KR20000060771A - 안정화된 효소 또는 단백질을 제조하는 방법 및 이에 의해 제공되는 안정화 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물 - Google Patents

안정화된 효소 또는 단백질을 제조하는 방법 및 이에 의해 제공되는 안정화 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸, 예를 들면, 스키조필란, 스클레로글루칸, 렌티난 등을 이용하여 효소 또는 단백질을 안정화시키는 방법 및 이 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 효소 또는 단백질의 안정도를 급격히 향상시킬 수 있고, 따라서, 이러한 안정화된 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물은 각각의 효소 또는 단백질이 갖는 각질제거, 피지조절, 항염증, 자극완화, 여드름(자국)완화, 항산화, 독성물질의 제거, 금속이온전달, 탄력증진, 주름제거, 노화방지, 미백, 탠닝(tanning), 탈모방지, 제모, 유해 세균 및 진균억제, 냄새제거, 일광손상치유, 상처치유 등의 효과를 장시간 동안 안정하게 제공할 수 있는 장점이 있다.

Description

효소 또는 단백질의 안정화 방법 및 이에 의해 제공되는 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물{A method for stabilizing enzymes or proteins and compositions for external application containing enzymes or proteins stabilized thereby}
본 발명은 효소 또는 단백질을 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-분지를 갖는 글루칸을 이용하여 안정화시키는 방법 및 이것에 의해 제공되는 효소 또는 단백질을 함유하여 효소 또는 단백질이 갖는 특유의 효과를 장기간 동안 안정하게 나타낼 수 있는 외용제 조성물에 관한 것이다.
효소 또는 단백질은 모든 생체기작에 있어서 직접적 촉매 작용을 하거나 정보전달을 하는 물질로서, 그 종류 및 효과가 다양하므로, 의약, 식품, 화장품 등 여러분야에서 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 기본적인 기능성에도 불구하고 구조적 불안정성에 의해 사용상 많은 제약을 받아왔으며, 특히 화장품 등과 같은 외용제 분야에서는 장기간 보존의 문제, 피부자극의 문제, 피부에서의 작용성의 문제, 제조의 용이성 문제 등과 같은 문제점으로 인하여 아직까지 충분히 활용되지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 이러한 문제해결의 일환으로 산업적으로 이용되는 고정화 방법 또는 화학적 변형 방법의 적용 및 개선이 진행되었으나, 화장품 등과 같은 외용제에 적용하기에는 아직까지 미흡한 상태로 이를 개선하기 위한 적절한 재료 및 결합방법의 선정이 지속적으로 요구되고 있다.
현재까지 이러한 효소 또는 단백질을 고정화 또는 안정화시키는 방법으로 알려진 예는 다음과 같다.
USP 4,556,554호에 효소를 기능성 폴리머에 고정 및 결합시키는 방법에 의해 고정화된 효소를 함유하는 피지 억제용 화장료 조성물이 개시되어 있으나, 이러한 고정화 방법은 일반적인 고정화 방법으로서, 실제 문제해결을 위한 특정적인 방법을 제시하지 못하고 있다. 또, T. Masunaga 등(IFSCC, Yokohama, A205, p483-501)에 단백분해효소에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)등을 화학결합시켜 안정도 및 자극도를 개선하는 방법이 개시되어 있으나, 이 방법은 장기간 보존하는데 있어서 문제가 있으며, 제조방법 또한 복잡하다. 또한, USP 5,230,891호에 덱스트란, 알긴산, 카라게닌 등의 폴리사카라이드와 삼염화시아누르(cyanuric trichloride)를 반응시켜 트리아진-링이 결합된 폴리사카라이드를 얻고, 이를 프로테아제와 반응시켜 프로테아제를 안정화시키는 방법이 개시되어 있으나, 제조방법이 복잡한 기존의 문제점은 여전히 존재하였다. 또, EP 0,803,257 A2호와 JP 평 4-141097호에 각각 다당류산화에 의한 단백질결합방법으로 효소를 안정화시키고, 이를 의약용 기구의 개선, 반응기 표면의 흡착억제 등에 포괄적으로 응용한 것이 개시되어 있으나, 안정도의 제시가 미비하여 화장품 등과 같은 외용제로서의 직접적인 응용에는 무리가 있다.
이에, 본 발명자들은 효소 또는 단백질을 안정화시켜 화장품 등과 같은 외용제로서 사용하는데 있어서의 상기한 문제점을 해소하기 위하여 예의 연구하였으며, 그 결과 효소 또는 단백질을 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 안정화제로 사용하는 경우 안정도 및 작용성이 뛰어나고, 피부자극과 같은 부작용이 적으며, 안정화방법이 용이하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 효소 또는 단백질을 안정화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 효소 또는 단백질의 안정화 방법은 안정화제로 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 사용하여 효소 또는 단백질을 안정화시킴을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 외용제 조성물은, 상기한 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼100중량%의 양으로 함유함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 효소 또는 단백질의 안정화에 사용되는 글루칸은 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸(이하, '글루칸'이라 한다)으로서, 이 글루칸은 수용액상에서 중성이며, 삼중나선(triple helix)구조를 갖는 안정적인 형태이고, 화학반응 방법에 따라 베타-1,6-잔기에만 반응기를 만들 수 있다. 즉, 덱스트란과 같은 일반적인 폴리사카라이드가 1개의 선형 주당쇄에 매 잔기 또는 불규칙하게 반응기를 만드는 것과 달리 베타-1,6-잔기에만 반응기를 만들 수 있으므로, 일반적인 폴리사카라이드를 사용하여 효소 또는 단백질을 안정화시키는 방법과는 결합도, 안정도, 작용성 등에서 다른 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 사용되는 글루칸은 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 치마버섯(Schizopyllum commune)에 의해 생산된 스키조필란(schizophyllan), 스클레로티니아 속(Sclerotinia sp.)균주에 의해 생산된 스클레로글루칸(scleroglucan), 표고버섯(Lentinus edodes)에 의해 생산된 렌티난(lentinan) 등이 있다.
상기한 글루칸은 수십만에서 수백만의 분자량을 갖는 것을 가공없이 그대로 사용하거나, 마이크로플루이다이저(microfluidizer), 초음파분쇄기(sonicator), 베타-글루카나제(β-glucanase)등을 사용하여 50,000 내지 수십만으로 분자량을 조절한 것을 사용할 수 있으며, 0.001∼20.0중량%, 바람직하게는 0.1∼5.0중량% 수용액의 형태로 사용한다.
본 발명에서 글루칸에 의해 안정화될 수 있는 효소 또는 단백질은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 효소로는 파파인(papain), 브로멜라인(bromelein), 피신(ficin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 콜라게나제(collagenase), 엘라스테제(elastase), 플라스민(plasmin), 세균성 프로테아제(bactrial protease) 등과 같은 단백분해효소류; α-아밀라제(amylase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 셀룰라제(cellulase), 펙티나제(pectinase), 키실라나제(xylanase), α-글루코시다제(glucosidase), β-글루코시다제, α-갈락톡시다제(galactosidase), β-갈락톡시다제, β-글루카나제(glucanase), 키티나아제(chitinase), 만난분해효소(mannannase) 등과 같은 탄수화물분해효소류; 포스포리파제(phospholipase), 트리아실글리세롤분해효소(triacylglycerol hydrolase)와 같은 지방분해효소류; 데옥시리보핵산분해효소(DNAase), 리보핵산분해효소(RNAase)와 같은 핵산분해효소류; 인산분해효소류(phosphatase); 리소짐(lysozyme); 카탈라제(catalase); 과산화물 디스뮤테이즈(superoxide dismutase); 트랜스글루타미나아제(transglutaminase); 퍼옥시다제(peroxidase); 포토리아제(photolyase) 또는 미생물 유래 복합효소류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소, 이들의 결합체 또는 이들의 펩타이드, 당 및 지방 복합체 등이 있고, 단백질로는 사이토카인류(cytokines), 세포성장인자류(growth factors), 호르몬류(hormones), 항원(antigen) 및 항체(antibody), 면역글로블린(immunoglobulins), 락토페린(lactoferrin), 메탈로티오네인(metallothionein), 티오레독신(thioredoxin), 항균성 단백질 또는 항산화 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질, 이들의 결합체 또는 이들의 펩타이드, 당 및 지방 복합체 등이 있다.
이하, 글루칸을 안정화제로 사용하여 상기 효소 또는 단백질을 안정화시키는 방법을 구체적으로 설명한다.
즉, 본 발명의 안정화 방법은 (1) 글루칸을 과요오드산염류와 반응시키는 단계; (2) 상기 (1)단계 반응액의 잔류 과요오드산염류를 제거하는 단계; (3) 상기 (2)단계의 용액에 효소 또는 단백질을 0.00001∼10.0중량%의 양으로 첨가하는 단계; (4) 상기 (3)단계의 용액에 0.0001∼1.0중량%의 환원제를 첨가하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계의 용액을 세척하는 단계를 포함한다.
상기 안정화 방법에 있어서, (1)단계는 글루칸중의 베타-1,6 잔기를 알데히드로 만들어 효소 또는 단백질과 결합시키기 위한 단계로서, 글루칸에 대하여 과요오드산염류를 0.1∼50.0몰당량, 바람직하게는 2∼5몰당량으로 첨가한 후, 암소에서 교반하여 반응시킨다. 이때 과요오드산염류로는 특별히 한정되지 않지만, 예들 들면 과요오드산(HIO4, H5IO6), 과요오드산나트륨(NaIO4, Na3H2IO4), 과요오드산칼륨(KIO4)등을 사용할 수 있다. 한편, 상기 방법에서 글루칸을 과요오드산염류와 반응시킨 후, 산화반응을 정지시키기 위하여 에틸렌글리콜을 0.01∼10.0중량%의 양으로 더 첨가할 수 있다.
상기 (2)단계는 상기 (1)단계의 반응액중에 반응하지 않고 남아있는 과요오드산염류 등을 제거하기 위한 단계로, 제거방법은 분자량 한계(molecular cut off)가 1,000∼500,000, 바람직하게는 10,000∼100,000인 막을 사용하여 투석(dialysis) 또는 한외여과(ultrafiltration)하여 제거한다.
상기 (3)단계는 글루칸 중 베타-1,6-잔기의 알데히드와 효소 또는 단백질의 아미노기가 결합하여 쉬프 염기(schiff's base)가 형성되도록 하는 단계로서, (2)단계에서 세척된 글루칸 용액에 효소 또는 단백질을 0.00001∼10.0중량%, 바람직하게는 0.001∼5.0중량%의 양으로 첨가한다.
상기 (4)단계는 쉬프 염기를 환원시키는 단계로서, 상기 글루칸-효소(단백질)용액(쉬프 염기 용액)에 환원제를 0.001∼1.0중량%, 바람직하게는 0.01∼0.1중량%의 양으로 첨가한다. 이때, 환원제로는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 붕수소화나트륨(NaBH4), 소듐시아노보로하이드라이드(NaBH3CN), 아민보란(amine borane)등을 사용할 수 있다. 한편, 반응하지 않은 알데히드 반응기를 없애기 위하여 환원된 글루칸-효소(단백질)용액에 0.01∼10중량%, 바람직하게는 0.1∼1.0중량%의 리신(lysine)을 더 첨가할 수 있다.
상기 (5)단계는 최종적으로 안정화된 효소(단백질)용액을 세척하는 단계로서, 상기 (2)단계에서와 같이 분자량 한계(cut off)가 1,000∼500,000, 바람직하게는 10,000∼100,000인 막을 사용하여 투석 또는 한외여과하여 세척한다.
본 발명의 글루칸을 이용하여 효소 또는 단백질을 안정화시키는데 있어서, 안정화시키고자 하는 효소 또는 단백질이 2개 이상인 경우, 효소 또는 단백질을 글루칸과 동시에 반응시킬 수 있지만, 하나를 먼저 글루칸과 반응시킨 후, 이후에 나머지를 반응시켜 안정화시킬 수도 있다.
본 발명의 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질은 사용되는 효소 또는 단백질의 특성에 따라 각질제거, 피지조절, 항염증, 자극완화, 여드름(자국)완화, 항산화, 독성물질의 제거, 금속이온전달, 탄력증진, 주름제거, 노화방지, 미백, 탠닝(tanning), 탈모방지, 제모, 유해 세균 및 진균억제, 냄새제거, 일광손상치유 및 상처치유 등의 효과를 갖는 외용제 조성물에 사용되는데, 그 사용량은 그 제형에 따라 적당량으로 선정될 수 있으며, 바람직하게는 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼100중량%의 양으로 함유된다.
본 발명의 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 메이크업 베이스, 립스틱, 팩, 젤, 삼푸, 린스, 헤어토닉, 비누 등의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 갖는 외용제 조성물일 수 있다.
또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 안정화된 효소 또는 단백질 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
이하, 제조예와 시험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.
＜제조예 1＞
1) 분자량이 200만인 0.5중량%의 스키조필란 수용액 50㎖에 과요오드산나트륨(NaIO4) 2g을 첨가하고, 4℃의 암소에서 1시간 동안 교반하였다.
2) 반응된 스키조필란 용액을 분자량한계 10,000의 투석막에 넣고, 4℃의 암소에서 2,500㎖의 수중에 12시간마다 물을 교환하면서 48시간 동안 투석하였다.
3) 100㎖ 정도로 양이 증가된 글루칸 용액에 0.1중량%의 파파인을 넣고, 2시간 동안 4℃의 암소에서 교반하였다.
4) 스키조필란-파파인 용액에 붕수소화나트륨(NaBH4) 0.05g을 넣고 4시간 동안 교반한 후, 리신 0.1g을 넣고 4℃의 암소에서 2시간동안 교반하였다.
5) 스키조필란-파파인 용액을 상기 2)에서와 같은 방법으로 투석하여 스키조필란-파파인 결합 용액인 GE-1을 얻었다.
상기 방법에 의해 제조된 GE-1의 수율은 효소활성도기준으로 95%이다.
＜제조예 2＞
1) 마이크로플루이다이저로 분자량을 30만으로 조정한 1중량%의 스클레로글루칸 수용액 50㎖에 과요오드산칼륨 2g을 첨가하고, 4℃의 암소에서 1시간 동안 교반하였다.
2) 반응된 스클레로글루칸 용액을 분자량한계 30,000의 한외여과막을 사용하여 상온, 암소에서 10,000㎖의 물을 서서히 가하면서 한외여과하였다.
3) 50㎖ 정도의 양으로 세척된 스클레로글루칸 용액에 0.5중량%의 리소짐을 넣고, 1시간 동안 4℃의 암소에서 교반하였다.
4) 스클레로글루칸-리소짐 용액에 붕수소화나트륨 0.05g을 넣고, 4℃의 암소에서 2시간동안 교반하였다.
5) 스클레로글루칸-리소짐 용액을 상기 2)에서와 같은 방법으로 세척하여 스클레로글루칸-리소짐 결합 용액인 GE-2를 얻었다.
상기 방법에 의해 제조된 GE-2의 수율은 효소활성도기준으로 93%이다.
＜제조예 3＞
1) 분자량이 100만인 0.5중량% 스키조필란 수용액 50㎖에 과요오드산나트륨 2g을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다.
2) 반응된 스키조필란 용액을 분자량한계 10,000의 투석막에 넣고, 4℃의 암소에서 2,500㎖의 수중에 12시간마다 물을 교환하면서 48시간 동안 투석하였다.
3) 100㎖ 정도로 양이 증가된 스키조필란 용액에 0.1중량%의 파파인을 넣고 2시간 동안 상온에서 교반하였다.
4) 스키조필란-파파인 용액에 붕수소화나트륨 0.01g을 넣고 상온에서 10분동안 교반한 후, 0.1중량%의 리소짐을 넣고 다시 2시간동안 반응한 후, 붕수소화나트륨 0.04g과 리신 0.1g을 넣고 24시간 동안 교반하였다.
5) 스키조필란-파파인과 스키조필란-리소짐의 혼합 용액을 상기 2)에서와 같은 방법으로 투석하여 글루칸-효소 결합용액인 시료 GE-3을 얻는다.
상기 방법에 의해 제조된 GE-3의 수율은 효소활성도기준으로 파파인은 94%이며, 리소짐은 90%이다.
＜제조예 4＞
1) 분자량이 200만인 0.1중량%의 스키조필란 수용액 5㎖에 과요오드산나트륨 0.05g을 첨가하고, 4℃의 암소에서 1시간 동안 교반하였다.
2) 반응된 스키조필란 용액을 분자량한계 1,000의 투석막에 넣고, 4℃의 암소에서 2,500㎖의 수중에 12시간마다 물을 교환하면서 48시간 동안 투석하였다.
3) 투석된 글루칸 용액에 0.01중량%의 인체 재조합 상피세포성장인자(human recombinant epidermal growth factor)를 넣고, 2시간 동안 4℃의 암소에서 교반하였다.
4) 스키조필란-상피세포성장인자 용액에 붕수소화나트륨 0.002g을 넣고 4시간 동안 교반하였다.
5) 스키조필란-상피세포성장인자 용액을 상기 2)에서와 같은 방법으로 투석하여 스키조필란-상피세포성장인자 결합 용액을 얻었다.
＜비교제조예 1＞
1) 분자량이 50만인 1중량%의 덱스트란 수용액 50㎖에 과요오드산나트륨 2g을 첨가하고, 4℃의 암소에서 1시간 동안 교반하였다.
2) 반응된 덱스트란 용액을 분자량한계 10,000의 투석막에 넣고, 4℃의 암소에서 2,500㎖의 수중에 12시간마다 물을 교환하면서 48시간 동안 투석하였다.
3) 100㎖ 정도로 양이 증가된 덱스트란 용액에 0.1중량%의 파파인을 넣고, 2시간 동안 4℃의 암소에서 교반하였다.
4) 덱스트란-파파인 용액에 붕수소화나트륨 0.05g을 넣고 4시간 동안 교반한 후, 리신 0.1g을 넣고 4℃의 암소에서 2시간동안 교반하였다.
5) 덱스트란-파파인 용액을 상기 2)에서와 같은 방법으로 투석하여 덱스트란-파파인 결합 용액을 얻었다.
상기 방법에 의해 제조된 시료의 수율은 효소활성도기준으로 65%이다.
＜비교제조예 2＞
파파인 대신에 리소짐을 사용한다는 것을 제외하고는 비교제조예 1과 동일한 방법으로 실시하여 덱스트란-리소짐 결합 용액을 얻었다.
상기 방법에 의해 제조된 시료의 수율은 효소활성도기준으로 61%이다.
［시험예 1］
상기에서 제조한 제조예 1의 GE-1과 제조예 3의 GE-3의 단백분해효소 활성도의 경시변화를 자연상태의 파파인(Native papain) 및 비교제조예 1의 파파인과 비교하여, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
단백분해효소의 활성도 측정은 K. E. Erlanger 등의 방법(Arch. Biochem. Biophys., 95,p271-278, 1961년)에 의해 측정하였다.
경시변화에 따른 온도별 잔존 단백분해효소 활성
(단위: %)
제조예 1(GE-1) 제조예 2(GE-3) 자연상태 파파인 (0.1%) 비교제조예 1 (0.1%)
30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃
0일 100 100 100 100 100 100 100 100
10일 100 100 100 100 18 10 65 40
30일 100 100 100 100 4 0 20 10
60일 100 98 100 98 0 0 15 10
90일 100 95 100 95 0 0 14 9
상기 표 1로부터, 본 발명의 방법에 의해 안정화된 파파인이 자연상태의 파파인 및 공지방법에 의해 안정화된 파파인(덱스트란-파파인)보다 안정도면에서 우수하다는 것을 알 수 있다.
[시험예 2］
상기에서 제조한 제조예 2의 GE-2와 제조예 3의 GE-3의 리소짐 활성도의 경시변화를 자연상태의 리소짐(Native papain) 및 비교제조예 2의 리소짐과 비교하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
리소짐의 활성도 측정은 D. Shugar의 방법(Biochim. Biophys. Acta., 8, p302, 1952년)의 방법에 의해 측정하였다.
경시변화에 따른 온도별 잔존 리소짐의 활성
(단위: %)
제조예 2(GE-2) 제조예 3(GE-3) 자연상태 리소짐 (0.1%) 비교제조예 2 (0.1%)
30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃
0일 100 100 100 100 100 100 100 100
10일 100 100 100 100 25 10 60 45
30일 100 100 100 100 9 5 22 12
60일 100 100 100 98 0 0 14 10
90일 100 100 100 96 0 0 14 8
상기 표 2로부터, 본 발명의 방법에 의해 안정화된 리소짐이 자연상태의 리소짐 및 공지방법에 의해 안정화된 리소짐(덱스트란-리소짐)보다 안정도면에서 우수하다는 것을 알 수 있다.
［시험예 3］
상기에서 제조한 제조예 1의 GE-1과 제조예 3의 GE-3의 불용성 기질인 각질에 대한 작용성을 자연상태의 파파인(Native papain) 및 비교제조예 1의 파파인과 비교하였다.
즉, D-판상세포(squame)를 이용해 정상인의 하박에서 각질을 채취한 각 디스크를 미리 동일한 활성도로 조정한 각 효소시료에 담가 37℃에서 반응시켰다. 그 다음, 시간에 따라 회수한 디스크를 0.2% 나일청 A 염색색소(Nile blue) 용액에 10분 동안 담근 후 증류수로 세척하고 크로마메터(chromameter)를 사용하여 디스크 각질의 분해도를 측정하여 백분율로 환산하였으며, 시험결과는 표 3과 같다.
(단위: 분해도%)
제조예 1(GE-1) 제조예 3(GE-3) 자연상태 파파인 비교제조예 1
0시간 0 0 0 0
12시간 20 12 20 5
24시간 55 43 48 20
36시간 100 90 90 55
48시간 100 100 92 64
상기 표 3으로부터, 본 발명에 의해 안정화된 효소는 각질에 대한 작용성이 자연상태의 효소와 유사하나 안정도면에서 자연상태의 효소보다 우수하므로 최종적인 각질에 대한 작용성은 본 발명의 효소가 우수하다는 것을 알 수 있다. 더구나, 본 발명의 방법에 의해 안정화된 효소가 공지의 방법에 의해 안정화된 효소보다 각질에 대한 작용성이 매우 우수함을 알 수 있다.
［시험예 4］
상기 제조예 1과 3에서 안정화시킨 효소의 피부자극도를 동일한 활성도의 자연상태 효소와 비교하였다.
즉, 각 효소시료에 의한 피부자극도를 홍반형성도에 의해 측정하였는데, 측정방법은 피부색소측정기(Chromameter CM2002)를 이용하여 시료도포 부위의 피부색 초기값을 측정하고, 각 효소시료를 각각 20㎕씩 1일 2회, 7일간 도포하면서 피부 색소 측정기를 이용하여 상기 시료들에 의한 홍반을 측정하고 대조군과 비교하여 자극도를 평가하였다. 이때, 홍반지수는 최초 피부색소 측정값을 100으로 환산한 값으로, 홍반지수는 아노바 테스트(Anova test)를 통해 통계적 유의성을 검증한 바, p＜0.05 범위에서 통계적으로 유의한 것으로 판정되었다. 그 결과는 하기 표 4와 같다.
(단위: 홍반지수)
대조군(증류수) 제조예 1(GE-1) 제조예 3(GE-3) 자연상태 파파인
원액 1/100희석 원액 1/100희석 원액 1/100희석
0일 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
3일 100.85 100.55 101.23 102.34 100.04 189.04 165.02
5일 103.58 103.02 98.56 98,76 100.05 225.08 192.78
7일 102.95 101.55 100.04 97.98 99.13 230.24 203.44
상기 표 4로부터, 대조군과 비교하여 자연상태의 효소는 1/100로 희석한 상태에서도 자극을 나타내는 반면 본 발명에 방법에 의해 안정화된 제조예 1과 3의 효소는 희석하지 않은 상태에서도 전혀 피부자극을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있다.
[시험예 5]
상기 제조예 4에서 제조한 글루칸-상피세포성장인자 결합체와 자연상태의 상피세포성장인자의 안정도를 섬유아세포증식능에 의해 비교하였다.
즉, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 사람의 섬유아세포를 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하였다. 시료로서, 제조예 4에서 얻은 글루칸-상피세포성장인자 결합체와 동일농도로 증류수에 용해한 자연상태 상피세포성장인자를 사용하여 전처리로서 각각 37℃ 온도에서 7일간 보존한 후, 새로 용해한 자연상태 상피세포성장인자와 함께 섬유아세포에 처리하고 다시 4일 동안 배양하였다. 시료들의 배양을 완료한 후 0.2% MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltertazolium bromide) 용액을 각 well당 50㎕씩 첨가하고, 다시 37℃ 에서 4시간동안 배양한 후 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용하여 용해시켰다. 용해된 포르마잔의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 이를 무처리군과 비교하여 섬유아세포의 증식여부를 판정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
(단위: 생존세포 %)
희석배수 자연상태상피세포성장인자(신규 용해) 제조예 4(전처리) 자연상태상피세포성장인자(전처리)
10-2 121.0 128,2 88.7
10-3 126.8 128.9 94.9
10-4 124.5 125.4 102.5
10-5 112.9 112.8 101.8
상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 자연상태 상피세포성장인자와 비교하여, 전처리로 단백질 활성손실을 유도한 처리군의 경우 제조예 4에 의해 안정화된 시료는 세포증식기능을 그대로 유지하는 반면, 자연상태 상피세포성장인자는 단백질의 기능을 거의 상실하였다. 따라서, 본 방법에 의해 제조된 단백질의 경우 안정적으로 기능을 유지할 수 있다는 것을 알 수 있다.
이상의 시험예들로부터 알 수 있는 바와 같이, 글루칸을 사용하여 안정화된 효소 또는 단백질은 장시간 동안 효소 또는 단백질의 활성을 유지할 수 있으면서 피부자극이 없고, 불용성 기질에 대한 작용성 또한 우수하다는 것을 알 수 있다.
［시험예 6］
하기 표 6과 같은 스킨로션에 대하여 단백분해효소의 활성도를 시험예 1과 동일한 방법으로 측정하여 그 결과를 표 7에 나타내었다.
성분 제형예 1 비교제형예 1 비교제형예 2
제조예 1의 파파인 0.1 - -
자연상태 파파인 - 0.1 -
비교제조예 1의 파파인 - - 0.1
글리세린 3.0 3.0 3.0
부틸렌글리콜 2.0 2.0 2.0
프로필렌글리콜 2.0 2.0 2.0
카르복시비닐폴리머 0.1 0.1 0.1
PEG-12 노닐페닐에테르 0.2 0.2 0.2
폴리솔베이트 80 0.4 0.4 0.4
에탄올 10.0 10.0 10.0
트리에탄올아민 0.1 0.1 0.1
방부제, 색소, 향료 적량 적량 적량
정제수 to 100 to 100 to 100
(단위: %)
제형예 1 비교제형예 1 비교제형예 2
30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃ 30 ℃ 45 ℃
0일 100 100 100 100 100 100
10일 100 100 20 11 45 20
30일 100 100 5 0 12 10
60일 100 100 0 0 4 0
90일 100 97 0 0 0 0
상기 표 7로부터, 글루칸에 의해 안정화된 효소가 조성물내에서도 안정도면에서 가장 우수함을 알 수 있다.
［시험예 7］
상기 제형예 1 및 비교제형예 1∼2의 스킨로션의 각질에 대한 작용성을 상기 시험예 3과 동일한 방법으로 측정하고, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
(단위: 분해도%)
제형예 1 비교제형예 1 비교제형예 2
0시간 0 0 0
12시간 24 22 0
24시간 65 54 15
36시간 100 80 35
48시간 100 80 35
상기 표 8로부터, 글루칸에 의한 안정화된 효소를 함유하는 제형이 각질에 대한 작용성면에서 가장 우수함을 알 수 있다.
［시험예 9］
상기 제형예 1 및 비교제형예 1의 스킨로션에 대한 피부자극도를 측정하였다. 즉, 피부색소 측정기(Chromameter CM2002)를 이용하여 시료도포 부위의 피부색 초기값을 측정하고, 각각의 스킨로션을 1mg씩 1일 2회, 7일간 도포하면서 피부 색소 측정기를 이용하여 상기 시료들에 의한 홍반을 측정하고 대조군과 비교하여 자극도를 평가하였다. 이때, 홍반 지수는 최초 피부색소 측정값을 100으로 환산한 값으로, 홍반 지수는 아노바 테스트(Anova test)를 통해 통계적 유의성을 검증한 바, p＜0.05 범위에서 통계적으로 유의한 것으로 판정되었다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
(단위:홍반지수)
대조군(증류수) 제형예 1 비교제형예 1
0일 100.00 100.00 100.00
3일 100.85 100.55 191.00
5일 107.51 100.02 225.05
7일 102.85 101.51 238.42
상기 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군과 비교하여 자연상태의 효소를 함유하는 제형은 자극을 나타내는 반면 글루칸에 의해 안정화된 효소를 함유하는 제형은 전혀 피부자극을 나타내지 않았다.
이하, 상기한 시험예들의 결과를 근거로 하여, 안정화된 효소 또는 단백질을 함유함으로써 각각의 효소 또는 단백질이 갖는 효과를 제공할 수 있는 여러 제형의 외용제를 조성하여 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물이 하기의 제형예에 한정되는 것은 아니다.
(제형예 2) 영양화장수(밀크로션)
배합성분 중량%
제조예 2 0.1
스쿠알란 5.0
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
유동파라핀 0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 3) 영양크림
배합성분 중량%
제조예 3 0.1
밀납 10.0
폴리솔베이트 60 1.5
PEG-60 경화피마자유 2.0
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 10.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
글리세린 5.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 4) 마사지크림
배합성분 중량%
제조예 1 0.1
밀납 10.0
폴리솔베이트 60 1.5
PEG-60 경화피마자유 2.0
솔비탄세스퀴올레이트 0.8
유동파라핀 40.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0
글리세린 5.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 5) 팩
배합성분 중량%
제조예 1 0.1
폴리비닐알콜 13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스 0.2
글리세린 5.0
알란토인 0.1
에탄올 6.0
PEG-12 노닐페닐에테르 0.3
폴리솔베이트 60 0.3
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 6) 젤
배합성분 중량%
제조예 2 0.1
에틸렌디아민초산나트륨 0.05
글리세린 5.0
카르복시비닐폴리머 0.3
에탄올 5.0
PEG-60 경화피마자유 0.5
트리에탄올아민 0.3
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 7) 연고
배합성분 중량%
제조예 4 1.0
밀납 10
폴리솔베이트 60 5.0
PEG-60 경화피마자유 2.0
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
바셀린 5.0
유동파라핀 10.0
스쿠알란 5.0
쉐어버터 3.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
글리세린 10.0
프로필렌글리콜 10.2
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
(제형예 8) 국소투여용 약제(겔 연고제)
배합성분 중량%
제조예 4 3.0
폴리아크릴산(Carbopol 940) 1.5
이소프로판올 5.0
헥실렌글리콜 25.0
트리에탄올아민 1.7
탈이온수 to 100
(제형예 9) 국소 투여용 약제(패취제)
배합성분 중량%
제조예 4 1.2
헥실렌글리콜 20.0
디에틸아민 0.7
폴리아크릴산(Carbopol 934P) 1.0
아황산나트륨 0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9) 1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르(Cetomacrogol 1000) 1.0
점성의 파라핀 오일 2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르(Cetiol LC) 2.5
폴리에틸렌글리콜 400 3.0
탈이온수 to 100
이상에서 설명한 바와 같이, 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 이용하여 효소 또는 단백질을 안정화시킴으로서 효소 또는 단백질의 안정도를 급격히 향상시킬 수 있고, 따라서, 이러한 안정화된 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물은 각각의 효소 또는 단백질이 갖는 각질제거, 피지조절, 항염증, 자극완화, 여드름(자국)완화, 항산화, 독성물질의 제거, 금속이온전달, 탄력증진, 주름제거, 노화방지, 미백, 탠닝(tanning), 탈모방지, 제모, 유해 세균 및 진균억제, 냄새제거, 일광손상치유, 상처치유 등의 효과를 장시간 동안 안정하게 제공할 수 있다.

Claims (9)

  1. 효소 또는 단백질을 안정화시키는 방법에 있어서, 안정화제로 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 사용함을 특징으로 하는 효소 또는 단백질의 안정화 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 효소 또는 단백질을 안정화시키는 방법은
    (1) 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 과요오드산염류와 반응시키는 단계;
    (2) 상기 (1)단계 반응액의 잔류 과요오드산염류를 제거하는 단계;
    (3) 상기 (2)단계의 용액에 효소 또는 단백질을 0.00001∼10.0중량%의 양으로 첨가하는 단계;
    (4) 상기 (3)단계의 용액에 0.0001∼1.0중량%의 환원제를 첨가하는 단계; 및
    (5) 상기 (4)단계의 용액을 세척하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 효소는 파파인(papain), 브로멜라인(bromelein), 피신(ficin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 콜라게나제(collagenase), 엘라스테제(elastase), 플라스민(plasmin), 세균성 프로테아제(bactrial protease), α-아밀라제(amylase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 셀룰라제(cellulase), 펙티나제(pectinase), 키실라나제(xylanase), α-글루코시다제(glucosidase), β-글루코시다제, α-갈락톡시다제(galactosidase), β-갈락톡시다제, β-글루카나제(glucanase), 키티나아제(chitinase), 만난분해효소(mannannase) , 포스포리파제(phospholipase), 트리아실글리세롤분해효소(triacylglycerol hydrolase), 데옥시리보핵산분해효소(DNAase), 리보핵산분해효소(RNAase), 인산분해효소류(phosphatase), 리소짐(lysozyme), 카탈라제(catalase), 과산화물 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 트랜스글루타미나아제(transglutaminase), 퍼옥시다제(peroxidase), 포토리아제(photolyase) 및 미생물 유래 복합효소류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소, 이들의 결합체 또는 이들의 펩타이드, 당 및 지방 복합체이고, 상기 단백질은 사이토카인류(cytokines), 세포성장인자류(growth factors), 호르몬류(hormones), 항원(antigen) 및 항체(antibody), 면역글로블린(immunoglobulins), 락토페린(lactoferrin), 메탈로티오네인(metallothionein), 티오레독신(thioredoxin), 항균성 단백질 및 항산화 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질, 이들의 결합체 또는 이들의 펩타이드, 당 및 지방 복합체임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸은 스키조필란(schizophyllan), 스클레로글루칸(scleroglucan) 또는 렌티난(lentinan)임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸은 마이크로플루이다이저(microfluidizer), 초음파분쇄기(sonicator) 또는 베타-글루카나제(β-glucanase)를 사용하여 분자량을 변형시킨 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 효소 또는 단백질이 2종 이상인 경우, 효소 또는 단백질 중에 하나를 상기 (3)단계에서 먼저 첨가한 후, 나머지 효소 또는 단백질은 상기 (4)단계에서 첨가함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼100중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 외용제 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 외용제 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 메이컵 베이스, 립스틱, 팩, 젤, 샴푸, 린스, 헤어토닉 또는 비누의 제형을 갖는 화장료 조성물임을 특징으로 하는 외용제 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 외용제 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 경피투여형 제형을 가짐을 특징으로 외용제 조성물.
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