JP4989922B2 - 変異体及びこれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
Akira Nakamura, Keiko Haga, and Kunio Yamane, Biochemstry, 32, 6624-6631, 1993 Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245-253, 1994
[1]
配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列内の75位、82位、91位、92位、119位、134位、147位、151位、223位、225位、234位、320位、347位、359位、360位、361位、451位、625位、656位、及び662位の少なくとも1つのアミノ酸残基を、親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの該当するアミノ酸残基とは異なる下記に示すアミノ酸残基で置換した変異体であって、
75位が、Ala、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Tyr、又はValであり、
82位が、Aspであり、
91位が、Leuであり、
92位が、Thrであり、
119位が、Valであり、
134位が、Ala、Pro、Ser、又はThrであり、
147位が、Thrであり、
151位が、Aspであり、
223位が、Arg、His、Lys、又はValであり、
225位が、Leuであり、
234位が、Asnであり、
320位が、Gluであり、
347位が、Asn、Asp、Cys、Glu、His、Ile、Leu、Ser、Thr、Tyr、又はValであり、
359位が、Glnであり、
360位が、Argであり、
361位が、Ala、Asn、Cys、Gln、Gly、Glu 、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はVal であり、
451位が、Valであり、
625位が、Cysであり、
656位が、Tyrであり、
662位が、Leuであり、
親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼと比較して、改良されたγ-シクロデキストリン合成に関する比活性を有するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ変異体。
[2]
配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列が、75位、82位、91位、92位、119位、134位、147位、151位、223位、225位、234位、320位、347位、359位、360位、361位、451位、625位、656位、及び662位以外のアミノ酸残基において、1〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものである[1]に記載の変異体。
[3]
前記変異体は、pH6〜11のいずれかのpHにおいて測定した比活性が、親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの比活性の1.1倍以上である[1]〜[2]のいずれかに記載の改良変異体。
[4]
前記変異体は、pH7.5又はpH10において測定した比活性が、親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの比活性の1.1倍以上である[1]〜[3]のいずれかに記載の改良変異体。
[5]
[1]〜[4]のいずれかに記載の変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
[6]
[5]に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
[7]
[6]に記載の組換えベクターで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体。
[8]
[7]に記載の形質転換体を培養し、前記形質転換体が生成するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ変異体を回収することを含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の変異体の製造方法。
本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用的な1文字及び3文字コードを用いる。引用を容易にするため、本発明のCGTase変異体は以下の命名法を用いて記述する。
もとのアミノ酸:位置:置換されるアミノ酸
この命名法によれば、例えば、位置75でのトリプトファンのロイシンへの置換は、
Trp75Leu又はW75L
と示す。
Trp75Leu/Asn82Asp又はW75L/N82D
と示す。
82位についてはAspであるのが好ましい。
91位についてはLeuであるのが好ましい。
92位についてはThrであるのが好ましい。
119位についてはValであるのが好ましい。
134位についてはAla、Pro、Ser又はThrであるのが好ましい。
147位についてはThrであるのが好ましい。
151位についてはAspであるのが好ましい。
223位についてはArg、His、Lys又はValであるのが好ましい。
225位についてはLeuであるのが好ましい。
234位についてはAsnであるのが好ましい。
320位についてはGluであるのが好ましい。
347位についてはAsn、Asp、Cys、Glu、His、Ile、Leu、Ser、Thr、Tyr又はValであるのが好ましい。
359位についてはGlnであるのが好ましい。
360位についてはArgであるのが好ましい。
361位についてはAla、Asn、Cys、Gln、Gly、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr又はValであるのが好ましい。
451位についてはValであるのが好ましい。
625位についてはCysであるのが好ましい。
656位についてはTyrであるのが好ましい。
662位についてはLeuであるのが好ましい。
CGTase変異体作製
バチルス クラーキー7364株由来のCGTase構造遺伝子の開始コドンの20base上流から終止コドンの100base下流までを含む約2.2kbの範囲に対し、該約2.2kbのDNAを増幅できるプライマー1(配列番号3)、プライマー2(配列番号4)及びTakara Taq(タカラ)を用い、エラープローンPCRを行なうことにより、ランダム変異を与えた。プライマー1はセンス鎖の5'末端側にSphIリンカーを、プライマー2はアンチセンス鎖の5'末端側にSacIリンカーを付与した。PCRの条件は、94℃で5分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分間、55℃で1.5分間、74℃で3分間を1サイクルとし30サイクル反応させた。増幅したDNA断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(アマシャム バイオサイエンス)にて精製し、末端制限酵素リンカーをSphI、SacIにより切断した。切断処理後のDNA断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kitにて精製した。精製したDNA断片をSphI、SacI処理したpUC19と混合した後、Ligation High(東洋紡)により、リガーゼ反応を行なった。リガーゼ反応後液を用い、宿主菌である大腸菌JM109を形質転換した。
CGTase変異体の評価
実施例2−1
CGTase変異体をコードする遺伝子の塩基配列の決定
前記候補株を2mlのLB-A培地[ポリペプトン(ディフコ) 1%(w/v)、酵母エキス(ディフコ)0.5%(w/v)、塩化ナトリウム1%(w/v)、アンピシリン50ppm]に植菌し、30℃で12〜16時間培養後、遠心分離により得られた菌体からGFX Micro Plasmid Prep Kit(アマシャム バイオサイエンス)を用いて、プラスミドを回収した。回収したプラスミド中に挿入されたCGTase変異体をコードする遺伝子の塩基配列の決定をMegaBACE 1000マルチキャピラリーシステム(アマシャム バイオサイエンス)を用いて行なった。
前記候補株を5mlのLB-A培地に植菌し、30℃で12〜20時間培養後、300mlのLB-A培地に植菌し、30℃で振盪培養を行ない、600nmにおける濁度が0.4〜1.0の時にIPTGを終濃度0.1mMになるよう添加し、さらに12〜20hr培養した。培養液から遠心分離により得られた菌体をULTRASONIC DISRUPTOR UD-201(トミー)を用いる5分間の超音波破砕処理を行ない、超音波処理液から遠心分離により菌体内粗酵素溶液を得た。該粗酵素溶液について、Sepharose6B(アマシャム バイオサイエンス)にγ-CDを固定化したγ-CD固定化Sepharose6Bを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、電気泳動的に均質なレベルにまで精製を行なった。
精製CGTaseのタンパク質濃度はDCプロテインアッセイキット(バイオラッド)を用いて測定した。標準タンパク質として牛血清アルブミンを用いた。
450μlの1.5%可溶性澱粉溶液/各緩衝液(pH5-7:1/4×McIlvaine緩衝液、pH7.5-8.5:25mM HEPES-NaOH緩衝液、pH9-10.5:25 mM Gly-NaCl-NaOH 緩衝液、pH11-11.9:25mM Na2HPO4-NaOH緩衝液)を40℃で保温し、適当に希釈した酵素溶液50μl を添加することで反応を開始した。反応開始10分後に500μl の0.05 N HClを添加する事で反応を停止した。反応液に5 mM BCG溶液(in 20 % Ethanol)を添加混合後、20分間室温で保持し、2mlの1M BCG緩衝液(pH 4.2)を加え630 nm の吸光度を測定した。該吸光度値からあらかじめ作成した検量線を用いて反応液中のγ-CD含量を求めた。CGTase活性1unitを上記反応条件で単位時間当りに1μmolのγ-CDを生成させる酵素量と定義した。
CGTase変異体の評価法
前記候補株由来の精製CGTase変異体のCGTase活性値及びタンパク質濃度から比活性を算出した。本比活性をバチルス クラーキー7364株由来のCGTase(親CGTase)の比活性と比べることで、改良された比活性を有するCGTase変異体を選別した。選別したCGTase変異体をコードする遺伝子の塩基配列決定により特定した変異部位を比活性の改良に関与する変異部位とした。
CGTase変異体の評価
親CGTase及び各CGTase変異体のpH7.5及び10.0におけるCGTase活性及びタンパク質濃度を測定し、比活性を算出した。表2に比活性の実測値及び親CGTaseの比活性を100とした時の本発明のCGTase変異体の相対値を示した。親CGTaseのpH 7.5における比活性は0.47U/mg、pH 10.0においては5.41U/mgであった。それに対して、各CGTase変異体の比活性はpH 7.5において0.39-4.35U/mg、pH 10.0において2.98-9.28U/mgであった。pH 7.5とpH10.0の両方あるいはどちらか一方での比活性が1.1倍以上向上したCGTase変異体が得られた。
75位における各種変異体の評価
pH7.5及びpH10.0における大幅な比活性の向上が認められた75位のTrpからLeuへの置換について、75位のTrpのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー3〜15(配列番号5〜17)、CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及びPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラ)を用いて、親CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行ない、各CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、W75A、W75C、W75E、W75F、W75H、W75I、W75K、W75M、W75Q、W75S、W75T、W75V、W75Yにおいて、pH 7.5とpH10.0の両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表3参照。
134位における各種変異体の評価
pH7.5における大幅な比活性の向上が認められた134位のValからAlaへの置換について、134位のValのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー16〜18(配列番号18〜20) 、CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及びPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラ)を用いて、親CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行ない、各CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、V134P、V134S、V134Tにおいて、pH 7.5とpH10.0の両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表5参照。
223位における各種変異体の評価
223位のおけるアミノ酸残基の置換について、Val以外のその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー19〜21(配列番号21〜23)、CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及びPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラ)を用いて、親CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行ない、各CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、A223H、A223K、A223Rにおいて比活性の向上が認められた。表7参照。
347位における各種変異体の評価
pH7.5及びpH10.0における大幅な比活性の向上が認められた347位のAlaからValへの置換について、347位のAlaのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー22〜31(配列番号24〜33)、CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及びPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラ)を用いて、親CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行ない、各CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、A347C、A347D、A347E、A347H、A347I、A347L、A347N、A347S、A347T、A347Yにおいて、pH 7.5とpH10.0の両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表9参照。
361位における各種変異体の評価
pH7.5における大幅な比活性の向上が認められた361位のAspからGlyへの置換について、361位のAspのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー32〜48(配列番号34〜50)、CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及びPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラ)を用いて、親CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行ない、各CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、D361A、D361C、D361E、D361F、D361H、D361I、D361K、D361L、D361M、D361N、D361P、D361Q、D361S、D361T、D361V、D361W、D361Yにおいて、pH 7.5とpH10.0の両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表11参照。
変異体の各種pHにおける比活性の評価
親CGTase(図1中●)、A223R(図1中▲)、D361V(図1中■)について、pH5-11.9における比活性の評価を行なった。結果を図1に示す。その結果、A223R、D361V変異体共にpH6-11において比活性の向上効果が認められた。
Claims (8)
- 配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列内の75位、82位、91位、92位、119位、134位、147位、151位、223位、225位、234位、320位、347位、359位、360位、361位、451位、625位、656位、及び662位の少なくとも1つのアミノ酸残基を、親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの該当するアミノ酸残基とは異なる下記に示すアミノ酸残基で置換した変異体であって、
75位が、Ala、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Tyr、又はValであり、
82位が、Aspであり、
91位が、Leuであり、
92位が、Thrであり、
119位が、Valであり、
134位が、Ala、Pro、Ser、又はThrであり、
147位が、Thrであり、
151位が、Aspであり、
223位が、Arg、His、Lys、又はValであり、
225位が、Leuであり、
234位が、Asnであり、
320位が、Gluであり、
347位が、Asn、Asp、Cys、Glu、His、Ile、Leu、Ser、Thr、Tyr、又はValであり、
359位が、Glnであり、
360位が、Argであり、
361位が、Ala、Asn、Cys、Gln、Gly、Glu 、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、又はVal であり、
451位が、Valであり、
625位が、Cysであり、
656位が、Tyrであり、
662位が、Leuであり、
親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼと比較して、改良されたγ-シクロデキストリン合成に関する比活性を有するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ変異体。 - 配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列が、75位、82位、91位、92位、119位、134位、147位、151位、223位、225位、234位、320位、347位、359位、360位、361位、451位、625位、656位、及び662位以外のアミノ酸残基において、1〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものである請求項1に記載の変異体。
- 前記変異体は、pH6〜11のいずれかのpHにおいて測定した比活性が、親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの比活性の1.1倍以上である請求項1〜2のいずれか1項に記載の改良変異体。
- 前記変異体は、pH7.5又はpH10において測定した比活性が、親γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの比活性の1.1倍以上である請求項1〜3のいずれか1項に記載の改良変異体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
- 請求項5に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項6に記載の組換えベクターで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体。
- 請求項7に記載の形質転換体を培養し、前記形質転換体が生成するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ変異体を回収することを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異体の製造方法。
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