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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Varianten der Cyclomaltodextrin-Glucano-Transferase
mit erhöhter Produktspezifität.
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HINTERGRUND
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Die
Cyclomaltodextrin-Glucano-Transferase (E. C. 2.4.1.19), auch bezeichnet
als Cyclodextrin-Glucano-Transferase oder Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase
und im folgenden CGTase genannt, katalysiert die Umwandlung von
Stärke
und ähnlichen
Substraten in Cyclomaltodextrine über eine intramolekulare Transglycosylierungsreaktion,
wodurch Cyclomaltodextrine, im folgenden Cyclodextrine (oder CD)
genannt, unterschiedlicher Größen gebildet
werden. Wirtschaftlich am bedeutendsten sind Cyclodextrine mit 6,
7 und 8 Glucoseeinheiten, die als α-, β- bzw. γ-Cyclodextrine bezeichnet werden.
Kommerziell weniger wichtig sind Cyclodextrine mit 9, 10 und 11
Glucoseeinheiten, die als δ-, ε- bzw. ζ-Cyclodextrine
bezeichnet werden.
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Cyclodextrine
sind folglich zyklische Glucoseoligomere mit einer hydrophoben innen
liegenden Spalte. Sie sind in der Lage Einschlusskomplexe mit vielen
kleinen hydrophoben Molekülen
in wässrigen
Lösungen zu
bilden, was zu Veränderungen
der physikalischen Eigenschaften führt, z.B. erhöhte Löslichkeit
und Stabilität
und erniedrigte chemische Reaktivität und Flüchtigkeit. Cyclodextrine finden
insbesondere in der Lebensmittel-, kosmetischen, chemischen und
pharmazeutischen Industrie Anwendung.
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Die
meisten CGTasen haben sowohl Stärke-abbauende
Aktivität
als auch Transglycosylierungs-Aktivität. Obwohl einige CGTasen hauptsächlich α-Cyclodextrine
herstellen und einige CGTasen hauptsächlich β-Cyclodextrine herstellen, bilden
CGTasen für
gewöhnlich
eine Mischung von α-, β- und γ-Cyclodextrinen.
Selektive Fällungsschritte
mit organischen Lösungsmitteln
können
zur Isolierung von getrennten α-, β- und γ-Cyclodextrinen
verwendet werden. Um teure und für
die Umwelt schädliche
Verfahren zu vermeiden, ist die Verfügbarkeit von CGTasen, die in
der Lage sind, einen erhöhten
Anteil eines bestimmten Typs von Cyclodextrin, insbesondere im Hinblick
auf α-, β- oder γ-Cyclodextrin, herzustellen,
wünschenswert.
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WO
96/33267 (Novo Nordisk) beschreibt CGTase-Varianten, die eine modifizierte
Substratbindung und/oder Produktselektivität zeigen. Obwohl die CGTase-Varianten,
die durch Mutation an den Positionen 47, 145, 146, 147, 196 oder
371 hergestellt worden waren, beschrieben wurden, wurden die spezifischen
CGTase-Varianten dieser Erfindung niemals beschrieben oder sogar
nahegelegt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue CGTase-Varianten mit erhöhter Produktspezifität bereit.
Obwohl CGTase-Varianten mit erhöhter
Produktspezifität
im Stand der Technik (WO 96/33267) bereits beschrieben wurden, wurden
die CGTase-Varianten der vorliegenden Erfindung bisher weder beschrieben
noch nahegelegt.
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Es
ist uns nun gelungen, in der ungeheuren Zahl von möglichen
CGTase-Varianten eine begrenzte Anzahl von Varianten zu finden,
die im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym eine erhöhte Produktspezifität zeigen.
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Folglich
stellt die Erfindung eine CGTase-Variante mit erhöhter Produktspezifität bereit,
in welcher ein oder mehrere der Aminosäurereste entsprechend den folgenden
Positionen durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden
(CGTase Nummerierung):
- (i) Position 47: 47C;
47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 47S; 47T; 47V; 47W
oder 47Y;
- (ii) Position 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q oder 145V;
- (iii) Position 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V oder 146Y;
- (iv) Position 147: 147C; 147D; 147E; 147N; 147Q
- (v) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K;
196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V oder 196W; 196Y und/oder
- (vi) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L;
371M; 371Q; 371R; 371T; 371V oder 371W.
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Aminosäuren
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Im
Zusammenhang mit dieser Erfindung werden die folgenden Symbole und
Abkürzungen
für Aminosäuren und
Aminosäurereste
verwendet:
- A
- = Ala = Alanin
- C
- = Cys = Cystein
- D
- = Asp = Asparaginsäure
- E
- = Glu = Glutaminsäure
- F
- = Phe = Phenylalanin
- G
- = Gly = Glycin
- H
- = His = Histidin
- I
- = Ile = Isoleucin
- K
- = Lys = Lysin
- L
- = Leu = Leucin
- M
- = Met = Methionin
- N
- = Asn = Asparagin
- P
- = Pro = Prolin
- Q
- = Gln = Glutamin
- R
- = Arg = Arginin
- S
- = Ser = Serin
- T
- = Thr = Threonin
- V
- = Val = Valin
- W
- = Trp = Tryptophan
- Y
- = Tyr = Tyrosin
- B
- = Asx = Asp oder Asn
- Z
- = Glx = Glu oder Gln
- X
- = Xaa = Eine beliebige
Aminosäure
- *
- = Deletion oder nicht
vorhandene Aminosäure
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CGTase-Varianten
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Eine
CGTase-Variante dieser Erfindung ist eine CGTase-Variante oder mutierte
CGTase mit einer Aminosäuresequenz,
die in der Natur nicht gefunden wird.
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Als
eine CGTase-Variante oder mutierte CGTase dieser Erfindung kann
ein funktionelles Derivat eines Vorläufer-CGTase-Enzyms (d.h. das
native, elterliche oder Wildtyp-Enzym) in Betracht gezogen werden
und dies kann durch Veränderung
einer DNA-Nukleotidsequenz
eines Vorläufergens
oder seiner Derivate, die das Vorläuferenzym kodieren, erhalten
werden. Die CGTase-Variante oder mutierte CGTase kann exprimiert
und hergestellt werden, wenn die DNA-Nukleotidsequenz, die die CGTase-Variante
kodiert, in einem geeigneten Vektor in einen geeigneten Wirtsorganismus
eingeführt
wird. Der Wirtsorganismus ist nicht notwendigerweise identisch mit
dem Organismus, aus dem das Vorläufergen
ursprünglich
stammte.
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In
der Literatur werden Enzymvarianten auch als Mutanten oder Muteine
bezeichnet.
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CGTase-Nummerierung
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Im
Zusammenhang mit dieser Erfindung wird eine spezifische Nummerierung
der Positionen der Aminosäurereste
in CGTase-Enzymen eingesetzt. Durch Anlagerung (alignment) der Aminosäuresequenzen
verschiedener bekannter CGTasen ist es möglich, jeder beliebigen Position
eines Aminosäurerestes
in jedem beliebigen CGTase-Enzym, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist, eine
CGTase-Aminosäure-Positionsnummer
eindeutig zuzuordnen.
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Unter
Verwendung des Nummerierungssystems, das von der Aminosäuresequenz
der CGTase stammt, die aus Bacillus circulans Stamm 251 erhalten
wurde und die an die Aminosäuresequenz
einer Reihe anderer bekannter CGTasen angelagert wird, ist es möglich, die
Position eines Aminosäurerests
in einem CGTase-Enzym eindeutig anzuzeigen.
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Dieses
CGTase-Nummerierungssystem wurde bereits in WO 96/33267 beschrieben,
siehe Tabelle 1, Seiten 9–31
(in der Tabelle ist Bacillus circulans Stamm 251 als a dargestellt).
Tabelle 1 von WO 96/33267 zeigt auch die Proteinsequenzen einer
Anzahl relevanter CGTasen und wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
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Bei
der Beschreibung der verschiedenen CGTase-Varianten, die erfindungsgemäß hergestellt
oder in Betracht gezogen wurden, wurden zur Vereinfachung der Bezugnahme
die folgenden Nomenklaturen angepasst:
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[Ursprüngliche Aminosäure; Position;
Substituierte Aminosäure]
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Folglich
wird die Substitution eines Serins mit Alanin in Position 145 als
S145A bezeichnet.
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Die
Aminosäurereste,
die im Hinblick auf die Aminosäuresequenz
der CGTase aus Bacillus circulans Stamm 251 Insertionen darstellen,
werden nummeriert, indem Buchstaben in alphabetischer Reihenfolge
an die vorangegangene CGTase-Nummer angefügt werden, wie z.B. Position
91aF für
das „Insert" Phe zwischen Thr
bei Position 91 und Gly bei Position 92 der Aminosäuresequenz
der CGTase aus Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627, vergl. Tabelle
1 (j).
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Die
Deletion eines Prolins an Position 149 wird als P149* angezeigt
und eine Insertion zwischen Position 147 und 148, wo kein Aminosäurerest
vorhanden ist, wird als *147aD für
die Insertion einer Asparaginsäure
an Position 147a angegeben.
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Mehrfache
Mutationen werden durch Markierung mittels Schrägstrich („/") getrennt, z.B. S145A/D147L, was Mutationen
an Positionen 145 und 147 darstellt, an denen Serin mit Alanin bzw.
Asparaginsäure
mit Leucin substituiert wurde.
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Wenn
eine Substitution durch Mutation z.B. einer CGTase, die aus einem
Stamm von Bacillus circulans stammt, durchgeführt wird, wird das Produkt
z.B. „B.
circulans/S145A" genannt.
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Alle
Positionen, auf die in dieser Anmeldung mittels CGTase-Nummerierung
Bezug genommen wird, beziehen sich auf die oben beschriebenen CGTase-Nummern.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die beiliegenden
Zeichnungen dargestellt, in denen:
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1 zeigt
eine Darstellung der Substratsbindungsspalte von B. circulans St.
251 CGTase. Die gestrichelten Linien zeigen Wasserstoffbrücken zwischen
dem Enzym (Wasser) und dem Substrat. Die Spaltungsstelle ist zwischen
Glucoserest –1
und 1 definiert.
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Die 2, 3 und 4 zeigen
Cyclodextrine, die während
der Inkubation von (mutierten) CGTase-Proteinen aus Thermoanaerobacterium
thermosulfurigenes gebildet wurden. A. Wildtyp (2);
B. Variante D196H (3); C. Variante D371R (4).
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AUSFÜHRLICHE
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue CGTase-Varianten bereit, d.h.
CGTase-Varianten mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur
nicht gefunden wird. Formell kann die erfindungsgemäße CGTase-Variante als
ein funktionelles Derivat eines Vorläufer-CGTase-Enzyms (d.h. des nativen, elterlichen
oder Wildtyp-Enzyms) durch Substitution, Insertion oder Deletion
eines oder mehrerer Aminosäurerests/e
des Vorläuferenzyms
angesehen werden.
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Im
Zusammenhang mit dieser Erfindung ist eine CGTase-Variante mit erhöhter Produktspezifität eine CGTase-Variante,
die in der Lage ist, einen erhöhten
Anteil eines bestimmten Typs von Cyclodextrin im Vergleich zu dem
Wildtyp-Enzym herzustellen.
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In
einer erfindungsgemäßen CGTase-Variante
wurden ein oder mehrere Aminosäurereste
entsprechend den folgenden Positionen (CGTase-Nummerierung) durch
Substitution und/oder Insertion eingeführt:
- (i)
Position 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 475;
47T; 47V; 47W oder 47Y;
- (ii) Position 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q oder 145V;
- (iii) Position 146: 146H, 146K; 146L; 146T; 146V oder 146Y;
- (iv) Position 147: 147C; 147D; 147E; 147N; 147Q;
- (v) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K;
196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
- (vi) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L;
371M; 371Q; 371R; 371T; 371V oder 371W.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden CGTase-Varianten, die im Hinblick auf die Herstellung von α-Cyclodextrin
eine erhöhte
Produktspezifität
zeigen, bereitgestellt, wobei in die Varianten eine oder mehrere
Aminosäurereste
entsprechend folgender Positionen (CGTase-Nummerierung) durch Substitution und/oder
Insertion eingeführt
wurden:
- (i) Position 47: 47F; 47K; 47R; 47W
oder 47Y;
- (ii) Position 145: 145D; 145H; 145N oder 145Q;
- (iii) Position 146: 146H, 146K; 146L; 146T; 146V oder 146Y;
- (iv) Position 147: 147C; 147D; 147E; 147N; 147Q;
- (v) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K;
196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
- (vi) Position 371: 371C; 371H; 371K; 371R oder 371T.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden CGTase-Varianten, die im Hinblick auf die Herstellung von β-Cyclodextrin
eine erhöhte
Produktspezifität
zeigen, bereitgestellt, wobei in die Varianten eine oder mehrere
Aminosäurereste
entsprechend folgender Positionen (CGTase-Nummerierung) durch Substitution
und/oder Insertion eingeführt
wurden:
- (i) Position 47: 47C; 47D; 47E; 47F;
47G; 47I; 47N; 47P; 475; 47T; 47V; 47W oder 47Y;
- (ii) Position 145: 145D; 145I; 145N oder 145V;
- (iii) Position 147: 147E;
- (iv) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K;
196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
- (v) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L;
371M; 371Q; 371R; 371T; 371V oder 371W.
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In
einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform werden CGTase-Varianten,
die im Hinblick auf die Herstellung von γ-Cyclodextrin eine erhöhte Produktspezifität zeigen,
bereitgestellt, wobei in die Varianten eine oder mehrere Aminosäurereste
entsprechend folgender Positionen (CGTase-Nummerierung) durch Substitution
und/oder Insertion eingeführt
wurden:
- (i) Position 47: 47C; 47D; 47E; 47F;
47G; 47I; 47N; 47P; 475; 47T; 47V; 47W oder 47Y;
- (ii) Position 145: 145D; 145I; 145N oder 145V;
- (iii) Position 147: 147E;
- (iv) Position 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K;
196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W oder 196Y und/oder
- (v) Position 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371K; 371M; 371Q;
371R; 371T oder 371W.
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Die
erfindungsgemäße CGTase-Variante
kann von jedem beliebigen CGTase-Enzym, das in der Natur gefunden
wird, stammen. Allerdings stammt die erfindungsgemäße CGTase-Variante vorzugsweise
von einem mikrobiellen Enzym, bevorzugt einem bakteriellen Enzym
und bevorzugt stammt die CGTase-Variante von einem Stamm von Bacillus,
einem Stamm von Brevibacterium, einem Stamm von Clostridium, einem
Stamm von Corynebacterium, einem Stamm von Klebsiella, einem Stamm
von Micrococcus, einem Stamm von Thermoanaerobium, einem Stamm von
Thermoanaerobacter, einem Stamm von Thermoanaerobacterium, einem Stamm
von Thermoanaerobacterium oder einem Stamm von Thermoactinomyces.
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In
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
stammt die erfindungsgemäße CGTase-Variante von einem
Stamm von Bacillus autolyticus, einem Stamm von Bacillus cereus,
einem Stamm von Bacillus circulans, einem Stamm von Bacillus circulans
var. alkalophilus, einem Stamm von Bacillus coagulans, einem Stamm
von Bacillus firmus, einem Stamm von Bacillus halophilus, einem
Stamm von Bacillus macerans, einem Stamm von Bacillus megaterium,
einem Stamm von Bacillus ohbensis, einem Stamm von Bacillus stearothermophilus,
einem Stamm von Bacillus subtilis, einem Stamm von Klebsiella pneumonia,
einem Stamm von Thermoanaerobacter ethanolicus, einem Stamm von
Thermoanaerobacter finnii, einem Stamm von Clostridium thermoamylolyticum,
einem Stamm von Clostridium thermosaccharolyticum oder einem Stamm
von Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes.
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In
einer am meisten bevorzugten Ausführungsform stammt die erfindungsgemäße CGTase-Variante von
dem Stamm Bacillus sp. Stamm 1011, dem Stamm Bacillus sp. Stamm
38-2, dem Stamm Bacillus sp. Stamm 17-1, dem Stamm Bacillus sp.
1-1, dem Stamm Bacillus sp. Stamm B1018, dem Stamm Bacillus circulans
Stamm 8, dem Stamm Bacillus circulans Stamm 251 oder dem Stamm Thermoanaerobacter
sp. ATCC 53627 oder Mutanten oder Varianten hiervon.
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Wenn
die erfindungsgemäße CGTase-Variante
von einem Stamm von Bacillus circulans stammt, können ein oder mehrere Aminosäurereste
entsprechend der folgenden Positionen eingeführt sein:
- (i)
Position R47: R47C; R47D; R47E; R47F; R47G; R47I; R47K; R47N; R47P;
R47S; R47T; R47V; R47W oder R47Y;
- (ii) Position S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q oder S145
V;
- (iii) Position S146: S146H; S146K; S146L; S146T; S146V oder
S146Y;
- (iv) Position D147: D147C; D147E; D 47N; D147Q;
- (v) Position D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I;
D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W oder
D196Y und/oder
- (vi) Position D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K;
D371L; D371M; D371Q; D371R; D371T; D371V oder D371W.
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Vorzugsweise
stammt die CGTase-Variante von Bacillus circulans Stamm 251 oder
einer Mutante oder Variante hiervon.
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Wenn
die CGTase-Variante von einem Stamm von Thermoanaerobacter sp. stammt,
können
ein oder mehrere Aminosäurereste
entsprechend der folgenden Positionen eingeführt sein:
- (i)
Position K47: K47C; K47D; K47E; K47F; K47G; K47I; K47N; K47P; K47R;
K47S; K47T; K47V; K47W oder K47Y;
- (ii) Position S 145: S 145D; S 145H; S 145I; S 145N; S 145Q
oder S 145 V;
- (iii) Position E146: E146H, E146K; E146L; E146T; E146V oder
E146Y;
- (iv) Position T147: T147C; T147D; T147E; T147N; T147Q;
- (v) Position D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I;
D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W oder
D196Y und/oder
- (vi) Position D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K;
D371L; D371M; D371Q; D371R; D3717; D371V oder D371W.
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Vorzugsweise
stammt die CGTase-Variante von dem Stamm Thermoanaerobacter sp.
ATCC 53627 oder einer Mutante oder Variante hiervon.
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Beispiel
1 beschreibt die Konstruktion der T. thermosulfurigenes CGTase-Varianten
Asp196His (D196H) und Asp371Arg (D371R) mit modifizierter Produktspezifität, in denen
die ortsspezifische Mutagenese zu einer veränderten Anzahl von Wasserstoffbrücken in
der Substratunterbindestelle der Spalte des aktiven Zentrums führte. Die
Varianten stammen von einer Thermoanaerobacter thermosulfurigenes
EM1 CGTase (d.h. dem Wildtyp), der wie von Haeckl und Bahl beschrieben
erhalten wurde [Haeckl, K., und Bahl, H. (1989) FEMS Microbiol.
Lett. 60, 333–338
oder Knegtel R. M. A., Wind R. D., Rozeboom H. J., Kalk K. H., Buitelaar R.
M., Dijkhuizen L., Dijkstra B. W. J. Mol. Biol. 256: 611–622 (1996)].
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
die erfindungsgemäße CGTase-Variante einen oder
mehrere der folgenden Aminosäurereste
(CGTase-Nummerierung):
- (i) 47K/145E/146V/147N;
- (ii) 47K/145E/146E/147N;
- (iii) 47K/145D/146R/147D;
- (iv) 47K/145DI146E/147D;
- (v) 47K/145E/146V/147N/196H;
- (vi) 47K/145E/146E/147N/196H;
- (vii) 47K/145E/146V/147N/196H/371R;
- (viii) 47K/145E/146E/147N/196H/371R;
- (ix) 47K/145D/146R/147D/196H;
- (x) 47K/145D/146E/147D/196H;
- (xi) 47K/145D/146R/147D/196H/371R und/oder
- (xii) 47K/145D/146R/147D/196H/371R.
- (xiii) 47K/196H;
- (xiv) 47R/196H
- (xv) 145E/146V/147N;
- (xvi) 145E/146E/147N;
- (xvii) 145D/146R/147D;
- (xviii) 145D/146E/147D;
- (xix) 47K/371R;
- (xx) 47R/371R;
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Wenn
die CGTase-Variante von einem Stamm von Bacillus circulans stammt,
kann einer oder mehrere der folgenden Aminosäurereste eingeführt sein:
- (i) R47K/S145E/S146V/D147N;
- (ii) R47K/S145E/S146E/D147N;
- (iii) R47K/S145D/S146R;
- (iv) R47K/S145D/S146E;
- (v) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H;
- (vi) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H;
- (vii) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H/D371R;
- (viii) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H/D371R;
- (ix) R47K/S145D/S146R/D196H;
- (x) R47K/S145D/S146E/D196H;
- (xi) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;
- (xii) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R.
- (xiii) R47K/D196H;
- (xiv) S145E/S146V/D147N;
- (xv) S145E/S146E/D147N;
- (xvi) S145D/S146R;
- (xvii) S145D/S146E;
- (xviii) R47K/D371R;
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Vorzugsweise
stammt die CGTase-Variante aus Bacillus circulans Stamm 251 oder
einer Mutante oder Variante hiervon.
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Wenn
die CGTase-Variante von einem Stamm von Thermoanaerobacter sp. stammt,
kann einer oder mehrere der folgenden Aminosäurereste eingeführt sein:
- (i) S145E/E146V/T147N;
- (ii) S145E/T147N;
- (iii) S145D/E146R/T147D;
- (iv) S145D/T147D;
- (v) S145E/E146V/T147N/D196H;
- (vi) S145E/T147N/D196H;
- (vii) S145E/E146V/T147N/D196H/D371R;
- (viii) S145E/T147N/D196H/D371R;
- (ix) S145D/E146R/T147D/D196H;
- (x) S145D/T147D/D196H;
- (xi) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;
- (xii) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R.
- (xiii) S145E/E146V/T147N;
- (xiv) S145E/T147N;
- (xv) S145D/E146R/T147D;
- (xvi) S145D/T147D und/oder
- (xvii) K47R/D371R;
- (xviii) K47R/D196H.
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Vorzugsweise
stammt die CGTase-Variante aus dem Stamm Thermoanaerobacter sp.
ATCC 53627 oder einer Mutante oder Variante hiervon.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen CGTase-Variante zur
Erhöhung
des α- oder β- oder γ-Cyclodextringehalts
eines Cyclodextrin-Endprodukts eines Cyclodextrinverfahrens.
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In
einem letzten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der
Produktspezifität
im Hinblick auf die Herstellung von α- oder β- oder γ-Cyclodextrinen, wobei ein oder
mehrere Aminosäurereste
entsprechend der oben genannten Positionen der erfindungsgemäßen CGTase-Variante
durch Substitution und/oder Insertion eingeführt wurden.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Konstruktion von T. thermosulfurigenes
CGTase-Varianten mit modifizierter Produktspezifität.
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Bakterienstämme, Plasmide
und Wachstumsbedingungen
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Escherichia
coli JM109 [endA1 recA1 gyrA96 thi hsdR17(rK-,mK+) relA1 supE44
(lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZ
M15] (Yanish-Perron et al. 1985 Gene 33, 103–119) wurde für rekombinante
DNA-Manipulationen verwendet. Escherichia coli PC1990 (Lazzaroni
und Portalier 1979 FEMS Microbiol. Lett. 5, 411–416), von dem bekannt ist,
dass es auf Grund einer Mutation in seinem tolB Locus periplasmatische
Proteine in den Überstand
austreten lässt,
wurde zur Herstellung von (mutierten) CGTase-Proteinen verwendet. Das
Plasmid pCT2, ein Derivat von pUC18 enthaltend das amyA Gen von
Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 (Knegtel R. M. A.,
Wind R. D., Rozeboom H. J., Kalk K. H., Buitelaar R. M., Dijkhuizen
L., Dijkstra B. W. J. Mol. Biol. 256: 611–622 (1996)), wurde zur ortsspezifischen
Mutagenese, dem Sequenzieren und der Expression von (mutierten)
CGTase-Proteinen verwendet. Die Plasmid-tragenden Bakterienstämme wurden
auf LB-Medium in Gegenwart von 100 μg/ml Ampicillin wachsen gelassen.
Soweit geeignet wurde IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid) zur
Induktion der Proteinexpression auf eine Konzentration von 0,1 mM
zugegeben.
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DNA-Manipulation
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Die
DNA-Manipulationen und Transformationen von E. coli wurden im Wesentlichen
wie von Sambrook et al. [Sambrook, J., Fritsch, E. J., und Maniatis,
T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York] beschrieben durchgeführt. Die Transformation von
E. coli durch Elektroporation wurde unter Verwendung eines Bio-Rad
Genpulserapparats durchgeführt
(Bio-Rad, Veenendaal, Niederlande). Die ausgewählten Bedingungen waren 2,5
kV, 25 μF
und 200 Ω.
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Ortsspezifische Mutagenese
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Mutierte
CGTase-Gene wurden mittels doppeltem PCR-Verfahren unter Verwendung
der Pfu-DNA-Polymerase von Stratagene (Westburg, Leusden, Niederlande)
konstruiert. Eine erste PCR-Reaktion wurde mit dem Mutagenese-Primer
für den
kodierenden Strang plus einem Primer 195–715 bp stromabwärts auf
dem Matrizenstrang durchgeführt.
Das Reaktionsprodukt wurde anschließend als ein Primer in einer
zweiten PCR-Reaktion zusammen mit einem Primer 295–815 bp
stromaufwärts
auf dem kodierenden Strang verwendet. Das Produkt der letzteren
Reaktion wurde mit NcoI und MunI geschnitten und durch das entsprechende
Fragment (900 bp) aus dem Vektor pCT2 ausgetauscht. Das resultierende
(mutierte) Plasmid wurde in E. coli JM109 zum Sequenzieren und E.
coli PC1990 zur Herstellung der (mutierten) Proteine transformiert.
Die folgenden Oligonukleotide wurden verwendet:
D196H 5'-CGTAACTTATTTCATTTAGCAGATCTAAATCAACAG-3'
(SEQ ID Nr.
1)
D371R 5'-GACAGGCAATGGACGTCCTTATAATAGAGC-3'
(SEQ ID Nr.
2).
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Erfolgreiche
Mutationen resultierten in den unterstrichenen Restriktionsschnittstellen
(BGlII für
D196H und AatII für
D371R), was ein schnelles Screenen nach Transformanten erlaubt.
Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt (Sanger
et al. 1977 Proc Natl. Sci. USA 74, 5463–5467). Die gesamten 900 bp auf
dem MunI-NcoI-Fragment, die durch PCR erhalten wurden, wurden durch
DNA-Sequenzierung überprüft.
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Herstellung und Reinigung
von CGTase-Proteinen
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Zur
Herstellung von CGTase-Proteinen wurde E. coli PC1990 in einem 2-Liter
Fermentor bei pH 7,0 und 30°C
wachsen gelassen. Das Medium enthielt 2% (Gew/Gew) Trypton (Oxoid,
Boom BV, Meppel, Niederlande), 1% (Gew/Gew) Hefeextrakt (Oxoid),
1 (Gew/Gew) Natriumchlorid, 1% (Gew/Gew) Caseinhydrolysat (Merck,
Darmstadt, Deutschland), 100 μg/l
Ampicillin und 0,1 mM IPTG. Das Wachstum wurde durch Messen der
optischen Dichte bei 450 nm beobachtet. Wenn die optische Dichte
bei 450 nm 2 bis 3 erreichte, wurde eine zusätzliche Menge von 50 g Trypton
zu dem Fermentor zugegeben. Die Zellen wurden nach 20–24 Stunden
des Wachstums bei einer optischen Dichte von 8–12 geerntet (8000 g, 30 Minuten,
4°C) und
der Überstand wurde
zur weiteren Reinigung der CGTasen verwendet. Der Überstand
wurde unmittelbar auf eine α-CD-Sepharose-6FF-Affinitätssäule aufgebracht
(Monma et al. 1988 Biotechnol. Bioeng. 32, 404–407). Nach dem Waschen der
Säule mit
10 mM Natriumacetat (pH 5,5) wurde die CGTase mit dem gleichen Puffer,
der mit 1% (Gew/Gew) α-CD
supplementiert war, eluiert. Die Reinheit und das Molekulargewicht
der (mutierten) CGTase-Proteine wurden auf SDS-PAGE überprüft (Wind
et al. 1995 Appl. Environ. Microb. 61, 1257–1265). Die Proteinkonzentrationen
wurden durch das Verfahren von Bradford unter Verwendung des „Coomassie" Protein-Testreagenz
von Pierce (Pierce Europe bv, Oud-Beijerland, Niederlande) bestimmt.
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Enzymtests
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Alle
Tests wurden einheitlich bei pH 6,0 und 50°C durchgeführt. Cyclisierungs- und Verzuckerungstests
wurden wie von Penninga et al. (Penninga, D., Strokopytov, B., Rozeboom,
H. J., Lawson, C. L., Dijkstra, B. W., Bergsma, J., und Dijkhuizen,
L. (1995) Biochemistry 34, 3368–3376)
beschrieben durchgeführt.
Die Einheiten für
die verschiedenen Reaktionen sind definiert als die Menge an Enzym,
die 1 μmol
Substrat bei pH 6,0 und 50°C
produziert.
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HPLC-Produkt-Analyse
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Die
Bildung von Cyclodextrinen wurde unter industriellen Verfahrensbedingungen
durch Inkubieren von 0,1 U/ml CGTase (β-CD-bildende Aktivität) mit 10%
Paselli WA4 (prägelatinisierte
trommelgetrocknete Stärke
mit einem hohen Polymerisationsgrad; AVEBE, Niederlande) in 10 mM
Natriumcitrat-Puffer (pH 6,0) bei 60°C für 45 Stunden gemessen. In regelmäßigen Zeitabständen wurden
Proben genommen und für
10 Minuten gekocht. Die gebildeten Produkte wurden durch HPLC unter
Verwendung einer 25-cm Econosil-NH2 10-μm Säule (Alltech Nederland bv,
Breda, Niederlande), die mit Acetonitril-Wasser (65:45) mit 1 ml/Minute eluiert
wurde, analysiert. Die Produkte wurden durch einen Brechungsindexdetektor
(Waters 410, Waters Chromatography Division, Milford, USA) nachgewiesen.
Die Temperatur der Fließzelle
und Säule
wurde auf 50°C
festgesetzt, um eine mögliche
Präzipitation
der Stärke
zu vermeiden. Die Bildung linearer Produkte wurde unmittelbar analysiert.
Die Bildung von CDs wurde nach Inkubation der Proben mit einer geeigneten
Menge an β-Amylase
(Typ I-B aus Süßkartoffel,
Sigma, Boom BV, Meppel, Niederlande) analysiert.
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Cyclodextrin-Produktspezifität
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Um
die Produktspezifität
der Thermoanaerobacterium CGTase zu verändern, ersetzten wir Asp196 durch
His (D196H) und Asp371 durch Arg (D371R). In der Mutante D196H war
die Produktion von α-CD
auf Kosten der Herstellung von β-CD
im Vergleich zur Wildtyp-CGTase
erhöht
(2). Das Cyclodextrin-Produktverhältnis war
von 28:58:14 (α:β:γ) für die Wildtyp-CGTase
auf 35:49:16 für
die Mutante D196H verändert
(Tabelle 1). Dieses entspricht den Erwartungen auf Grundlage der
strukturellen Arbeiten. Durch Ersetzen von Asp197 mit His wird ein
größerer Rest
eingeführt,
was den so genannten Bindungsmodus für gerade Substrate blockieren
würde.
Darüber
hinaus ist His 197 wahrscheinlich auch in der Lage, Wasserstoffbrücken mit
dem in dem „gebogenen" Modus gebunden Produkt
zu bilden. Diese Ergebnisse stärken
die Theorie, dass die gebogene Konformation mit einer α-Cyclodextrin-Herstellung
verbunden ist und zeigen, dass sie verwendet werden kann, um durch
rationale Überlegungen
eine CGTase mit gewünschter
Produktspezifität
technisch herzustellen.
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Tabelle
1: Stärkeumwandlung
von T. thermosulfurigenes Wildtyp- und mutierten CGTase-Proteinen. Proteine (0,1
U/ml β-CD-bildende
Aktivität)
wurden für
45 Stunden bei pH 6,0 und 60°C
mit 10% Paselli WA4 inkubiert.
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Asp371
hat eine sehr wichtige Rolle bei der Substratbindung von Substratunterbindedomäne 2 sowohl bei
der BC251- als auch bei der Tabium-CGTase. Das Ersetzen von Asp371
durch Arg resultiert in der Einführung
einer sehr sperrigen Aminosäure,
die wahrscheinlich ernstlich in die Bindung jeglicher Art von Substraten bei
Substratunterbindedomäne
2 eingreifen würde,
wodurch der Gesamtabfall an Aktivität zu erklären ist. Abgesehen von dieser
geringen Aktivität
war das Produktverhältnis
von 28:58:14 für
das Wildtyp-Enzym auf 6:68:26 für
die Mutante D371H geändert
(Tabelle 1, 2). Dies legt nahe, dass die
Cyclisierungsreaktion, die zu einem α-Cyclodextrin führt, durch
das Arg371 stärker
behindert wird als die anderen Cyclisierungsreaktionen. Wahrscheinlich
behindert dieser sperrige Rest die „gebogene" Konformation sterisch. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die Tabium-CGTase durch nur eine Mutation von einem α/β-Cyclodextrinproduzenten
zu einem β/γ-Cyclodextrinproduzenten
geändert
werden kann, was die Umsetzbarkeit des CGTase-Protein-Engineerings
veranschaulicht.
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Die
Erfindung ist mit Bezug auf die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht,
von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie in irgend einer Weise
den Umfang der Erfindung wie beansprucht begrenzen sollen.
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