on l'agite à la température ambiante pendant 10 minutes. De plus, on ajoute 0,1% en poids de lysozyme (0,1 g) au mélange réactionnel, et on laisse le mélange résultant réagir pendant 2 heures. On ajoute du borohydrure de sodium (0,04 g) et de la lysine (0,1 g), et on agite le
mélange résultant pendant 24 heures.
On soumet la solution mixte de schizophyllane-
papaine et de schizophyllane-lysozyme résultante à une dialyse comme décrit ci-dessus pour obtenir une solution de papaine et de lysozyme qui sont couplées à de la schizophyllane ("GE-3"). Le rendement en GE-3 est
de 95% par rapport à l'activité enzymatique.
EXEMPLE DE PREPARATION 4
A 5 ml d'une solution aqueuse à 0,1% en poids de schizophyllane (Mp 2 000 000), on ajoute 0,05 g de peroxyde de sodium (NaIO4), et on laisse le mélange résultant reposer dans le noir à 4 C pendant 1 heure sous agitation. On soumet la solution de schizophyllane résultante à une dialyse sur membrane (coupure de Mp 1 000) dans le noir à 4 C pendant 48 heures. On réalise la dialyse en remplaçant 2500 ml d'eau toutes les 12
heures.
A la solution de schizophyllane ainsi obtenue, on ajoute 0,01% en poids de facteur de croissance épidermique recombinant humain ("hrEGF")(Sigma-Aldrich Co.), et on agite la solution résultante pendant 2
heures dans le noir à 4 C.
On ajoute du borohydrure de sodium (0,002 g) à la solution de schizophyllane-hrEGF, puis on l'agite pendant 4 heures. On soumet la solution de schizophyllane-hrEGF résultante à une dialyse comme décrit ci-dessus pour obtenir une solution de hrEGF
couplée à de la schizophyllane ("conjugué glucane-
hrEGF").
EXEMPLE DE PREPARATION COMPARATIF 1
A 50 ml d'une solution aqueuse à 1% en poids de dextrane (Mp 500 000), on ajoute 2 g de peroxyde de sodium (NaIO4), et on laisse le mélange résultant reposer dans le noir à 4 C pendant 1 heure sous agitation. On soumet la solution de dextrane résultante à une dialyse sur membrane (coupure de Mp 10 000) dans le noir à 4 C pendant 48 heures. On réalise la dialyse
en remplaçant 2500 ml d'eau toutes les 12 heures.
Lorsque le volume de la solution de dextrane augmente à environ 100 ml, on ajoute 0,1% en poids de papaïne, et on agite la solution résultante pendant 2
heures dans le noir à 4 C.
On ajoute du borohydrure de sodium (0,05 g) à la solution de dextranepapaïne, puis on l'agite pendant 4 heures. On ajoute de la lysine (0,1 g) et on agite le
mélange résultant pendant 2 heures dans le noir à 4 C.
On soumet la solution de glucane-papaine résultante à une dialyse comme décrit ci-dessus pour obtenir une solution de papaine couplée à de la glucane. Le rendement en produit recherché est de 65%
par rapport à l'activité enzymatique.
EXEMPLE DE PREPARATION COMPARATIF 2
En suivant le mode opératoire de l'exemple de préparation comparatif 1, sauf que l'on utilise de la lysozyme à la place de la papaïne, on obtient de la lysozyme couplée à de la dextrane. Le rendement en produit recherché est de 61% par rapport à l'activité
enzymatique.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 1
On évalue l'activité de GE-1 ou GE-3 respectivement des exemples de préparation 1 ou 3, de papaïne naturelle ou de papaïne modifiée de l'exemple de préparation comparatif 1 en fonction du temps. On mesure l'activité de la protéase selon le procédé de Erlanger et al. (K.E. Erlanger et al., Arch. Biochem. Biophys., 95, pages 271-278, 1961). Les résultats sont
présentés dans le tableau 1.
TABLEAU 1
Ex. prép. Ex. prép. Papaine Ex. Prép.
1 3 naturelle Comp. 1
(GE-1) (GE-3) (0,1%) (0,1%)
C 45 C 30 C 45 C 30 C 45 C 30 C 45 C
Jour 0 100 100 100 100 100 100 100 100 Jour 10 100 100 100 100 18 10 65 40 Jour 30 100 100 100 100 4 0 20 10 Jour 60 100 98 100 98 0 0 15 10 Jour 90 100 95 100 95 0 0 14 9 Comme le montre tableau 1, la papaïne modifiée selon la présente invention présente une stabilité améliorée par rapport à la papaïne naturelle ou à la
papaïne modifiée par le procédé classique.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 2
On évalue l'activité de GE-2 ou GE-3 respectivement des exemples de préparation 2 ou 3, de lysozyme naturelle ou de lysozyme modifiée de l'exemple de préparation comparatif 2 en fonction du temps. On mesure l'activité de la lysozyme selon le procédé de Shugar (D. Shugar, Biochem. Biophys., Acta., 8, page 302, 1952). Les résultats sont présentés dans le
tableau 2.
TABLEAU 2
Ex. prép. Ex. prép. Lysozyme Ex. Prép.
2 3 naturelle Comp. 1
(GE-2) (GE-3) (0,1%) (0,1%)
C 45 C 30 C 45 C 30 C 45 C 30 C 45 C
Jour 0 100 100 100 100 100 100 100 100 Jour 10 100 100 100 100 25 10 60 45 Jour 30 100 100 100 100 9 5 22 12 Jour 60 100 100 100 98 0 0 14 10 Jour 90 100 100 100 96 0 0 14 8 Comme le montre le tableau 2, la lysozyme modifiée selon la présente invention présente une stabilité améliorée par rapport à la lysozyme naturelle ou à la
lysozyme modifiée par le procédé classique.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 3
On évalue l'action sur la corne, un substrat insoluble pour la papaine, de GE-1 ou GE-3 respectivement des exemples de préparation 1 ou 3, de lysozyme naturelle ou de lysozyme modifiée de l'exemple
de préparation comparatif 2.
On prélève donc de la corne de jambes inférieures
de volontaires en bonne santé en utilisant de la D-
squame, et on la place sur des disques. On place les disques dans une solution d'enzymes, que l'on a ajusté pour qu'elle ait une certaine valeur d'activité, et on la laisse réagir à 37 C. A un intervalle de 12 heures, on retire les disques de la solution d'enzymes et on en mesure la désintégration de la corne. On mesure la désintégration de la corne en immergeant le disque dans une solution de Nile Blue A à 0,2% pendant 10 minutes, en rinçant le disque avec de l'eau distillée et en déterminant la désintégration en utilisant un dispositif de mesure de la coloration. Les résultats
sont présentés dans le tableau 3.
TABLEAU 3
(Unité: % de désintégration)
Ex. Prép. Ex. Prép. Papaïne Ex. Prép.
1 (GE-1) 3 (GE-3) naturelle Comp. 1 Heure 0 0 0 0 0 Heure 12 20 12 20 5 Heure 24 55 43 48 20 Heure 36 100 90 90 55 Heure 42 100 100 92 64 Comme le montre le tableau 3, la papaïne modifiée selon la présente invention présente une activité similaire à celle de la papaïne naturelle tout en conservant son activité plus longtemps, à savoir qu'elle présente une stabilité plus élevée que la papaïne naturelle. En outre, on peut affirmer que la papaïne modifiée selon la présente invention présente une activité supérieure à celle de la papaïne modifiée
de façon classique.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 4
On mesure l'innocuité vis-à-vis de la peau, en termes d'irritation de la peau, de GE-1 et de GE-3 respectivement des exemples de préparation 1 ou 3 en les comparant à ceux de la papaïne naturelle ayant le
même titre enzymatique.
On détermine l'irritation de la peau en mesurant
la rougeur provoquée par l'application de l'enzyme.
Ainsi, on applique la solution d'enzyme (20 pl) sur la peau deux fois par jour pendant 7 jours consécutifs, et on mesure la couleur de la peau en utilisant un dispositif de mesure de la coloration CM2002 aux jours , 3, 5 et 7. On calcule l'indice de rougeur en fonction de la valeur 100 attribuée au jour 0 (couleur de la peau initiale). L'indice de rougeur ainsi obtenue a une signification statistique <0,05 lorsqu'il est
testé par l'essai Anova.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
TABLEAU 4
(Unité: Indice de rougeur) Ex. Prép. 1 Ex. Prép. 3 Papaïne naturelle Témoin (GE-1) (GE-3) (Eau Mère Dilution Mère Dilution Mère Dilution distillée) 1/100 1/100 1/100 Jour 0 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Jour 3 100,85 100,55 101,23 102,34 100,04 189,04 165,02 Jour 5 103,58 103,02 98,56 98,76 100,05 225,08 192,78 Jour 7 102,95 101,55 100, 04 97,98 99,13 230,24 203,44 Comme le montre le tableau 4, la solution mère de papaine modifiée selon la présente invention ne présente aucune irritation de la peau, alors que même une dilution de 1/100 de papaine naturelle présente une
irritation de la peau.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 5
On compare la stabilité du conjugué glucane-hrEGF de l'exemple de préparation 4 avec celle du facteur de croissance épidermique recombinant humain ("hrEGF") en
mesurant leur activité de croissance de fibroblastes.
On répartit donc de la fibroblaste humaine cultivée dans un Modified Eagle's Media de Dulbecco (DMEM) contenant 2,5% de sérum foetal bovin sur une plaque de mitrotitrage à 96 puits à raison de 5 000 cellules/puits. On dissout le conjugué glucane-hrEGF ou le hrEGF naturel dans de l'eau distillée à la même concentration, et on les laisse reposer à 37 C pendant 7 jours ("Prétraitement"). On ajoute le conjugué glucane-hrEGF prétraité, le hrEGF naturel prétraité ou du hrEGF naturel frais dans la plaque de microtitrage ci- dessus, et on les laisse grossir pendant quatre jours supplémentaires. Après la croissance, on ajoute
pl d'une solution à 0,2% de MTT (bromure de 3-[4,5-
diméthylthiazo-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium) dans chaque puits et on réalise la culture à 37 C pendant 4 heures. On dissout la formazane formée dans chaque puits en ajoutant du DMSO (diméthylsulfoxyde). On mesure l'absorbance de la formazane à 570 nm avec un lecteur de microplaque. En comparant l'absorbance des groupes prétraités avec celle du groupe non traité, on évalue la croissance de la fibroblaste. Les résultats
sont présentés dans le tableau 5.
TABLEAU 5
Unité: % de cellules survivantes Dilution hrEGF naturel Conjugué hrEGF naturel frais glucane-hrEGF prétraité prétraité
-' 121,0 128,2 88,7
-3 126,8 128,9 94,9
-4 124,5 125,4 102,5
-5 112,9 112,8 101,8
Comme le montre le tableau 5, lorsqu'on le compare au hrEGF naturel non traité, le conjugué glucane-hrEGF selon l'invention conserve sa capacité de croissance cellulaire même s'il est prétraité pour induire une perte d'activité, alors que le hrEGF naturel perd la plupart de son activité. Par conséquent, on affirme que la protéine modifiée selon la présente invention
présente une stabilité améliorée. Ces exemples précédents prouvent que la protéine couplée à une glucane
fournie par la présente invention conserve son activité pendant une durée prolongée, ne provoque pas d'irritation de la peau et présente une
action plus importante sur les substrats insolubles.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 6
On prépare des lotions pour la peau (formulation 1 et formulations comparatives 1 et 2) ayant la composition présentée dans le tableau 6, et on évalue leur activité de protéine-lyse par le même procédé que dans l'exemple expérimental 1. Les résultats sont
présentés dans le tableau 7.
TABLEAU 6
Unité: % en poids Ingrédients Formulation 1 Formulation Formulation comparative 1 comparative 2
Papalne de Ex. Prép. 1 0,1 -
Papaïne naturelle - 0,1 -
Papaïne de Ex. Prép. - - 0,1 Comp. 1 Glycérine 3,0 3,0 3,0 Butylèneglycol 2,0 2,0 2,0 Propylèneglycol 2,0 2,0 2,0 Polymère de carboxyvinyle 0,1 0,1 0,1 Ether de nonylphényle et 0,2 0,2 0,2 de PEG-12 Polysorbate 80 0,4 0,4 0,4 Ethanol 10,0 10,0 10,0 Triéthanolamine 0,1 0,1 0,1 Conservateurs, pigments, parfums complément complément complément Eau distillée à 100 à 100 à 100
TABLEAU 7
Unité: % en poids Formulation 1 Formulation Formulation Comp. 1 Comp. 2
C 45 C 30 C 45 C 30 C 45 C
Jour 0 100 100 100 100 100 100 Jour 10 100 100 20 11 45 20 Jour 30 100 100 5 0 12 10 Jour 60 100 100 0 0 4 0 Jour 90 100 97 0 0 0 0 Les résultats du tableau 7 prouvent que l'enzyme modifiée selon la présente invention présente la
stabilité la plus élevée dans la composition.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 7
On évalue l'action sur la corne des lotions pour la peau de la formulation 1, ou des formulations comparatives 1 ou 2 par le même procédé que dans l'exemple expérimental 3. Les résultats sont présentés
dans le tableau 8.
TABLEAU 8
Unité: % de désintégration Formulation 1 Formulation Formulation comp. 1 comp. 2 Heure 0 100 100 100 Heure 12 100 20 45 Heure 24 100 5 12 Heure 36 100 0 4 Heure 48 100 0 0 Les résultats du tableau 8 prouvent que l'enzyme modifiée selon la présente invention présente l'action
la plus importante sur la désintégration de la corne.
EXEMPLE EXPERIMENTAL 9
On évalue l'innocuité sur la peau des lotions pour la peau de la formulation 1 et de la formulation comparative 1. Ainsi, on applique la lotion pour la peau (1 mg) sur la peau deux fois par jour pendant 7 jours consécutifs, et on mesure la couleur de la peau en utilisant un dispositif de mesure de la coloration CM2002 aux jours 0, 3, 5 et 7. On calcule l'indice de rougeur en fonction de la valeur 100 attribuée au jour 0 (couleur de la peau initiale). L'indice de rougeur ainsi obtenue a une signification statistique <0,05
lorsqu'il est testé par l'essai Anova.
Les résultats sont présentés dans le tableau 9.
TABLEAU 9
(Unité: Indice de rougeur) Témoin (eau Formulation 1 Formulation distillée) comp. 1 Jour 0 100,00 100,00 100,00 Jour 3 100,85 100,55 191, 00 Jour 5 107,51 100,02 225,05 Jour 7 102,85 101,51 238,42 Comme le montre le tableau 9, la lotion pour la peau contenant la papaïne modifiée selon la présente invention ne présente aucune irritation de la peau, alors que la lotion pour la peau contenant la papaïne
naturelle présente un irritation sévère de la peau.
A partir des résultats des exemples expérimentaux ci-dessus, on fournit les diverses formulations suivantes. On peut appliquer ces formulations sur la peau pour obtenir un certain effet produit par la protéine incorporée dans celles-ci pendant une durée prolongée sans irritation de la peau. On ne doit pas considérer que ces formulations limitent le cadre de
l'invention.
EXEMPLE DE FORMULATION 2: Lotion nutritive pour la peau Ingrédients % en poids GE-2 de l'exemple de préparation 2 0,1 Squalane 5,0 Cire d'abeille 4,0 Polysorbate 60 1,5 Cesquioléate de sorbitane 1,5 Huile de paraffine 0,5 Triglycéride caprylique/caprique 5,0 Glycérine 3,0 Butylèneglycol 3,0 Propylèneglycol 3,0 Polymère de carboxyvinyle 0,1 Triéthanolamine 0,2 Conservateurs, Pigments, Parfums complément à Eau distillée 100 EXEMPLE DE FORMULATION 3: Crème nutritive pour la peau Ingrédients % en poids GE-3 de l'exemple de préparation 3 0,1 Cire d'abeille 10, 0 Polysorbate 60 1,5 Huile de ricin durcie avec du PEG-60 2,0 Cesquioléate de sorbitane 0,5 Huile de paraffine 10,0 Squalane 5,0 Triglycéride caprylique/caprique 5,0 Glycérine 5,0 Butylèneglycol 3,0 Propylèneglycol 3,0 Triéthanolamine 0,2 Conservateurs, Pigments, Parfums complément à Eau distillée 100 EXEMPLE DE FORMULATION 4: Crème de massage Ingrédients % en poids GE-1 de l'exemple de préparation 1 0,1 Cire d'abeille 10,0 Polysorbate 60 1,5 Huile de ricin durcie avec du PEG-60 2,0 Cesquioléate de sorbitane 0,8 Huile de paraffine 40,0 Squalane 5,0 Triglycéride caprylique/caprique 4,0 Glycérine 5,0 Butylèneglycol 3,0 Propylèneglycol 3,0 Triéthanolamine 0,2 Conservateurs, Pigments, Parfums complément à Eau distillée 100 EXEMPLE DE FORMULATION 5: Masque facial Ingrédients % en poids GE-1 de l'exemple de préparation 1 0,1 Poly(alcool vinylique) 13,0 Carboxyméthylcellulose de sodium 0,2 Glycérine 5,0 Alantoine 0,1 Ethanol 6,0 Ether de nonylphényle et de PEG-12 0,3 Polysorbate 0,3 Conservateurs, Pigments, Parfums complément à Eau distillée 100 EXEMPLE DE FORMULATION 6: Gel facial Ingrédients % en poids GE-2 de l'exemple de préparation 2 0,1 Ethylènediamineacétate de sodium 0,05 Polymère de carboxyvinyle 0,3 Ethanol 5,0 Huile de ricin durcie avec du PEG-60 0,5 Triéthanolamine 0,3 Conservateurs, Pigments, Parfums complément à Eau distillée 100 EXEMPLE DE FORMULATION 7: Pommade Ingrédients % en poids Produit de l'exemple de préparation 4 0,1 Cire d'abeille 10,0 Polysorbate 60 5, 0 Huile de ricin durcie avec du PEG-60 2,0 Cesquioléate de sorbitane 0,5 Vaseline 5,0 Huile de paraffine 10,0 Squalane 5,0 Beurre de karité 3,0 Triglycéride caprylique/caprique 5,0 Glycérine 10,0 Propylèneglycol 10,2 Triéthanolamine 0,2 Conservateurs, Pigments, Parfums complément à Eau distillée 1005 EXEMPLE DE FORMULATION 8: Pommade en gel (Application topique) Ingrédients % en poids Produit de l'exemple de préparation 4 3,0 Poly(acide acrylique) (Carbopol 940) 1,5 Isopropanol 5,0 Hexylèneglycol 25,0 Triéthanolamine 1,7 Eau distillée A 100 EXEMPLE DE FORMULATION 9: Masque (Application topique) Ingrédients % en poids Produit de l'exemple de préparation 4 3,0 Hexylèneglycol 20,0 Diéthylamine 0,7 Poly(acide acrylique) (Carbopol 934P) 1,0 Sulfite de sodium 0,1 Lauryléther polyéthoxylé (E.O. = 9) 1,0 Ether de cétylstéaryle et de 1,0 polyhydroxyéthylène (Cetomacrogol 1000) Huile de paraffine visqueuse 2,5 Ester caprylique/ester caprique (Cetiol LC) 2,5 Polyéthylèneglycol 400 3,0 Eau distillée A 100 Bien que les modes de réalisation préférés de la
présente invention aient été décrits en détail ci-
dessus, on comprendra aisément que de nombreuses variations et/ou modifications des concepts de base de l'invention enseignés ici, qui peuvent apparaître à l'homme du métier, entrent toujours dans l'esprit et dans le cadre de la présente invention, telle que
définie dans les revendications annexées.
Claims (13)
1. Protéine modifiée pour améliorer sa stabilité, caractérisée en ce que ladite protéine modifiée est couplée à une P-1,3-glucane ramifiée avec une liaison en -l,6.
2. Protéine modifiée selon la revendication 1, dans laquelle ladite P-l,3-glucane ramifiée avec une liaison en P-1, 6 est la schizophyllane, la
scléroglucane ou la lentinane.
3. Protéine modifiée selon la revendication 1, dans laquelle ladite protéine est choisie dans le groupe constitué par la papaïne, la broméléine, la ficine, la trypsine, la chymotrypsine, la collagénase, l'élastase, la plasmine ou la protéase bactérienne; l'o-amylase, la glucoamylase, la cellulase, la
pectinase, la xylanase, l'-glucosidase, la 1-
glucosidase, l'a-galactosidase, la P-galactosidase, la P-glucanase, la chitinase ou la mannannase; la phospholipase ou la triacylglycérolhydrolase; la DNase ou la RNase; les phosphatases; les lysozymes; les catalases; les superoxydes dismutases; les transglutaminases; les peroxydases; les photolyases; les enzymes complexes provenant de micro-organismes; les cytokines; les facteurs de croissance; les hormones; les antigènes; les anticorps; les immunoglobulines; les lactoferrines; les métallothinéines; les thiorédoxines; les protéines antimicrobiennes; ou les protéines antioxydantes; ou les peptide actif de ceux-ci ou leurs conjugués avec des saccharides ou des lipides, seuls ou en
combinaisons de celles-ci.
4. Procédé pour modifier une protéine pour améliorer sa stabilité, caractérisé en ce qu'il
comprend l'étape de couplage de la protéine à une j-
1,3-glucane ramifiée avec une liaison en P-1,6.
5. Procédé selon la revendication 4, qui comprend les étapes consistant à (a) faire réagir une glucane avec des periodates pour oxyder le résidu en 1-1,6 de la glucane en un aldéhyde; (b) éliminer les periodates n'ayant pas réagi de la solution réactionnelle; (c) ajouter à la solution réactionnelle une protéine en une proportion de 0,00001 à 10,0% en poids et permettre à la protéine d'entrer en contact avec la glucane oxydée; et (d) ajouter à la solution réactionnelle un agent
réducteur en une proportion de 0,0001 à 1,0% en poids.
6. Procédé selon la revendication 5 comprenant en outre l'étape (e) de lavage du produit obtenu dans
l'étape (d).
7. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite protéine est choisie dans le groupe constitué par la papaïne, la broméléine, la ficine, la trypsine, la chymotrypsine, la collagénase, l'élastase, la plasmine ou la protéase bactérienne; l'c-amylase, la glucoamylase, la cellulase, la pectinase, la xylanase, l'a- glucosidase, la P-glucosidase, l'a-galactosidase, la P-galactosidase, la P-glucanase, la chitinase ou la mannannase; la phospholipase ou la triacylglycérolhydrolase; la DNase ou la RNase; les phosphatases; les lysozymes; les catalases; les superoxydes dismutases; les transglutaminases; les peroxydases; les photolyases; les enzymes complexes provenant de micro-organismes; les cytokines; les facteurs de croissance; les hormones; les antigènes; les anticorps; les immunoglobulines; les lactoferrines; les métallothinéines; les thiorédoxines; les protéines antimicrobiennes; ou les protéines antioxydantes; ou les peptides actifs de ceux-ci ou leurs conjugués avec des saccharides ou des
lipides, seules ou en combinaisons de celles-ci.
8. Procédé selon la revendication 4, dans lequel ladite P-l,3-glucane ramifiée avec une liaison en P-1,6 est la schizophyllane, la scléroglucane ou la
lentinane.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel ladite P-1,3-glucane ramifiée avec une liaison en P-1,6 est l'une des glucanes soumise à un ajustement de la masse moléculaire à l'aide d'un dispositif de
microfluidification, d'un appareil acoustique ou de P-
glucanase.
10. Procédé selon la revendication 5, dans lequel, lorsque deux protéines ou plus sont modifiées, l'une d'elles est ajoutée au mélange réactionnel dans l'étape (c) et l'autre est ajoutée au mélange réactionnel dans
l'étape (d).
11. Composition pour une application externe ou topique, qui comprend la protéine modifiée selon la revendication 1 en une proportion de 0,00001 à 100% en poids, par rapport au poids total de la composition et un véhicule acceptable au plan dermatologique ou cosmétique.
12. Composition selon la revendication 11, qui est une composition cosmétique choisie dans le groupe constitué par une lotion de démaquillage, une crème de démaquillage, un lait pour la peau, une lotion émolliente, une crème de massage, une crème émolliente, une base de maquillage, un rouge à lèvre, un masque facial, un gel facial, des shampooings, des produits de rinçage, des produits tonifiant les cheveux ou des savons.
13. Composition selon la revendication 11, qui est une composition dermatologique choisie dans le groupe constitué par des lotions, des pommades, des gels, des
crèmes, des pansements ou des pulvérisations.
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