KR100447055B1 - 변성 알터난의 제조방법 및 이를 이용한 효소 안정화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변성 알터난의 제조방법 및 이를 이용한 효소 안정화 방법에 관한 것으로, 본 발명의 변성 알터난은 먼저 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CBI-110이 생산하는 물질은 직선상(linear)의 α-1,3 글루칸을 분리·정제하여 NSA(Nitrosyl sulfuric acid; 산화제)로 산화시키는 일련의 과정을 통하여 다당체의 타 글루코스(glucose)분자와 결합되지 않은 6번 탄소위치의 -CH₂OH를 -COOH로 산화시켜 얻음을 특징으로 한다. 다당체의 이러한 구조적 변형을 주면 다당체의 전반적인 구조의 변형을 유도하며 효소와 다당체의 결합 및 안정성 증가에 영향을 주게 된다. 생산된 수용성 다당체를 과요오드산 나트륨(NaIO₄)으로 산화시킨 후 분리·정제하여 분자량 100K 이상의 다당체를 일정 조건에서 효소와 고정화 반응시키고 이에 의해, 효소의 안정성이 증가하게 되는 것이다. 이와 같이 구성된 본 발명은 안정성이 약한 효소를 상온에서 보관하고, 사용할 수 있을 정도로 안정성을 강화시킬 수 있는 방법을 제공함으로서 화장품 산업뿐 아니라, 의약품 및 식품 영역에서도 효과적으로 사용될 수 있는 유용한 발명이다.

Description

변성 알터난의 제조방법 및 이를 이용한 효소 안정화 방법{Technical procedure of modified Alternan production and enzyme stabilization}

본 발명은 변성 알터난의 제조방법 및 이를 이용한 효소 안정화 방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 류코노스톡 메센테로이데스 CBI-110(Leuconostoc mesenteroidesCBI-110; 미생물 수탁번호 KFCC-10999)에 의하여 생산된 알터난을 구조변형시킨 변성 알터난의 제조방법과 이를 화장품의 첨가물질인 효소안정화제로 사용하는 것에 관한 것이다.

피부미용성 화장품에는 케라틴의 제거 등 일정한 목적을 가지고 효소를 첨가하는데 이런 효소는 자외선, pH, 온도변화 등 각종 변성인자에 의해 그 활성이 저하된다. 이와 같이 효소의 주성분으로 되는 단백질의 3차 구조 및 생물학적 활성에 영향을 주는 인자들은 매우 많으며, 그 중 단백질이 변성이 되지 않는 최고 온도에 달했을 때, 단백질 본래의 구조를 유지하게 해주는 비 공유결합(non-covalent interactions)의 균형이 상실되며 마침내 그 구조가 파괴되고, 이 단백질을 다시 저온에서 보관하게 되면 구조를 다시 구축하게 되고 활성을 찾게 된다. 하지만, 효소가 장시간 최대온도에 직면하게 되면 저온으로의 회귀에서도 불구하고 그 활성을 찾을 수 없게 된다. 따라서, 생물학적 활성을 갖는 단백질, 즉 효소는 적정 온도에서 보존되어질 때 그 활성을 최대한 유지시켜 나갈 수 있는 것이다. 일반적인 효소 보존온도는 4℃이며, 이러한 조건에서도 장기간 보존 시에는 그 활성이 저하된다.

한편, 효소가 첨가되는 화장품은 상온에서 보관 유통되며 때로는 그 이상의 온도에서 유통된다. 또한, 이러한 온도 조건 이외에도 화장료의 조성물에는 효소의 안정성을 저해하는 물질이 많다. 따라서, 이와 같이 안정성이 약한 효소를 상온에서 보관하고, 사용할 수 있을 정도로 안정성을 강화한다는 것은 매우 중요하며 화장품 산업뿐 아니라, 의약품 및 식품 영역에서도 효과적으로 사용될 수 있는 중요한 기술이다.

따라서, 보존 온도와 주위 조건에 따라 안정성이 낮은 효소의 안정성을 높이고자 하는 시도가 많이 되어 왔다. 이중 다당체를 이용하여 효율적으로 안정화시키는 방법이 P.V.Sundaram 등(Protein Engineering, vol.8, no.10, 1039-1047,1995)에 의하여 보고되었다. 이러한 방법은 Sim등(Biotechnology letter, 22: 137-140, 2000)이 보고한 SC-glucan(태평양, 한국)에서도 이용되었으나, 효소의 안정화에 이용될 수 있는 다당체는 많지 않으며, 또한 일반적으로 매우 고가인 문제점이 있다. 이와 같이 효소를 안정화시켜 크림 및 로션 등의 화장료에서 장기간 그 안정성을 유지시킬 수 있는 기술에 대해 많은 연구가 진행되고 있으나 그 안정성이 미흡하고 제조단가가 높다는 단점이 있다.

본 발명자등은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 효소의 안정성을 높여줄 수 있는 다당체를 찾아 분리하고 여러 보고된 효소 안정화방법을 본 다당체에 맞게 수정하여 상온에서 장기간 활성을 유지할 수 있는 효소 안정화제를 제공하고자 많은 연구를 하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 화장품과 같은 효소에 불리한 조건 내에서도 첨가되어진 효소가 활성을 장기간 유지할 수 있도록 하는 효소 안정화제의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

더욱이, 본 발명은 상기와 같은 효소 안정화제를 보다 대량으로 용이하게 제조할 수 있는 방법을 제공함으로써 저렴하게 공급할 수 있는 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

또한, 이러한 효소 안정화제가 특히 화장품에 첨가되는 효소를 화장품의 보관 유통 조건하에서도 적정하게 안정하게 할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.

이러한 본 발명의 과제는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CBI-110이 생산하는 특이적인 α-1,3 글루칸(glucan)을 화학적 구조변형을 유도할 수 있는 생산조건을 찾고, 이들 생산물을 분자량에 따라 분리·정제하였고, 이를 이용하여 안정화 효소를 생산하는 생산조건을 수정 확립하여 그 과제를 해결하였다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 변성 알터난의 NMR 스펙트럼이고,

도 2는 본 발명에 따라 제조된 변성 알터난의 FT-IR 스펙트럼이고,

도 3은 SDS-PAGE에서 안정화 효소의 분자량 증가를 확인한 사진이고,

도 4는 본 발명에 따른 안정화 효소의 최적 활성온도를 나타낸 그래프이고,

도 5 및 도 6은 각각 본 발명에 따른 안정화 효소가 첨가된 크림의 피부 각질 제거능을 나타낸 사진과 그래프이다.

본 발명의 변성 알터난은 먼저 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CBI-110이 생산하는 물질은 직선상(linear)의 α-1,3 글루칸을 주(main)로 하여 구성되어진 물질이다. 이 물질을 분리·정제하여 NSA(Nitrosyl sulfuric acid; 산화제)로 산화시키는 일련의 과정을 통하여 다당체의 타 글루코스(glucose)분자와 결합되지 않은 6번 탄소위치의 -CH₂OH를 -COOH로 산화시켜 얻음을 특징으로 한다.

다당체의 이러한 구조적 변형을 주면 다당체의 전반적인 구조의 변형을 유도하며 효소와 다당체의 결합 및 안정성 증가에 영향을 주게 된다. 생산된 수용성 다당체를 과요오드산 나트륨(NaIO₄)으로 산화시킨 후 분리·정제하여 분자량 100K 이상의 다당체를 일정 조건에서 효소와 고정화 반응시킨다. 이로 인하여 효소와 산화된 다당체는 공유결합을 형성하고 효소는 다당체에 의해 안정성이 증가하게 되는 것이다. 이렇게 생산된 효소액을 SDS-PAGE 전기영동에서 그 분자량의 변화를 조사하여 본 결과, MW 30K 이하였던 효소단백질의 spot이 MW 100K 이상의 효소단백질의 spot으로 변하게 된다. 또한, 그 활성도 약 65% 정도 유지하고 있었다. 전기영동 결과와 안정화 후의 활성을 고려할 때, 효소단백질의 안정화가 순조롭게 이루어졌다고 판단되었다.

이하 본 발명을 첨부도면을 참고로 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 사용된 α-1,3 글루칸은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CBI-110의 발효액을 에탄올(ethanol) 침전법에 의해 얻었으며, 한외여과(ultrafiltration) 법(Stirred cell, Millipore co. Ltd.)으로 분자량 10만(MW 100K) 이상인 것을 분리하여 구조변형을 시도하였다. 구조변형은 분리된 다당체를 85% 인산에 팽윤(swelling)하고, NSA(Nitrosyl sulfuric acid)를 이용하여 생산된 NO가스를 다당체와 반응시켜 6번 탄소부위를 산화시킨 후 포름산으로 반응시켜 도 1 및 도 2의 NMR 및 FT-IR 분석에 나타난 바와 같이 6번 탄소위치가 변화된 것을 확인할 수 있다. 먼저, 도 1의 NMR 스펙트로스코피에서 카르복실기는 160∼190ppm에서 나타나는데, 본 NMR 데이터에서는 180ppm 부근에서 나타난다. 또한, 도 2의 적외선 스펙트로스코피에서 카르복실기는 1730㎝^-1부근의 영역에서 나타난다(ref: Introduction to spectroscopy).

6번 탄소부위를 -COOH로 치환하는 것은 국소적 변형뿐 아니라 전체적인 형태의 변형을 유도하여 변형전보다 더욱 직선상의(linear) 다당체의 형태가 될 수 있다고 보고되어 있다(R. Rizzo, POLYtech, Trieste, Italy).

상기의 과정에서 생산된 다당체를 25℃에서 고농도의 과요오드산 나트륨(NaIO₄)과 16시간동안 반응시키고, 분자량 12,000(MW 12K) 투석(Dialysis bag, Sigma Co. Ltd.)법을 이용하여 반응되지 않고 남은 NaIO₄를 제거하였다. 투석후 백(bag)에 남아 있는 다당체를 한외여과(Stirred cell, Millipore Co. Ltd.)법으로 분자량 10만(MW 100K) 이상의 다당체를 분리하였다. 이러한 방법으로 생산된 다당체를 25℃에서 효소인 파파인(papain, Sigma Co. Ltd.)과 반응시켰으며, 다당체와 효소의 양은 약 1:5 비율로 첨가하였다. 일정시간 경과후 25℃에서 약 30분동안 수소화붕소 나트륨(NaBH₄)을 처리하고, 약 16시간동안 4℃에서 놓아두어 안정화된 효소를 생산하였다.

한외여과(Stirred cell, Millipore Co. Ltd.)법으로 분자량 10만(MW 100K)에서 분획을 나누어 생산된 안정화 효소와 결합되지 않은 효소를 분리하였다. 효소(papain)의 분자량이 2만∼3만이므로 분자량 10만(MW 100K) 이상의 분획을 안정화 효소라고 판단하였고, 분자량 10만(MW 100K) 이하의 분획을 결합되지 못한 비안정화 효소라고 판단하여, 최적온도의 변화, 화장품 제형에서의 안정성을 측정하였고, 전기영동법(Electrophoresis; SDS-PAGE)으로 분자량의 변화를 확인하였다.

안정화 효소의 분자량 변화를 확인하기 위한 전기영동법(SDS-PAGE)은 아크릴아미드용액을 8% 첨가한 분리 겔(separating gel)에서 실시되었으며, 이는 이러한 농도에서 포어 사이즈(pore size)는 약 분자량 2만∼9만KD의 단백질을 분리할 수 있는 영역이므로(Ref: BioMedical Research, 유욱준) 변성된 효소는 이동이 매우 적을 것이라는 것에 기인하였다. 4×분리 완충액(separation buffer)와 4×체류 완충액(stacking buffer)는 각각 1.5M Tris-Cl(pH 8.8)과 0.5M Tris-Cl(pH 6.8)을 사용하였으며, 탱크 완충액(tank buffer) 조성은 0.025M Tris-Cl, 0.192M 글리신, 0.1% SDS이며, pH 8.8로 보정하였다. 또한, 2×SDS 샘플 완충액의 조성은 0.125MTris-Cl(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-머갚토에탄올, 2% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)이다. 1.5㎜ gel 두장에 적하(loading)하였으며, 전류 60mA, 전압 70∼80볼트(volt)로 전기영동을 실시하였다. 도 3에서는 SDS-PAGE로 전기영동하여 분자량의 차이를 확인한 실험의 결과이다.

②는 효소(papain)를 그대로 사용하였고, ③은 위에 기재된 것처럼 생산하여 한외여과로 분자량 10만 이하의 분획을 제거하기 전의 것으로 안정화된 것과 안정화되지 않은 것이 혼합되어 존재하는 것이며, ④는 ③과 같이 생산되어 분자량 10만 이하의 분획이 제거된 것이기 때문에 ①과 ②와 같은 위치에 점(spot)이 나타나지 않았다. 이와 같은 결과로 인하여 효소와 다당체의 결합이 이루어졌음을 확인하고 최적활성온도의 증가 및 화장품 제형에서의 안정성을 확인할 수 있다.

<시험예 1>

다당체에 의한 효소의 안정화는 최적활성온도의 변화를 가져온다는 P.V.Sundaram의 보고(Protein Engineering, Vol.8, no.10, pp.1039∼1047, 1995)에 의거하여 안정화된 효소의 최적온도의 변화를 측정한 결과, 도 4에서처럼 최적활성온도의 변화를 확인할 수 있었다. 생산된 효소의 활성은 N,N-디메틸화 카세인(Sigma Co. Ltd)과 Nα-벤조일-DL-알지닌-ρ-니트로아닐리드(BAPNA, Sigma Co. Ltd)로 분석하였으며, 스펙트로포토미터(CE 1020, Cecil Co. Ltd)를 이용하여 N,N-디메틸화 카세인은 280㎚, BAPNA는 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

pH 6.5, 0.05M 인산염 완충액에서 안정화되지 않은 효소(papain)과 안정화된 효소를 60℃부터 80℃까지 온도를 변화시키며 30분동안 활성을 측정한 결과 약 11∼12℃정도의 최적활성온도가 변화된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 효소와 다당체의 결합에 기인한 것으로 그 구조적 안정성이 향상되었다는 것을 나타낸 것이다.

<시험예 2>

피부시험은 디하이드록시아세톤법(G.E.Pierard, Dermatology, 186, 133∼137, 1993)을 사용하였다. 디하이드록시아세톤법은 10% 농도로 디하이드록시아세톤을 크림제형에 첨가하여 피부에 도포하면 피부 각질의 단백질과 디하이드록시아세톤은 메일라드(maillard) 반응을 일으켜 도포된 부위의 피부를 인위적으로 검게 만든다. 이렇게 검게 된 피부는 각질이 제거됨에 따라 점차 엷어지다가 없어지게 되는데 이러한 주기는 약 7∼10일로 본래의 피부와 같아진다. 그러나 효소(papain)를 도포하면 그 주기를 단축시킬 수 있다. 따라서 상온에서 30일동안 보관한 후에도 그 활성을 계속 유지하고 있는지 육안으로 확인할 수 있는 것이다. 디하이드록시아세톤 도포 1일 경과후부터 1일 1회 도포하여 각질을 제거하였으며, 1회 도포시 효소작용시간은 10분이었다.

생산된 효소가 화장품 제형상에서 그 활성을 유지할 수 있는지에 관한 실험을 하기 위하여 맛사지 크림제형에 세가지 군, 즉 생산된 안정화 효소첨가군과 일반 효소첨가군 및 DW 첨가군으로 첨가하여 30일 이상 상온에서 보관한 후 동일한 양을 각각 피부에 도포하여 10분 경과후 물로 세척하고, 피부각질의 제거능력을 대조구와 비교하였다. 각질제거능을 수치화하기 위하여 스킨 비시오미터(Skin Visiometer) SV600(CK electronics GmbH, Germany)와 시그마스캔 프로(Sigmascan Pro) 3.0(Sigma Co. Ltd)을 이용하였으며, 그레이 레벨(gray level)을 측정한 결과도 5와 도 6에 나타내었다. 도 5는 도포후 3일째 경과된 시점의 사진이다. 도면에서 볼 수 있듯이 안정화 효소첨가군의 색이 대조군 이나 효소첨가군 보다 더 엷은 것을 볼 수 있으며, 이러한 색의 차이를 도 6의 그레이 레벨(gray level)로 분석하면 안정화 효소첨가군의 곡선이 오른쪽, 즉 백색방향으로 치우친 것을 볼 수 있었다. 따라서 안정화 효소첨가군이 보다 빠른 속도로 각질을 제거한다는 것을 확인할 수 있었으며, 효소첨가군 보다 안정화 효소첨가군이 화장품 제형에서 더욱 안정성을 유지할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 구성에 따른 본 발명은 주변 조건에 따라 매우 불안정한 효소를 용이하게 안정화시킬 수 있는 변성 알터난 및 그 제조방법을 제공함으로서, α-1,3 글루칸을 효과적으로 사용할 수 있는 이용성을 제공할 뿐 아니라 그 구조적 변형을 통하여 생산된 다당체인 변성 알터난을 이용하여 생산된 안정화 효소는 그 안정성을 크게 증가하는 유용한 발명이다. 이와 같이 안정성이 약한 효소를 상온에서 보관하고, 사용할 수 있을 정도로 안정성을 강화시킬 수 있는 기술은 화장품 산업뿐 아니라, 의약품 및 식품 영역에서도 효과적으로 사용될 수 있는 유용한 기술이며, 특히 화장품의 기능을 향상시킬 수 있는 물질로서 맛사지크림 및 영양크림, 로션 등의 화장품 공업에서 유용하게 사용될 수 있는 유용한 발명이다.

Claims (4)

1. 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CBI-110이 생산하는 물질인 직선상(linear)의 α-1,3 글루칸을 분리·정제하여 산화제로 산화시켜 다당체의 타 글루코스(glucose)분자와 결합되지 않은 6번 탄소위치의 -CH₂OH를 -COOH로 산화시켜서 얻음을 특징으로 하는 변성 알터난의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 산화제가 NSA(Nitrosyl sulfuric acid)임을 특징으로 하는 변성 알터난의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 생산된 변성 알터난을 과요오드산 나트륨(NaIO₄)으로 산화시킨 후 분리·정제하여 분자량 100K 이상의 다당체를 일정 조건에서 효소와 반응시킴을 특징으로 하는 효소의 안정화 방법.
4. 제 3항의 효소 안정화 방법에 따라 제조되는 화장료조성물 첨가용 안정화 효소.