JP2009028048A - 新規シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ変異体 - Google Patents

新規シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ変異体 Download PDF

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Abstract

【課題】新規なシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼの変異体の提供。
【解決手段】発明は、高められた生成物特異性を有するシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼの変異体に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、高められた生成物特異性のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼの変異体に関する。
シクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ又はシクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼとも呼ばれているシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ（CGTアーゼ）（E.C.2.4.1.19 ）は、分子内トランスグリコシル化反応を通してスターチ及び類似する基質のシクロマルトデキストリンへの転換を触媒し、それにより、種々のサイズのシクロマルトデキストリン（シクロデキストリン、又はCDと称する）を形成する。それぞれα−、β−及びγ−シクロデキストリンと称する、６，７及び８個のグルコース単位のシクロデキストリンは、商業的に最も重要である。
それぞれ、δ−、ε−及びζ−シクロデキストリンと称する、９，１０及び１１個のグルコース単位のシクロデキストリンは、商業的にあまり重要ではない。従って、シクロデキストリンは、疎水性内部腔を有する環状グルコースオリゴマーである。それらは、水溶液において多くの小さな疎水性分子を有する封入複合体を形成することができ、物性の変化、たとえば高められた溶解性及び安定性、及び低められた化学反応及び揮発性をもたらす。シクロデキストリンは、食品、化粧品、化学及び医薬産業に特に適用できる。
ほとんどのCGTアーゼは、スターチ−分解活性及びトランスグリコシル化活性の両者を有する。いくつかのCGTアーゼは主にα−シクロデキストリンを生成し、そしていくつかのCGTアーゼは主にβ−シクロデキストリンを生成するが、CGTアーゼは通常、α−、β−及びγ−シクロデキストリンの混合物を形成する。有機溶媒による選択的沈殿段階が、別々のα−、β−及びγ−シクロデキストリンの単離のために使用され得る。高価な及び環境的に有害な方法を回避するためには、特にα−、β−又はγ−シクロデキストリンに関して、高められた割合の１つの特定タイプのシクロデキストリンを生成することができるCGTアーゼの有用性が所望される。
WO96/33267号（Novo Nordisk）は、修飾された基質結合及び/又は生成物選択性を示すCGTアーゼ変異体を記載する。位置 47, 145, 146, 147, 196 又は371での突然変異により生成されるCGTアーゼ変異体は記載されているが、本発明の特定のCGTアーゼ変異体は決して記載されておらず、又は提案されてさえもいない。
発明の要約
本発明は、高められた生成物特異性の新規CGTアーゼ変異体を提供している。高められた生成物特異性のCGTアーゼ変異体は従来技術（WO 96/33267 号）に記載されているが、本発明のCGTアーゼ変異体はこれまで決して記載されても又は提案されてもいない。
非常に多数の可能性あるCGTアーゼ変異体の中で、本発明者は現在、野生型酵素に比較される場合、高められた生成物特異性を示す限定された数の変異体の発見に成功している。
従って、本発明は、高められた生成物特異性のCGTアーゼ変異体を提供し、ここで下記位置の対応するアミノ酸残基の１又は複数の残基が置換及び/又は挿入により導入されている（CGTアーゼ番号付け）：
(i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 47S; 47T;47V; 47W; もしくは 47Y;
(ii) 位置 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q; もしくは145V;
(iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y;
(iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q;
(v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は
(vi) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M;371Q; 371R; 371T; 371V; もしくは 371W。
アミノ酸：
本発明においては、アミノ酸及びアミノ酸残基について、次の記号及び略語が使用される：
A = Ala = アラニン
C = Cys = システイン
D = Asp = アスパラギン酸
E = Glu = グルタミン酸
F = Phe = フェニルアラニン
G = Gly = グリシン
H = His = ヒスチジン
I = Ile = イソロイシン
K = Lys = リジン
L = Leu = ロイシン
M = Met = メチオニン
N = Asn = アスパラギン
P = Pro = プロリン
Q = Gln = グルタミン
R = Arg = アルギニン
S = Ser = セリン
T = Thr = トレオニン
V = Val = バリン
W = Trp = トリプトファン
Y = Tyr = チロシン
B = Asx = Asp又は Asn
Z = Glx = Glu 又は Gln
X = Xaa = いずれかのアミノ酸
★ = 欠失又は不在のアミノ酸。
CGTアーゼ変異体：
本発明のCGTアーゼ変異体は、天然においては見出されていないアミノ酸配列を有する、CGTアーゼ変異体又は突然変異誘発されたCGTアーゼである。本発明のCGTアーゼ変異体又は突然変異誘発されたCGTアーゼは、前駆体CGTアーゼ酵素（すなわち、天然、親又は野生型酵素）の機能的誘導体であると思われ、そして前駆体酵素をコードする、前駆体遺伝子又はその誘導体のDNA又はヌクレオチド配列の変更により得られる。
CGTアーゼ変異体又は突然変異誘発されたCGTアーゼは、CGTアーゼ変異体をコードするDNAヌクレオチド配列が適切な宿主生物における適切なベクター中に挿入される場合、発現され、そして生成され得る。宿主生物は、前駆体遺伝子が起因する生成物と必ずしも同一である必要はない。文献においては、酵素変異体はまた、変異株又はムテインとしても言及されて来た。
CGTアーゼ番号付け：
本発明においては、CGTアーゼ酵素におけるアミノ酸残基位置の特定の番号付けが使用される。種々の既知CGTアーゼのアミノ酸配列の整列により、アミノ酸配列が知られているいずれかのCGTアーゼ酵素におけるいずれかのアミノ酸残基位置にCGTアーゼアミノ酸位置を明白に割り当てることが可能である。
多くの他の既知CGTアーゼのアミノ酸配列と整列される、バチルス・サーキュランス 251株から得られるCGTアーゼのアミノ酸配列に起因する番号付けシステムを用いて、CGTアーゼ酵素におけるアミノ酸残基の位置を明白に示すことが可能である。
このCGTアーゼ番号付けシステムは、WO 96/33267 に記載されており、表１、ページ９−３１（この表においては、バチルス・サーキュランス 251株がａとして表されている）を参照のこと。WO96/33267 の表１はまた、多くの相当のCGTアーゼのタンパク質配列を示し、そして引用により本明細書に組み込まれる。
本発明に従って生成され、又は企画される種々のCGTアーゼ変異体を記載する場合、次の命名法が参照を容易にするために適合される：
[元のアミノ酸；位置；置換されたアミノ酸]。従って、位置145 におけるアラニンによるセリンの置換は、S145Aとして命名される。
バチルス・サーキュランス 251株からのCGTアーゼのアミノ酸配列に関して挿入を表すアミノ酸残基は、前のCGTアーゼ番号、たとえばサーモアナエロバクター sp. ATCC53627 からのCGTアーゼのアミノ酸配列の位置91でのThr と位置92でのGlyとの間の“挿入体”Pheのための位置91aFに、アルファベット順に文字の追加により番号付けられる；表１を参照のこと（１）。
位置149 でのプロリンの欠失は、P149・として示され、そしてアミノ酸残基が存在しない、位置147と148との間の挿入は、位置147aにおけるアスパラギン酸の挿入のためには・147aDとして示される。
複数の突然変異は、スラッシュ記号（“/”）、たとえばS145A/D147Lにより分離され、それは、それぞれアラニンによりセリンを及びロイシンによりアスパラギン酸を置換する位置145及び147での突然変異を表す。
置換が、たとえばバチルス・サーキュランスの株に由来するCGTアーゼにおける突然変異により行われる場合、その生成物は、たとえば“B.サーキュランス/S145A”として命名される。
CGTアーゼ番号付けによる本出願において言及されるすべての位置は、上記CGTアーゼ番号を意味する。
発明の特定の開示
本発明は、新規CGTアーゼ変異体、すなわち天然において見出されないアミノ酸配列を有するCGTアーゼ変異体を提供する。形式的には、本発明のCGTアーゼ変異体は、前駆体酵素の１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失による前駆体CGTアーゼ酵素（すなわち、天然、親又は野生型酵素）の機能的誘導体として見なされ得る。
本発明においては、高められた生成物特異性のCGTアーゼ変異体は、野生型酵素に比較される場合、高められた割合の１つの特定タイプのシクロデキストリンを生成できるCGTアーゼ変異体である。
本発明のCGTアーゼ変異体においては、次の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が、置換/又は挿入により導入されている（CGTアーゼ番号付け）：
(i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 47S; 47T;47V; 47W; もしくは 47Y;
(ii) 位置 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q; もしくは145V;
(iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y;
(iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q;
(v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は
(vi) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M;371Q; 371R; 371T; 371V; もしくは 371W。
好ましい態様においては、α−シクロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示すCGTアーゼ変異体が提供され、ここでその変異体においては、次の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が置換及び/又は挿入により導入されている（CGTアーゼ番号付け）：
(i) 位置 47: 47F; 47K; 47R; 47W; もしくは 47Y;
(ii) 位置 145: 145D; 145H; 145N; もしくは 145Q;
(iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y;
(iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q;
(v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P;196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは196Y 、及び/又は
(vi) 位置 371: 371C; 371H; 371K; 371R; もしくは 371T。
好ましい態様においては、β−シクロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示すCGTアーゼ変異体が提供され、ここでその変異体においては、次の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が置換及び/又は挿入により導入されている（CGTアーゼ番号付け）：
(i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I 47N; 47P; 47S; 47T; 47V; 47W; もしくは 47Y;
(ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V;
(iii) 位置 147:147E;
(iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は
(v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M; 371Q; 371R; 371T; 371V; もしくは 371W。
好ましい態様においては、γ−シクロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示すCGTアーゼ変異体が提供され、ここでその変異体においては、次の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が置換及び/又は挿入により導入されている（CGTアーゼ番号付け）：
(i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47N; 47P; 47S; 47T; 47V; 47W; もしくは 47Y;
(ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V;
(iii) 位置 147: 147E;
(iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は
(v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371K; 371M; 371Q; 371R; 371T; もしくは 371W。
本発明のCGTアーゼ変異体は、天然において見出されるいずれかのCGTアーゼ酵素から誘導され得る。しかしながら、本発明のCGTアーゼ変異体は好ましくは、微生物酵素、好ましくは細菌酵素から誘導され、そして好ましくは、CGTアーゼ変異体は、バチルス（Bacillus）の株、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）の株、クロストリジウム（Clostridium）の株、コリネバクテリウム（Corynebacterium）の株、クレブシエラ（Klebsiella）の株、ミクロコーカス（Micrococcus）の株、サーモアナエロビウム（Thermoanaerobium）の株、サーモアナエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）の株、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）の株、又はサーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）の株から誘導される。
より好ましい態様においては、本発明のCGTアーゼ変異体は、バチルス・オートリチカス（Bacillus autolyticus）の株、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）の株、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）の株、バチルス・サーキュランス var. アルカロフィラス（Bacillus circulans var. alkalophilus）の株、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans ）の株、バチルス・フィルマス（Bacillus firmus ）の株、バチルス・ハロフィラス（Bacillus halophilus）の株、バチルス・マセランス（Bacillus macerans）の株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）の株、
バチルス・オーベンシス（Bacillus ohbensis）の株、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）の株、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）の株、クレビシエラ・プネウモニ (Klebsiella pneumonia）の株、サーモアナエロバクター・エタノエイカス（Thermoanaerobacter ethanolicus ）の株、サーモアナエロバクター・フィニイ（Thermoanaerobacter finnii）の株、クロストリジウム・サーモアミロリチカム（Clostridium thermoamylolyticum）の株、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム（Clostridium thermosaccharolyticum）の株、又はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Thermoanaerobacterium thrmosulfurigenes）の株から誘導される。
最も好ましい態様においては、本発明のCGTアーゼ変異体は、バチルスsp.1011株, バチルス sp.38-2株, バチルス sp.17-1株, バチルス sp.1-1株, バチルス sp.B1018株、バチルス・サーキュランス８株もしくはバチラス・サーキュランス 251株, 又はそれらの変異株もしくは変異体から誘導される。
本発明のCGTアーゼ変異体がバチルス・サーキュランスの株から誘導される場合、次の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が導入され得る：
(i) 位置 R47: R47C; R47D; R47E; R47F; R47G; R47I; R47K; R47N; R47P; R47S; R47T; R47V; R47W; もしくは R47Y;
(ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V;
(iii) 位置 S146: S146H; S146K; S146L; S146T; S146V; もしくは S146Y;
(iv) 位置 D147: D147C; D147E; D147N; もしくはD147Q;
(v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/又は
(vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W。
好ましくは、CGTアーゼ変異体は、バチルス・サーキュランス 251株, 又はその変異株もしくは変異体から誘導される。
CGTアーゼ変異体がサーモアナエロバクター sp. の株から誘導される場合、次の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が導入されえる：
(i) 位置 K47: K47C; K47D; K47E; K47F; K47G; K47I; K47N; K47P; K47R; K47S; K47T; K47V; K47W; もしくは K47Y;
(ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V;
(iii) 位置 E146: E146H; E146K; E146L; E146T; E146V; もしくは E146Y;
(iv) 位置 T147: T147C; T147D; T147E; T147N; もしくはT147Q;
(v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/又は
(vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W。
好ましくは、CGTアーゼ変異体は、サーモアエロバクター sp. ATCC 53627, 又はその変異株もしくは変異体から誘導される。
例１は、改良された生成物特異性を有するサーモアナエロバクター・サーモスルフルゲネスCGTアーゼ変異体Asp196His (D196H) 及びAsp371Arg (D371R) の構成を記載しており、ここにおいて、特定部位の突然変異誘発が活性部位分解のサブサイトにおける変更された数の水素結合を誘導されている。変異体は、Haeckel and Bahl [ Haeckel, K., and Bahl, H. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60, 333-338 又はKnegtel R.M.A., Wind R.D., Rozeboom H.J., Kelk K.H., Buitelaar R.M., Dijkhuizen L., Dijkstra B.W.J. Mol. Biol. 256: 611-622 (1996) ] により記載のようにして得られたサーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネスEM1 CGTアーゼ（すなわち野生型）から誘導される。
もう１つの態様においては、本発明のCGTアーゼ変異体は、１又は複数の次のアミノ酸残基を含んで成る（CGTアーゼ番号付け）：
(i) 47K/145E/146V/147N;
(ii) 47K/145E/146E/147N;
(iii) 47K/145D/146R/147D;
(iv) 47K/145D/146E/147D;
(v) 47K/145E/146V/147N/196H;
(vi) 47K/145E/146E/147N/196H;
(vii) 47K/145E/146V/147N/196H/371R;
(viii) 47K/145E/146E/147N/196H/371R;
(ix) 47K/145D/146R/147D/196H;
(x) 47K/145D/146E/147D/196H;
(xi) 47K/145D/146R/147D/196H/371R;
(xii) 47K/145D/146R/147D/196H/371R;
(xiii) 47K/196H;
(xiv) 47R/196H;
(xv) 145E/146V/147N;
(xvi) 145E/146E/147N;
(xvii) 145D/146R/147D;
(xviii) 145D/146E/147D;
(xix) 47K/371R 、及び/又は
(xx) 47R/371R。
CGTアーゼ変異体がバチルス・サーキュランスの株から誘導される場合、１又は複数の次のアミノ酸残基が導入されている：
(i) R47K/S145E/S146V/D147N;
(ii) R47K/S145E/S146E/D147N;
(iii) R47K/S145D/S146R;
(iv) R47K/S145D/S146E;
(v) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H;
(vi) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H;
(vii) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H/D371R;
(viii) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H/D371R;
(ix) R47K/S145D/S146R/D196H;
(x) R47K/S145D/S146E/D196H;
(xi) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;
(xii) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;
(xiii) R47K/D196H;
(xiv) S145E/S146V/D147N;
(xv) S145E/S146E/D147N;
(xvi) S145D/S146R;
(xvii) S145D/S146E;
(xviii) R47K/D371R。
好ましくは、CGTアーゼ変異体は、バチルス・サーキュランス 251株, 又はその変異株もしくは変異体から誘導される。
CGTアーゼ変異体がサーモアナエロバクター sp. の株から誘導される場合、１又は複数の次のアミノ酸残基が導入され得る：
(i) S145E/E146V/T147N;
(ii) SI45E/T147N;
(iii) S145D/E146R/T147D;
(iv) S145D/T147D;
(v) S145E/E146V/T147N/D196H;
(vi) S145E/T147N/D196H;
(vii) S145E/E146V/T147N/D196H/D371R;
(viii) S145E/T147N/D196H/D371R;
(ix) S145D/E146R/T147D/D196H;
(x) S145D/T147D/D196H;
(xi) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;
(xii) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;
(xiii) S145E/E146V/T147N;
(xiv) S145E/T147N;
(xv) S145D/E146R/T147D;
(xvi) S145D/T147D;
(xvii) K47R/D371R; 及び/又は
(xviii) K47R/D196H。
好ましくは、CGTアーゼ変異体は、サーモアナエロバクター sp. ATCC 53627, 又はその変異株もしくは変異体から誘導される。
さらなる観点においては、本発明は、シクロデキストリン工程の最終シクロデキストリン生成物のα又はβ又はγ−シクロデキストリン含有率を高めるためへの本発明のCGTアーゼ変異体の使用に関する。
最終の観点においては、本発明は、α又はβ又はγ−シクロデキストリンの生成に関して生成物特異性を高めるための方法に関し、ここで上記で言及された本発明のCGTアーゼ変異体の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が、置換及び/又は挿入により導入されている。
例
例１．改良された生成物特異性を有するサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネスCGTアーゼ変異体の構成
細菌株、プラスミド及び増殖条件：
エスシェリチア・コリ（Escherichia coli）JM109 [ endA1 recA2 gyrA96 thi hsdR17 (rk-, mK+) relA1 supE4 (lac-proAB) ] [ F’ traD36 proAB lacIgZ M15 ] (Yanish-Rerron など.1985 Gene 33, 103-109) を、組換えDNA操作のために使用した。そのtalB 遺伝子座における突然変異のために、上清液中にペリプラズムタンパク質を漏出することが知られているエスシェリチア・コリPC 1990 (Lazzaroni and Portalier 1979 FEMS Microbiol. Lett. 5, 411-416) を、CGTアーゼ（変異体）タンパク質の生成のために使用した。
プラスミドpCT2, すなわちサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチウムEM1を含むpUC18の誘導体（Knegtel R.M.A., Wind R.D., Rozeboom H.J., Kalk., Buitelaar R.M., Dikhuizen L., Dijkstra B.W., J. Mol. Biol. 256: 611-622 (1996) を、CGTアーゼ（変異体）タンパク質の特定部位の突然変異誘発、配列決定及び発現のために使用した。プラスミド担持の菌株を、100μg/mgのアンピシリンの存在下でLB培地上で増殖した。適切な場合、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）を、タンパク質発現の誘発のために、0.1mMの濃度で添加した。
DNA操作：
エスシェリチア・コリのDNA 操作及び形質転換は、Sambrook など.[ Sambrook, J., Fritsch, E.J., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold spring Harbor Laboratory Press, New York ] により実質的に記載の通りであった。エレクトロポレーションによるエスシェリチア・コリの形質転換を、Bio-Rad 遺伝子パルサー装置（Bio-Rad, Veenendaal, The Netherlands ）を用いて実施した。選択された条件は、2.5kV, 25μF 及びΩであった。
特定部位の突然変異誘発：
変異体CGTアーゼ遺伝子を、Stratagene (Westburg, Leusden, The Netherlands)からのpfu DNA ポリメラーゼを用いての二重PCR方法を通して構成した。最初のPCR反応を、コーバ鎖のための突然変異誘発プライマー、及び鋳型鎖上の195〜715bp 下流のプライマーを用いて実施した。
続いて、反応生成物を、コード鎖上の295〜815bp 下流のプライマーと共に、第２PCR反応においてプライマーとして使用した。最終反応の生成物を、NcoI及びMunIにより切断し、そしてベクターpCT２からのその対応するフラグメント（900bp）により交換した。その得られる（変異体）プラスミドを、配列決定のためにエスシェリチア・コリJM109に対して、及び（変異体）タンパク質の生成のためのエスシェリチア・コリpc1990に対して形質転換した。
次のオリゴヌクレオチドを使用した：
D196H 5’-CGTAACTTATTTCATTTAGCAGATCTAAATCAACAG-3’ （配列番号１）
D371R 5’-GACAGGCAATGGACGTCCTTATAATAGAGC-3’ （配列番号２）。
好結果を生む突然変異誘発は、形質転換体のすばやいスクリーニングを可能にする下線の制限部位（D196HのためのBgl II 及びD371RのためのAatII）をもたらした。突然変異を、DNA配列決定により確かめた（Sanger など., 1977, Proc. Natl. Sci. USA 74, 5463-5467）。PCRにより得られたMunI-NcoIフラグメント上のすべての900bpを、DNA−配列決定により調べた。
CGTアーゼタンパク質の生成及び精製：
CGTアーゼタンパク質の生成のために、エスシェリチア・コリPC1990を、pH7.0及び30℃で、２Lの発酵器において増殖した。培地は、２％（w/w）のトリプシン（Oxoid, Boom BV, Meppel, the Netherlands）、1％（w/w）の酵母抽出物（Oxoid）, 1％（w/w）の塩化ナトリウム、1％（w/w）のカゼイン加水分分解物（Merck, Darmstadt, Germany）、100μg/lのアンピシリン及び0.1nM のIPTGを含んだ。
増殖を、450nmでの光学密度を測定することによってモニターした。450nmでの光学密度が2〜3に達した場合、50gの追加量のトリプインを、発行器に添加した。細胞を、8〜12の光学密度で、20〜24時間の増殖（ 8,000g, 30, 4℃ ）の後、収穫し、そして上清液を、CGTアーゼのさらなる精製のために使用した。上清液を、α−CD−セファロース−6FF 親和性カラム（Monma など., 1988, Biotechnol. Bioeng. 32, 404-407）に直接的に適用した。
10nM の酢酸ナトリウム（pH 5.5）によりカラムを清浄した後、CGTアーゼを、１％（w/w）のαCDにより補充された同じ緩衝液により溶出した。CGTアーゼ（変異体）タンパク質の純度及び分子量を、SDS-PAGE（Wind など., 1995, APPl. Environ. Microb. 61, 1257-1265）上で調べた。タンパク質濃度を、Pierce (Pierce Europe bv, Oud-Beijerland, The Netherlands ) のクーマシータンパク質アッセイ試薬を用いて、Bradford の方法により決定した。
酵素アッセイ：
すべてのアッセイは、pH6.0及び50℃で標準的に実施した。環化及び糖化アッセイを、Penninga など., ( Penninga, D., Strokopytov, B., Rozeboom, H.J., Lawson, C.L., Dijkstra, B.W., Bergsma, J., and Dijkhuizen, L. (1995) Biochemistry 34, 3368-3376) により記載のようにして実施した。異なった反応のための単位は、pH6.0及び50℃で1μモルの基質で生成する酵素の量として定義された。
HPLC生成物の分析：
シクロデキストリンの形成を、10mM のクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）において、0.1U/ml のCGTアーゼ（β−CD形成活性）及び10％のPaselli；WA4（高い程度の重合を有するプレゲル化され、ドラム−乾燥されたスターチ；AVEBE, The Netherlands）と共に、60℃で45時間、インキュベートすることによって、産業的工程条件下で測定した。サンプルを規則的な時間間隔で採取し、そして10分間、煮沸した。
形成される生成物を、1ml/分でアセトニトリル−水（65:45）により溶出される、25−cmのEconosil-NH2 10-μmカラム（Alltech Netherland bv, Breda, The Netherlands）を用いてのHPLCにより分析した。生成物を、屈折率検出器（Waters 410, Waters Chromatography Division, Milford, USA）により検出した。流動細胞及びカラムの温度を50℃で設定し、スターチの可能性ある沈殿を回避した。線状生成物の形成を直接的に分析した。CDの形成を、適切な量のβ−アミラーゼ（サツマイモからのタイプ・I−B, Sigma, Boom BV, Meppel, The Netherlands）と共にサンプルをインキュベートした後、分析した。
シクロデキストリン生成物特異性：
サーモアナエロバクテリウムCGTアーゼの生成物特異性を変えるために、本発明者は、HisによりAps196を置換し（D196H）、そしてArgによりAps371を置換した（D371R）。変異体D196Hにおいては、α−CDの生成が、野生型CGTアーゼに比較して、β−CDの生成を犠牲にして高められた（図２）。シクロデキストリン生成物比を、野生型CGTアーゼについての28：58：14（α：β：γ）から変異体D196Hについての35：49：16に変更した（表１）。
これは、構造研究に基づく予測に従っている。HisによるAsp196の置換により、より大きな残基が導入され、これは、いわゆる直線基質結合態様を阻止する。さらに、His197はまた、たぶん、“湾曲（bent）”態様で結合される基質と水素結合を形成することができる。それらの結果は、湾曲形状がα−シクロデキストリン生成と相互関係している理論により強く傾向し、そしてそれが所望する生成物特異性を有するCGTアーゼを合理的に構築するために使用され得ることを示す。
Figure 2009028048
タンパク質（0.1U/mlのβ−CD形成活性）を、10％のPasell; WA4と共に、PH6.0及び60℃で45時間インキュベートした。
Asp371は、BC251及びTabium CGTアーゼの両者において、サブサイト2での基質結合において非常に重要な役割を有する。ArgによるASP371の置換は、サブサイト2でのすべての種類の基質の結合性を重度にたぶん妨害する非常に大きなアミノ酸の導入をもたらし、それにより、活性の全体的な低下を説明する。この低い活性とは異なって、生成物比は、野生型酵素についての28:58:14から変異体D371Hについての6:68:26に変更した（表１、図２）。
これは、α−シクロデキストリンを導く環化反応が他の環化反応よりも、Arg 371により一層、妨害されることを示唆する。たぶん、この大きな残基は、“湾曲”形状を立体的に妨害している。それらの結果は、Tabium CGTアーゼが、わずか1つの突然変異によりα/β−シクロデキストリン生成体からβ/γ−シクロデキストリン生成体に変更したことを示す、これはCGTアーゼタンパク質構築の実行可能性を例示する。
本発明は、例によって例示されてきたが、但しそれらは本発明を制限するものではない。
図１は、バチルス・サーキュランス 251株の CGTアーゼの基質結合分解の図を示す。点線は、酵素（水）と基質との間だの水素結合を示す。分解点は、グルコース残基 −１と1との間に定義される。 図２は、サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネスからの（変異体）CGTアーゼタンパク質のインキュベーションの間に形成されるシクロデキストリンを示す。A.野生型。 図３は、サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネスからの（変異体）CGTアーゼタンパク質のインキュベーションの間に形成されるシクロデキストリンを示す。B.変異体D196H。 図４は、サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネスからの（変異体）CGTアーゼタンパク質のインキュベーションの間に形成されるシクロデキストリンを示す。C.変異体D371R。

Claims (28)

  1. 高められた生成物特異性のCGTアーゼ変異体であって、次の位置に対応するアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 47S; 47T;47V; 47W; もしくは 47Y;
    (ii) 位置 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q; もしくは145V;
    (iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y;
    (iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q;
    (v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は
    (vi) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M;371Q; 371R; 371T; 371V; もしくは 371W 、
    中の１又は複数の残基が、置換及び/又は挿入により導入されているCGTアーゼ変異体。
  2. K47Rである請求項１記載のCGTアーゼ変異体。
  3. D196Hである請求項１記載のCGTアーゼ変異体。
  4. D371Rである請求項１記載のCGTアーゼ変異体。
  5. 次の位置に対応するアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) 位置 47: 47F; 47K; 47R; 47W; もしくは 47Y;
    (ii) 位置 145: 145D; 145H; 145N; もしくは 145Q;
    (iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y;
    (iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q;
    (v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P;196Q; 196R; 196T; 196V; 196W;もしくは196Y 、及び/又は
    (vi) 位置 371: 371C; 371H; 371K; 371R; もしくは 371T 、
    中の１又は複数の残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、α−シクロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示す請求項１記載のCGTアーゼ変異体。
  6. 次の位置に対応するアミノ酸残基（ CGTアーゼ番号付け）：
    (i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I 47N; 47P; 47S; 47T; 47V; 47W; もしくは 47Y;
    (ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V;
    (iii) 位置 147:147E;
    (iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は
    (v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M; 371Q; 371R; 371T; 371V; もしくは 371W 、
    中の１又は複数の残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、β−シクロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示す請求項１記載のCGTアーゼ変異体。
  7. 次の位置に対応するアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47N; 47P; 47S; 47T; 47V; 47W; もしくは 47Y;
    (ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V;
    (iii) 位置 147: 147E;
    (iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は
    (v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371K; 371M; 371Q; 371R; 371T; もしくは 371W 、
    中の１又は複数の残基が、置換及び/ 又は挿入により導入されている、γ−シクロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示す請求項１記載のCGTアーゼ変異体。
  8. バチルス（Bacillus）の株、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）の株、クロストリジウム（Clostridium）の株、コリネバクテリウム（Corynebacterium）の株、クレブシエラ（Klebsiella）の株、ミクロコーカス（Micrococcus）の株、サーモアナエロビウム（Thermoanaerobium）の株、サーモアナエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）の株、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）の株、又はサーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）の株に由来する請求項１〜７のいずれか１項記載のCGTアーゼ変異体。
  9. バチルス・オートリチカス（Bacillus autolyticus）の株、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）の株、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）の株、バチルス・サーキュランス var. アルカロフィラス（Bacillus circulans var. alkalophilus）の株、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans ）の株、バチルス・フィルマス（Bacillus firmus ）の株、バチルス・ハロフィラス（Bacillus halophilus）の株、バチルス・マセランス（Bacillus macerans）の株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）の株、バチルス・オーベンシス（Bacillus ohbensis）の株、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）の株又はバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）の株に由来する請求項８記載のCGTアーゼ変異体。
  10. バチルスsp.1011株, バチルス sp.38-2株, バチルス sp.17-1株, バチルス sp.1-1株, バチルス sp.B1018株, バチルス・サーキュランス８株もしくはバチラス・サーキュランス251株, 又はそれらの変異株もしくは変異体に由来する請求項９記載のCGTアーゼ変異体。
  11. バチルス・サーキュランス251株, 又はその変異株もしくは変異体に由来する請求項１０記載のCGTアーゼ変異体。
  12. クレブシエラ・プネウモニア (Klebsiella pneumonia）の株、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus ）の株、サーモアナエロバクター・フィニイ（Thermoanaerobacter finnii）の株、クロストリジウム・サーモアミロリチカム（Clostridium thermoamylolyticum）の株、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム（Clostridium thermosaccharolyticum）の株、又はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Thermoanaerobacterium thrmosulfurigenes）の株に由来する請求項８記載のCGTアーゼ変異体。
  13. サーモアナエロバクター sp. ATCC53627、又はその変異株もしくは変異体に由来する請求項８記載のCGTアーゼ変異体。
  14. バチル・サーキュランスの株に由来し、そして次の位置に対応するアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) 位置 R47: R47C; R47D; R47E; R47F; R47G; R47I; R47K; R47N; R47P; R47S; R47T; R47V; R47W; もしくは R47Y;
    (ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V;
    (iii) 位置 S146: S146H; S146K; S146L; S146T; S146V; もしくは S146Y;
    (iv) 位置 D147: D147C; D147E; D147N; もしくはD147Q;
    (v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/又は
    (vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W 、中の１又は複数の残基が、その変異体において、置換及び/又は挿入により導入されている請求項１〜７のいずれか１項記載のCGTアーゼ変異体。
  15. バチルス・サーキュランス 251株、又はその変異株もしくは変異体に由来する請求項１１記載のCGTアーゼ変異体。
  16. サーモアナエロバクター sp. の株に由来し、そして次の位置に対応するアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) 位置 K47: K47C; K47D; K47E; K47F; K47G; K47I; K47N; K47P; K47R; K47S; K47T; K47V; K47W; もしくは K47Y;
    (ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V;
    (iii) 位置 E146: E146H; E146K; E146L; E146T; E146V; もしくは E146Y;
    (iv) 位置 T147: T147C; T147D; T147E; T147N; もしくはT147Q;
    (v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/又は
    (vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W 、
    中の１又は複数の残基が、その変異体において、置換及び/又は挿入により導入されている請求項１〜７のいずれか１項記載のCGTアーゼ変異体。
  17. サーモアナエロバクター sp. ATCC53627、又はその変異株もしくは変異体に由来する請求項１６記載のCGTアーゼ変異体。
  18. 次のアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) 47K/145E/146V/147N;
    (ii) 47K/145E/146E/147N;
    (iii) 47K/145D/146R/147D;
    (iv) 47K/145D/146E/147D;
    (v) 47K/145E/146V/147N/196H;
    (vi) 47K/145E/146E/147N/196H;
    (vii) 47K/145E/146V/147N/196H/371R;
    (viii) 47K/145E/146E/147N/196H/371R;
    (ix) 47K/145D/146R/147D/196H;
    (x) 47K/145D/146E/147D/196H;
    (xi) 47K/145D/146R/147D/196H/371R;
    (xii) 47K/145D/146R/147D/196H/371R;
    (xiii) 47K/196H;
    (xiv) 47R/196H;
    (xv) 145E/146V/147N;
    (xvi) 145E/146E/147N;
    (xvii) 145D/146R/147D;
    (xviii) 145D/146E/147D;
    (xix) 47K/371R 、及び/又は
    (xx) 47R/371R 、
    の１又は複数の残基を含んで成る請求項１〜１３のいずれか１項記載のCGTアーゼ変異体。
  19. バチルス・サーキュランスの株に由来し、そして次のアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) R47K/S145E/S146V/D147N;
    (ii) R47K/S145E/S146E/D147N;
    (iii) R47K/S145D/S146R;
    (iv) R47K/S145D/S146E;
    (v) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H;
    (vi) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H;
    (vii) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H/D371R;
    (viii) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H/D371R;
    (ix) R47K/S145D/S146R/D196H;
    (x) R47K/S145D/S146E/D196H;
    (xi) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;
    (xii) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R;
    (xiii) R47K/D196H;
    (xiv) S145E/S146V/D147N;
    (xv) S145E/S146E/D147N;
    (xvi) S145D/S146R;
    (xvii) S145D/S146E;
    (xviii) R47K/D371R 、
    の１又は複数の残基を含んで成る請求項１８記載のCGTアーゼ変異体。
  20. バチルス・サーキュランス 251株、又はその変異株もしくは変異体に由来する請求項１９記載のCGTアーゼ変異体。
  21. サーモアナエロバクター sp. の株に由来し、そして次のアミノ酸残基（CGTアーゼ番号付け）：
    (i) S145E/E146V/T147N;
    (ii) SI45E/T147N;
    (iii) S145D/E146R/T147D;
    (iv) S145D/T147D;
    (v) S145E/E146V/T147N/D196H;
    (vi) S145E/T147N/D196H;
    (vii) S145E/E146V/T147N/D196H/D371R;
    (viii) S145E/T147N/D196H/D371R;
    (ix) S145D/E146R/T147D/D196H;
    (x) S145D/T147D/D196H;
    (xi) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;
    (xii) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R;
    (xiii) S145E/E146V/T147N;
    (xiv) S145E/T147N;
    (xv) S145D/E146R/T147D;
    (xvi) S145D/T147D;
    (xvii) K47R/D371R; 及び/又は
    (xviii) K47R/D196H 、
    の１又は複数の残基を含んで成る請求項１８記載のCGTアーゼ変異体。
  22. サーモアナエロバクター sp. ATCC 53627、又はその変異株もしくは変異体に由来する請求項２１記載のCGTアーゼ変異体。
  23. シクロデキストリン工程の最終シクロデキストリン生成物中のα−シクロデキストリン含有率を高めるための請求項１〜２２のいずれか１項記載のCGTアーゼ変異体の使用。
  24. シクロデキストリン工程の最終シクロデキストリン生成物中のβ−シクロデキストリン含有率を高めるための請求項１〜２２のいずれか１項記載のCGTアーゼ変異体の使用。
  25. シクロデキストリン工程の最終シクロデキストリン生成物中のγ−シクロデキストリン含有率を高めるための請求項１〜２２のいずれか１項記載のCGTアーゼ変異体の使用。
  26. 請求項１〜２２のいずれか１項の変異体中の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、α−シクロデキストリンの生成に関して生成物特異性を高めるための方法。
  27. 請求項１〜２２のいずれか１項の変異体中の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、β−シクロデキストリンの生成に関して生成物特異性を高めるための方法。
  28. 請求項１〜２２のいずれか１項の変異体中の位置に対応する１又は複数のアミノ酸残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、γ−シクロデキストリンの生成に関して生成物特異性を高めるための方法。
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