ES2290184T3 - Ciclodextrina-glucanotransferasa (cgtasa) a partir de bacillus agaradherens (dsm 9948) asi como agentes para el lavado y la limpeiza con esta nueva ciclodextrina-glucanotransferasa. - Google Patents

Abstract

Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa con una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. 2 en las posiciones 1 - 713 al menos en un 95 %.

Description

Ciclodextrina-glucanotransferasa (CGTasa) a partir de Bacillus agaradherens (DSM 9948) así como agentes para el lavado y la limpieza con esta nueva ciclodextrina-glucanotransferasa.

La presente solicitud se refiere a una ciclodextrina-glucanotransferasa (CGTasa) procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948) y a proteínas o derivados que ejerzan una actividad amilolítica y/o de CGTasa suficientemente similar, a los ácidos nucleicos correspondientes y a los microorganismos productores, a procedimientos para la obtención de esta proteína así como a diversas posibilidades de aplicación de las mismas. La solicitud se refiere, además de a otros campos industriales de aplicación, especialmente a los agentes para el lavado y la limpieza con tales CGTasas, a procedimientos para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras con participación de tales CGTasas
o a agentes correspondientes, así como a su empleo para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras.

Las \alpha-amilasas (E.C. 3. 2. 1. 1) hidrolizan los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos de los almidones y de los polímeros similares a los almidones tales como la amilosa, la amilopectina o el glicógeno, con formación de dextrinas y de oligosacáridos \beta-1,6-ramificados. Éstas pertenecen a los enzimas absolutamente más importantes, utilizados en la industria. Esto se debe, por un lado, a que son desprendidos en el medio circundante por microorganismos en la mayoría de los casos como ocurre con muchos enzimas degradadores de los substratos de tal manera, que pueden ser obtenidos a escala industrial por medio de la fermentación y de la purificación a partir del medio de cultivo con un coste comparativamente bajo. Por otro lado las amilasas se utilizan para un amplio espectro de aplicaciones.

Un empleo industrial importante de las \alpha-amilasas es la obtención de jarabe de glucosa. Otras utilizaciones son, por ejemplo, las de componentes activos en agentes para el lavado y la limpieza, para el tratamiento de materiales en bruto en la fabricación de los artículos textiles, para la obtención de pegamentos o para la fabricación de artículos comestibles o de componentes de los artículos comestibles, que contengan azúcares. Las CGTasas se emplean especialmente para la síntesis y para la elaboración de las ciclodextrinas.

Desde hace algún tiempo se emplean en los agentes para el lavado y la limpieza, entre otros, enzimas hidrolíticos, tales como, por ejemplo, las proteasas, las celulasas o las lipasas. Entre éstas se han establecido perfectamente también las amilasas como enzimas disociadoras del almidón.

Una \alpha-amilasa industrialmente significativa y empleada frecuentemente también en los agentes para el lavado y la limpieza, es la que procede de Bacillus licheniformis. A modo de ejemplo, el producto correspondiente de la firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca, porta el nombre comercial Termamyl®; el de la firma Genencor Int., Rochester, New York, USA, se llama Purastar®. El homólogo, obtenido a partir de B. subtilis, o bien a partir de B. amyloliquefaciens se comercializa por la firma Novozymes bajo el nombre BAN®.

Esta molécula de amilasa, o bien estos parientes próximos, han sido desarrollados en un gran número de invenciones, las cuales tenían como cometido la optimación de sus propiedades enzimáticas para aplicaciones específicas con ayuda de diversas modificaciones, especialmente de modificaciones efectuadas por medio de la biología molecular. Tales optimaciones pueden referirse por ejemplo a la especificidad para el substrato, a la estabilidad del enzima bajo diversas condiciones de reacción o a la propia actividad enzimática. Como ejemplos de tales optimaciones pueden citarse las siguientes solicitudes: EP 410498 para el encolaje de los artículos textiles y la WO 96/02633 para la licuación de los almidones. Para la estabilización frente a la oxidación de los restos de metionina producida por el peróxido de hidrógeno por ejemplo durante la colada de los artículos textiles y la limpieza mecánica se han descrito variantes de la amilasa en las que se ha intercambiado la metionina por aminoácidos no oxidables. Ejemplos a este respecto se han descrito en las publicaciones WO 94/18314, WO 96/30481, WO 95/26397 y WO 94/02597.

Sin embargo, las \alpha-amilasas son desarrolladas ante todo, también, en lo que se refiere a su empleo en los agentes para el lavado y la limpieza. Como ejemplos a este respecto pueden citarse simplemente las siguientes solicitudes: las amilasas de la solicitud WO 99/02702 son más estables a temperaturas elevadas que la molécula de partida. Los enzimas de la solicitud WO 99/23211 son estables a valores altos del pH, en presencia de iones de calcio y a temperaturas elevadas. Las \alpha-amilasas de la solicitud WO 97/43424 muestran un comportamiento modificado para el enlace de los iones calcio y, por lo tanto, propiedades enzimáticas modificadas. El procedimiento de mutagénesis de la solicitud WO 99/20768 conduce a variantes de la \alpha-amilasa, que son especialmente estables en presencia de los componentes de los agentes de limpieza.

En el caso de tales modificaciones, una variación de las propiedades enzimáticas individuales, afecta también siempre, en la práctica, a otras propiedades y al rendimiento de lavado del enzima correspondiente. Un ejemplo de un producto de optimación, obtenido de este modo, que se ha comercializado entretanto, es el Duramyl® (WO 94/02597) con una sensibilidad a la oxidación disminuida (firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca; S6FVI/ Journal 123, (1997), páginas 723-731).

Puesto que los desarrollos, que consisten simplemente en las optimaciones de los enzimas de partida sólo poco conocidos, están limitados posiblemente a los resultados alcanzables, tiene lugar, paralelamente a ello, una búsqueda intensa de enzimas comparables a partir de otras fuentes naturales. Se han identificado enzimas disociadores de los almidones por ejemplo a partir de Pimelobacter, Pseudomonas y Thermus para la fabricación de artículos comestibles, productos cosméticos y productos farmacéuticos (EP 636693), así como a partir de Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium y Micrococcus (EP 628630), a partir de Pyrococcus (WO 94/19454) y a partir de Sulfolobus para la licuación de los almidones a temperaturas elevadas, o bien bajo condiciones de la reacción fuertemente ácidas (EP 727485 y WO 96/02633). Para el empleo con valores alcalinos del pH se han encontrado amilasas procedentes de Bacillus sp. (WO 95/26397 y WO 97/00324). Otras amilasas, procedentes de Bacilli (EP 670367) son adecuadas para el empleo en los agentes para el lavado o la limpieza debido a su baja sensibilidad frente a los detergentes.

Los enzimas procedentes de organismos recién explotados son adecuados, debido a su origen, posiblemente mejor que los enzimas poco establecidos para ser desarrollados para aplicaciones específicas. Un ejemplo a este respecto es la amilasa procedente de Thermoalcalibacter (WO 98/13481), cuya actividad natural es ampliamente insensible frente a los iones calcio de tal manera que presenta inicialmente buenas condiciones previas para el empleo en los agentes para el lavado.

Otras optimaciones de los enzimas aislados a partir de fuentes naturales, para el correspondiente campo de aplicación pueden ser obtenidas, por ejemplo, a través de los métodos de la biología molecular (por ejemplo según las publicaciones US 5171673 o WO 99/20768) o a través de modificaciones químicas (DE 4013142). Las solicitudes WO 99/57250 y WO 99/57254, proporcionan, por ejemplo, enseñanzas para la combinación de enzimas adecuados para el empleo en los agentes para el lavado y la limpieza, a través de enlaces químicos o en forma de proteínas quiméricas con un dominio de enlace que aumenta la concentración efectiva en enzimas sobre el producto a ser limpiado.

En la solicitud de patente WO 99/43793 se ha descrito un desarrollo ulterior de las conocidas \alpha-amilasas Novamyl®. Según esta publicación pueden aprovecharse las similitudes de las secuencias entre Novamyl® y las conocidas ciclodextrinaglucanotransferasas (CGTasas) para construir un conjunto de moléculas emparentadas con ayuda de técnicas de la biológica molecular. Éstas están constituidas por \alpha-amilasas con secuencias de consenso adicionales específicas de las CGTasas (casetes) y funciones o, a la inversa, están constituidas por CGTasas con regiones y con funciones adicionales típicas para las \alpha-amilasas o se trata de quimeras de ambas moléculas. Se había divulgado ya con la solicitud WO 91/04669 el empleo de las \alpha-amilasas Novamyl® debido a su efecto para retardar que el pan u otros artículos de panadería se vuelvan añejos durante la fabricación (anti staling effect). El sentido de este nuevo desarrollo se encuentra en primer lugar en la optimación del producto Novamyl® para estas aplicaciones.

En la solicitud WO 99/57250 se divulga el modo en que los enzimas para los agentes de lavado, por ejemplo, las lipasas, las celulasas, las proteasas, las amilasas o incluso las CGTasas pueden aumentar su rendimiento de lavado. El principio, allí descrito, consiste en que los enzimas correspondientes son enlazados con regiones de enlace de la celulosa (CBD) de origen natural a través de un enlazador no aminoácido. Éstos se encargan de que el enzima actúe de una manera más reforzada sobre la superficie del artículo textil. Con la publicación WO 99/57252 se incluyen en este concepto otros posibles enlazadores, y en la publicación WO 99/57254 se divulgan otros enzimas, tales como, por ejemplo, las glicosil-transferasas o las acil-transferasas, que se enlazan sobre la CBD bien directamente, es decir con formación de una proteína quimérica, o a través del enlazador citado en la publicación WO 99/57252.

Como \alpha-amilasas especiales deben considerarse las ciclodextrinaglucanotransferasas (CGTasas; E.C. 2. 4. 1. 19), puesto que tienen los mismos dominios A, B y C que las \alpha-amilasas, que son responsables de su función amilolítica; además, las CGTasas disponen de otros dos dominios D y E, cuyas funciones consisten en posibilitar las transglicosilaciones intramoleculares. La actividad enzimática de una CGTasa consiste por lo tanto, igual que la de una \alpha-amilasa, en disociar los enlaces internos \alpha-(1,4)-glicosídicos de la amilosa o de la amilopectina, pero no de manera hidrolítica sino a través de transglicosilaciones intramoleculares. De este modo se degradan los polisacáridos similares a los almidones con la formación de ciclodextrinas.

Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos, enlazados de forma \alpha-(1,4)-glicosídica, entre los cuales tienen el máximo significado económico las \alpha-, las \beta-, o bien las \gamma-ciclodextrinas constituidas por 6, por 7 o por 8 monómeros de glucosa (o ciclohexa-, hepta-, o bien octa-amilosas); sin embargo se conocen también ciclodextrinas constituidas por más de ocho monómeros. Éstas forman, especialmente cuando estén superpuestas en la red cristalina, canales intramoleculares pasantes, en los cuales pueden ocluirse moléculas gaseosas hidrófobas. Tales compuestos de oclusión son significativos hasta ahora, entre otras cosas, para la fabricación de artículos comestibles, para la industria farmacéutica o para la industria cosmética.

Las CGTasas pertenecen, igual que las \alpha-amilasas, a la familia de las glicosil-hidrolasas, cuyos representantes presentan en los dominios A, B y C la característica estructural de una caja (\beta/\alpha)_{8} y actividades catalíticas comparables. Se conoce un gran número de CGTasas de origen bacteriano. Éstas presentan las cinco regiones altamente conservadas A hasta E con, por otra parte, morfologías secuenciales más bien pequeñas; las dos regiones C-terminales D y E son características, en este caso, de las CGTasas. Los autores Nakamura et al. (FEBS-Letters, 296 (1992), páginas 37-40) han demostrado que se conservan tres restos de aminoácidos de las \alpha-amilasas, que deben ser considerados como restos catalíticamente activos, también en las regiones N-terminales de las CGTasas, lo cual permite concluir que ambos enzimas disociadores de la amilosa presentan un mecanismo de reacción catalítico similar. Sin embargo, también en las regiones A, B y C están presentes aminoácidos individuales, que diferencian a las CGTasas de las \alpha-amilasas (Wind et al., Eur. J. Biochem., 253 (1998), páginas 598 - 605).

Se conocen diversas aplicaciones para las CGTasas, por ejemplo en el sector de los artículos comestibles o en el sector farmacéutico. Para la obtención de artículos de panadería, por ejemplo, se emplean, debido a su actividad disociadora de los almidones, para impedir la pérdida de sabor conocida debida al añejamiento (efecto anti-staling). La capacidad que tienen las ciclodextrinas para almacenar compuestos hidrófobos hace que éstas sean interesantes para la absorción y la liberación, retardada en el tiempo, de colorantes o de substancias farmacológicamente activas. Por lo tanto las CGTasas tienen también una función importante para la fabricación y el aprovechamiento de tales compuestos de oclusión.

Este efecto es beneficioso, también para su rendimiento de limpieza, como se ha descrito en las publicaciones JP 7-107971 y JP 7-109488 para las CGTasas procedentes de bacilos alcalífilos. Éstos también pueden desplegar un efecto desodorante probablemente debido a su capacidad para ocluir en las ciclodextrinas compuestos de bajo peso molecular y, por lo tanto, para enmascararlos.

Del mismo modo que en el caso de las \alpha-amilasas, se han llevado a cabo también mutaciones puntuales en las CGTasas para la modificación de sus propiedades enzimáticas, por ejemplo según la solicitud WO 96/33267. En dicha publicación se han divulgado diversas variantes a partir de CGTasas bacterianas conocidas, que han sido modificadas en lo que se refiere a su enlace con los substratos y/o a su selectividad para el producto. También la modificación enzimática de la solicitud WO 99/43793 puede considerarse como mutagénesis en una CGTasa, aún cuando también las propiedades del enzima resultante como una \alpha-amilasa modificada, se encuentre en primera línea en la solicitud correspondiente.

Cada uno de los enzimas empleados en los agentes para el lavado y/o para la limpieza, así como también cada uno de los enzimas hidrolizadores de los almidones, tiene un perfil individual de rendimiento. Esto demuestra además la necesidad de enriquecer el estado de la técnica con otros enzimas, por ejemplo amilolíticos. Esta necesidad se produce, entre otros motivos, también por las costumbres y por las exigencias de los usuarios, sometidas a modificaciones, según las cuales existe cada vez una mayor necesidad de agentes para el lavado para la limpieza a temperaturas bajas y medias.

Además, los nuevos enzimas, como los que pueden ser obtenidos a partir de organismos todavía no explotados para esta finalidad, en el sentido de una ingeniería de las proteínas "Protein Engineering" como punto de partida para otras modificaciones realizadas por medio de la ingeniería genética o de otro tipo. Su objetivo consiste en la introducción de propiedades que no presentan los enzimas conocidos hasta ahora o los enzimas para los agentes de lavado, derivados de los anteriores.

Por otro lado, precisamente tales enzimas naturales aparecen como candidatos especialmente adecuados para tales optimaciones, que presenten desde un inicio, en cooperación con los componentes usuales de los agentes para el lavado o la limpieza, un cierto rendimiento para el lavado o bien para la limpieza.

A pesar de todos estos desarrollos existe invariablemente la tarea de encontrar otros enzimas, además del reducido número de enzimas amilolíticos naturales, que sean realmente aprovechables en la industria sin modificaciones o en forma de desarrollos ulteriores, que presenten, a priori, un amplio espectro de aplicaciones y que puedan servir como punto de partida para desarrollos ulteriores específicos.

Por lo tanto, la presente invención tiene como tarea identificar un enzima amilolítico, que no haya sido descrito hasta ahora, que aparezca adecuado incluso para posibilidades industriales de aplicación, especialmente en los agentes para el lavado o para la limpieza o que pueda servir como base para desarrollos ulteriores específicos de la aplicación.

Una parte de la tarea consistía en obtener ácidos nucleicos que codificasen un enzima amilolítico de este tipo, puesto que éstos son imprescindibles tanto para la obtención por biotecnología así como también para el desarrollo ulterior de este enzima.

Otra parte de la tarea consistía en encontrar un organismo que produjese de manera natural un enzima amilolítico de este tipo.

Otra parte de la tarea consistía en posibilitar la producción por biotecnología de un enzima amilolítico de este tipo.

Otra parte de la tarea consistía en proporcionar agentes para el lavado o la limpieza con un nuevo enzima amilolítico. En este caso el enzima amilolítico y que disponga, en caso dado, de otras actividades, que puede ser obtenido a partir de una cepa natural debería presentar en cooperación con los componentes usuales para tales agentes, rendimientos de lavado o bien de limpieza ventajosos, que sobrepasasen a los de los enzimas establecidos y optimados para el uso en tales agentes o que al menos fuesen equivalentes a los mismos. Las propiedades de este enzima, que van eventualmente más allá de una función puramente amilolítica, deberían favorecer su contribución al rendimiento del lavado o al rendimiento del lavado del agente o, al menos, no deberían perjudicarlo.

Otros aspectos parciales residen en la puesta a disposición de procedimientos correspondientes de lavado o de limpieza y en la señalización de las posibilidades de aplicación correspondientes.

Otra parte de la tarea consistía en definir otras posibilidades de aplicación industrial para un enzima amilolítico de este tipo.

Sorprendentemente, los enzimas como las ciclodextrina-glucanotransferasas (CGTasas) procedentes de Bacillus agaradherens (DSM 9948), puestas a disposición con la presente solicitud, son representantes adecuados a este respecto. Este enzima, de origen natural, puede ser considerado como ciclodextrinaglucanotransferasa (CGTasa) y, simultáneamente, puede ser considerado como \alpha-amilasa. Por lo tanto puede ser empleado como consecuencia de ambas actividades. La actividad \alpha-amilasa reside en los dominios A, B y C. A través de las funciones ejercidas por los dominios D y E se produce la actividad de CGTasa y, por lo tanto, una ampliación correspondiente del espectro de actividad y, por lo tanto, de las posibilidades de aplicación.

Por lo tanto, la solución de la tarea representa proteínas que presentan actividad amilolítica y/o de CGTasa, cuya secuencia de aminoácidos presentan una similitud suficiente con la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. 2, especialmente en las regiones parciales de la proteína madura y de forma muy especialmente preferente en los dominios A, B y C. Los fragmentos de proteína, las variantes por deleción, las variantes por inserción, las quimeras, los derivados o las proteínas inmunológicamente emparentadas o los derivados de las mismas representan también soluciones para la tarea en la que está basada la invención, en tanto en cuanto dispongan de una actividad amilolítica y/o de una actividad de CGTasa.

Preferentemente, se formarán por una fuente natural, preferentemente por un microorganismo y de una manera más preferente por una bacteria, por una bacteria gram-positiva, por una del género Bacillus, por un Bacillus alcalífilo, por una de las especies Bacillus agaradherens y especialmente por Bacillus agaradherens (DSM 9948).

Otras soluciones de la tarea representan los ácidos nucleicos que codifiquen estas proteínas, o bien estos derivados, que presentan una similitud suficiente con la secuencia de los nucleótidos indicada en la SEQ ID NO.1, preferentemente aquellos que codifiquen las proteínas o los derivados precedentemente citados.

Otras soluciones de la tarea consisten en organismos que formen de manera natural tales proteínas o derivados o que contengan ácidos nucleicos que los codifiquen; en este caso son más preferentes los microorganismos, las bacterias, las bacterias gram-positivas, los bacilos, los bacilos alcalífilos, los Bacillus agaradherens y los B. agaradherens (DSM 9948); en vectores, que contengan las regiones correspondientes de los ácidos nucleicos, preferentemente vectores de clonación y/o de expresión; en células, que contengan tales ácidos nucleicos o vectores, preferentemente aquellas que puedan expresarlos; a éstas pertenecen tanto las células procariotas así como también las células eucariotas, en el caso de las procariotas preferentemente aquellas que secreten la proteína, o el derivado, formados en el medio circundante, entre las cuales son preferentes aquella de las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus o las bacterias gram-negativas, y, entre éstas, de forma especialmente preferente aquellas del género Escherichia, preferentemente de las especies Escherichia coli o Klebsiella, y, de forma especialmente preferente, las cepas E. coli JM 109, E. coli DH 100B, E. coli DH 12S o Klebsiella planticola (Rf); entre las eucariotas son preferentes aquellas que modifiquen a la proteína o al derivado en el plano de la post-traducción.

Esta invención abarca, además, todos los procedimientos, preferentemente todos los procedimientos microbiológicos para la obtención de las proteínas o de los derivados correspondientes.

La solución de una parte de la tarea y, por lo tanto, otro aspecto de la presente invención está representada por agentes para el lavado o la limpieza, que se caractericen por las proteínas o los derivados según la invención, especialmente en los intervalos de concentración adecuados; preferentemente aquellos que contengan otras amilasas, especialmente \alpha-amilasas, otros enzimas tales como, especialmente, una o varias proteasas, lipasas, óxidorreductasas, hemicelulasas y/o celulasas o ciclodextrinas; aquellos que presenten más de una fase que, cuando sean sólidos, contengan mezclados entre sí al menos dos componentes sólidos diferentes, especialmente polvos, granulados o cuerpos extruidos, en forma globalmente a granel; que estén compactados; en los cuales contenga, al menos una de las fases, un material sensible a las amilasas, especialmente almidones o que esté rodeado o recubierto por el mismo, al menos en parte, que sean líquidos, en estado de gel o pastosos y en los cuales estén presentes de manera encapsulada la proteína contenida y/o al menos uno de los enzimas contenidos y/o al menos uno de los otros componentes contenidos, individualmente o junto con otros componentes, preferentemente en microcápsulas, de forma especialmente preferente en aquellos que estén constituidos por un material sensible a las amilasas; y/o en los cuales esté modificada la actividad amilolítica y/o la actividad de la CGTasa por medio de otro de los componentes del agente, especialmente estabilizado y/o cuya contribución al rendimiento del lavado o bien al rendimiento de limpieza del agente quede aumentada.

Otras soluciones son procedimientos para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, en los cuales se activa, al menos en una de las etapas del procedimiento, una proteína, según la invención, que presente actividad amilolítica y/o actividad de la CGTasa o a un agente correspondiente, preferentemente en los intervalos adecuados de concentración; los empleos correspondientes, preferentemente en concentraciones correspondientes, especialmente en una máquina lavavajillas o en una máquina lavadora; otras soluciones son el empleo de una proteína o de un derivado, según la invención, solos o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto limpiador y un agente para el lavado o para la limpieza constituido por más de una fase, para la activación de su propia fase o de otras fases; o en agentes para el lavado o para la limpieza con componentes encapsulados para la liberación de los componentes.

Otras soluciones son las posibilidades industriales de aplicación de la proteína o del derivado, según la invención, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de la CGTasa; sus campos de aplicación se encuentran, entre otros, en el tratamiento de materiales en bruto o de productos semielaborados en la fabricación de artículos textiles, especialmente en el desencolaje del algodón o en la eliminación de las capas protectoras de almidón o similares al almidón de los productos industriales semielaborados; en la licuación de los almidones, especialmente en la producción de etanol; en la fabricación o en la modificación de oligosacáridos y/o de cadena corta; en la absorción o la liberación de compuestos de bajo peso molecular en o bien a partir de soportes constituidos por polisacáridos, especialmente por ciclodextrinas, ante todo para la estabilización de compuestos químicos durante su fabricación o durante su transformación; en la obtención o como parte integrante de productos cosméticos o de productos farmacéuticos, con lo cual se reivindican también los productos cosméticos y farmacéuticos correspondientes, caracterizados porque contienen una proteína o derivado correspondiente o al menos un componente que ha sido obtenido con el empleo de una proteína de este tipo; en el empleo de una proteína o derivado, según la invención, para la obtención de artículos comestibles, de componentes para los artículos comestibles, de pienso para los animales y/o de componentes para los piensos de los animales; en la restauración del papel; en la obtención o en la disolución de pegamentos que contengan almidones o compuestos similares y, por lo tanto, especialmente en procedimientos de pegado temporal.

En el sentido de la presente solicitud se entenderá por una proteína un polímero compuesto por los aminoácidos naturales, construido ampliamente de manera lineal, que toma la mayoría de las veces una estructura tridimensional para ejercer su función. En la presente solicitud se denominarán los 19 L-aminoácidos proteinógenos, de origen natural, con el código usado internacionalmente con 1 y con 3 letras.

En el sentido de la presente solicitud se entenderá por un enzima, aquella proteína que ejerza una determinada función bioquímica. Se entenderán por proteínas amilolíticas o enzimas con función amilolítica aquellas que hidrolicen los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos de los polisacáridos, especialmente aquellas que se encuentren en el interior de los polisacáridos y que, por lo tanto, puedan ser denominadas también como \alpha-1,4-amilasas (E.C. 3.2.1.1). Las CGTasas son aquellas \alpha-amilasas, que no catalicen la hidrólisis en un mecanismo análogo sino que catalicen las transglicosilaciones intramoleculares sobre el substrato, con lo cual se degradan los polímeros similares al almidón con la formación de ciclodextrinas.

Se forma un gran número de proteínas como las denominadas preproteínas, es decir junto con un péptido de señal. Se entenderá por este concepto la parte N-terminal de la proteína, cuya función consiste, en la mayoría de los casos en garantizar la secreción de la proteína formada a partir de la célula protectora en el periplasma o en el medio circundante y/o su plegado correcto. A continuación se disociará el péptido de señal por el resto de la proteína bajo condiciones naturales por medio de una peptidasa de señal de tal manera, que ésta ejerza su actividad propiamente catalítica sin los aminoácidos N-terminales inicialmente presentes. La CGTasa nativa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948), tiene, por ejemplo, una longitud de 713 aminoácidos, como se ha mostrado en la SEQ ID NO.2. Tal como se ha indicado en los ejemplos de aplicación, el péptido de señal de este enzima abarca aproximadamente 34 aminoácidos de tal manera que, para el enzima maduro se da una longitud de 679 aminoácidos aproximadamente.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por ácidos nucleicos aquellas moléculas constituidas de manera natural por nucleótidos, que sirven como portadoras de información, que codifican las series lineales de aminoácidos en proteínas o en enzimas. Éstos pueden presentarse como cadena única, como cadena única complementaria de esta cadena única o como cadena doble. El ácido nucleico ADN es preferente para los trabajos de biología molecular como portador de informaciones natural persistente. Por el contrario se formará un ARN para la realización de la invención en un medio natural, tal como por ejemplo en una célula expresadora, con lo cual las moléculas de ARN según la invención representan igualmente formas de realización de la presente invención.

En el caso del ADN deben tenerse en consideración las secuencias de ambas cadenas complementarias respectivamente en las tres pautas de lectura posibles. Además debe tenerse en consideración que diversos tripletes de codón pueden codificar los mismos aminoácidos de tal manera que, puede derivarse una determinada serie de aminoácidos de varias secuencias de nucleótidos diferentes y que presenten, posiblemente, sólo una pequeña identidad (degenerabilidad del código genético). Además, diversos organismos presentan diferencias en la utilización de estos codones. Por estos motivos deben considerarse incluidos en el ámbito de protección tanto las secuencias de los aminoácidos como también las secuencias de los nucleótidos y las secuencias de nucleótidos indicadas deben considerarse respectivamente sólo como una codificación ejemplificativa de una determinada serie de aminoácidos.

La unidad de información, que corresponde a una proteína, se denominará también en el sentido de la presente invención, como gen.

Un técnico en la materia tiene la posibilidad, por medio de los métodos conocidos en general actualmente, tales como, por ejemplo, las síntesis químicas o las reacciones en cadena de polimerasa (RCP) en combinación con métodos patrón de la microbiología molecular y de la química de proteínas, para la preparación de los ácidos nucleicos correspondientes hasta llegar al gen completo, por medio de las secuencias conocidas de ADN y/o de aminoácidos. Tales métodos son conocidos, por ejemplo, por la publicación "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, tomo 1, páginas 267-271 y tomo 2, páginas 227-229.

Se denominarán mutaciones a aquellas modificaciones de la secuencia de los nucleótidos como las que pueden provocarse por ejemplo por medio de los métodos de la biología molecular en sí conocidos. Según el tipo de la modificación se distingue, por ejemplo, entre mutaciones por deleción, por inserción o por substitución o aquellas en las cuales se fusionan diversos genes o partes de genes (shuffling); éstas son mutaciones genéticas. Los organismos correspondientes se denominarán mutantes. Las proteínas, derivadas de los ácidos nucleicos mutados, se denominarán variantes. De este modo, por ejemplo, las mutaciones por deleción, por inserción, por substitución o las fusiones conducen a genes mutados por deleción por inserción, por substitución o a genes de fusión y en el plano de las proteínas conducen a las correspondientes variantes por deleción, por inserción o por substitución, o bien las proteínas de fusión.

Se entenderán por fragmentos todas aquellas proteínas o péptidos que sean menores que la proteína natural o que aquellas proteínas que correspondan a los genes completamente traducidos y que, por ejemplo, también pueden ser obtenidos de manera por vía de síntesis. Debido a sus secuencias de aminoácidos pueden asociarse con la correspondiente proteína completa. A modo de ejemplo pueden tomar las mismas estructuras o pueden ejercer las actividades amilolíticas o las actividades parciales tal como por ejemplo la transformación en complejo de un substrato. En principio son equivalentes los fragmentos y las variantes de deleción de las proteínas de partida; mientras que los fragmentos representan trozos más bien pequeños, los mutantes por deleción carecen por el contrario sólo de regiones cortas y por lo tanto, sólo de algunas funciones parciales.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por proteínas quiméricas o híbridas, aquellas proteínas que estén constituidas por elementos que procedan de manera natural de diversas cadenas polipéptidas procedentes del mismo organismo o procedentes de organismos diversos. Este modo de proceder se denominará también shuffling o mutagénesis por fusión. El objeto de una fusión de este tipo puede consistir, por ejemplo, en la obtención o en la modificación de una determinada función enzimática con ayuda de la parte de la proteína que ha sido introducida por fusión.

Se entenderán por proteínas, obtenidas por medio de la mutación por inserción, aquellas variantes que hayan sido obtenidas a través de métodos en sí conocidos por medio de la introducción en las secuencias de partida de un fragmento de ácido nucleico o bien de un fragmento de proteína. Debido a su equivalencia de principio deben asociarse con las proteínas quiméricas. Éstas se diferencian de aquellas únicamente en la relación de tamaño entre la parte de la proteína no modificada y el tamaño de la proteína en su conjunto. La parte de la proteína foránea es en tales proteínas mutadas por inserción, menor que en las proteínas quiméricas.

Puede considerarse una mutagénesis por inversión, es decir una inversión parcial de la secuencia, como forma especial tanto de la deleción así como también de la inserción. Lo mismo es válido para un nuevo agrupamiento de diversas partes de la molécula que se desvíe de la serie original de los aminoácidos. Esta puede considerarse tanto como variante por deleción, como variante por inserción, así como también como variante shuffling de la proteína original.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por derivados aquellas proteínas cuya cadena original de los aminoácidos haya sido modificada por vía química. Tales derivatizaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por vía biológica en cooperación con la biosíntesis de proteínas por medio del organismo huésped. Con esta finalidad pueden emplearse métodos de la biología molecular. Sin embargo pueden llevarse a cabo también por vía química, por ejemplo por medio de la transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o por medio del enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. Un compuesto de este tipo puede estar constituido, por ejemplo, por otras proteínas que se enlacen sobre la proteína según la invención, por ejemplo, a través de compuestos químicos bifuncionales. Del mismo modo se entenderá por derivatización el enlace covalente sobre un soporte macromolecular.

En el sentido de la presente invención se agruparán todos los enzimas, las proteínas, los fragmentos y los derivados, en tanto en cuanto no deban ser citados explícitamente como tales, bajo el concepto de proteínas.

En el sentido de la presente invención se entenderán por vectores elementos constituidos por ácidos nucleicos, que contengan como región caracterizante de los ácidos nucleicos un gen determinado. Éstos son capaces de consolidarlo en una especie o en una línea celular a través de varias generaciones o de varias divisiones celulares como elemento genéticamente estable que se replica independientemente del resto del genoma. Los vectores son plásmidos especiales, en particular en el caso del empleo en bacterias, es decir que son elementos genéticos circulares. Se distingue en la genética por un lado entre aquellos vectores que sirvan para el almacenamiento y, por lo tanto, en cierta medida también para el trabajo de ingeniería genética, que se denominan vectores de clonación, y, por otro lado, aquellos que cumplan la función de realizar el gen interesado en la célula huésped, es decir que posibiliten la expresión y, por lo tanto, la biosíntesis de la proteína correspondiente. Estos vectores se denominan vectores de expresión.

Mediante comparación con los enzimas conocidos, que han sido depositados por ejemplo en general en bancos de datos accesibles, pueden deducirse partes de moléculas características a partir de la secuencia de los aminoácidos o de la secuencia de los nucleótidos, tales como, por ejemplo, elementos estructurales o la actividad enzimática de un enzima considerado. Una comparación de este tipo se lleva a cabo relacionando entre sí las series similares en las secuencias de los nucleótidos o de los aminoácidos de las proteínas consideradas. Esto se denomina homologación. Una asociación en forma de tabla de las posiciones correspondientes se denomina alineamiento. En el caso del análisis de las secuencias de los nucleótidos deben tenerse en consideración a su vez amabas cadenas complementarias y respectivamente, las tres pautas de lectura posibles; del mismo modo debe tenerse en consideración la degeneración del código genético y el uso del codón específico del organismo. Entre tanto se preparan alineamientos por medio de programas de ordenador, como por ejemplo por medio de los algoritmos FASTA o BLAST; esta forma de proceder ha sido descrita, por ejemplo, por los autores D. J. Lipman y W. R. Pearson (1985) en Science, tomo 227, página 1435-1441. Una agrupación de todas las posiciones coincidentes en las secuencias comparadas se denomina secuencia de consenso.

Una comparación de este tipo permite también una predicción sobre la similitud o sobre la homología de las secuencias comparadas entre sí. Esto se indica como porcentaje de identidad, es decir la parte de los nucleótidos idénticos o de los restos de aminoácidos idénticos sobre las mismas posiciones. Otro concepto de homología utilizado incluye también las variaciones conservadas, es decir los aminoácidos con una actividad química similar en este valor: de este modo se considerarán como intercambios conservados aquellos en los que haya sido intercambiado, por ejemplo, un aminoácido alifático (Gly, Ala, Val, Leu, Ile) por otro aminoácido alifático o uno aromático (Phe, Tyr, Trp) por otro aromático, formulado de manera general cuando se haya intercambiado un aminoácido por otro aminoácido que, sea capaz de ejercer una actividad química similar en caso dado teniendo con consideración el medio químico correspondiente dentro de la proteína. Por lo tanto se habla de porcentaje de similitud. Tales predicciones pueden realizarse a través de toda la proteína o de todo el gen o únicamente a través de regiones individuales, a ser asociadas respectivamente entre sí.

Las indicaciones sobre homología o sobre similitud pueden referirse tanto a la secuencia de los aminoácidos como también a la secuencia de los nucleótidos. En el caso de estos últimos se elimina, desde luego, el concepto utilizado de "conservado" y se habla únicamente de porcentaje de identidad.

Regiones homólogas de diversas proteínas son, en la mayoría de los casos, aquellas con elementos estructurales y/o con funciones iguales, que pueden reconocerse por las coincidencias en la secuencia primaria de los aminoácidos. Ésta se extiende hasta la total identidad en regiones pequeñas, denominadas casetes, que abarcan únicamente un reducido número de aminoácidos y que ejercen en la mayoría de los casos funciones esenciales para la actividad total. Se entenderán por las funciones de las regiones homólogas, las funciones parciales mínimas de la función ejercida por el conjunto de la proteína tal como por ejemplo la formación de enlaces simples por puentes de hidrógeno hasta la transformación en complejo de un substrato o de un complejo de metal de transición.

La actividad enzimática puede modificarse de manera cualitativa o cuantitativa por medio de otras regiones de la proteína, que no participen en la reacción propiamente dicha (por ejemplo en el desprendimiento y/o en la unión de enlaces químicos en el substrato). Esto se refiere, por ejemplo, a la estabilidad enzimática, a la actividad, a las condiciones de la reacción o a la especificidad con respecto al substrato.

Así pues, en el ámbito de la presente invención debe interpretarse ampliamente el concepto de actividad amilolítica: tanto la actividad correspondiente de una \alpha-amilasa, debida únicamente a los aminoácidos del centro catalíticamente activo, así como también cada una de las funciones auxiliares ejercidas por otras regiones parciales de la proteína, para la hidrólisis, o bien para la disociación de los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, deberán considerarse como función amilolítica según la invención, en tanto en cuanto la propia reacción que queda influenciada esté constituida por una actividad de amilasa y/o de CGTasa. El concepto de función amilolítica y/o de CGTasa abarca también sólo a tales funciones modificadas. Esto se debe a que, por un lado, no se conoce con exactitud cual de los restos de aminoácidos de la proteína según la invención cataliza realmente la hidrólisis, o bien la disociación y nueva ligadura de los enlaces y, por otro lado, no pueden excluirse definitivamente de antemano determinadas funciones individuales de la participación en la catálisis. A las funciones auxiliares o a las actividades parciales pertenecen, por ejemplo, el enlace de un substrato, de un producto semielaborado o de un producto final, la activación o la inhibición o la inducción de un efecto regulador sobre la actividad hidrolítica o bien glicolítica. En este caso puede tratarse, por ejemplo, también de la formación de un elemento estructural que esté alejado del centro activo o puede tratarse de un péptido de señal, cuya función se refiera a la secreción de la proteína formada desde la célula y/o a su plegado correcto y sin que se forme in vivo, por regla general, un enzima capaz de ejercer una función.

Especialmente los dominios C y/o D, presentes en las CGTasas son asociados, en el sentido de la presente invención, igualmente con funciones amilolíticas y/o de CGTasas puesto que desde el punto de vista de u mecanismo catalizan un tipo especial de la disociación de los enlaces \alpha-(1,4)-glicosídicos, en concreto la transglicosilación intramolecular. Los productos de la reacción son, además de las ciclodextrinas, los almidones y/o los polímeros similares a los almidones degradados de manera correspondiente, como los que pueden ser obtenidos, por ejemplo, también por medio de la hidrólisis catalizada con las \alpha-amilasas.

El concepto de actividad de CGTasa debe interpretarse, por los mismos motivos que han sido expuestos para la actividad amilolítica, igualmente en el sentido más amplio y se refiere también a las partes mínimas de la molécula que ejerzan un influjo sobre la síntesis de las ciclodextrinas, que se verifica por medio de la degradación de los compuestos similares al almidón. En este sentido debe considerarse especialmente también como actividad de la CGTasa, la actividad de los dominios A, B y C.

Se entenderá por rendimiento de un enzima su actividad en el sector industrial considerado en cada caso. Esto se basa en la actividad enzimática propiamente dicha, sin embargo depende también de otros factores que son relevantes para el proceso correspondiente. A éstos pertenecen, por ejemplo, la estabilidad, el enlace con el substrato, la interacción con el material que porta al substrato o con las interacciones con otros componentes, especialmente las sinergias. De este modo se considerará por ejemplo en los ensayos dirigidos a determinar si un enzima es adecuado para el empleo en los agentes para el lavado o en los agentes para la limpieza, su contribución para el rendimiento del lavado o de la limpieza de un agente formulado con otros componentes. Para diversas aplicaciones industriales puede desarrollarse adicionalmente y puede optimarse un enzima, entre otras cosas por medio de las técnicas de la biología molecular en sí conocidas, especialmente por medio de las que han sido precedentemente citadas, es decir que pueden mejorarse en su rendimiento, por ejemplo con respecto a su contribución al rendimiento del lavado o de la limpieza de un agente correspondiente.

El enzima, según la invención, de una forma de realización especialmente preferente puede obtenerse por medio del aislamiento a partir del sobrenadante del cultivo de Bacillus agaradherens DSM-9948, es decir a partir del organismo del que se forma de manera natural. Éste ha sido depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional para el depósito de microorganismos del 28 de abril de 1977 en la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares sociedad limitada (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) residente en Braunschweig (DSMZ). Éste porta en dicha colección la designación C/M 1-6 y el número de entrada DSM 9948 (DSM ID 94-759). Los datos determinantes sobre las características de este material biológico, como los que han sido determinados por la DSMZ en el momento del depósito, se han reunido en la tabla 1 siguiente.

TABLA 1 Propiedades microbiológicas del Bacillus agaradherens (DSM 9948) (determinado por la DSMZ el 20.4.1995)

1

2

3

Tal como ha podido comprobarse ahora, sorprendentemente, más allá de esta caracterización, el enzima amilolítico, producido por esta cepa presenta propiedades que lo predestinan para diversas posibilidades de empleo, entre las cuales se cuentan las de componentes activos en los agentes para el lavado y la limpieza. Éste puede caracterizarse bioquímicamente, tal como puede realizarse por medio de los ejemplos de la presente solicitud, de la siguiente manera:

El enzima nativo de la cepa, Bacillus agaradherens (DSM 9948), que presenta actividad amilolítica y CGTasa presenta en la electrofóresis de SDS-gel de poliacrilo, desnaturalizante, un peso molecular aparente de 89 kD (ejemplo 7), mientras que puede deducirse a partir de la secuencia de proteínas, que abarca 713 aminoácidos (SEQ ID NO. 2) un peso molecular de 88,9 kD, o bien sin péptido de señal de 76,4 kD (ejemplo 3). Otras CGTasas, por ejemplo procedentes de Bacillus stearothermophilus o Thermoanaerobacter thermosulfurogenes presentan valores comparables, concretamente con tamaños de 710 y 711 aminoácidos, pesos moleculares de 78,9, o bien de 78,4 kD (véase también la publicación: Nakamura et al., FEBS-Letters, 296 (1992), páginas 37-40). Según la focalización isoeléctrica, el punto isoeléctrico del enzima nativo procedente de B. agaradherens (DSM 9948) es de 6,0 (ejemplo 7).

En un ensayo de actividad, que está dirigido especialmente a la formación de ciclodextrina (ejemplo 8), el sobrenadante del cultivo no purificado de B. agaradherens (DSM 9948) presenta ya una actividad de CGTasa. Al mismo tiempo dispone de una actividad de amilasa, que puede ser medida (ejemplo 9). Además dispone hasta, al menos, 50ºC, de una amplia estabilidad a la temperatura, a valores del pH comprendidos entre 5 y 12 dispone de una amplia estabilidad frente a las oscilaciones del valor del pH y, además, dispone de una cierta estabilidad frente a los tensioactivos y a las proteasas (ejemplo 9).

La secuencia de nucleótidos, que abarca 2142 bp, de este enzima ha sido dada en el protocolo de secuencias bajo la denominación SEQ ID NO. 1. Por lo tanto está disponible por ejemplo para desarrollos ulteriores con ayuda de métodos de la biología molecular en sí conocidos. La secuencia de aminoácidos, que abarca 713 aminoácidos, de este enzima está dada en el protocolo de secuencias bajo la denominación SEQ ID NO. 2.

Las proteínas que presentan una similitud suficiente con el mismo representan formas de realización de la presente invención.

El objeto de la presente solicitud está constituido, por lo tanto, por proteínas que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO. 2, de una manera más preferente, al menos en un 65%, en un 67,5%, en un 70%, en un 72,5%, en un 75%, en un 77,5%, en un 80%, en un 82,5%, en un 85%, en un 87,5%, en un 90%, en un 92,5%, en un 95%, en un 96%, en un 97%, en un 98%, en un 99% o en un 100%.

Ambas proteínas conocidas más parecidas, conocidas hasta el 25.5.2000 están constituidas según una investigación realizada en el banco de datos (ejemplo 4) por las CGTasas procedentes de Bacillus stearothermophilus (Q9ZAQ0) y Thermoanaerobacter thermosulfurogenes (P 26827; ambas denominaciones según la enumeración del banco de datos de Swiss-Prot; Geneva Bioinformatics, Ginebra, Suiza; http://www.genebio.com/sprot.html). Ambas presentan homologías en las secuencias con respecto a la CGTasa, según la invención, procedente de B. agaradherens (DSM 9948) con una identidad del 56% en el plano de las proteínas. Si se tienen en consideración los intercambios de aminoácidos conservados, se deducen valores del 68% respectivamente. La proteína, según la invención, se caracteriza de manera inequívoca como CGTasa por medio de la similitud de las regiones homólogas, especialmente de los dominios A, B, C, D y E. Proteínas emparentadas representativas han sido mostradas en el alineamiento de la figura 1. El enzima más parecido con los dominios A hasta C, una CGTasa, dispone con respecto a éstos de una homología con una identidad del 60,1% en el plano de los aminoácidos. En el plano del ADN el enzima más parecido dispone de una homología con una identidad del 61,1%.

La homología con respecto a las \alpha-amilasas conocidas se encuentra claramente por debajo de este valor. A través de los dominios A, B y C existe por ejemplo con respecto a las \alpha-amilasas, que pueden ser adquiridas bajo el nombre Termamyl®, procedentes de Bacillus licheniformis, es decir con respecto a las posiciones 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2 de la presente solicitud, una homología con únicamente una identidad del 30%.

Son preferentes, respectivamente, aquellas desviaciones de las secuencias indicadas, que representen intercambios de aminoácidos conservados.

Entre las variantes que se encuentran dentro de las regiones de similitud anteriormente indicadas son especialmente preferentes aquellas que presenten propiedades optimadas en lo que se refiere a las posibilidades de aplicación previstas. Éstas pueden prepararse, como ya se ha descrito al principio, según métodos en sí conocidos, preferentemente de la biología molecular. A modo de ejemplo sería posible, también, someter a una deleción, en aplicación de las enseñanzas de la solicitud WO 94/18314, a los restos de metionina, de triptofano, de cisteína y/o de tirosina de las proteínas según la invención y/o llevar a cabo su substitución por restos de aminoácidos que tengan una menor facilidad para la oxidación. De este modo puede mejorarse la estabilidad frente a la oxidación, el perfil de la actividad con respecto al pH y/o la estabilidad térmica. Desarrollos ulteriores a través de mutagénesis puntual específica pueden orientarse, por ejemplo, según las solicitudes WO 99/09183 y WO 99/23211.

La región homóloga reivindicada es válida para la longitud completa de la proteína, es decir para las posiciones 1 hasta 713, de una manera más preferente sin embargo para proteínas parciales, que se extienden desde la posición 35 hasta la posición 713 o desde la posición 35 hasta la posición 526.

Estas secuencias parciales, es decir las proteínas maduras, tienen, por lo tanto, un interés especial puesto que los primeros 34 aminoácidos, tal como puede deducirse por la secuencia de aminoácidos, representan el péptido de señal importante para la producción.

Éste se disocia probablemente in vivo tras la segregación de tal manera, que se ejercerán las actividades amilolíticas o bien de CGTasa propiamente dichas por las partes restantes de la proteína. De este modo probablemente no tienen ningún significado los aminoácidos 1 hasta 34 para la actividad enzimática en el sentido estricto de la palabra, pero sí son significativos para la producción, con lo cual no quedan excluidos del ámbito de protección de la presente invención, sin embargo son preferentes las partes restantes.

Las proteínas emparentadas, suficientemente similares, procedentes de otros organismos pueden presentar oscilaciones en cuanto al tamaño del péptido de señal. No son inusuales longitudes comprendidas entre 20 y 40 aminoácidos, por lo tanto se aumenta con las posiciones citadas 1 hasta 34 en la secuencia parcial la probabilidad de ser considerado como el péptido de señal. Por lo tanto si se pusiese de manifiesto que el péptido de señal es otro, será válido lo que se ha indicado precedentemente, de manera análoga, para el péptido de señal real, o bien para las proteínas maduras reales.

Especialmente, tiene un gran interés cada molécula o cada parte de la molécula, que corresponda a las posiciones 35 hasta 492 y, por lo tanto, los dominios A, B y C de la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948). Esto se debe a que sólo esta parte puede ejercer una función amilolítica sin las regiones restantes. Esto puede ser suficiente para un gran número de aplicaciones y, por lo tanto, el hecho de desistir a las regiones restantes puede tener un efecto conveniente, por ejemplo puede ser más económica la obtención de la proteína. Esto ocurre, especialmente, cuando se anteponga la hidrólisis de compuestos similares al almidón frente a la síntesis de la ciclodextrina.

En el alineamiento de la figura 1 se ha caracterizado la región de transición de los dominios C y D por medio de una doble flecha cerca de la posición 530; la serie de aminoácidos VWE (posiciones 524 hasta 526 según la SEQ ID NO.2) se asocia todavía al dominio C, mientras que la serie de aminoácidos PSI (posiciones 535 hasta 537 según la SEQ ID NO. 2) se asocia ya con el dominio D.

La región de similitud abarca de una manera más preferente también todas las proteínas que ejerzan actividad amilolítica y/o de CGTasa, que se deriven de una secuencia de nucleótidos, que sea idéntica con respecto a la secuencia de nucleótidos, indicada en la SEQ ID NO. 1, de manera más preferente, al menos en un 65%, en un 67,5%, en un 70%, en un 72,5%, en un 75%, en un 77,5%, en un 80%, en un 82,5%, en un 85%, en un 87,5%, en un 90%, en un 92,5%, en un 95%, en un 96%, en un 97%, en un 98%, al menos en un 99% o en el 100%.

Esto es válido, de acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente, especialmente para aquellas regiones parciales de la proteína que correspondan a los aminoácidos 35 hasta 713 o a las posiciones 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2 y para los intercambios preferentes correspondientes en las posiciones individuales.

Otras formas de realización de la presente invención son los fragmentos de proteína que presenten actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa o a las proteínas que pueden ser obtenidas por medio de la mutación por deleción dentro de la región de similitud anteriormente reivindicada.

En el sentido de la presente invención, se entenderán por fragmentos según la invención todas las proteínas o péptidos que sean menores que aquellas proteínas que correspondan a las de las SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2, pero que sean suficientemente homólogas con las mismas en las secuencias parciales correspondientes. En tanto en cuanto presenten una actividad amilolítica y/o una actividad de CGTasa, éstas representan formas de realización de la presente invención. Esto se refiere por ejemplo a aquellos fragmentos que contribuyan a la formación de un complejo con un substrato o que contribuyan a la formación de un elemento estructural necesario para la hidrólisis. Los fragmentos pueden estar constituidos, por ejemplo, por dominios individuales o pueden estar constituidos por trozos que no coincidan con los dominios. Tales fragmentos pueden prepararse de manera más económica, sin que tengan ya determinadas características eventualmente negativas de la molécula de partida, tal como posiblemente un mecanismo de regulación que reduzca la actividad, o pueden desarrollar un perfil de actividad más conveniente. Tales fragmentos de proteínas pueden prepararse también por vía no biosintética, sino, por ejemplo, por vía química. La síntesis química es ventajosa, por ejemplo, cuando después de la síntesis deban llevarse a cabo modificaciones químicas.

Los fragmentos deben asociarse, también, a las proteínas obtenidas por medio de la mutación por deleción debido a su equivalencia de principio. La mutagénesis por deleción está especialmente indicada para la eliminación de regiones inhibidoras. Como resultado puede producirse con la deleción tanto una especialización como también una ampliación del espectro de aplicación de la proteína. En tanto en cuanto se mantenga, se modifique, se especifique o solamente se alcance entonces de este modo una función amilolítica y/o una función de CGTasa en el sentido más amplio de la palabra, las proteínas obtenidas por medio de la mutación por deleción estarán constituidas, igual que en el caso de los fragmentos, por proteínas según la invención; la única condición previa adicional a este respecto consiste en que las secuencias parciales homólogas, presentes todavía, se encuentren dentro de la región de similitud indicada ya anteriormente con respecto a las secuencias SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2.

Como fragmentos, formados por vía natural, o bien proteínas mutadas por deleción pueden considerarse también las proteínas y los péptidos de señal que pueden ser obtenidos a partir las preproteínas por medio de la disociación de los aminoácidos N-terminales. Un mecanismo de disociación de este tipo puede emplearse, por ejemplo, para establecer de antemano puntos de corte específicos en las proteínas recombinantes con ayuda de determinadas regiones de la secuencia, que son reconocidas por las peptidasas de señal. Por lo tanto pueden llevarse a cabo la activación y/o la desactivación in vitro de las proteínas según la invención.

Tiene un interés especial las partes de las proteínas según la invención, que contengan uno o varios de los dominios A, B y C, que ejerzan una actividad disociadora de los almidones comparable con la de las \alpha-amilasas típicas. Especialmente estos fragmentos sin función de CGTasa propiamente dicha quedan abarcados por el ámbito de protección de la presente invención. Esto se debe a que algunas aplicaciones, tal como por ejemplo la simple hidrólisis de los almidones o como componentes activos de los agentes para el lavado o la limpieza no requieren obligatoriamente la síntesis simultánea de las ciclodextrinas.

A la inversa, especialmente los dominios D y E pueden emplearse para la síntesis o para la modificación de los almidones o de los polisacáridos similares a los almidones o de las ciclodextrinas. Para ello puede ser adecuado someter a una deleción a partes individuales de los dominios citados en la parte anterior de las proteínas según la invención.

Otras formas de realización de la presente invención consisten en proteínas que presentan actividad amilolítica y/o de CGTasa, que pueden ser obtenidas por medio de la mutación por inserción o proteínas quiméricas, que estén constituidas por una proteína o por un fragmento descritos hasta ahora, al menos en una parte que proporcione la actividad amilolítica y/o que proporcione la actividad de CGTasa.

Las proteínas quiméricas según la invención presentan en el sentido más amplio de la palabra una actividad amilolítica y/o una actividad de CGTasa. Ésta puede ser ejercida o modificada por una molécula que se derive de una proteína según la invención y que se encuentre dentro de la región de similitud reivindicada. Las proteínas quiméricas pueden encontrarse a lo largo de toda su longitud, así pues, también, fuera de la región reivindicada. El sentido de una fusión de este tipo puede consistir, por ejemplo, con ayuda de la parte de la proteína insertada por fusión, según la invención, en introducir o en modificar una fusión amilolítica o la hidrólisis o la nueva unión de los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, la síntesis de la ciclodextrina o una función favorecedora. En el sentido de la presente invención carece de importancia el que una proteína quimérica esté constituida por una cadena péptida individual o por varias subunidades, entre las cuales puedan estar distribuidas las diversas funciones. Para la realización de las alternativas citadas en último lugar es posible, por ejemplo, trocear en varias partes una cadena de polipéptido quimérica, individual en el plano de la postraducción o solamente después de una etapa de purificación, por medio de un corte proteolítico
específico.

De este modo es posible, por ejemplo de acuerdo con las publicaciones WO 99/57250 y WO 99/57254 dotar a una proteína o partes de la misma, según la invención, con dominios de enlace procedentes de otras proteínas por medio de enlazadores de tipo péptido o de enlazadores de tipo no péptido y, de este modo, configurar de manera más efectiva la hidrólisis del substrato. Tales construcciones se encuentran entonces dentro del ámbito de protección de la presente invención cuando ejerzan actividades amilolíticas y/o de CGTasa y las partes de la construcción, que ejercen esta función, tengan una similitud suficiente con respecto a las secuencias indicadas según la invención. Del mismo modo también pueden enlazarse proteínas según la invención por ejemplo con proteasas para ejercer una función doble.

Las proteínas según la invención, que pueden ser obtenidas por medio de la mutación por inserción, deben asociarse con las proteínas quiméricas según la invención debido a su equivalencia en principio. A éstas pertenecen también variantes por substitución, es decir aquellas en las cuales se ha reemplazado una región de la molécula por elementos de otras proteínas.

El sentido de las mutagénesis por inserción y por substitución consiste, como ocurre en el caso de la formación del híbrido, en combinar propiedades individuales de las proteínas según la invención con las de las otras proteínas. En este caso se trata de proteínas o de proteínas quiméricas, según la invención, obtenidas por medio de mutación por inserción o de mutación por substitución, cuando las regiones que se atribuyen por medio de su homología a las secuencias SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2 presenten valores de homología correspondientes al que se ha citado precedentemente y la proteína tenga una función amilolítica y/o una función de CGTasa en el sentido más amplio de la palabra, debido a estas regiones.

La mutagénesis por inversión, es decir una inversión parcial de la secuencia, puede ser considerada como una forma especial tanto de la deleción así como también de la inserción. Lo mismo es válido para un nuevo agrupamiento de diversas partes de la molécula, que se desvíe de la serie original de los aminoácidos. Éste puede considerarse tanto como variante por deleción, así como variante por inserción, así como, también, como variante shuffling de la proteína original.

Otras formas de realización de la presente invención son derivados de las proteínas descritas hasta ahora, que presenten actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa.

Se entenderán, bajo este concepto, aquellas proteínas que se deriven de proteínas que tengan en sí mismas actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa en el sentido de la solicitud. Éstas pueden ser, por ejemplo, aquellas proteínas que hayan sido modificadas después de su síntesis. Tales derivatizaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo por vía biológica, por ejemplo en relación con la síntesis de las proteínas pasando por el procesamiento por medio del organismo huésped productor. Sin embargo también pueden llevarse a cabo por vía química, por ejemplo por medio de la transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o por medio del enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. Éstos pueden estar constituidos por compuestos de bajo peso molecular o por macromoléculas tal como, por ejemplo, el polietilenglicol. Un compuesto de este tipo puede estar constituido, por ejemplo, también, por otras proteínas, que estén enlazadas sobre la proteína según la invención por ejemplo a través de compuestos químicos bifuncionales.

Tales modificaciones pueden influenciar, por ejemplo, la estabilidad, la especificidad con respecto al substrato o la fuerza de enlace sobre el substrato o pueden introducir un bloqueo provisional de la actividad enzimática cuando la substancia enlazada esté constituida por un inhibidor. Esto puede ser conveniente por ejemplo para el período de tiempo que dure el almacenamiento. Los polímeros enlazados pueden reducir por ejemplo también la alergenicidad y/o la inmunogenicidad del enzima y, por lo tanto, pueden aumentar por ejemplo su compatibilidad con la piel.

Otras formas de realización de la presente invención consisten en proteínas o derivados, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, que tengan, al menos, un determinante antígeno con una proteína o derivado precedentemente descritos.

Esto se debe a que son decisivos para las actividades enzimáticas los elementos estructurales secundarios de una proteína y su plegado tridimensional. De este modo pueden formar estructuras que son ampliamente coincidentes en el espacio, dominios que se diferencian claramente entre sí en cuanto a su estructura primaria y, de este modo, posibilitan comportamientos enzimáticos idénticos. Tales características comunes en la estructura secundaria son reconocidas usuales como determinantes antígenos coincidentes de antisueros o de anticuerpos puros o monoclonales. Por lo tanto pueden detectarse y asociarse proteínas o derivados parecidos entre sí por medio de reacciones cruzadas inmunoquímicas. Por lo tanto quedarán abarcadas en el ámbito de protección de la presente invención precisamente también aquellas proteínas que posiblemente no puedan ser asociadas por medio de sus valores de homología en la estructura primaria pero que puedan ser asociadas por medio de su parentesco inmunoquímico con las proteínas o con los derivados según la invención, precedentemente definidos.

Las variantes descritas pueden ser obtenidas con ayuda de métodos en sí conocidos (véase más adelante), especialmente con ayuda de métodos de la biología molecular, como los que se han descrito, por ejemplo, en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989. Con tales métodos pueden optimarse todavía más las proteínas según la invención, por ejemplo por medio de la mutagénesis puntual o por medio de la fusión con secuencias procedentes de otros genes. De este modo puede ampliarse el ámbito de aplicación de las proteínas según la invención. Esto es válido por ejemplo para las proteínas que sean menos sensibles frente a los efectos de la temperatura, frente a las oscilaciones del valor del pH, frente a las condiciones Redox y/o frente a otros efectos tales como, por ejemplo, los agentes de blanqueo o los agentes desnaturalizantes, especialmente los tensioactivos.

Las proteínas o los derivados, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, que corresponden a lo que se ha descrito hasta ahora y que proceden de fuentes naturales, son formas preferentes de realización de la presente invención, especialmente cuando se obtengan a partir de microorganismos.

Éstos pueden ser, por ejemplo, hongos o bacterias individuales. Esto se debe a que pueden manipularse en la mayoría de los casos de una manera más sencilla que los organismos policelulares o que los cultivos celulares derivados de los organismos policelulares; aún cuando éstos pueden representar opciones interesantes para formas de realización especiales y, por lo tanto, no quedan excluidos básicamente del objeto de la invención.

Son especialmente preferentes los que proceden de las bacterias gram-positivas, puesto que éstas no tienen membrana externa y por lo tanto las proteínas secretadas son directamente desprendidas en el medio circundante.

Son muy especialmente preferentes aquellos procedentes de bacterias gram-positivas del género Bacillus, puesto que éstos se han consolidado como organismos productores con un rendimiento de producción especialmente elevado en procesos industriales.

Entre aquellos que proceden de las especies Bacillus son preferentes a su vez aquellos que proceden de bacilos alcalífilos, especialmente los que proceden de la cepa Bacillus agaradherens y de forma muy especial preferente de B. agaradherens (DSM 9948). Esto se debe a que, originalmente, se obtuvo a partir de éste la forma de realización del enzima según la invención, cuya secuencia correspondiente está dada en el protocolo de secuencias y cuyas características enzimáticas han sido descritas en los ejemplos.

Son preferentes, respectivamente, aquellas cepas que segreguen en el medio circundante la proteína formada, que ejerza actividad amilolítica y/o la actividad de CGTasa. Es posible, ciertamente, que productores de origen natural puedan preparar un enzima según la invención, sin embargo lo expresan sólo en pequeñas cantidades bajo las condiciones determinadas en primer lugar y/o que lo segreguen en el medio ambiente. Sin embargo quedan abarcados por el ámbito de protección de la presente invención en tanto en cuanto exista la posibilidad de determinar experimentalmente las condiciones medioambientales adecuadas o los factores de bajo peso molecular o de otro tipo, bajo cuya acción puedan ser incitadas a una producción de la proteína según la invención, que permita considerar que es conveniente una utilización económica. Un mecanismo de regulación de este tipo puede emplearse específicamente para la producción biotecnológica, por ejemplo para la regulación de los promotores responsables.

De acuerdo con la obtención, la elaboración o la preparación de una proteína podrán comercializarse con otros productos diferentes, especialmente cuando esta proteína haya sido obtenida a partir de productores naturales. Sin embargo podrá combinarse específicamente también, independientemente de lo anterior, con otros productos determinados, por ejemplo para aumentar su estabilidad al almacenamiento. Por lo tanto, deben entenderse, bajo el concepto de proteína según la invención, además, también, todas las preparaciones de la proteína según la invención propiamente dicha. Esto ocurre igualmente de manera independiente de que en una determinada preparación se desarrolle o no realmente esta actividad enzimática. Esto se debe a que puede ser deseable que durante el almacenamiento no tenga ninguna actividad o que únicamente tenga una baja actividad y solamente desarrolle su función amilolítica en el momento de la utilización. Esto puede depender, por ejemplo, del estado de plegamiento de la proteína o resultar del enlace reversible de uno o varios productos acompañantes procedentes de la preparación o resultantes de otro mecanismo de control.

Las proteínas, según la invención, pueden protegerse, ante todo, durante el almacenamiento por medio de estabilizantes, por ejemplo contra la desnaturalización, la descomposición o la inactivación, por ejemplo debido a efectos físicos, a la oxidación o a la proteólisis. Muchas veces se emplearán también combinaciones de estabilizantes que se complementen o que se refuercen mutuamente.

De acuerdo con la obtención, la elaboración o la preparación de una proteína ésta podrá asociarse con otros productos diferentes. También puede combinarse específicamente con otros productos determinados, por ejemplo para aumentar su estabilidad al almacenamiento. Por lo tanto deben entenderse por el concepto de la proteína según la invención también todas las preparaciones de la proteína propiamente dicha según la invención. Esto es independiente de que en una determinada preparación se desarrolle o no realmente esta actividad enzimática. Esto se debe a que puede ser deseable que no tenga actividad o que únicamente tenga una actividad pequeña durante el almacenamiento y que despliegue su función amilolítica solamente en el momento de la utilización. Esto puede depender, por ejemplo, del estado de plegamiento de la proteína o puede resultar de la formación reversible de uno o varios productos acompañantes a partir de la preparación o de otros componentes del agente según la invención sobre una proteína según la invención o puede resultar de otro mecanismo de control.

Una proteína, esencial para la invención, puede protegerse, especialmente durante el almacenamiento por medio de estabilizantes, por ejemplo contra la desnaturalización, la descomposición o la inactivación, por ejemplo debido a los efectos físicos, a la oxidación o a la disociación proteolítica. Muchas veces se emplearán también combinaciones de estabilizantes que se complementen o que se refuercen entre sí.

Un grupo de estabilizantes son los inhibidores reversibles de la proteasa, que cuando se diluye el agente en el baño de la colada se separan por disociación. El hidrocloruro de la benzamidina y la leupeptina se han establecido para esta finalidad. Frecuentemente, se utilizan borax, ácido bórico, ácidos borónicos o sus sales o ésteres, entre los cuales, ante todo, derivados con grupos aromáticos, por ejemplo ácidos fenilborónicos ortosubstituidos según la publicación WO 95/12655, ácidos fenilborónicos metasubstituidos según la publicación WO 92/19707 y ácidos fenilborónicos parasubstituidos según la publicación US 5972873, o bien sus sales o ésteres. En las solicitudes WO 98/13460 y EP 583534 se divulgan peptidoaldehídos, es decir oligopéptidos con C-extremo reductor y, concretamente, aquellos constituidos por 2 hasta 50 monómeros, para la inhibición reversible de las proteasas en los agentes para el lavado y para la limpieza. A los inhibidores reversibles de la proteasa peptídicos pertenecen, entre otros, el ovomucoide (WO 93/00418). De manera ejemplificativa se divulgan con la solicitud WO 00/01826 inhibidores reversibles de péptidos, específicos, para la proteasa subtilisina para el empleo en los agentes que contienen proteasa y en la publicación WO 00/01831 se divulgan proteínas de fusión correspondientes constituidas por proteasas e inhibidor.

Otros estabilizantes de los enzimas son los aminoalcoholes tales como la mono-, la di-, la trietanol- y -propanola-
mina y sus mezclas, ácidos carboxílicos alifáticos con hasta 12 átomos de carbono inclusive, tales como, por ejemplo, los que se conocen por la solicitud EP 378261 y WO 97/05227, tales como el ácido succínico, otros ácidos dicarboxílicos o sales de los ácidos citados. Se divulgan en la solicitud DE 19650537 para esta finalidad alcoxilatos de amidas de ácidos grasos cerrados en los grupos extremos. Determinados ácidos orgánicos, empleados a modo de adyuvantes, son capaces, tal como se ha divulgado en la publicación WO 97/18287, de estabilizar adicionalmente un enzima contenido.

Otros estabilizantes de los enzimas, empleados frecuentemente, son los alcoholes alifáticos inferiores, ante todo, sin embargo, los polioles, tales como, por ejemplo, la glicerina, el etilenglicol, el propilenglicol o la sorbita. Del mismo modo, se utilizan sales de calcio, tal como por ejemplo el acetato de calcio o el formiato de calcio divulgado en la memoria descriptiva de la patente EP 028865 con esta finalidad, y las sales de magnesio, por ejemplo según la solicitud europea EP 378262.

Los oligómeros de poliamida (WO 99/43780) o los compuestos polímeros tales como la lignina (WO 97/00932), los copolímeros de vinilo solubles en agua (EP 828 762) o, como se ha divulgado en la publicación EP 702 712, los éteres de la celulosa, los polímeros acrílicos y/o las poliamidas estabilizan las preparaciones enzimáticas entre otras cosas frente a los efectos físicos o frente a las oscilaciones del valor del pH. Los polímeros que contienen N-óxidos de poliamina (EP 587550 y EP 581751) actúan simultáneamente como estabilizantes de los enzimas y como inhibidores del corrido de los colores. Otros estabilizantes polímeros son los polioxialquilenos con 8 hasta 18 átomos de carbono lineales divulgados en la publicación WO 97/05227 junto a otros componentes. Los alquilpoliglicósidos pueden estabilizar los componentes enzimáticos del agente según la invención como en las solicitudes WO 97/43377 y WO 98/45396 e incluso pueden acrecentar su rendimiento. Los compuestos que contienen N, reticulados, como los que se han divulgado en la publicación WO 98/17764, cumplen una doble función como agentes desprendedores de la suciedad (Soil-release) y como estabilizantes de los enzimas. Los polímeros hidrófobos, no iónicos, actúan en una mezcla con otros estabilizantes según la solicitud WO 97/32958 de manera estabilizante sobre una celulasa de tal manera, que
también pueden ser adecuados tales componentes u otros componentes similares para el enzima según la invención.

Los agentes reductores y los antioxidantes aumentan la estabilidad de los enzimas frente a la descomposición por oxidación como se ha divulgado entre otras, en la publicación EP 780466. Los agentes reductores que contienen azufre son conocidos, por ejemplo, por las memorias descriptivas de las patentes EP 080748 y EP 080223. Otros ejemplos son el sulfito de sodio (EP 533239) y los azúcares reductores (EP 656058).

Muchas veces se utilizan también combinaciones de estabilizantes, por ejemplo constituidas por polioles, por el ácido bórico y/o por el borax, como se ha divulgado en la solicitud WO 96/31589, la combinación de ácido bórico o del borato, de sales reductoras y del ácido succínico u otros ácidos dicarboxílicos, como se divulga en la solicitud EP 126505, o la combinación de ácido bórico o de borato con polioles o con compuestos poliamínicos y con sales reductoras, como se divulga en la solicitud EP 080223. El efecto de los estabilizantes péptido-aldehídicos se acrecienta, de acuerdo con la publicación WO 98/13462, por medio de la combinación con ácido bórico y/o con derivados del ácido bórico y polioles y se refuerza todavía más según la publicación WO 98/13459 por medio del empleo adicional de iones de calcio.

Los ácidos nucleicos, que codifican proteínas que ejerzan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa representan formas de realización de la presente invención en tanto en cuanto sean idénticos con la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, de una manera más preferente al menos en un 65%, en un 67,5%, en un 70%, en un 72,5%, en un 75%, en un 77,5%, en un 80%, en un 82,5%, en un 85%, en un 87,5%, en un 90%, en un 92,5%, en un 95%, en un 96%, en un 97%, en un 98%, al menos en un 99% o en el 100%. Esto es válido, de acuerdo con lo que se ha dicho preferentemente, especialmente para aquellas regiones parciales de la proteína que correspondan a los aminoácidos 35 hasta 713 o a las posiciones 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2.

Representan formas de realización especialmente preferentes aquellos ácidos nucleicos anteriormente indicados, que codifiquen una proteína, o un derivado, según la invención, que ejerzan una actividad amilolítica y/o una actividad de CGTasa.

Esto abarca también aquellas variantes que no se encuentren en el intervalo de similitud definido según la SEQ ID NO. 1 a través de toda la longitud de su secuencia, pero que sin embargo lo haga en regiones individuales. A éstas pertenecen, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que, como se ha indicado anteriormente, hayan sido obtenidas por medio de la mutación por inserción o por deleción, las proteínas quiméricas o los fragmentos de proteína. Del mismo modo, las construcciones denominadas antisentido, por ejemplo a través de una sección parcial individual, representan formas de realización de la presente invención, puesto que pueden emplearse para la regulación de la actividad amilolítica o bien de la actividad de CGTasa.

Los ácidos nucleicos forman el punto de partida para los ensayos de biología molecular y desarrollos más avanzados. Tales métodos están descritos, por ejemplo, en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York, 1989. Del mismo modo todos los métodos de ingeniería genética reunidos en el estado de la técnica por el concepto de ingeniería de las proteínas, y los métodos bioquímicos para proteínas están basados en el gen, especialmente en el gen clonado. Con los mismos pueden optimarse todavía más las proteínas según la invención desde el punto de vista de las diversas aplicaciones, por ejemplo por medio de la mutagénesis puntual o por medio de la fusión con secuencias procedentes de otros genes.

A las variantes de una proteína, según la invención, que pueden ser obtenidas a través de los métodos conocidos de la biología molecular, pertenecen, especialmente, aquellas con intercambios específicos de aminoácidos individuales o mutaciones puntuales estadísticas, deleciones de aminoácidos individuales o de secuencias parciales, fusiones con otros fragmentos o con otros enzimas, inserciones o inversiones. Tales mutaciones o modificaciones pueden representar, de acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente, formas de realización preferentes para aplicaciones específicas. Una mutagénesis de este tipo puede llevarse a cabo de manera específica o a través de métodos casuales. Esto puede combinarse, por ejemplo, con un procedimiento de reconocimiento y/o de selección (muestreo y selección), dirigido a continuación a la actividad con los genes clonados.

Otra forma de realización de la presente invención está representada por los organismos que forman, de manera natural, proteínas o derivados según la invención o que contienen ácidos nucleicos los codifiquen.

El caso citado en último lugar es significativo, por ejemplo, cuando ciertamente esté presente un gen correspondiente pero que no sea expresado bajo determinadas condiciones. Esto puede ser válido, también, en el caso en que no funcione la regulación de la expresión, para todo el ciclo de vida del organismo correspondiente.

Tales organismos pueden ser obtenidos por medio del empleo de técnicas conocidas en general, por ejemplo por medio del aislamiento de cepas procedentes de un habitat natural o por medio de un muestreo de bancos de genes. La secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, o partes de la misma, pueden emplearse en este caso, por ejemplo, como sonda para el muestreo o como muestra para la construcción del iniciador PCR correspondiente. De manera análoga pueden emplearse péptidos de cadena corta o péptidos completos con secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO. 2 para la formación de los antisueros correspondientes con cuya ayuda pueden identificarse organismos correspondientes, o bien las proteínas liberadas por los mismos.

De acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente se trata de una manera más preferente de un microorganismo de una monobacteria, de una bacteria gram-positivo, de un bacilo, de un bacilo alcalífilo, de Bacillus agaradherens y, especialmente, de Bacillus agaradherens (DSM 9948), que ha sido depositado en la Colección alemana de microorganismos y de cultivos celulares sociedad limitada (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) (véase más arriba).

Otras formas de realización de la presente invención representan vectores que contienen una región de ácidos nucleicos anteriormente definida, especialmente aquellos que codifiquen una proteína o derivado según la invención. De acuerdo con el campo de aplicación son preferentes los vectores de clonación y/o los vectores de expresión.

Los vectores representan formas consolidadas en el estado de la técnica para manipular los ácidos nucleicos; para ello se clonan en el vector elegido según métodos en sí conocidos. Los vectores se derivan, por ejemplo, de plásmidos bacterianos, de virus o de bacteriófagos, o vectores preponderantemente sintéticos o plásmidos con elementos de origen diverso. Éstos son capaces de estabilizarse en forma de unidades estables en las células huésped correspondientes durante varias generaciones. En este caso no tiene importancia en el sentido de la invención que se establezcan de manera extracromosómica como unidades propias o que se integren en un cromosoma. El sistema elegido entre el gran número de sistemas conocidos por el estado de la técnica, dependerá de cada caso particular. De manera ejemplificativa puede ser decisivo el número de copias alcanzable, los sistemas de selección disponibles, entre ellos ante todo la resistencia a los antibióticos, o la aptitud al cultivo de las células huésped capaces de alojar a los vectores.

Los vectores forman puntos de partida adecuados para los ensayos de biología molecular y bioquímicos del gen correspondiente o de la proteína correspondiente y para el desarrollo adicional según la invención y, finalmente, para la amplificación y la producción de la proteína según la invención. Las células, que contienen los vectores, especialmente con genes adicionales, se denominan células huésped; este concepto es especialmente familiar para aquellas células que expresen las proteínas según la invención.

Los vectores de clonación son formas de realización preferentes. Éstos son adecuados, además de para el almacenamiento, la amplificación biológica o la selección del gen interesado, para la caracterización del gen correspondiente, por ejemplo por medio del establecimiento de un mapa de restricción o por medio de la secuenciación. Los vectores de clonación representan, por lo tanto, también una forma transportable y almacenable de los ADN reivindicados. Éstos son también productos de partida preferentes para las tecnologías de biología molecular que no están relacionadas con la célula, tal como por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa.

Los vectores de expresión se diferencian de los vectores de clonación en aquellas secuencias parciales, que son capaces de replicarse en los organismos huésped optimados para la producción de proteínas y hacen que el gen obtenido se exprese en los mismos. Así pues éstos posibilitan la biosíntesis de las proteínas interesadas. Son formas preferentes de realización los vectores de expresión, que portan en sí mismos los elementos genéticos necesarios para la expresión. La expresión depende, por ejemplo, de los promotores, que regulan la transcripción del gen. De este modo, puede llevarse a cabo la expresión por medio del promotor natural, localizado originalmente por delante de este gen, así como también tras la fusión genética tanto por medio de un promotor preparado en el vector de expresión de la célula huésped como también por medio de un promotor modificado o de un promotor completamente diferente de otro organismo.

Son formas preferentes de realización los vectores de expresión que pueden regularse por medio de las modificaciones de las condiciones de cultivo o por medio de la adición de determinados compuestos, tal como por ejemplo la densidad celular o factores especiales. Los vectores de expresión posibilitan que la proteína correspondiente se produzca de manera heteróloga, es decir en otro organismo diferente de aquél en el cual puede obtenerse de manera natural. También se encuentra dentro del ámbito de protección de la presente invención una obtención homóloga de proteínas a partir de un organismo huésped que exprese el gen de manera natural a través de un vector adaptado. Esto puede presentar la ventaja de que se lleven a cabo reacciones de modificación naturales, que están relacionadas con la traducción, en la proteína formada del mismo modo que se produciría también de manera natural.

Representan otras formas de realización de la presente invención aquellas células que contengan uno de los ácidos nucleicos anteriormente indicados, preferentemente sobre un vector, anteriormente descrito.

Esto se debe a que puede utilizarse, por medio de las mismas, el correspondiente ácido nucleico según métodos en sí conocidos para la obtención de proteínas y de derivados según la invención. De manera ventajosa éstas contienen, con tal finalidad, los correspondientes vectores de clonación y/o de expresión. Por lo tanto, éstas representan formas de almacenamiento y de transporte para estos vectores, por ejemplo incluso para la transferencia a otros organismos, o sirven para la amplificación o la modificación del gen correspondiente. Tales células, que contienen los vectores de expresión y, por lo tanto, que son adecuadas para la biosíntesis de las proteínas correspondientes, sirven para la producción de las proteínas correspondientes.

Son formas de realización preferentes las células correspondientes, que expresan una de las proteínas o uno de los derivados según la invención o que pueden excitarse para su expresión, especialmente con empleo de un vector de expresión anteriormente definido.

Con la transferencia del gen a la célula huésped, que constituye su tansformación, es posible la síntesis in-vivo de una proteína según la invención. Como células huésped son adecuados en principio todos los organismos, es decir los procariotas, los eucariotas y los cianofitos. Son preferentes aquellas células huésped que puedan manipularse genéticamente bien, por ejemplo en cuanto a la transformación con el vector de expresión y a su establecimiento estable, por ejemplo hongos o bacterias individuales. Además las células huésped preferentes se caracterizan por una buena manipulabilidad microbiológica y biotecnológica. Esto se refiere por ejemplo a la fácil aptitud al cultivo, a las elevadas velocidades de crecimiento, a los reducidos requisitos exigidos a los medios de fermentación y a las buenas velocidades de producción y de secreción para la proteína foránea. Frecuentemente tienen que determinarse experimentalmente, de entre el gran número de los diversos sistemas disponibles según el estado de la técnica, los sistemas de expresión óptimos para cada caso particular. Cada una de las proteínas según la invención puede obtenerse de este modo a partir de una pluralidad de organismos huésped.

Representan formas preferentes de realización aquellas células huésped que pueden regularse en cuanto a su actividad debido a los elementos de regulación genéticos, que pueden estar disponibles por ejemplo en el vector de expresión, así como también que pueden estar presentes desde un inicio en estas células. De manera ejemplificativa pueden excitarse estas células para que produzcan la expresión por medio de la adición controlada de compuestos químicos, que sirven como activadores, por medio de la modificación de las condiciones de cultivo o cuando se alcance una determinada densidad celular. Esto posibilita una producción muy económica de las proteínas interesadas.

En una forma preferente de realización, las células huésped están constituidas por bacterias, especialmente aquellas que secreten en el medio ambiente la proteína, o el derivado, formados.

Esto se debe a que las bacterias se caracterizan frente a los eucariotas por regla general por medio de tiempos de generación más cortos y por menores exigencias en lo que se refiere a las condiciones de cultivo. De este modo pueden consolidarse procedimientos económicos para la obtención de las proteínas según la invención. Especialmente las bacterias gram-positivas, por ejemplo los bacilos, no tienen una membrana externa de tal manera que la proteína secretada puede ser liberada al mismo tiempo en el medio nutriente que circunda las células, a partir del cual pueden purificarse directamente las proteínas expresadas, según la invención, según otra forma preferente de realización. Sin embargo se han desarrollado también (véase más adelante) sistemas similares para las bacterias gram-negativas.

Una variante de este principio de ensayo está representada por sistemas de expresión en los que genes adicionales, por ejemplo aquellos que están disponibles en otros vectores, influyen sobre la producción de las proteínas según la invención. En este caso puede tratarse de productos genéticos modificados o puede tratarse de aquellos que deban ser purificados conjuntamente con la proteína según la invención por ejemplo para influenciar sobre su función enzimática. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de otras proteínas o enzimas, de inhibidores o de aquellos elementos que influyen la interacción con diversos substratos.

En una forma preferente de realización, la célula huésped según la invención para la producción de las proteínas o de los derivados según la invención, están constituidas por aquellas que pertenecen al género Bacillus, especialmente de las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

De este modo, por ejemplo, una forma de realización de la presente invención utiliza el propio B. agaradherens (DSM 9948) para expresar de manera homóloga proteínas según la invención. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio de un vector incorporado, que introduzca en estas células el gen ya presente de manera endógena, o modificaciones del mismo según la invención, por ejemplo en un gran número de copias. Esto puede ser especialmente ventajoso cuando la proteína deba sufrir modificaciones después de su síntesis, que sean llevadas a cabo adecuadamente por la propia célula correspondiente.

Por el contrario es preferente, sin embargo, la expresión heteróloga y concretamente, en particular en cepas del género Bacillus. De este modo se ha llevado a cabo en el ejemplo 5 de la presente solicitud una expresión heteróloga en B. subtilis. Son muy especialmente preferentes los de las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus. Esto se debe a que con éstos se han adquirido amplias experiencias en la producción industrial.

En una forma preferente de realización, las células huésped según la invención están constituidas por bacterias gram-negativas.

Esto es válido, especialmente, para aquellas que sirvan para la clonación y/o para la modificación por ingeniería genética de los ácidos nucleicos obtenidos según la invención puesto que se han adquirido para ello las máximas experiencias con bacterias gram-negativas, especialmente con Escherichia coli.

En el caso de las bacterias gram-negativas se secretará, por regla general, una pluralidad de proteínas en la cavidad periplasmática, es decir en el compartimento comprendido entre ambas membranas que encierran a las células. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales.

En una forma preferente de realización, las bacterias gram-negativas, según la invención, están constituidas por aquellas de los géneros Escherichia, preferentemente de las especies Escherichia coli o Klebsiella, de forma especialmente preferente aquellas de las cepas E. coli JM 109, E. coli DH 100B, E. coli DH 12S o Klebsiella planticola (Rf).

Esto se debe a que se han descrito entretanto sistemas para tales bacterias, según los cuales pueden emplearse también para la producción de proteínas extracelulares. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT/EP01/04227.

En otras formas de realización, las células según la invención están constituidas por células eucariotas, especialmente aquellas que expresen la proteína, de manera muy especialmente preferente, las que modifiquen en el plano de la postraducción a la proteína.

Éstas pueden aprovecharse también para la clonación según métodos consolidados en el estado de la técnica. Preferentemente se utilizarán sin embargo para la producción de las proteínas según la invención. Esto es especialmente ventajoso, por ejemplo, cuando las proteínas deban recibir modificaciones específicas en relación con su síntesis, que posibiliten tales sistemas. A éstas pertenecen por ejemplo el enlace de compuestos de bajo peso molecular tales como anclajes con la membrana u oligosacáridos. Ejemplos de las células eucariotas, que pueden ser empleadas preferentemente para esta finalidad, son los hongos tales como los actinomicetes o las levaduras tales como Saccharomyces o Kruyveromyces.

Otro objeto de la invención consiste en procedimientos para la obtención de una proteína o de un derivado según la invención con empleo de un ácido nucleico definido anteriormente según la invención y/o con empleo de un organismo definido anteriormente según la invención y/o con empleo de un vector definido anteriormente según la invención y/o con empleo de una célula definida precedentemente según la invención

Entre éstos se cuentan todos los procedimientos en sí conocidos, que estén basados en uno de los elementos anteriormente indicados. De este modo pueden combinarse en principio todos los elementos ya descritos para dar procedimientos para la obtención de las proteínas según la invención. En este caso puede imaginarse para cada proteína según la invención una pluralidad de posibilidades de combinaciones de etapas del procedimiento. El procedimiento óptimo debe ser determinado experimentalmente para cada caso concreto individual, por ejemplo en función del tamaño y de la identidad del gen, del tipo de las mutaciones, de las propiedades de la cepa huésped, tal como por ejemplo la utilización de codón (codon-usage) o del sistema de selección.

En principio, se procederá de la siguiente manera: los ácidos nucleicos, según la invención, se encajan en un vector de expresión adecuado, convenientemente en forma de un ADN -en caso dado tras formación, modificación y/o almacenamiento provisional en un vector de clonación-. Este vector se transforma en la célula huésped adecuada para la expresión, por ejemplo en células de una cepa bacteriana que pueda ser fácilmente cultivada, que descargue en el medio nutriente circundante las proteínas, cuyos genes se encuentren bajo el control de los elementos genéticos correspondientes; los elementos reguladores para esta finalidad pueden ser proporcionados por ejemplo por el vector de expresión. A partir del medio circundante puede purificarse la proteína según la invención a través de varias etapas de purificación tales como, por ejemplo, filtraciones, precipitaciones o cromatografías. Un técnico en la materia es capaz de extrapolar a escala de producción industrial un sistema que haya sido optimado experimentalmente a escala de laboratorio.

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En cada una de las etapas de este procedimiento se presentan posibilidades de variaciones, que son familiares para el técnico en la materia y que pueden ser aprovechadas según el resultado deseado (mutación, rendimiento, aptitud para la transformación, etc.). También pueden ser formas de realización de la presente invención por ejemplo los sistemas de expresión exentos de células, en los cuales se lleve a cabo la síntesis de las proteínas in vitro. Tales sistemas de expresión están igualmente consolidados en el estado de la técnica.

A continuación se indicarán los campos de aplicación industrial más importantes para las proteínas según la invención. Se ha indicado un gran número de posibilidades de aplicación, consolidadas en la industria, para los enzimas amilolíticos en manuales, tal como por ejemplo en el libro "Industrial enzymes and their applications" de H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. La recopilación siguiente no deber ser considerada como una enumeración excluyente sino que representa una selección de los campos especialmente relevantes. Si se descubriese que algunas proteínas, comprendidas dentro de la región de similitud, fuesen adecuadas para posibilidades de aplicación adicionales no reivindicadas expresamente en este caso, debido a sus propiedades enzimáticas, es decir a sus propiedades amilolíticas y/o de CGTasa, éstas quedan comprendidas por la presente en el ámbito de protección de la presente inven-
ción.

Un campo de aplicación importante de los enzimas amilolíticos es el de los componentes activos en los agentes para el lavado o para la limpieza, para la limpieza de textiles o de superficies duras.

Esto es válido, especialmente, también para aquellas proteínas o derivados, según la invención, en los que hayan sido sometidos a deleción a los dominios D y E desistiéndose a la actividad de CGTasa, que sin embargo sean adecuados para el empleo para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras debido a su actividad amilolítica. Esto puede ser suficiente para un gran número de aplicaciones, especialmente cuando se anteponga la hidrólisis de los compuestos similares a los almidones, con respecto a la síntesis de la ciclodextrina. Por lo tanto el hecho de desistir a las regiones restantes es más conveniente, por ejemplo es más económico para la obtención de las proteínas.

Por otro lado, las proteínas según la invención con actividad de CGTasa pueden desarrollar además del rendimiento de limpieza un efecto desodorante. Esto se debería posiblemente a que quedan ocluidos compuestos correspondientes de bajo peso molecular en los compuestos de ciclodextrina formados y, de este modo, quedan enmascarados.

Un objeto de la invención representa, por lo tanto, agentes para el lavado o la limpieza caracterizados porque contienen una proteína o derivado según la invención, precedentemente descritos.

La actividad amilolítica sirve en estos agentes para disolver hidrolíticamente a las impurezas que contengan hidratos de carbono, especialmente las impurezas similares a los almidones y/o para desprenderlas del soporte. Ésta se complementa preferentemente por medio de la actividad de CGTasa, por ejemplo en lo que se refiere a la liberación o al enmascarado de los productos acompañantes. Estos agentes se caracterizan porque los enzimas, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa y los componentes restantes actúan de manera sinérgica para la eliminación de las impurezas, por ejemplo por medio de la solubilización de los productos de la hidrólisis de las proteínas amilolíticas por medio de otros componentes de los agentes tales como, por ejemplo, los tensioactivos.

Una proteína, o un derivado, según la invención puede encontrar aplicación en agentes para el consumo a gran escala o para los usuarios industriales así como también en productos para el consumidor privado, representando todas las formas de comercialización consolidadas en el estado de la técnica también formas de realización correspondientes de la presente invención.

Con ello quieren indicarse todos los tipos imaginables de agentes de limpieza, tanto concentrados como también agentes que deban ser empleados en forma no diluida; para el empleo a escala industrial, es decir a escala comercial en máquinas lavadoras o lavavajillas o en el caso de la colada o bien de la limpieza individual, es decir manual. A éstos pertenecen, por ejemplo, agentes de lavado para textiles, alfombras o fibras naturales, para los que se utiliza según la presente invención la denominación de agentes de lavado. A éstos pertenecen, por ejemplo, también agentes para el fregado de la vajilla para máquinas lavavajillas, agentes para el fregado a mano de la vajilla o limpiadores para superficies duras tales como metal, vidrio, porcelana, cerámica, baldosines, piedra, superficies barnizadas, materiales sintéticos, madera o cuero; para los que se empleará, según la presente invención, la denominación de agentes de limpieza. Cualquier tipo de agente de limpieza representa una forma de realización de la presente invención en tanto en cuanto se enriquezca con una proteína según la invención.

Las formas de realización de la presente invención abarcan todas las formas de administración de los agentes según la invención establecidas según el estado de la técnica y/o convenientes. A éstas pertenecen, por ejemplo, los agentes sólidos, pulverulentos, líquidos, en forma de gel o pastosos, en caso dado incluso constituidos por varias fases, comprimidos o no comprimidos; además pertenecen por ejemplo a éstos: cuerpos extruidos, granulados, tabletas o bolsitas, tanto en grandes envases como también envasados en porciones.

Además de una proteína o de un derivado según la invención, el agente según la invención contiene, en caso dado, otros componentes tales como tensioactivos, por ejemplo tensioactivos no iónicos, aniónicos y/o anfóteros, y/o agentes de blanqueo, y/o adyuvantes, así como, en caso dado, otros componentes usuales, que se explicarán a más adelante.

Como tensioactivos no iónicos se utilizan, preferentemente, alcoholes alcoxilados, ventajosamente etoxilados, especialmente primarios, con preferentemente de 8 a 18 átomos de carbono y, en promedio, de 1 a 12 moles de óxido de etileno (EO) por mol de alcohol, en los que el resto de alcohol puede ser lineal o preferentemente ramificado con metilo en posición 2 o bien puede contener restos lineales y ramificados con metilo mezclados, de la manera en que están presentes usualmente en los restos de oxoalcoholes. Sin embargo, son preferentes, especialmente, los etoxilatos de alcoholes con restos lineales, a partir de alcoholes de origen natural con de 12 a 18 átomos de carbono, por ejemplo de alcoholes grasos de coco, de palma, de sebo o alcohol oleico, y, en promedio, desde 2 hasta 8 EO por mol de alcohol. A los alcoholes etoxilados preferentes pertenecen, por ejemplo, los alcoholes con de 12 a 14 átomos de carbono con 3 EO o con 4 EO, los alcoholes con 9 a 11 átomos de carbono con 7 EO, los alcoholes con de 13 a 15 átomos de carbono con 3 EO, 5 EO, 7 EO u 8 EO, los alcoholes con de 12 a 18 átomos de carbono con 3 EO, 5 EO o 7 EO y mezclas de los mismos, tales como mezclas de alcoholes con 12 a 14 átomos de carbono con 3 EO y alcoholes con 12 a 18 átomos de carbono con 5 EO. Los grados de etoxilación indicados representan valores medios estadísticos, que, para un producto especialmente pueden ser un número entero o un número fraccionario. Los etoxilatos de alcohol preferentes presentan una distribución restringida de homólogos (narrow range ethoxylates, NRE). Además de estos tensioactivos no iónicos pueden utilizarse también alcoholes grasos con más de 12 EO. Ejemplos a este respecto son alcoholes grasos de sebo con 14 EO, 25 EO, 30 EO o 40 EO.

Otra clase de tensioactivos no iónicos, preferentemente empleados, que se emplean bien como tensioactivo no iónico solo o bien en combinación con otros tensioactivos no iónicos, son ésteres de alquilo de ácidos grasos alcoxilados, preferentemente etoxilados o etoxilados y propoxilados, preferentemente con 1 hasta 4 átomos de carbono en la cadena de alquilo, especialmente los ésteres de metilo de los ácidos grasos.

Otra clase de tensioactivos no iónicos, que pueden ser empleados ventajosamente, son los alquilpoliglicósidos (APG). Los alquilpoliglicósidos, que pueden ser empleados, corresponden a la fórmula general RO(G)_{z}, en la que R significa un resto alifático, de cadena lineal o de cadena ramificada, especialmente ramificada con metilo en la posición 2, saturado o insaturado, con 8 hasta 22, preferentemente con 12 hasta 18 átomos de carbono, y G es el símbolo de una unidad de glicosa con 5 o 6 átomos de carbono, preferentemente significa glucosa. El grado z de glicosilación se encuentra en este caso, comprendido entre 1,0 y 2,0 y, especialmente, comprendido entre 1,1 y 1,4. Preferentemente se emplearán alquilpoliglucósidos lineales, es decir alquilpoliglicósidos, en los que el resto de poliglicosilo sea un resto de glucosa y el resto alquilo sea un resto n-alquilo.

También pueden ser adecuados los tensioactivos no iónicos del tipo de los óxidos de aminas, por ejemplo el óxido de N-cocoalquil-N,N-dimetilamina y el óxido de N-seboalquil-N,N-dihidroxietilamina, y de las alcanolamidas de los ácidos grasos. Preferentemente, la proporción de estos tensioactivos no iónicos no es mayor que la de los alcoholes grasos etoxilados, especialmente no es mayor que la mitad de la misma.

Otros tensioactivos adecuados son amidas de los ácidos polihidroxigrasos de fórmula (II),

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en la que RCO significa un resto acilo alifático con 6 hasta 22 átomos de carbono, R^{1} significa hidrógeno, un resto alquilo o un resto hidroxialquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono y [Z] significa un resto lineal o ramificado de polihidroxialquilo con 3 hasta 10 átomos de carbono y con 3 hasta 10 grupos hidroxilo. Las amidas de los ácidos polihidroxigrasos están constituidas por substancias conocidas, que usualmente pueden ser obtenidas por medio de la aminación reductora de un azúcar reductor con amoníaco, una alquilamina o una alcanolamina y acilación subsiguiente con un ácido graso, un éster de alquilo de ácido graso o con un cloruro de ácido graso.

Al grupo de las amidas de los ácidos polihidroxigrasos pertenecen, también, los compuestos de fórmula (III),

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en la que R significa un resto alquilo o alquenilo, lineal o ramificado, con 7 hasta 12 átomos de carbono, R^{1} significa un resto alquilo lineal, ramificado o cíclico, o un resto arilo con 2 hasta 8 átomos de carbono y R^{2} significa un resto alquilo lineal, ramificado o cíclico o un resto arilo o un resto oxi-alquilo, con 1 hasta 8 átomos de carbono, siendo preferentes los restos alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono o los restos fenilo, y [Z] significa un resto lineal de polihidroxialquilo, cuya cadena alquilo está substituida por, al menos, dos grupos hidroxilo, o derivados alcoxilados, preferentemente etoxilados o propoxilados de este resto.

Preferentemente, [Z] se obtiene por medio de la aminación reductora de un azúcar reductor, por ejemplo glucosa, fructosa; maltosa, lactosa, galactosa, manosa o xilosa. Los compuestos substituidos por N-alcoxi o por N-ariloxi pueden transformarse en las amidas de los ácidos polihidroxigrasos, deseadas, por ejemplo, por medio de la reacción con ésteres de metilo de ácidos grasos en presencia de un alcóxido a modo de catalizador.

Como tensioactivos aniónicos se utilizan, por ejemplo, aquellos del tipo de los sulfonatos y sulfatos. En este caso entran en consideración como tensioactivos de tipo sulfonato, preferentemente, alquilbencenosulfonatos con 9 a 13 átomos de carbono, sulfonatos de olefinas, es decir, mezclas de sulfonatos de alquenos y de hidroxialcanos, así como disulfonatos, como los que se obtienen, por ejemplo, a partir de monoolefinas con 12 a 18 átomos de carbono con doble enlace terminal o en el interior de la cadena, por medio de la sulfonación con trióxido de azufre gaseoso y, a continuación, hidrólisis alcalina o ácida, de los productos de sulfonación. También son adecuados los alcanosulfonatos, que se obtienen, por ejemplo, a partir de alcanos con 12 a 18 átomos de carbono por medio de la sulfocloración o de la sulfoxidación con hidrólisis o bien neutralización subsiguiente. También son adecuados los ésteres de los ácidos \alpha-sulfograsos (éstersulfonatos), por ejemplo los ésteres de metilo \alpha-sulfonados de los ácidos grasos de coco, de semilla de palma o de sebo hidrogenados.

Otros tensioactivos aniónicos, adecuados, son los ésteres de glicerina de ácidos grasos, sulfonados. Por ésteres de glicerina de ácidos grasos se entienden los monoésteres, los diésteres y los triésteres, así como sus mezclas, tal como se obtienen en la producción por medio de esterificación de una monoglicerina con 1 a 3 moles de ácido graso o en la transesterificación de triglicéridos con 0,3 a 2 moles de glicerina. En este caso, los ésteres de glicerina de ácidos grasos sulfonados, preferentes, son los productos de sulfonación de ácidos grasos saturados con 6 a 22 átomos de carbono, por ejemplo del ácido caprónico, del ácido del caprílico, del ácido caprínico, del ácido mirístico, del ácido láurico, del ácido palmítico, del ácido esteárico o del ácido behénico.

Como sulfatos de alqu(en)ilo son preferentes las sales alcalinas, y en especial, las sales de sodio, de los semiésteres del ácido sulfúrico de los alcoholes grasos con 12 a 18 átomos de carbono, de manera ejemplificativa a partir de alcoholes grasos de coco, de alcoholes grasos de sebo, de alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico o alcohol estearílico, o de oxoalcoholes con 10 a 20 átomos de carbono, y aquellos semiésteres de alcoholes secundarios con estas longitudes de cadena. Además, son preferentes los sulfatos de alqu(en)ilo con las citadas longitudes de cadena, que contengan un resto alquilo de cadena lineal, sintético, obtenido sobre base petroquímica, que tenga un comportamiento a la degradación análogo al de los compuestos adecuados a base de materias primas de la química de grasas. Son preferentes, por interés de la tecnología del lavado, los sulfatos de alquilo con 12 a 16 átomos de carbono y los sulfatos de alquilo con 12 a 15 átomos de carbono, así como sulfatos de alquilo con 14 a 15 átomos de carbono. También los sulfatos de 2,3-alquilo son tensioactivos aniónicos adecuados.

También son adecuados los monoésteres de ácido sulfúrico de los alcoholes etoxilados con 1 hasta 6 moles de óxido de etileno, de cadena lineal o de cadena ramificados, con 7 a 21 átomos de carbono, tales como alcoholes con 9 a 11 átomos de carbono, 2-metil-ramificados, con un promedio de 3,5 moles de óxido de etileno (EO) o alcoholes grasos con 12 a 18 átomos de carbono con 1 a 4 EO. Debido a su marcado comportamiento espumante, éstos se utilizan en los agentes de limpieza únicamente en cantidades relativamente pequeñas, por ejemplo en cantidades de hasta un 5% en peso, usualmente en cantidades desde un 1 hasta un 5% en peso.

Otros tensioactivos aniónicos, adecuados, son también las sales de los ácidos alquilsulfosuccínicos, que también se denominan también como sulfosuccinatos o como ésteres del ácido sulfosuccínico y que representan monoésteres y/o diésteres del ácido sulfosuccínico con alcoholes, preferentemente con alcoholes grasos y, especialmente, con alcoholes grasos etoxilados. Los sulfosuccinatos preferentes contienen restos de alcoholes grasos con de 8 a 18 átomos de carbono o mezclas de los mismos. Los sulfosuccinatos especialmente preferentes contienen un resto de alcohol graso, que se deriva de alcoholes grasos etoxilados, que, en sí mismos, representan tensioactivos no iónicos (para su descripción véase más adelante). En este caso son especialmente preferentes, a su vez, los sulfosuccinatos, cuyos restos de alcohol graso se deriven de alcoholes grasos etoxilados con una distribución restringida de homólogos. También es posible utilizar
un ácido alqu(en)ilsuccínico con, preferentemente, 8 a 18 átomos de carbono en la cadena de alqu(en)ilo o sus sales.

Como otros tensioactivos aniónicos entran en consideración, especialmente, los jabones. Son adecuados los jabones de los ácidos grasos saturados, tales como las sales del ácido láurico, del ácido mirístico, del ácido palmítico, del ácido esteárico, del ácido erúcico hidrogenado y del ácido behénico, así como, especialmente, las mezclas de jabones derivadas de los ácidos grasos naturales, por ejemplo de los ácidos grasos de coco, de semilla de palma o de sebo.

Los tensioactivos aniónicos, inclusive los jabones, pueden estar presentes en forma de sus sales de sodio, de potasio o de amonio, así como en forma de sales solubles de bases orgánicas, como monoetanolamina, dietanolamina o trietanolamina. Preferentemente se presentan los tensioactivos aniónicos en forma de sus sales de sodio o de potasio, especialmente en forma de sus sales de sodio.

Los tensioactivos pueden estar contenidos en los agentes de limpieza o de lavado según la invención, en total en una cantidad desde, preferentemente, un 1% en peso hasta un 50% en peso, especialmente desde un 5% en peso hasta un 30% en peso, referido al agente acabado.

Los agentes según la invención pueden contener agentes de blanqueo. Entre los compuestos, que sirven como agente de blanqueo, que proporcionan H_{2}O_{2} en agua, tiene un significado especial el percarbonato sódico, el perborato sódico tetrahidrato y el perborato sódico monohidrato. Otros agentes de blanqueo, que pueden ser empleados, son, por ejemplo, los peroxopirofosfatos, los perhidratos de citrato, así como las sales perácidas que proporcionan H_{2}O_{2} o los perácidos, tales como los persulfatos o bien el ácido persulfúrico. También puede emplearse el peroxohidrato de urea percarbamida, que puede describirse por medio de la fórmula H_{2}N-CO-NH_{2}\cdotH_{2}O_{2}. Especialmente en el caso en que se utilice el agente para la limpieza de superficies duras, por ejemplo en el caso del fregado a máquina de la vajilla, pueden contener, en caso deseado, también agentes de blanqueo del grupo de los agentes de blanqueo orgánicos, aún cuando su empleo es posible, principalmente, también en el caso de los agentes para el lavado de los textiles. Los agentes orgánicos de blanqueo, típicos, son los peróxidos de diacilo, tal como, por ejemplo, el peróxido de dibenzoilo. Otros agentes de blanqueo orgánicos típicos son los peroxiácidos, mencionándose como ejemplos especialmente los alquilperoxiácidos y los arilperoxiácidos. Representantes preferidos son el ácido peroxibenzoico y sus derivados substituidos en el anillo, tales como los ácidos alquilperoxibenzoicos, así como también pueden utilizarse el ácido peroxi-\alpha-naftoico y el monoperftalato de magnesio, los peroxiácidos alifáticos o sustituidos alifáticos, tales como el ácido peroxiláurico, el ácido peroxiesteárico, el ácido \varepsilon-ftalimidoperoxicaprónico [ácido ftaloiminoperoxihexanoico (PAP)], el ácido o-carboxibenzamidoperoxicaprónico, el ácido N-nonenilamidoperadípico y N-nonenilamidopersuccinatos, y ácidos peroxidicarboxílicos alifáticos y aralifáticos, tales como el ácido 1,12-diperoxicarboxílico, el ácido 1,9-diperoxiazelaico, el ácido diperoxisebácico, el ácido diperoxibrasílico, los ácidos diperoxiftálicos, el ácido 2-decildiperoxibutano-1,4-dioico, el ácido N,N-tereftaloil-di(6-aminopercaprónico).

El contenido de los agentes en agentes de blanqueo puede encontrarse comprendido entre un 1 y un 40% en peso y, especialmente, entre un 10 y un 20% en peso, empleándose, ventajosamente, el monohidrato de perborato o el percarbonato. Se ha divulgado un empleo sinérgico de amilasas con percarbonato o de amilasas con ácido percarbónico en la solicitud de patente WO 99/63036, o bien en la solicitud de patente WO 99/63037. También, según la publicación WO 99/63038 son capaces de desarrollar un efecto activador del blanqueo los derivados del acetonitrilo y, según la publicación WO 99/63041, son capaces de hacerlo, también, los compuestos de los complejos de metales de transición con actividad de blanqueo.

Para conseguir un efecto de blanqueo mejorado, cuando se lave a temperaturas de 60ºC y por debajo de este valor, y, especialmente, en el caso del tratamiento previo de la colada, los activadores de blanqueo pueden ser incorporados en los cuerpos moldeados de los agentes para el lavado y para la limpieza. Como activadores de blanqueo pueden emplearse compuestos que formen ácidos peroxocarboxílicos alifáticos bajo las condiciones de perhidrólisis con, preferentemente, 1 hasta 10 átomos de carbono, especialmente con 2 hasta 4 átomos de carbono, y/o ácidos perbenzoicos en caso dado substituidos. Son adecuadas substancias que porten grupos O- y/o N-acilo, con el número de átomos de carbono citado y/o grupos benzoilo en caso dado substituidos. Son preferentes las alquilendiaminas poliaciladas, especialmente la tetraacetiletilendiamina (TAED), los derivados acilados de triazina, especialmente la 1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina (DADHT), los glicolurilos acilados, especialmente el 1,3,4,6-tetraacetilglicolurilo (TAGU), las N-acilimidas, especialmente la N-nonanoilsuccinimida (NOSI), los fenolsulfonatos acilados, especialmente el n-nonanoil- o el isononanoilbencenosulfonato (n- o bien iso-NOBS), los ácidos hidroxicarboxílicos acilados, tal como el citrato de trietil-O-acetilo (TEOC), los anhídridos de los ácidos carboxílicos, especialmente el anhídrido del ácido ftálico, el anhídrido del ácido isatoico y/o el anhídrido del ácido succínico, las amidas de los ácidos carboxílicos, tal como la N-metildiacetamida, el glicólido, los alcoholes polivalentes acilados, especialmente la triacetina, el diacetato de etilenglicol, el acetato de isopropenilo, el 2,5-diacetoxi-2,5-dihidrofurano y los enolésteres, conocidos por las solicitudes de patente alemanas DE 196 16 693 y DE 196 16 767 así como el sorbitol y el manitol acetilados o bien sus mezclas descritas en la solicitud de patente europea EP 0 525 239 (SORMAN), los derivados sacáricos acilados, especialmente la pentaacetilglucosa (PAG), la pentaacetilfructosa, la tetraacetilxilosa y la octaacetillactosa así como la glucamina acetilada, en caso dado N-alquilada y la gluconolactona, el triazol o bien los derivados del triazol y/o las caprolactamas en forma de partículas y/o los derivados de la caprolactama, preferentemente las lactamas N-aciladas, por ejemplo la N-benzoilcaprolactama y la N-acetilcaprolactama, que se conocen por las solicitudes de patente internacionales WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 y WO 95/17498. Los acilacetales substituidos hidrófilos, conocidos por la solicitud de patente alemana DE 196 16 769 y las acillactamas, descritas en la solicitud de patente alemana DE 196 16 770 así como en la solicitud de patente internacional WO 95/14075, se emplearán también de manera preferente. También pueden emplearse las combinaciones de los activadores de blanqueo convencionales, conocidos por la solicitud de patente alemana DE 44 43 177. Del mismo modo pueden emplearse derivados de nitrilo tales como cianopiridinas, nitrilquats, por ejemplo N-alquilamonioacetonitrilo y/o derivados de cianoamida. Los activadores de blanqueo preferentes son el 4-(octanoiloxi)-bencenosulfato de sodio, el oxibencenosulfato de n-nonanoilo o de isononanoilo (n- o bien iso-NOBS), oxibencenosulfonato de undecenoilo (UDOBS), dodecanoiloxibencenosulfonato de sodio (DOBS), el ácido decanoiloxibenzoico (DOBA, OBC 10) y/o el oxibencenosulfonato de dodecanoilo (OBS 12), así como el N-metilmorfolinio-acetonitrilo (MMA). Tales activadores de blanqueo pueden estar contenidos dentro de intervalos cuantitativos usuales desde un 0,01 hasta un 20% en peso, preferentemente en cantidades desde un 0,1 hasta un 15% en peso, especialmente desde un 1% en peso hasta 10% en peso, referido al conjunto de la composición.

Además de los activadores de blanqueo convencionales, o en su lugar, pueden estar contenidos, también, los denominados catalizadores de blanqueo. Estos productos están constituidos por sales de metales de transición, o bien complejos de metales de transición, que refuerzan el blanqueo, tales como, por ejemplo, complejos de sales o complejos de carbonilo de Mn, de Fe, de Co, de Ru o de Mo. También pueden emplearse como catalizadores de blanqueo los complejos de Mn, de Fe, de Co, de Ru, de Mo, de Ti, de V y de Cu, con enlazadores trípode, nitrogenados, así como complejos amínicos de Co, de Fe, de Cu y de Ru, empleándose, preferentemente, aquellos compuestos que han sido descritos en la publicación DE 19709284 A1. También son capaces de desarrollar un efecto activador del blanqueo los derivados de acetonitrilo, según la publicación WO 99/63038, y los compuestos de los complejos de los metales de transición, según la publicación WO 99/63041, en combinación con amilasas.

Los agentes según la invención contienen, por regla general, uno o varios adyuvantes, especialmente zeolitas, silicatos, carbonatos, coadyuvantes orgánicos y - cuando no existan motivos ecológicos contra su empleo - también fosfatos. Estos últimos son, en especial, productos estructurantes a ser empleados preferentemente en los agentes de limpieza para el fregado a máquina de la vajilla.

En este caso deben citarse los silicatos de sodio cristalinos, estratificados, de la fórmula general NaMSi_{x}O_{2x+1}\cdotyH_{2}O, en la que M significa sodio o hidrógeno, x es un número de 1,6 a 4, preferentemente de 1,9 a 4,0 e y es un número de 0 a 20, y los valores preferentes para x son 2, 3 o 4. Tales silicatos estratificados cristalinos se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0 164 514. Los silicatos estratificados cristalinos, preferentes, de la fórmula indicada, son aquellos en los cuales M es sodio y x toma los valores 2 o 3. Especialmente son preferentes tanto los disilicatos de sodio \beta como también los disilicatos de sodio \delta Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O. En el comercio se encuentran tales compuestos, por ejemplo, bajo la denominación SKS® (firma Clariant). De este modo el SKS-6® está constituido, preponderantemente por un disilicato de sodio \delta con la fórmula Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, el SKS-7® está constituido, preponderantemente, por el disilicato de sodio \beta. Mediante reacción con ácidos (por ejemplo ácido cítrico o ácido carbónico) se forma, a partir del disilicato de sodio \delta, la canemita NaHSi_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, que se encuentra en el comercio bajo las denominaciones SKS-9® o bien SKS-10® (firma Clariant). También puede ser ventajoso emplear modificaciones químicas de estos silicatos estratificados. De este modo puede influenciarse adecuadamente por ejemplo la alcalinidad de los silicatos estratificados. Los silicatos estratificados dopados con fosfato o bien con carbonato presentan, en comparación con el disilicato de sodio \delta, morfologías cristalinas modificadas, se disuelven más rápidamente y presentan, en comparación con el disilicato de sodio \delta, una mayor capacidad enlazante del calcio. De este modo se han descrito en la solicitud de patente DE 19601063, silicatos estratificados de la fórmula cuantitativa general x Na_{2}O \cdot y SiO_{2} \cdot z P_{2}O_{5}, en la que la relación entre x e y corresponde a un número desde 0,35 hasta 0,6, la proporción entre x y z corresponde a un número desde 1,75 hasta 1.200 y la proporción de y sobre z corresponde a un número desde 4 hasta 2.800. La solubilidad de los silicatos estratificados puede aumentarse también si se emplean, de manera especial, silicatos estratificados finamente divididos. También pueden emplearse mixturas constituidas por silicatos estratificados cristalinos con otros componentes. En este caso deben citarse especialmente mixturas con derivados de la celulosa, que presentan ventajas en cuanto al efecto desintegrante y que se emplean especialmente en las tabletas de los agentes de lavado, así como mixturas con poli-
carboxilatos, por ejemplo ácido cítrico, o bien policarboxilatos polímeros, por ejemplo copolímeros del ácido acrílico.

También pueden utilizarse los silicatos amorfos de sodio con un módulo Na_{2}O : SiO_{2} de 1:2 a 1:3,3, preferentemente de 1:2 a 1:2,8 y, especialmente, de 1:2 a 1:2,6, que sean de disolución retardada y que presenten propiedades secundarias de lavado. En este caso, el retardo en la disolución, frente a los silicatos de sodio amorfos tradicionales, puede haber sido producido de diferentes maneras, por ejemplo por medio del tratamiento superficial, el amasado, la compactación/compresión o por medio de un sobresecado. En el ámbito de la presente invención, se entenderá por el concepto de "amorfo" o, también, de "amorfo a los rayos X". Esto significa que los silicatos, en el caso de experimentos de difracción de rayos X, no proporcionan reflexiones nítidas de los rayos X, como las que son típicas para las substancias cristalinas, sino que, a lo sumo, presentan uno o varios máximos de la radiación de rayos X dispersada, que presentan una anchura del ángulo de difracción de varias unidades de grados. Sin embargo, puede conducir, perfectamente, a propiedades adyuvante especialmente buenas, el que las partículas de silicato proporcionen máximos de difracción poco claros o incluso nítidos en los experimentos por medio de la difracción electrónica. Esto debe interpretarse de tal manera, que los productos microcristalinos presentan zonas con un tamaño desde 10 hasta algunos cientos de nm, siendo preferentes los valores hasta un máximo de 50 nm y, especialmente, de hasta un máximo de 20 nm. Son especialmente preferentes los silicatos amorfos comprimidos/compactados, los silicatos amorfos amasados y los silicatos amorfos a los rayos X, sobresecados.

Una zeolita, que puede ser empleada en caso dado, finamente cristalina, sintética y que contenga agua enlazada es, por ejemplo, la zeolita A y/o P. Como zeolita P será especialmente preferente la zeolita MAP® (producto comercial de la firma Crosfield). Sin embargo son adecuadas también la zeolita X así como las mezclas formadas por A, X y/o P. También puede obtenerse en el comercio y puede emplearse en el ámbito de la presente invención, preferentemente, por ejemplo un cocristalizado formado por zeolita X y por zeolita A (aproximadamente 80% en peso de zeolita X), que se comercializa por la firma CONDEA Augusta S.p.A. bajo la marca registrada VEGOBOND AX® y que puede describirse por medio de la fórmula

nNa_{2}O \cdot (1-n)K_{2}O \cdot Al_{2}O_{3} \cdot (2 - 2,5)SiO_{2} \cdot (3,5 - 5,5)H_{2}O.

Las zeolitas adecuadas presentan un tamaño medio de las partículas menor que 10 \mum (distribución en volumen; método de medición: Coulter Counter) y preferentemente contienen desde un 18 hasta un 22% en peso, especialmente desde un 20 hasta un 22% en peso de agua enlazada.

Evidentemente, es posible también el empleo de los fosfatos conocidos en general como substancias adyuvantes, en tanto en cuanto un empleo de este tipo no deba ser evitado por motivos ecológicos. Entre el gran número de fosfatos, que pueden ser adquiridos en el comercio, han adquirido un gran significado los fosfatos de los metales alcalinos, de una manera especialmente preferente los trifosfatos de pentasodio o bien de pentapotasio (tripolifosfato de sodio o bien tripolifosfato de potasio) en la industria para los agentes para el lavado y para la limpieza.

El concepto de fosfatos de metales alcalinos abarca en este caso las sales de los metales alcalinos (especialmente de sodio y de potasio) de los diversos ácidos fosfóricos, entre los cuales se puede distinguir entre el ácido metafosfórico (HPO_{3})_{n} y el ácido ortofosfórico H_{3}PO_{4} además de representantes de mayor peso molecular. Los fosfatos reúnen en este caso varias ventajas en sí mismos: actúan como portadores de álcali, impiden los depósitos de cal sobre las partes de las máquinas o bien las incrustaciones de cal en los tejidos y contribuyen, además, a la potencia de limpieza.

El hidrógenofosfato de sodio, NaH_{2}PO_{4}, existe en forma de dihidrato (densidad 1,91 gcm^{-3}, punto de fusión 60ºC) y a modo de monohidrato (densidad 2,04 gcm^{-3}). Ambas sales son blancas, polvos muy fácilmente solubles en agua, que pierden el agua de cristalización por calentamiento y que se transforman en 200ºC en el difosfato débilmente ácido (hidrógenodifosfato disódico, Na_{2}H_{2}P_{2}O_{7}), a temperaturas más elevadas en el trimetafosfato de sodio (Na_{3}P_{3}O_{9}) y en la sal de Maddrell (véase más adelante). El NaH_{2}PO_{4} tiene reacción ácida; se forma cuando se ajusta ácido fosfórico con lejía de hidróxido de sodio a un valor del pH de 4,5 y se pulveriza el caldo. El dihidrógenofosfato de potasio (fosfato de potasio primario o monobásico, bifosfato de potasio, KDP), KH_{2}PO_{4}, es una sal blanca con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 253ºC [descomposición con formación de polifosfato de potasio (KPO_{3})_{x}] y es fácilmente soluble en agua.

El hidrógenofosfato disódico (fosfato sódico secundario), Na_{2}HPO_{4}, es una sal incolora, cristalina, muy fácilmente soluble en agua. Existe en estado anhidro y con 2 moléculas de agua (densidad 2,066 gcm^{-3}, pérdida de agua a 95ºC), con 7 moléculas de agua (densidad 1,68 gcm^{-3}, punto de fusión 48ºC con pérdida de 5 H_{2}O) y con 12 moléculas de agua (densidad 1,52 gcm^{-3}, punto de fusión 35ºC con pérdida de 5 H_{2}O), a 100ºC se vuelve anhidro y se transforma, por calentamiento más pronunciado, en el difosfato Na_{4}P_{2}O_{7}. El hidrógenofosfato disódico se prepara por neutralización de ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio con empleo de fenolftaleína como indicador. El hidrógenofosfato dipotásico (fosfato de potasio secundario o dibásico), K_{2}HPO_{4}, es una sal blanca, amorfa, que es fácilmente soluble en agua.

El fosfato trisódico, fosfato de sodio terciario, Na_{3}PO_{4}, está constituido por cristales incoloros, que presentan, en forma de dodecahidrato, una densidad de 1,62 gcm^{-3} y un punto de fusión de 73-76ºC (descomposición), a modo de decahidrato (lo que corresponde a un 19-20% de P_{2}O_{5}) un punto de fusión de 100ºC y en forma anhidra (lo que corresponde a un 39-40% de P_{2}O_{5}), presenta una densidad de 2,536 gcm^{-3}. El fosfato trisódico es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina y se prepara por evaporación de una solución formada exactamente por 1 mol de fosfato disódico y 1 mol de NaOH. El fosfato tripotásico (fosfato de potasio terciario o tribásico), K_{3}PO_{4}, es un polvo blanco, granular, esparcible, con una densidad de 2,56 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 1.340ºC y es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina. De manera ejemplificativa se forma por calentamiento de escoria de Thomas con carbón y sulfato de potasio. A pesar del precio mayor son preferentes muchas veces en la industria de los agentes de limpieza los fosfatos de potasio más fácilmente solubles, por lo tanto más activos, frente a los compuestos de sodio correspondientes.

El difosfato tetrasódico (pirofosfato de sodio), Na_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma anhidra (densidad 2,534 gcm^{-3}, punto de fusión 988ºC, también se ha dado con 880ºC) y a modo de decahidrato (densidad 1,815-1,836 gcm^{-3}, punto de fusión 94ºC con pérdida de agua). Ambas substancias son cristales incoloros, solubles en agua con reacción alcalina. El Na_{4}P_{2}O_{7} se forma por calentamiento de fosfato disódico a temperaturas de > 200ºC o por reacción de ácido fosfórico con carbonato de sodio en proporción estequiométrica y eliminación del agua de la solución por medio de pulverización. El decahidrato forma sales complejas con los metales pesados y con los formadores de la dureza y reduce, por lo tanto, la dureza del agua. El difosfato de potasio (pirofosfato de potasio), K_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma de trihidrato y representa un polvo incoloro, higroscópico, con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, que es soluble en agua, siendo el pH de la solución al 1%, a 25ºC, de 10,4.

Mediante condensación del NaH_{2}PO_{4} o bien del KH_{2}PO_{4} se forman fosfatos de sodio y de potasio de elevado peso molecular, entre los cuales pueden distinguirse representantes cíclicos, los metafosfatos de sodio o bien de potasio y tipos en forma de cadenas, los polifosfatos de sodio o bien de potasio. Especialmente se utiliza una gran cantidad de denominaciones para estos últimos: fosfato por fusión o por calcinación, sal de Graham, sal de Kurrol y de Maddrell. Todos los fosfatos de sodio y de potasio superiores se denominan, en conjunto, fosfatos condensados.

El trifosfato pentasódico, industrialmente importante, Na_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato de sodio), es una sal anhidra o que cristaliza con 6 H_{2}O, no higroscópica, blanca, soluble en agua de la fórmula general NaO-[P(O)(ONa)-O]_{n}-Na con n=3. A temperatura ambiente se disuelven, en 100 g de agua, aproximadamente 17 g, a 60ºC, aproximadamente 20 g, a 100ºC aproximadamente 32 g de la sal exenta de agua de cristalización; al cabo de un calentamiento de dos horas de la solución a 100ºC se forma, por hidrólisis, aproximadamente un 8% de ortofosfato y un 15% de difosfato. En la fabricación del trifosfato pentasódico se hace reaccionar ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio o con lejía de hidróxido de sodio en proporción estequiométrica y se libera la solución del agua, por medio de pulverización. De manera similar a lo que ocurre en el caso de la sal de Graham y del difosfato de sodio, el trifosfato pentasódico disuelve muchos compuestos metálicos insolubles (también jabones de cal, etc.). El trifosfato pentapotásico, K_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato de potasio), se comercializa por ejemplo en forma de una solución al 50% en peso (> 23% de P_{2}O_{5}, 25% de K_{2}O). Los polifosfatos de potasio encuentran una amplia aplicación en la industria de los agentes para el lavado y para la limpieza. Además existen también tripolifosfatos de sodio y de potasio que igualmente pueden emplearse en el ámbito de la presente invención. Éstos se forman, por ejemplo, cuando se hidroliza con KOH el trimetafosfato de sodio:

(NaPO_{3})_{3} + 2 KOH \rightarrow Na_{3}K_{2}P_{3}O_{10} + H_{2}O

Estos fosfatos pueden emplearse, según la invención, exactamente igual que el tripolifosfato de sodio, el tripolifosfato de potasio o las mezclas de ambos, también pueden emplearse, según la invención, mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de sodio y de potasio o mezclas constituidas por tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y de potasio o mezclas constituidas por tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y de potasio.

Como coadyuvantes orgánicos pueden utilizarse en los agentes para el lavado y para la limpieza según la invención, especialmente policarboxilatos o ácidos policarboxílicos, policarboxilatos polímeros, ácido asparagínico, poliacetales, dextrinas en caso dado oxidadas, otros coadyuvantes orgánicos (véase lo expuesto posteriormente), así como fosfonatos. Estas clases de substancias se describen a continuación.

Las substancias estructurantes orgánicas, adecuadas son, por ejemplo, los ácidos policarboxílicos que pueden utilizarse en forma de sus sales de sodio, entendiéndose por ácidos policarboxílicos aquellos ácidos carboxílicos que llevan más de una función ácida. Éstos son, por ejemplo, el ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácidos sacáricos, ácidos aminocarboxílicos, ácido nitrilotriacético (NTA), siempre que este tipo de uso no pueda rechazarse por motivos ecológicos, así como mezclas de los mismos. Las sales preferidas son las sales de los ácidos policarboxílicos, tales como el ácido cítrico, el ácido adípico, el ácido succínico, el ácido glutárico, el ácido tartárico, los ácidos sacáricos y mezclas de las mismas.

También pueden utilizarse los ácidos en sí mismos. Además de su efecto de adyuvante, los ácidos tienen también típicamente la propiedad de un componente de acidificación y, con ello, sirven también para el ajuste de un valor de pH bajo y suave de los agentes de lavado y de los agentes de limpieza. En este caso deben citarse especialmente los ácidos compatibles con el sistema y con el medio ambiente, tales como el ácido cítrico, el ácido acético, el ácido tartárico, el ácido málico, el ácido láctico, el ácido glicólico, el ácido succínico, el ácido glutárico, el ácido adípico, el ácido glucónico y cualquier mezcla de éstos. Además pueden servir como reguladores del pH, también, los ácidos minerales, especialmente el ácido sulfúrico o las bases, especialmente los hidróxidos de amonio o los hidróxidos alcalinos. Tales reguladores están contenidos en los agentes, según la invención, en cantidades preferentemente no mayores que el 20% en peso, especialmente desde un 1,2% en peso hasta un 17% en peso.

Además, como adyuvantes son adecuados los policarboxilatos polímeros, estos son, por ejemplo, las sales de metales alcalinos del ácido poliacrílico o del ácido polimetacrílico, por ejemplo aquellas con un peso molecular relativo de 500 a 70.000 g/mol.

En cuanto a los pesos moleculares indicados para los policarboxilatos polímeros se trata, en el sentido de este documento, de pesos moleculares M_{w} promedio en peso de la forma respectiva del ácido, que se determinaron básicamente por medio de la cromatografía de permeación en gel (GPC), para lo cual se utilizó un detector de rayos UV. A este respecto, la medición se realizó frente a un patrón externo de ácido poliacrílico, que proporciona valores de peso molecular similares a los reales debido a su afinidad estructural con los polímeros analizados. Estos datos difieren marcadamente de los datos de pesos moleculares para los cuales se utiliza un patrón de ácidos poliestirenosulfónicos. Los pesos moleculares medidos frente a los ácidos poliestirenosulfónicos son en general marcadamente más altos que los pesos moleculares indicados en este documento.

Los polímeros adecuados son especialmente poliacrilatos, que presentan preferentemente un peso molecular de 2.000 a 20.000 g/mol. Debido a su solubilidad superior, de este grupo pueden preferirse a su vez los poliacrilatos de cadena corta, que presentan pesos moleculares de 2.000 a 10.000 g/mol y, de forma especialmente preferente, de 3.000 a 5.000 g/mol.

Además, son adecuados los policarboxilatos copolímeros, especialmente aquellos del ácido acrílico con ácido metacrílico y del ácido acrílico o del ácido metacrílico con ácido maleico. Han demostrado ser especialmente adecuados los copolímeros del ácido acrílico con ácido maleico, que contienen del 50 al 90% en peso de ácido acrílico y del 50 al 10% en peso de ácido maleico. Su peso molecular relativo, referido al ácido libre, es generalmente de 2.000 a 70.000 g/mol, preferentemente de 20.000 a 50.000 g/mol y especialmente de 30.000 a 40.000 g/mol. Los policarboxilatos (co)polímeros pueden utilizarse o bien como polvo o bien como solución acuosa. El contenido de policarboxilatos (co)polímeros en los agentes es preferentemente del 0,5 al 20% en peso, especialmente del 1 al 10% en peso.

Para mejorar la solubilidad, los polímeros pueden contener también ácidos alilsulfónicos como monómeros, como por ejemplo ácido aliloxibencenosulfónico y ácido metalilsulfónico.

Especialmente, son preferentes también los polímeros biodegradables constituidos por más de dos unidades de monómeros diferentes, por ejemplo aquellos que contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido maleico, así como alcohol vinílico o bien derivados del alcohol vinílico, o contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido 2-alquilalilsulfónico, así como derivados sacáricos.

Otros copolímeros preferentes son aquellos que presentan como monómeros preferentemente acroleína y ácido acrílico/sales del ácido acrílico o bien acroleína y acetato de vinilo.

También deben mencionarse como substancias adyuvantes preferidas los ácidos aminodicarboxílicos polímeros, sus sales o sus substancias precursoras. Especialmente, son preferentes los ácidos poliasparagínicos o sus sales y derivados.

Otras substancias adyuvantes adecuadas son los poliacetales, que pueden se obtenidos por reacción de dialdehídos con ácidos policarboxílicos, que presentan de 5 a 7 átomos de carbono y al menos 3 grupos hidroxilo. Los poliacetales preferentes se obtienen a partir de dialdehídos, tales como glioxal, glutaraldehído, tereftalaldehído, así como sus mezclas, y a partir de ácidos poliolcarboxílicos, tales como ácido glucónico y/o ácido glucoheptónico.

Otras substancias adyuvantes orgánicas adecuadas son dextrinas, por ejemplo oligómeros o bien polímeros de hidratos de carbono, que pueden ser obtenidos por hidrólisis parcial de almidones. La hidrólisis puede realizarse según procedimientos usuales, por ejemplo procedimientos catalizados por ácidos o enzimas. Preferentemente se trata de productos de hidrólisis con pesos moleculares promedio en el intervalo de 400 a 500.000 g/mol. En este sentido, es preferente un polisacárido con un equivalente de dextrosa (ED) en el intervalo de 0,5 a 40, especialmente de 2 a 30, con lo que ED es una medida usual para el efecto reductor de un polisacárido en comparación con la dextrosa, que tiene un ED de 100. Son aptas, tanto las maltodextrinas con un ED de entre 3 y 20 y los jarabes de glucosa secos con un ED de entre 20 y 37, como también las denominadas dextrinas amarillas y dextrinas blancas con mayores pesos moleculares en el intervalo de 2.000 a 30.000 g/mol.

En cuanto a los derivados oxidados de este tipo de dextrinas se trata de sus productos de reacción con agentes oxidantes, que sean capaces de oxidar al menos una función de alcohol del anillo del sacárido para dar una función de ácido carboxílico. Los adyuvantes orgánicos, especialmente preferentes para los agentes, según la invención, son los almidones oxidados, o bien sus derivados conocidos por las solicitudes EP 472042, WO 97/25399 y EP 755944.

Otros coadyuvantes adecuados son también los oxidisuccinatos y otros derivados de los disuccinatos, preferentemente etilendiaminodisuccinato. En este caso, el N,N'-disuccinato de etilendiamina (EDDS) se utiliza preferentemente en forma de sus sales de sodio o magnesio. En este contexto son preferentes, además, los disuccinatos de glicerina y trisuccinatos de glicerina. Las cantidades de uso adecuadas son del 3 al 15% en peso, en formulaciones que contienen zeolita y/o silicato.

Otros adyuvantes orgánicos adecuados son, por ejemplo, los ácidos hidroxicarboxílicos acetilados o bien sus sales que, en caso dado, también pueden estar presentes en forma de lactona y que contienen al menos 4 átomos de carbono y al menos un grupo hidroxilo, así como un máximo de dos grupos ácidos.

Otra clase de substancias con propiedades coadyuvantes son los fosfonatos. En este caso se trata especialmente de fosfonatos de hidroxialcanos o bien fosfonatos de aminoalcanos. Bajo los fosfonatos de hidroxialcanos, el 1,1-difosfonato de 1-hidroxietano (HEDP) tiene una especial importancia como coadyuvante. Se utiliza preferentemente como sal de sodio, reaccionando la sal disódica neutra y la sal tetrasódica alcalina (pH 9). Como fosfonatos de aminoalcano se consideran preferentemente el fosfonato de etilendiaminotetrametileno (EDTMP), el fosfonato de dietilentriaminopentametileno (DTPMP), así como sus homólogos superiores. Se utilizan preferentemente en forma de las sales de sodio de reacción neutra, por ejemplo como la sal hexasódica de EDTMP o como sal heptasódica y octasódica de DTPMP. En este sentido, de la clase de los fosfonatos se utiliza preferentemente como adyuvante el HEDP. Además, los fosfonatos de aminoalcano tienen un marcado poder de unión de metales pesados. De manera correspondiente puede preferirse el uso de fosfonatos de aminoalcano, especialmente de DTPMP, especialmente cuando los agentes también contienen agentes de blanqueo, o el uso de mezclas de los fosfonatos mencionados.

Además, todos los compuestos capaces de formar complejos con iones alcalinotérreos pueden utilizarse como coadyuvante.

Las substancias adyuvantes pueden estar contenidas en los agentes, según la invención, en caso dado en cantidades de hasta un 90% en peso. Preferentemente éstas están contenidas en cantidades de hasta un 75% en peso. Los agentes de lavado, según la invención, presentan contenidos en adyuvantes especialmente desde un 5% en peso hasta un 50% en peso. En los agentes según la invención para la limpieza de superficies duras, especialmente para la limpieza mecánica de la vajilla, el contenido en las substancias adyuvantes se encuentra especialmente entre un 5% en peso y un 88% en peso, no empleándose materiales adyuvantes insolubles en agua preferentemente en tales agentes. En una forma preferente de realización de los agentes según la invención especialmente para la limpieza mecánica de la vajilla está contenido desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de adyuvantes orgánicos solubles en agua, especialmente de citratos alcalinos, desde un 5% en peso hasta un 15% en peso de carbonatos alcalinos y desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de disilicatos alcalinos.

Los disolventes, que pueden ser empleados en las composiciones líquidas hasta en forma de gel de los agentes para el lavado y para la limpieza proceden, de manera ejemplificativa, del grupo de alcoholes monovalentes o polivalentes, de las alcanolaminas o de los glicoléteres, en tanto en cuanto éstos sean miscibles con agua en el intervalo de concentración indicado. Preferentemente se seleccionan los disolventes entre el etanol, el n- o i-propanol, los butanoles, el etilenglicolmetiléter, el etilenglicoletiléter, el etilenglicolpropiléter, el etilenglicolmono-n-butiléter, el dietilenglicol-metiléter, el dietilenglicoletiléter, el propilenglicolmetil-, -etil- o -propil-éter, el dipropilenglicolmonometil- o -etiléter, el di-isopropilenglicolmonometil- o -etiléter, el metoxi-, etoxi- o butoxitriglicol, el 1-butoxietoxi-2-propanol, el 3-metil-3-metoxibutanol, el propilen-glicol-t-butiléter, así como mezclas de estos disolventes.

Los disolventes pueden emplearse en los agentes para el lavado y para la limpieza líquidos hasta en forma de gel, según la invención, en cantidades comprendidas entre un 0,1 y un 20% en peso, preferentemente sin embargo por debajo del 15% en peso, y, especialmente, por debajo del 10% en peso.

Para el ajuste de la viscosidad pueden añadirse a las composiciones, según la invención, uno o varios espesantes, o bien sistemas espesantes. Estos productos de elevado peso molecular, que se denominan también agentes de hinchamiento, absorben la mayoría de las veces los líquidos y se hinchan para, finalmente, transformarse en soluciones viscosas reales o en soluciones coloidales.

Los espesantes adecuados son compuestos inorgánicos u orgánicos polímeros. A los espesantes inorgánicos pertenecen, por ejemplo, los ácidos polisilícicos, los minerales de arcilla tales como montmorillonita, zeolitas, ácidos silícicos y bentonitas. Los espesantes orgánicos proceden de los grupos de los polímeros naturales, de los polímeros naturales modificados y de los polímeros completamente sintéticos. Los polímeros que proceden de la naturaleza son por ejemplo, el agar-agar, el carrageno, el tragacanto, la goma arábiga, los alginatos, las pectinas, las poliosas, el harina de guar, el harina de algarroba, los almidones, las dextrinas, las gelatinas y las caseínas. Los productos naturales modificados, que se emplean como espesantes, proceden ante todo del grupo de los almidones y de las celulosas modificadas. De manera ejemplificativa pueden citarse en este caso la carboximetilcelulosa y otros éteres de celulosa, la hidroxietil- y -propilcelulosa así como éteres de flor de harina. Los espesantes completamente sintéticos son polímeros tales como compuestos de poliacrilato y de polimetacrilato, polímeros vinílicos, ácidos policarboxílicos, poliéteres, poliiminas, poliamidas y poliuretanos.

Los espesantes pueden estar contenidos en cantidades de hasta un 5% en peso, preferentemente desde un 0,05 hasta un 2% en peso y, de forma especialmente preferente, desde un 0,1 hasta un 1,5% en peso, referido a la composición acabada.

Los agentes para el lavado y para la limpieza según la invención pueden contener en caso dado a modo de otros componentes usuales, agentes secuestrantes, electrolitos y otros productos auxiliares tales como abrillantadores ópticos, inhibidores del agrisado, inhibidores de la corrosión de la plata, inhibidores del corrido de los colores, inhibidores de la espuma, productos abrasivos, colorantes y/o productos odorizantes, así como productos activos microbianos y/o absorbedores de los UV.

Los agentes para el lavado de los artículos textiles, según la invención, pueden contener abrillantadores ópticos del tipo de los derivados del ácido diaminoestilbendisulfónico o bien de sus sales de metales alcalinos. Son adecuadas por ejemplo, sales del ácido 4,4'-bis(2-anilino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)estilben-2,2'-disulfónico o compuestos de constitución similar, que porten, en lugar del grupo morfolino, un grupo dietanolamino, un grupo metilamino, un grupo anilino o un grupo 2-metoxietilamino. Además pueden estar presentes abrillantadores del tipo de los difenilestirilos substituidos, por ejemplo las sales alcalinas del 4,4'-bis(2-sulfoestiril)-difenilo, del 4,4'-bis(4-cloro-3-sulfoestiril)-difenilo, o del 4-(4-cloroestiril)-4'-(2-sulfoestiril)-difenilo. También pueden emplearse mezclas de los abrillantadores anteriormente citados.

Los inhibidores del agrisado tienen como cometido mantener en suspensión en el baño la suciedad desprendida de las fibras textiles. Para ello son adecuados los coloides solubles en agua, la mayoría de las veces de naturaleza orgánica, por ejemplo los almidones, las colas, las gelatinas, las sales de los ácidos etercarboxílicos o de los ácidos etersulfónicos de los almidones o de la celulosa o sales de ésteres ácidos del ácido sulfúrico de la celulosa o de los almidones. También son adecuadas para esta finalidad poliamidas que contienen grupos ácidos, solubles en agua. Además pueden emplearse otros derivados del almidón diferentes de los que se han citado precedentemente por ejemplo aldehídoalmidones. Preferentemente se emplearán éteres de celulosa tales como carboximetilcelulosa (sal de Na), metilcelulosa, hidroxialquilcelulosa y éteres mixtos, tales como metilhidroxietilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y sus mezclas, por ejemplo en cantidades desde 0,1 hasta 5% en peso, referido a los agentes.

Con objeto de provocar una protección contra la corrosión de la plata, pueden emplearse en los agentes de limpieza según la invención para la vajilla inhibidores de la corrosión de la plata. Éstos son conocidos por el estado de la técnica, por ejemplo benzotriazoles, cloruro férrico(III) o CoSO_{4}. Tal como se conoce, por ejemplo, por la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 736084 B1, son especialmente adecuados para el empleo conjunto con enzimas los inhibidores de la corrosión de la plata constituidos por sales y/o complejos de manganeso, de titanio, de circonio, de hafnio, de vanadio, de cobalto o de cerio, en los cuales están presentes los metales citados en uno de los niveles de oxidación II, III, IV, V o VI. Ejemplos de tales compuestos son MnSO_{4}, V_{2}O_{5}, V_{2}O_{4}, VO_{2}, TiOSO_{4}, K_{2}TiF_{6}, K_{2}ZrF_{6}, Co(NO_{3})_{2}, Co(NO_{3})_{3}, así como sus mezclas.

Los productos activos "desprendedores de la suciedad" "Soil-Release" o "Soil-Repellents" son, en la mayoría de los casos, polímeros, que proporcionan a las fibras de la colada propiedades que la hacen repeler la suciedad cuando se emplean en un agente de lavado y/o favorecen la capacidad desprendedora de la suciedad de los restantes componentes de los agentes de lavado. Un efecto comparable puede observarse también cuando se emplean en agentes de limpieza para superficies duras.

Los productos activos, desprendedores de la suciedad (Soil-Release) especialmente activos y conocidos desde hace mucho tiempo son copoliésteres con unidades de ácidos dicarboxílicos, de alquilenglicol y de polialquilenglicol. Ejemplos a este respecto son copolímeros o polímeros mixtos constituidos por tereftalato de polietileno y polioxietilenglicol (DT 16 17 141, o bien DT 22 00911). Se han citado en la solicitud de patente alemana publicada, no examinada DT 22 53 063 agentes ácidos que contienen, entre otras cosas, un copolímero constituido por un ácido carboxílico dibásico y por un alquilen- o cicloalquilenpoliglicol. Los polímeros constituidos por tereftalato de etileno y por tereftalato de óxido de polietileno y su empleo en los agentes de lavado están descritos en las memorias descriptivas de las patentes alemanas DE 28 57 292 y DE 33 24 258 y en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 253 567. La patente europea EP 066944 se refiere a agentes, que contienen un copoliéster constituido por etilenglicol, polietilenglicol, ácidos dicarboxílicos aromáticos y ácidos dicarboxílicos aromáticos sulfonados en determinadas proporciones molares. Se conocen por la patente europea EP 0 185 427 poliésteres cerrados en los extremos con grupos metilo o con grupos etilo con unidades de tereftalato de etileno y/o de propileno y con unidades de tereftalato de óxido de polietileno y agentes de lavado que contienen tales polímeros desprendedores de la suciedad. La patente europea EP 0241984 se refiere a un poliéster que contiene, además de grupos de oxietileno y de unidades de ácido tereftálico, también unidades de etileno substituidas así como unidades de glicerina. Se conocen por la patente europea EP 0 241 985 poliésteres que contienen, además de grupos de óxido de etileno y de unidades de ácido tereftálico, grupos de 1,2-propileno, 1,2-butileno y/o 3-metoxi-1,2-propileno así como unidades de glicerina y que están cerrados en los grupos extremos con grupos alquilo con 1 a 4 átomos de carbono. Se conocen por la solicitud de patente europea EP 0 272033 poliésteres cerrados en los grupos extremos al menos en parte por restos alquilo o por restos acilo con 1 a 4 átomos de carbono con unidades de tereftalato de poli-propileno y tereftalato de polioxietileno. La patente europea EP 0 274 907 describe poliésteres desprendedores de la suciedad que contienen tereftalato cerrados en los grupos extremos con sulfoetilo. Según la solicitud de patente europea EP 0 357 280 se preparan por medio de la sulfonación de los grupos extremos insaturados, poliésteres desprendedores de la suciedad con unidades de tereftalato, de alquilenglicol y de poli-glicol con 2 a 4 átomos de carbono. La solicitud de patente internacional WO 95/32232 se refiere a poliésteres ácidos, aromáticos, con capacidad para el desprendimiento de la suciedad. Se conocen por la solicitud de patente internacional WO 97/31085 productos activos no polímeros repelentes a la suciedad para materiales constituidos por algodón con varias unidades funcionales: una primera unidad, que puede ser catiónica, por ejemplo, es capaz de adsorberse sobre la superficie del algodón por medio de la interacción electrostática, y una segunda unidad, que está formada de manera hidrófoba, que es responsable de la permanencia del producto activo sobre la superficie límite entre el agua/algodón.

A los inhibidores del corrido de los colores que entran en consideración para el empleo en los agentes de lavado de artículos textiles, según la invención, pertenecen, especialmente, las polivinilpirrolidonas, los polivinilimidazoles, los N-óxidos polímeros tal como el poli-(N-óxido de vinilpiridina) y los copolímeros de vinilpirrolidona con vinilimidazol.

Cuando se emplean en procedimientos de limpieza a máquina puede ser ventajoso añadir los agentes inhibidores de la espuma. Como inhibidores de la espuma son adecuados, por ejemplo, jabones de origen natural o sintético, que presenten una elevada proporción en ácidos grasos con 18 a 24 átomos de carbono. Los inhibidores de la espuma de tipo no tensioactivos, adecuados, son, por ejemplo, órganopolisiloxanos y sus mezclas con ácido silícico microfino, en caso dado silanizado así como parafinas, ceras, ceras microcristalinas y sus mezclas con ácido silícico silanizado o biesteariletilendiamida. Ventajosamente se emplearán también mezclas constituidas por diversos inhibidores de la espuma, por ejemplo aquellas constituidas por siliconas, parafinas o ceras. Son preferentes los inhibidores de la espuma, especialmente los inhibidores de la espuma que contienen silicona y/o parafina, enlazados sobre una substancia de soporte granular, soluble en agua o bien dispersable en agua. Son especialmente preferentes en este caso mezclas constituidas por parafinas y por biesteariletilendiamidas.

Un agente de limpieza, según la invención, para superficies duras puede contener, además, componentes con actividad abrasiva, especialmente del grupo que comprende harina de cuarzo, harina de madera, harina de material sintético, cretas y microesferas así como sus mezclas. Los productos abrasivos están contenidos en los agentes de limpieza según la invención preferentemente en una proporción no mayor que el 20% en peso, especialmente desde el 5% en peso hasta el 15% en peso.

A los agentes para el lavado y para la limpieza se les añaden colorantes y productos odorizantes para mejorar la impresión estética de los productos y para poner a disposición del usuario, además del rendimiento del lavado y de la limpieza, un producto "típico e inconfundible" desde el punto de vista estético y sensorial. Como esencias perfumantes o bien productos odorizantes pueden utilizarse compuestos odorizantes individuales, por ejemplo los productos sintéticos del tipo de los ésteres, de los éteres, de los aldehídos, de las cetonas, de los alcoholes y de los hidrocarburos. Los compuestos odorizantes del tipo de los ésteres son, por ejemplo, el acetato de bencilo, el isobutirato de fenoxietilo, el acetato de p-terc.-butilciclohexilo, el acetato de linalilo, el acetato de dimetilbencilcarbinilo, el acetato de feniletilo, el benzoato de linalilo, el formiato de bencilo, el glicinato de etilmetilfenilo, el propionato de alilciclohexilo, el propionato de estiralilo y el salicilato de bencilo. A los éteres pertenecen, por ejemplo, el benciletiléter, a los aldehídos pertenecen, por ejemplo los alcanales lineales con 8 a 18 átomos de carbono, el citral, el citronelal, el citroneliloxiacetaldehído, el ciclamenaldehído, el hidroxicitronelal, el lilial y el bourgeonal, a las cetonas pertenecen, por ejemplo la ionona, la \alpha-isometilionona y la metilcedrilcetona, a los alcoholes pertenecen el anetol, el citronelol, el eugenol, el geraniol, el linalool, el alcohol feniletílico y el terpineol, a los hidrocarburos pertenecen, principalmente, los terpenos, tales como el limoneno y el pineno. Sin embargo, son preferentes mezclas de diferentes productos odorizantes, que produzcan, en conjunto, una nota de olor agradable. Tales esencias perfumantes también pueden contener mezclas de productos odorizantes naturales, como a las que pueden ser obtenidas a partir de fuentes vegetales, por ejemplo la esencia de pino, de cítricos, de jazmín, de pachulí, de rosas o Ylang-Ylang. También son adecuadas la esencia de salvia romana, la esencia de manzanilla, la esencia de clavel, la esencia de melisa, la esencia de menta, la esencia de hojas de canela, la esencia de pétalos de tilo, la esencia de bayas de enebro, la esencia de vetiver, la esencia de olibano, la esencia de galbano y la esencia de labdano, así como esencia de azahar, la esencia de neroli, la esencia de cáscara de naranja y de madera de sándalo.

Usualmente, el contenido de los colorantes en los agentes para el lavado y para la limpieza se encuentra por debajo del 0,01% en peso, mientras que los productos odorizantes pueden constituir hasta un 2% en peso del conjunto de la formulación.

Los productos odorizantes pueden incorporarse directamente en los agentes para el lavado y para la limpieza, no obstante también puede ser ventajoso disponer los productos odorizantes sobre soportes, que refuercen la adherencia del perfume sobre el artículo sometido a la limpieza y que se encarguen de que el olor se mantenga durante mucho tiempo debido a una liberación lenta del olor, especialmente de los artículos textiles tratados. Se han acreditado, por ejemplo, como materiales de soporte las ciclodextrinas, pudiéndose revestir los complejos de ciclodextrina-perfume adicionalmente con otros agentes auxiliares.

En tanto en cuanto pueda emplearse una actividad de CGTasa, esencial según la invención, para la obtención de tales complejos, o que sirva para la liberación de los componentes, se tratará de formas preferente de realización de la presente invención. Lo mismo es válido para otros compuestos de bajo peso molecular tales como los colorantes o los productos activos antimicrobianos, que se especifican más adelante.

Otro soporte preferente para los productos odorizantes es la zeolita X, descrita, que puede absorber también productos odorizantes en lugar de o en mezcla con los tensioactivos. Son preferentes los agentes para el lavado y para la limpieza, que contengan la zeolita X, descrita, y los productos odorizantes, que estén al menos parcialmente absorbidos en la zeolita.

Los colorantes preferentes, cuya elección no constituye ninguna dificultad para el técnico en la materia, tienen una elevada estabilidad al almacenamiento y son insensibles frente a los restantes componentes del agente y contra la luz así como están exentos de cualquier substantividad marcada frente a las fibras textiles para no colorearlas.

Para la lucha contra los microorganismos, los agentes de lavado o de limpieza pueden contener productos activos antimicrobianos. En este caso se distingue según el espectro antimicrobiano y el mecanismo de actuación entre bacteriostáticos y bactericidas, fungistáticos y fungicidas, etc. Los productos importantes de estos grupos son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio, los alquilarilsulfonatos, los halógenofenoles y el mercuriacetato de fenol. Las expresiones de efecto antimicrobiano y producto activo antimicrobiano tienen en el ámbito de las enseñanzas según la invención el significado usual en el ramo, que se han dado por ejemplo en la publicación de K. H. Wallhäußer en "Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5ª edición - Stuttgart; New York: Thieme, 1995), pudiéndose emplear todas las substancias allí descritas con efecto antimicrobiano. Los productos activos antimicrobianos adecuados se eligen, preferentemente, entre el grupo de los alcoholes, las aminas, los aldehídos, los ácidos antimicrobianos o bien sus sales, los ésteres de los ácidos carboxílicos, las amidas de ácido, los fenoles, los derivados de fenol, los difenoles, los difenilalcanos, los derivados de urea, los acetales así como los formales oxigenados y nitrogenados, las benzamidinas, las isotiazolinas, los derivados de ftalimida, los derivados de piridina, los compuestos tensioactivos antimicrobianos, las guanidinas, los compuestos anfóteros antimicrobianos, las quinolinas, el 1,2-dibromo-2,4-dicianobutano, el yodo-2-propil-butil-carbamato, el yodo, los yodóforos, los compuestos peroxo, los compuestos halogenados así como mezclas arbitrarias de los precedentes.

El producto activo antimicrobiano puede elegirse, en este caso, entre etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butanodiol, fenoxietanol, 1,2-propilenglicol, glicerina, ácido undecilénico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido dihidracético, o-fenilfenol, N-metilmorfolinacetonitrilo (MMA), 2-bencil-4-clorofenol, 2,2'-metilen-bis-(6-bromo-4-clorofenol), 4,4'-dicloro-2'-hidroxidifeniléter (Dichlosan), 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifeniléter (Trichlosan), clorohexidina, N-(4-clorofenil)-N-(3,4-diclorofenil)-urea, dihidrocloruro de N,N'-(1,10-decan-diildi-1-piridinil-4-iliden)-bis-(1-octanoamina), N,N'-bis-(4-clorofenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecanodiimidoamida, glucoprotaminas, compuestos cuaternarios tensioactivos antimicrobianos, guanidinas con inclusión de las biguanidinas y de las poliguanidinas, tales como, por ejemplo, el dihidrocloruro de 1,6-bis-(2-etilhexil-biguanido-hexano), el tetrahidrocloruro del 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenil-N_{1},N_{1}-metildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,6-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-beta-(p-metoxifenil)diguanido-N_{5},N_{5}']-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-alfa-metil-.beta.-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-nitrofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el dihidrocloruro de omega:omega-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},
N_{5}')-di-n-propiléter, el tetrahidrocloruro de omega:omega'-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-di-n-propiléter, el tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-metilfenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4,5-triclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')
hexano, el dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-alfa-(p-clorofenil)etildiguanido-N_{5},N_{5}']hexano, el dihidrocloruro de omega:omega-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')m-xileno, el dihidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-dodecano, el tetrahidrocloruro de 1,10-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-decano, el tetrahidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-dodecano, el dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, el tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, la etilen-bis-(1-tolilbiguanida), la etilen-bis-(p-tolilbiguanida), la etilen-bis-(3,5-dimetilfenilbiguanida), la etilen-bis-(p-terc.-amilfenilbi-
guanida), la etilen-bis-(nonilfenilbiguanida), la etilen-bis-(fenilbiguanida), la etilen-bis-(N-butilfenilbiguanida), la etilen-bis(2,5-dietoxifenilbiguanida), la etilen-bis(2,4-dimetilfenilbiguanida), la etilen-bis(o-difenilbiguanida), la etilen-bis(amilnaftilbiguanida mixta), la N-butil-etilen-bis-(fenilbiguanida), la trimetileno hasta (o-tolilbiguanida), la N-butil-trimetilo-bis-(fenilbiguanida) y las sales correspondientes tales como los acetatos, los gluconatos, los hidrocloruros, los hidrobromuros, los citratos, los bisulfitos, los fluoruros, los polimaleatos, los N-cocoalquilsarcosinatos, los fosfitos, los hipofosfitos, los perflúoroctanoatos, los silicatos, los sorbatos, los salicilatos, los maleatos, los tartratos, los fumaratos, los etilendiaminotetraacetatos, los iminodiacetatos, los cinamatos, los tiocianatos, los arginatos, los piromelitatos, los tetracarboxibutiratos, los benzoatos, los glutaratos, los monoflúorfosfatos, los perflúorpropionatos así como mezclas arbitrarias de los mismos. Además son adecuados los derivados halogenados del xileno y del cresol, tales como el p-clorometacresol o el p-clorometa-xileno, así como productos activos antimicrobianos naturales de origen vegetal (por ejemplo procedentes de especias o de hierbas aromáticas), de origen animal así como de origen microbiano. Preferentemente pueden emplearse compuestos cuaternarios antimicrobianos, de acción tensioactiva, un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal y/o un producto activo antimicrobiano natural de origen animal, de manera extraordinariamente preferente, al menos, un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal del grupo que comprende la cofeína, la teobromina y la teofilina así como esencias etéreas tales como eugenol, timol y geraniol, y/o al menos un producto activo antimicrobiano natural de origen animal del grupo que comprende los enzimas tales como la proteína de leche, la lisozima y la lactoperoxidasa, y/o al menos un compuesto cuaternario antimicrobiano, de acción tensioactiva, con un grupo amonio, sulfonio, fosfonio, yodonio o arsonio, compuestos peroxo y compuestos clorados. También pueden emplearse productos de origen microbiano, las denominadas bacteriocinas.

Los compuestos de amonio cuaternario (QAV), adecuados como productos activos antimicrobianos, de la fórmula general (R^{1})(R^{2})(R^{3})(R^{4})N^{+}X^{-}, en la que R^{1} hasta R^{4} son restos alquilo con 1 hasta 22 átomos de carbono, restos aralquilo con 7 hasta 28 átomos de carbono o restos heterocíclicos, iguales o diferentes, formando dos restos o, en el caso de un enlace aromático tal como en la piridina, incluso tres restos, junto con el átomo de nitrógeno del heterociclo, por ejemplo un compuesto de piridinio o un compuesto de imidazolinio y X^{-} significa iones halogenuro, iones sulfato, iones hidroxi o iones similares. Para un efecto antimicrobiano óptimo uno de los restos presenta al menos preferentemente una longitud de la cadena de 8 hasta 18, especialmente de 12 hasta 16 átomos de carbono.

Los QAV pueden ser obtenidos por medio de la reacción de las aminas terciarias con agentes de alquilación, tales como, por ejemplo, cloruro de metilo, cloruro de bencilo, sulfato de dimetilo, bromuro de dodecilo así como también con óxido de etileno. La alquilación de las aminas terciarias con un resto alquilo largo y dos grupos metilo se consigue de forma especialmente sencilla, también la cuaternización de las aminas terciarias con dos restos largos y un grupo metilo puede llevarse a cabo con ayuda de cloruro de metilo bajo condiciones suaves. Las aminas, que disponen de un resto alquilo largo o de un resto alquilo substituido por hidroxi, son menos reactivas y se cuaternizarán preferentemente con sulfato de dimetilo.

Los QAV adecuados son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio (cloruro de N-alquil-N,N-dimetil-bencilamonio, CAS No. 8001-54-5), benzalcona B (cloruro de m,p-diclorobencil-dimetil-alquilamonio con 12 átomos de carbono, CAS No. 58390-78-6), cloruro de benzoxonio (cloruro de bencil-dodecil-bis-(2-hidroxietil)-amonio), bromuro de cetrimonio (bromuro de N-hexadecil-N,N-trimetil-amonio, CAS No. 57-09-0), cloruro de bencetonio (cloruro de N,N-dimetil-N-[2-[2-[p-1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenoxi]etoxi]etil]-bencilamonio, CAS No. 121-54-0), cloruro de dialquildimetilamonio tales como el cloruro de di-n-decil-dimetil-amonio (CAS No. 7173-51-5-5), bromuro de didecildi-metilamonio (CAS No. 2390-68-3), cloruro de dioctil-dimetil-amonio, cloruro de 1-cetilpiridinio (CAS No. 123-03-5) y yoduro de tiazolinio (CAS No. 15764-48-1) así como sus mezclas. Los QAV especialmente preferentes son los cloruros de benzalconio con restos alquilo con 8 hasta 18 átomos de carbono, especialmente el cloruro de alquil-bencil-dimetil-amonio con 12 hasta 14 átomos de carbono.

Los halogenuros de benzalconio y/o los halogenuros de benzalconio substituidos pueden ser adquiridos en el comercio por ejemplo como Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/Sherex y Hyamine® ex Lonza, así como Bardac® ex Lonza. Otros productos activos antimicrobianos, que pueden ser adquiridos en el comercio son el cloruro de N-(3-cloroalil)-hexaminio tales como Dowicide® y Dowicil® ex Dow, cloruro de benzoetonio tal como Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, cloruro de metilbenzoetonio tal como Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, cloruro de cetilpiridinio tal como Cepacolchlorid ex Merrell Labs.

Los productos activos antimicrobianos se emplean en cantidades desde 0,0001% en peso hasta 1% en peso, preferentemente desde 0,001% en peso hasta 0,8% en peso, de forma especialmente preferente desde 0,005% en peso hasta 0,3% en peso y, especialmente, desde 0,01 hasta 0,2% en peso.

Los agentes pueden contener absorbedores de los UV (absorbedores UV), que se absorban en los artículos textiles tratados y que mejoren la estabilidad frente a la luz de las fibras y/o la estabilidad frente a la luz de otros componentes de la receta. Se entenderán por absorbedores de los UV substancias orgánicas (filtros protectores contra la luz), que sean capaces de absorber la irradiación ultravioleta y de desprender de nuevo la energía absorbida por ejemplo en forma de irradiación de longitud de onda más larga, por ejemplo en forma de calor.

Los compuestos que presentan estas propiedades deseadas son, por ejemplo, los compuestos activos por medio de la desactivación en ausencia de irradiación y los derivados de la benzofenona con substituyentes en la posición 2 y/o en la posición 4. Además son adecuados también los benzotriazoles substituidos, los acrilatos substituidos por fenilo en la posición 3 (derivados del ácido cinámico, en caso dado con grupos ciano en la posición 2), salicilatos, complejos orgánicos de Ni así como productos naturales tales como la umbeliferona y los ácidos urocanoicos corporales. Tienen un significado especial los derivados de bifenilo y, ante todo, los derivados del estilbeno como los que se han descrito por ejemplo en la publicación EP 0728749 A y que pueden adquirirse en el comercio como Tinosorb® FD o Tinosorb® FR ex Ciba. Como absorbedores de las UV-B pueden citarse: el 3-bencilidenalcanfor o bien el 3-bencilidennoralcanfor y sus derivados, por ejemplo el 3-(4-metilbenciliden)alcanfor, como se describe en la publicación EP 0693471 B1; los derivados del ácido 4-aminobenzoico, preferentemente el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-etilhexilo, el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-octilo y el 4-(dimetilamino)benzoato de amilo; los ésteres del ácido cinámico, preferentemente el 4-metoxicinamato de 2-etilhexilo, el 4-metoxicinamato de propilo, el 4-metoxicinamato de isoamilo, el 2-ciano-3-fenilcinamato de 2-etilhexilo (octocrileno); los ésteres del ácido salicílico, preferentemente el salicilato de 2-etilhexilo, el salicilato de 4-isopropilbencilo, el salicilato de homometilo; los derivados de la benzofenona, preferentemente la 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, la 2-hidroxi-4-metoxi-4'-metilbenzofenona, la 2,2'-dihidroxi-4-metoxibenzofenona; los ésteres del ácido benzalmalónico, preferentemente el 4-metoxibenzalmalonato de 2-etilhexilo; los derivados de triazina, tales como, por ejemplo, la 2,4,6-trianilino-(p-carbo-2'-etil-1'-hexiloxi)-1,3,5-triazina y la octiltriazona, como se han descrito en la publicación EP 0818450 A1 o la dioctil butamido triazona (Uvasorb® HEB); las propano-1,3-dionas tal como, por ejemplo, la 1-(4-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona; los derivados de cetotriciclo(5.2.1.0)decano, tales como los que se han descrito en la publicación EP 0694521 B1. Además, son adecuados el ácido 2-fenilbencimidazol-5-sulfónico y sus sales alcalinas, alcalinotérreas, de amonio, de alquilamonio, de alcanolamonio y de glucamonio; los derivados de ácidos sulfónicos de benzofenonas, preferentemente el ácido 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfónico y sus sales; los derivados de ácidos sulfónicos del 3-bencilidenalcanfor tales como, por ejemplo, el ácido 4-(2-oxo-3-bornilidenmetil)bencenosulfónico y el ácido 2-metil-5-(2-oxo-3-borniliden)sulfónico y sus sales.

Como filtros típicos contra los UV-A entran en consideración derivados del benzoilmetano, tales como, por ejemplo, la 1-(4'-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona, el 4-terc.-butil-4'-metoxidebenzoilmetano (Parsol 1789), la 1-fenil-3-(4'-isopropilfenil)-propano-1,3-diona así como compuestos de enamina, como los que se han descrito en la publicación DE 19712033 A1 (BASF). Los filtros para los UV-A y UV-B pueden emplearse también, evidentemente, en mezcla. Además de los productos solubles, citados, entran en consideración para esta finalidad también pigmentos insolubles, protectores contra la luz, en concreto óxidos metálicos finamente dispersados, preferentemente a nanonizados o bien sales. Ejemplos de los óxidos metálicos adecuados son, especialmente el dióxido de cinc y el dióxido de titanio y, además, los óxidos de hierro, de circonio, de silicio, de manganeso, de aluminio y de cerio así como sus mezclas. Como sales pueden emplearse silicatos (talco), sulfato de bario o estearato de cinc. Los óxidos y las sales se emplearán en forma de pigmentos listos para emulsiones destinadas al cuidado de la piel y para la protección de la piel y para productos cosméticos decorativos. Las partículas deben presentar en este caso un diámetro medio menor que 100 nm, preferentemente comprendido entre 5 y 50 nm y, especialmente, comprendido entre 15 y 30 nm. Éstas pueden presentar una forma esférica, sin embargo, pueden emplearse también aquellas partículas que tengan una forma elipsoide o que se diferencie de la configuración esférica de otro modo. Los pigmentos pueden presentarse también tratados superficialmente, es decir hidrofilados o hidrofobados. Ejemplos típicos son dióxidos de titanio revestidos, tales como, por ejemplo dióxido de titanio T 805 (Degussa) o Eusolex® T2000 (Merck); como agentes de revestimiento hidrófobos entran en consideración, preferentemente, las siliconas y, de forma especialmente preferente, los trialcoxioctilsilanos o las simeticonas. Preferentemente se empleará el óxido de cinc micronizado. Otros filtros adecuados, protectores contra la luz UV pueden verse en la recopilación de P.Finkel en SÖFW-Journal 122, (1966), página 543.

Los absorbedores de los UV se emplearán usualmente en cantidades desde 0,01% en peso hasta 5% en peso, preferentemente desde 0,03% en peso hasta 1% en peso.

Especialmente las proteínas según la invención y/o otras proteínas pueden requerir una protección especial en los agentes para el lavado y la limpieza. Con esta finalidad los agentes preferentes según la invención contienen estabilizantes. Éstos han sido descritos ya más arriba. Agentes con las actividades enzimáticas estabilizadas, anteriormente descritas, representan formas preferentes de realización de la presente invención. Son especialmente preferentes aquellos con enzimas que estén estabilizadas por varias de las formas descritas.

Los agentes según la invención de las formas preferentes de realización contienen a la proteína o al fragmento, según la invención, que presentan actividad amilolítica y/o de CGTasa en proporciones comprendidas entre un 0,0001 por ciento en peso y un 5% en peso y, de una manera más preferentes, en proporciones comprendidas entre un 0,00025 y un 4,5% en peso, comprendidas entre un 0,0005 y un 4% en peso, comprendidas entre un 0,00075 y un 3,5% en peso, comprendidas entre un 0,001 y un 3% en peso o comprendidas entre un 0,002 y un 2% en peso.

La concentración en proteína puede determinarse con ayuda de métodos conocidos, por ejemplo según el procedimiento del ácido bicincónico (ácido 2,2'-biquinolil-4,4'-dicarboxílico; procedimiento BCA; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) o el procedimiento al biuret (A.G. Gornall, C.C. Bardawill y M.M. David, J. Biol. Chem. 177 (1948), páginas 751-766).

En una forma preferente de realización los agentes según la invención contienen además de las proteínas o de los derivados, según la invención, uno o varios enzimas amilolíticos, especialmente \alpha-amilasas.

Entre éstos pueden encontrarse enzimas conocidos por el estado de la técnica, especialmente consolidados para el empleo en los agentes para el lavado y la limpieza. Ejemplos de amilasas, que pueden ser adquiridas en el comercio, son BAN®, Termamyl®, Purastar®, Amylase-LT®, Maxamyl®, Duramyl® y/o Purafect® OxAm. Esto es adecuado cuando los diferentes enzimas sean capaces de complementarse. Un complemento de este tipo puede verificarse, por ejemplo, desde el punto de vista de la regulación, por ejemplo por medio de la activación mutua o por medio de la inactivación. Ésta puede producirse, por ejemplo, si al menos una parte del enzima esencial según la invención, no homóloga con las \alpha-amilasas conocidas, ejerce un efecto sobre las actividades amilolíticas adicionales, que estén presentes. Sin embargo puede ser interesante el empleo conjunto debido a especificidades del substrato variables. La actividad de la CGTasa de las variantes según la invención puede ser ventajosa para ambas formas de realización.

Una forma preferente de realización está representada por agentes según la invención, que se caracterizan porque contienen, adicionalmente, otros enzimas, especialmente una o varias proteasas, lipasas, óxidorreductasas, hemicelulasas y/o celulasas.

Esto se debe a que, especialmente es ventajoso con diversas suciedades químicas, el empleo de enzimas adicionales con actividad limpiadora, respectivamente de enzimas con actividad específica. A éstos pertenecen, por ejemplo, tal como puede verse por el estado de la técnica, las proteasas, las lipasas, las cutinasas, las óxidorreductasas o las peroxidasas como componentes de los sistemas de blanqueo enzimáticos, las lacasas (WO 00/39306), las esterasas, las pululanasas, las celulasas, las hemicelulasas, tal como por ejemplo las xilanasas, los enzimas desprendedores de pectina (WO 00/42145) o las \beta-glucanasas (WO 99/06515 y WO 99/06516), que se emplean especialmente en agentes de lavado especiales, así como sus mezclas.

Ejemplos de enzimas que pueden ser adquiridos en el comercio para su utilización en los agentes según la invención son proteasas tales como subtilisina BPN', Properase®, BLAP®, Optimase®, Opticlean®, Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Alcalase®, Esperase®, Savinase®, Durazym®, Everlase® y/o Purafect®G o Purafect®OxP y lipasas tales como Lipolase®, Lipomax®, Lumafast® y/o Lipozym®.

La actividad de la proteasa en tales agentes puede determinarse según los métodos descritos en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132. Por lo tanto se indicará, de manera correspondiente, en PE (unidades de proteasa). La actividad en proteasa de los agentes preferentes puede llegar hasta 1.500.000 unidades de proteasa por gramo de preparación (PE, determinado según los métodos descritos en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132).

En lo que se refiere a su obtención entran en consideración, entre los enzimas que pueden ser empleados, en primer lugar, los que se obtienen a partir de microorganismos, tales como bacterias u hongos, por ejemplo a partir de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptomyces griseus, Humicola lanuginosa, Humicola insolens, Pseudomonas pseudoalcaligenes o Pseudomonas cepacia, especialmente las mezclas de enzimas formadas de manera natural por estas cepas, o bien mezclas con las otras cepas. De manera conocida se obtienen por medio de procesos de fermentación a partir de los microorganismos adecuados, que han sido descritos por ejemplo en las solicitudes de patente alemanas publicadas, no examinadas DE 1940488 y DE 2121397, en las memorias descriptivas de las patentes norteamericanas US 3623957 y US 4264738, en la solicitud de patente europea EP 006638, así como en la solicitud de patente internacional WO 91/02792.

También estos enzimas, empleados adicionalmente en caso dado, pueden estar adsorbidos sobre soportes y/o pueden estar incrustados en substancias de recubrimiento para su protección contra una inactivación prematura como se describe por ejemplo en la memoria descriptiva de la patente europea EP 564476 o en la solicitud de patente internacional WO 94/23005. Éstos están contenidos en los agentes de lavado preferentemente en cantidades de hasta un 10% en peso, especialmente desde un 0,2% en peso hasta un 2% en peso, empleándose de forma especialmente preferente enzimas estabilizados contra la degradación por oxidación, como los que se conocen por ejemplo, por la solicitud de patente internacional WO 94/18314.

En una forma preferente de realización los agentes según la invención se caracterizan porque contienen ciclodextrinas, especialmente aquellas en las que están ocluidos los compuestos de bajo peso molecular.

Éstos pueden estar constituidos por ejemplo por los productos odorizantes, los colorantes o los productos activos antimicrobianos anteriormente descritos. Esto es especialmente ventajoso cuando se quiera que se produzca la liberación de estos componentes en un instante determinado, por ejemplo dentro de un procedimiento con varias etapas. Mediante la adición o la activación de las amilasas o de las CGTasas, éstos pueden ser liberados entonces.

Inversamente, la actividad de la CGTasa puede servir para encapsular en ciclodextrinas compuestos de bajo peso molecular no deseados, tales como substancias estructurantes o productos odorizantes o productos tóxicos y, de este modo, aumentar el rendimiento de limpieza del agente correspondiente, o bien de la etapa correspondiente del procedimiento o del empleo correspondiente. Para la realización de estas variantes es ventajoso añadir a los agentes correspondientes un almidón o un compuesto similar al almidón.

Los agentes preferentes se caracterizan porque están constituidos por más de una fase.

En este caso puede tratarse de fases en dos estados de agregación diferentes, especialmente sin embargo se trata de dos fases en el mismo estado de agregación. Cuando dos o varias fases estén enlazadas entre sí, se ajustarán entre sí de manera especialmente buena los efectos correspondientes. Una ventaja de esta forma de realización, a ser configurada según el estado de la técnica consiste en que tales agentes pueden liberar independientemente entre sí en el tiempo o en el espacio por ejemplo los productos activos que contienen. Además pueden protegerse durante el almacenamiento frente a los otros componentes a los componentes sensibles, por ejemplo a los enzimas.

Una forma de realización preferente de este tipo se caracteriza porque el agente es sólido y se presentan mezclados entre sí al menos dos componentes sólidos diferentes, especialmente polvos, granulados o cuerpos extruidos, en forma globalmente a granel.

Tales agentes pueden fabricarse de manera sencilla mezclándose entre sí los diversos componentes sólidos, especialmente los polvos, los granulados o los cuerpos extruidos con diversos componentes y/o mezclas de componentes y/o con comportamientos diferentes a la liberación, en forma globalmente a granel. La obtención de estos componentes puede llevarse a cabo de manera conocida, por ejemplo por medio del secado por pulverización o la granulación, añadiéndose ulteriormente, por separado, en caso dado, los enzimas y, eventualmente, otros componentes térmicamente sensibles tales como, por ejemplo, los agentes de blanqueo. Para la obtención de los agentes según la invención con elevado peso a granel, especialmente en el intervalo comprendido entre 650 g/l y 950 g/l, es preferente un procedimiento conocido por la memoria descriptiva de la patente europea EP 486592, que presente una etapa de extrusión. Otra obtención preferente con ayuda de un procedimiento de granulación ha sido descrita en la memoria descriptiva de la patente europea EP642576. Algunos de estos componentes pueden disponerse en este caso también forma comprimida.

Las proteínas pueden emplearse para los agentes sólidos o pobres en agua, por ejemplo, en forma secada, granulada, encapsulada o encapsulada y adicionalmente secada. Pueden añadirse separadamente, es decir como fase propia, o junto con otros componentes en la misma fase, con o sin compactación. Cuando deban elaborarse enzimas microencapsulados en forma sólida, podrá eliminarse el agua con procedimientos conocidos por el estado de la técnica a partir de las soluciones acuosas que se forman durante la preparación, tal como por medio del secado por pulverización, de la eliminación por centrifugación o por medio de la transolubilización. Las partículas, obtenidas de este modo, tienen usualmente un tamaño de partícula comprendido entre 50 y 200 \mum.

La forma encapsulada es adecuada para proteger los enzimas frente a otros componentes, tales como, por ejemplo, los agentes de blanqueo o para posibilitar una liberación controlada (controlled release). De acuerdo con el tamaño de estas cápsulas se distinguirá entre milicápsulas, microcápsulas y nanocápsulas, siendo las microcápsulas especialmente preferentes para los enzimas. Tales cápsulas se han divulgado por ejemplo, con las solicitudes de patente WO 97/24177 y DE 19918267. Otro posible método de encapsulación consiste en que los enzimas, adecuados para el empleo en los agentes para el lavado y para la limpieza, se encapsulan a partir de una mezcla de la solución enzimática con una solución o suspensión de almidones o de un derivado del almidón, en almidones, o bien en el derivado del almidón. Un procedimiento de encapsulación de este tipo se ha descrito en la solicitud de patente alemana DE 19956382 con el título "Procedimiento para la obtención de enzimas microencapsulados".

En una forma preferente de realización los agentes según la invención se caracterizan porque están compactados.

Es preferente el prensado adicional o el compactado para formar tabletas. Para la fabricación de los agentes según la invención en forma de tabletas, que pueden ser monocrómicas o policrómicas, monofásicas o polifásicas y/o que pueden estar constituidas por una o por varias capas, se mezclan entre sí en un mezclador preferentemente todos los componentes -en caso dado para cada capa- y la mezcla se prensa con prensas entabletadoras tradicionales, por ejemplo prensas excéntricas o prensas circulares, con fuerzas de prensado en el intervalo desde aproximadamente 50 hasta 100 kN/cm^{2}, preferentemente a 60 hasta 70 kN/cm^{2}. Especialmente en el caso de tabletas con varias capas puede ser ventajoso que se prense previamente al menos una capa. Esto se llevará a cabo preferentemente con fuerzas para el prensado comprendidas entre 5 y 20 kN/cm^{2}, especialmente a 10 hasta 15 kN/cm^{2}. Preferentemente una tableta configurada de este modo presenta un peso desde 10 g hasta 50 g, especialmente desde 15 g hasta 40 g. La forma geométrica de las tabletas es arbitraria y puede ser circular, oval, poligonal, aún cuando también sean posibles formas intermedias.

Los agentes según la invención de las formas preferentes de realización se caracterizan porque al menos una de las fases contiene un material sensible a las amilasas, especialmente almidones o está rodeada o recubierta, al menos en parte, por dicho material.

Esto se debe a que entonces pueden liberarse los componentes de la fase correspondiente con ayuda de la actividad de una proteína o derivado según la invención. Esto es ventajoso especialmente cuando los productos correspondientes no deban ser activos especialmente durante el almacenamiento o tampoco al comienzo del empleo del agente correspondiente. Esto puede aprovecharse para agentes con, al menos, dos fases diferentes, por ejemplo dos o más fases sólidas, combinadas entre sí de un agente en forma de tabletas para el lavado o la limpieza, o diversos granulados dentro del mismo agente en estado de polvo. Los agentes con dos o con varias fases para el fregado mecánico de la vajilla así como también en agentes de lavado corresponden al estado de la técnica. La actividad de un enzima amilolítico en una fase activada prematuramente es una condición previa favorable para la activación de una fase tardía, cuando ésta esté rodeada por una capa o recubrimiento sensibles a las amilasas o el material sensible a las amilasas sea un componente integral de la fase sólida, durante cuya hidrólisis parcial o completa se desintegre la fase correspondiente. Alternativamente, pueden ser directamente contiguos también la actividad amilolítica y su substrato de tal manera, que se produzca directamente la hidrólisis y la desintegración con el agua entrante.

Los sistemas complejos de agentes para el lavado y la limpieza con componentes diversos y con diversos tipos de encapsulación pueden basarse en este mecanismo, cuyos sistemas representan formas de realización especialmente preferentes de la presente invención.

Los agentes según la invención de las formas de realización preferentes se caracterizan porque se presentan en estado líquido, de gel o pastoso y la proteína contenida y/o al menos uno de los enzimas contenidos y/o al menos uno de los otros componentes contenidos están presentes de manera encapsulada individualmente o junto con otros componentes, preferentemente en microcápsulas, de forma especialmente preferente en aquellas constituidas por material sensible a las amilasas.

Las proteínas o los derivados según la invención pueden añadirse a los agentes según la invención en solución concentrada acuosa o no acuosa, por ejemplo en forma líquida, por ejemplo en forma de solución, de suspensión o de emulsión, así como también en forma de gel o en forma de polvo encapsulado o como polvo seco. Tales agentes se fabrican por regla general por medio de la simple mezcla de los componentes, que se añaden a un mezclador automático en substancia o en forma de fase líquida homogénea.

Entre éstos son especialmente preferentes aquellos agentes líquidos, en forma de gel o pastosos con cápsulas constituidas por material sensible a las amilasas. De este modo, el enzima amilolítico favorece la disociación de las microcápsulas y controla, de este modo, como se ha descrito anteriormente, el proceso de liberación de los componentes encapsulados. Ventajosamente se lleva a cabo la liberación en un instante determinado.

Los agentes según la invención se caracterizan, en una forma preferente de realización, porque está modificada la actividad amilolítica y/o la actividad de CGTasa del agente por medio de los otros componentes, especialmente está estabilizada y/o se ha aumentado su contribución para el rendimiento del lavado o bien de la limpieza del agente.

Los componentes de los agentes para el lavado o la limpieza según la invención son capaces, de manera conveniente, por lo tanto de favorecer mutuamente su rendimiento. El empleo sinérgico de amilasas y de inhibidores para el corrido de los colores para aumentar el rendimiento de la limpieza se ha divulgado, por ejemplo, en la solicitud WO 99/63035. También se sabe que puede estabilizarse y aumentar la actividad y la estabilidad de los enzimas contenidos con ayuda de polímeros que simultáneamente pueden ser empleados como coadyuvantes, tales como, por ejemplo, los alquil-poli-glicósidos, como se ha descrito en la solicitud WO 98/45396. Del mismo modo es posible que también sea modificada, especialmente que sea estabilizada y/o que quede reforzada la actividad amilolítica esencial para la invención por medio de los restantes componentes anteriormente descritos. Las recetas coordinadas de manera correspondiente para los agentes según la invención representan, por lo tanto, formas de realización especialmente preferentes, de la presente invención.

Los procedimientos para la limpieza de artículos textiles sobre superficies duras representan otro objeto de la invención, que se caracterizan porque se activa al menos en una de las etapas del procedimiento una proteína o derivado, según la invención, que presenten una actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa.

Todos los procedimientos de limpieza representan formas de realización con esta finalidad, entre las cuales se encuentran los procedimientos para la limpieza a mano, especialmente sin embargo los procedimientos para la limpieza mecánica. Éstos pueden ser procedimientos para la limpieza de todos los materiales imaginables, especialmente de artículos textiles o de materiales comparables y de superficies duras. De este modo se demuestra por medio de los ejemplos en la presente solicitud que un enzima según la invención, enlazado en los agentes para el lavado o la limpieza, aumenta tanto el rendimiento de lavado de los agentes para el lavado mecánico de los artículos textiles así como también el rendimiento de limpieza de los agentes para el fregado mecánico de la vajilla.

En este caso son preferentes aquellos procedimientos en los cuales la actividad de la CGTasa de la proteína empleada, esencial para la invención, forma ciclodextrinas y en éstas están ocluidos compuestos de bajo peso molecular, tales como, por ejemplo, los productos odorizantes o las toxinas. Una etapa del procedimiento de este tipo puede ser denominada "enmascaramiento".

Precisamente, los procedimientos para la limpieza mecánica se caracterizan por un programa de limpieza con varias etapas de tal manera que pueden ser liberados diversos componentes con actividad de limpieza sobre el producto a ser limpiado de manera separada entre sí en el tiempo. Tales procedimientos se utilizan, por ejemplo, en el caso de la limpieza de instalaciones de producción industriales para artículos comestibles. Por otro lado, el enzima, esencial para la invención, tiene por sí mismo, debido a su actividad enzimática, la capacidad de atacar a las impurezas que contengan hidratos de carbono y ciertamente también en ausencia parcial o total de detergentes o de otros componentes característicos de los agentes para el lavado o la limpieza. Según una forma de realización de la presente invención puede elegirse por lo tanto en un procedimiento mecánico para la limpieza de artículos textiles o de productos sólidos, en el que la proteína, esencial para la invención, actúe sobre las impurezas sin otros componentes con actividad limpiadora. Preferentemente se combinará con esta finalidad con estabilizantes y/o con substancias tampón.

Los procedimientos para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras representan formas preferentes de realización, que se caracterizan porque se utiliza un agente según la invención al menos en una de las etapas del procedimiento.

Esto se debe a que estos agentes se caracterizan porque contienen una proteína o derivado según la invención, preferentemente en el ámbito de una receta, que ha sido ajustada de acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente.

Los procedimientos para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras representan formas preferentes de realización, que se caracterizan porque se emplea la proteína, o el derivado, que presentan la actividad amilolítica y/o la actividad de CGTasa en la etapa correspondiente del procedimiento en una cantidad comprendida entre 0,035 mg y 2.000 mg o de una manera más preferente comprendida entre 0,07 mg y 1.900 mg, comprendida entre 0,1 mg y 1.800 mg, comprendida entre 0,15 mg y 1.700 mg, comprendida entre 0,2 mg y 1.600 mg, comprendida entre 0,3 mg y 1.500 mg o comprendida entre 0,4 mg y 1.250 mg por aplicación.

En una posible forma de realización de los procedimientos mecánicos para la limpieza de los artículos textiles o de las superficies duras se han establecido como adecuadas concentraciones activas de una proteína según la invención comprendidas entre 0,005 mg y 10 mg por litro de baño de lavado, preferentemente comprendidas entre 0,01 mg y 8 mg por litro de baño de lavado. En otras formas adecuadas de realización pueden producirse valores que se desvíen claramente de los anteriores cuando se tenga en consideración que para los procedimientos de limpieza mecánicos se utilizan dispositivos que transforman volúmenes claramente diferentes del baño de lavado en cantidades de agente de lavado o bien en cantidades de agente para el fregado casi idénticas. De este modo, los agentes para el lavado, según la invención, se emplearán usualmente en los procedimientos mecánicos en cantidades comprendidas entre 50 y 100 g en volumen por cada 50 hasta 100 litros y los agentes de limpieza según la invención se emplearán en cantidades comprendidas entre 20 y 40 g en volumen por cada 8 hasta 20 litros.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado según la invención, que presenten actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, individualmente o junto con al menos otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca la actividad de limpieza para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras.

Un empleo de este tipo puede llevarse a cabo mecánicamente o de otra manera, especialmente de manera manual. Esto se refiere a la limpieza de todos los materiales imaginables, especialmente de los artículos textiles o de las superficies duras. Este empleo puede estar incorporado, de acuerdo con lo que se ha dicho anteriormente, en una receta constituida por otras substancias con actividad de lavado o puede llevarse a cabo, de acuerdo con la naturaleza del enzima esencial para la invención, también ampliamente en ausencia de tales compuestos. A partir de las realizaciones anteriores se presentan formas correspondientes de realización preferente. A éstas pertenecen, por ejemplo, el empleo en un procedimiento de limpieza con varias etapas o aquellas posibilidades de aplicación en las que la actividad de CGTasa de la proteína empleada, esencial para la invención, forme ciclodextrinas y estén ocluidos y, por lo tanto, enmascarados en las mismas compuestos de bajo peso molecular, tales como, por ejemplo, los productos odorizantes o las toxinas.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de un agente según la invención para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras. Con esta finalidad se presentan las formas de realización preferentes que corresponden, respectivamente, a lo que se ha dicho anteriormente.

Las formas de realización preferentes se caracterizan porque se añade, por aplicación, preferentemente por aplicación en una máquina lavavajillas o en una máquina lavadora, entre 0,035 mg y 2.000 mg o, de una manera más preferente, entre 0,07 mg y 1.900 mg, entre 0,1 mg y 1.800 mg, entre 0,15 mg y 1.700 mg, entre 0,2 mg y 1.600 mg, entre 0,3 mg y 1.500 mg o entre 0,4 mg y 1.250 mg de la proteína o del derivado que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa.

Otra forma de realización corresponde al empleo de una proteína o derivado según la invención solos o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca la acción de limpieza, en un agente para el lavado o la limpieza que esté constituido po más de una fase, para la activación de la fase propia o de otras fases.

De este modo, se disolverán, de manera parcial o total, como se ha descrito precedentemente, en los agentes correspondientes las capas protectoras alrededor de los componentes correspondientes o se desintegrarán las fases sólidas con los materiales sensibles a las amilasas contenidos o circundantes. Es especialmente preferente también, bajo este aspecto, la liberación de los componentes para provocar un efecto limpiador de los componentes sobre superficies duras o materiales de tipo textil.

Una forma de realización especialmente preferente consiste en el empleo de una proteína o derivado según la invención, solos o junto con, al menos, otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza, en un agente para el lavado o la limpieza con componentes encapsulados para la liberación de los componentes a partir de las cápsulas.

Esto se debe a que, debido a su actividad se provocará en agentes correspondientes, preferentemente en agentes líquidos, en estado de gel o pastosos, la disolución parcial o completa de las cápsulas que contengan hidratos de carbono, especialmente las nanocápsulas, las microcápsulas o las milicápsulas. De este modo se posibilita de manera controlada, como se ha explicado ya, el proceso de liberación de los componentes correspondientes del agente. Preferentemente se lleva a cabo la liberación de los componentes para provocar un efecto limpiador de los componentes sobre una superficie dura o sobre un material de tipo textil.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado, según la invención, para el tratamiento de materiales en bruto o de productos semielaborados en la fabricación de los artículos textiles, especialmente para el desencolaje del almidón o para la eliminación de capas protectoras de almidón o similares al almidón de productos semielaborados industriales.

Los materiales en bruto para la fabricación de artículos textiles, por ejemplo para aquellos a base de algodón, se aprestan en el ámbito de su fabricación y en su elaboración ulterior con almidones, para mejorar su elaboración. Este procedimiento, empleado tanto en los hilos, en los productos semielaborados así como también en los artículos textiles, se denomina encolaje (sizing). Para la eliminación del encolaje, es decir de la capa de protección que contiene almidón (desizing) son adecuadas las proteínas según la invención.

Otro objeto de la invención consiste en procedimientos para la licuación de los almidones, especialmente para la producción de etanol, caracterizados porque se utiliza en los mismos una proteína o derivado según la invención al menos en una de las etapas del procedimiento.

Para la licuación de los almidones se incuba el almidón hinchado en agua o en solución tampón, con los enzimas amilolíticos, con lo cual se trocea el polisacárido en componentes más pequeños, finalmente se trocea preponderantemente en maltosa. Los enzimas según la invención se emplearán preferentemente para este procedimiento o en una etapa parcial del mismo, cuando puedan adaptarse perfectamente en un procedimiento de producción correspondiente como consecuencia de sus propiedades bioquímicas. Esto ocurre por ejemplo cuando puedan emplearse en una etapa además de otros enzimas, que requieran las mismas condiciones de reacción y/o cuando estén disponibles en variantes insensibles al calor. Son especialmente preferentes las proteínas amilolíticas, según la invención, cuando constituyan el centro de interés los propios productos formados por las mismas. La licuación del almidón puede representar incluso una etapa en un procedimiento con varias etapas para la obtención de etanol o de los productos derivados del mismo, por ejemplo ácido acético.

Otro objeto de la invención consiste, por lo tanto, de acuerdo con el objeto anteriormente citado, también en el empleo de una proteína o derivado, según la invención, para la licuación del almidón, especialmente en un procedimiento para la producción de etanol.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado, según la invención, para la obtención o la modificación de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta, especialmente de una proteína o derivado de este tipo cuya actividad de CGTasa haya quedado limitada por deleción.

Se sabe que las CGTasas de tipo natural se transforman únicamente en parte en ciclodextrinas y en otra parte se convierten sin embargo en oligosacáridos lineales (Wind et al., Eur. J. Biochem., 253 (1998), páginas 598 - 605), frecuentemente en aquellos con 2 hasta 12 monómeros. Por lo tanto el enzima según la invención puede emplearse también para la obtención o para la modificación tanto de las ciclodextrinas así como también de los oligosacáridos lineales. Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, para la obtención in situ de compuestos correspondientes con una conducción correspondiente de la reacción.

De este modo, las proteínas amilolíticas, según la invención forman, especialmente cuando haya sido reprimida su capacidad para la transglicosilación, es decir para la formación de ciclodextrina, por ejemplo por medio de la mutagénesis de deleción, a partir de polímeros similares a los almidones al cabo de un corto tiempo de incubación, preponderantemente oligosacáridos de elevado peso molecular, tales como, por ejemplo, la maltohexaosa, la maltoheptaosa o la maltooctaosa. Al cabo de un tiempo de incubación mayor aumenta la proporción de los oligosacáridos de bajo peso molecular entre los productos de la reacción, tales como, por ejemplo, la maltosa o la maltotriosa. Cuando se tenga un interés especial en determinados productos de la reacción podrán emplearse variantes correspondientes de la proteína según la invención y/o podrán establecerse de manera correspondiente las condiciones de la reacción. Esto es especialmente atractivo cuando no se trate de obtener productos puros sino cuando se trate de obtener mezclas de compuestos parecidos, tal como por ejemplo en el caso de la formación de soluciones, de suspensiones o de geles únicamente con determinadas propiedades físicas.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado según la invención para la obtención, para la modificación o para la hidrólisis de las ciclodextrinas.

Las proteínas o los derivados según la invención son adecuados, debido a su actividad de CGTasa, para la obtención, para la modificación o para la hidrólisis de ciclodextrinas. Esto se verifica, por ejemplo, por medio de la transformación alternativa o por medio de la formación de otras ciclodextrinas. Estas reacciones pueden llevarse a cabo de manera conveniente en cooperación con otros enzimas que actúen sobre los monosacáridos y/o sobre los oligosacáridos.

En una forma preferente de realización se lleva a cabo este empleo para el alojamiento o la liberación de compuestos de bajo peso molecular o de elevado peso molecular en, respectivamente a partir de los soportes de tipo polisacárido, especialmente las ciclodextrinas.

Las ciclodextrinas son adecuadas para el alojamiento de compuestos poco hidrófilos debido a su cavidad interna, que se caracteriza por una cierta magnitud de hidrofobicidad, especialmente cuando estén superpuestos en la red cristalina de tal manera que formen canales intramoleculares continuos. En el caso de las moléculas gaseosas hidrófobas puede tratarse, por ejemplo, de productos odorizantes, de colorantes, de compuestos activos de bajo peso molecular cosméticos o farmacéuticos o similares. Las ciclodextrinas pueden cumplir por lo tanto la función de alojar provisionalmente los correspondientes componentes y de liberarlos nuevamente de manera controlada, por ejemplo tras la rotura mecánica, por hidrólisis o enzimática de su estructura cristalina.

Las proteínas, o los derivados, según la invención, especialmente aquellos con actividad de CGTasa pueden emplearse tanto en la obtención o en la elaboración de tales compuestos de oclusión así como también para la liberación de los componentes. Para la obtención pueden incubarse, por ejemplo, el almidón o el polisacárido similar al almidón y, al mismo tiempo, el compuesto de bajo peso molecular con un enzima según la invención de tal manera, que en el instante de la formación de la ciclodextrina queden ocluidos al mismo tiempo los compuestos de bajo peso molecular. La liberación puede llevarse a cabo por medio de la inversión de la reacción de formación aplicándose sobre el preparado de ciclodextrina, que contiene un componente, la CGTasa u otro enzima que hidrolice a las ciclodextrinas, que hidrolice los compuestos de oclusión y, que por lo tanto, libere los componentes.

De manera similar pueden liberar las proteínas amilolíticas, según la invención, compuestos de bajo peso molecular también de otros polisacáridos enlazados de manera \alpha-(1,4)-glicosídica, por ejemplo cuando los componentes estén presentes encapsulados en forma de microcápsulas. El almidón es, por ejemplo, un material consolidado en el estado de la técnica para encapsular durante el almacenamiento compuestos tales como, por ejemplo, enzimas, que deban ser empleados en cantidades definidas en la carga de la reacción. El proceso controlado de liberación a partir de tales cápsulas puede ser favorecido por los enzimas, según la invención, que presentan función amilolítica y/o función de CGTasa.

En una forma preferente de realización se lleva a cabo este empleo por medio de la estabilización de compuestos químicos durante su obtención o durante su elaboración.

La oclusión de los compuestos hidrófobos en las ciclodextrinas puede emplearse en la química, por ejemplo, para la extracción en fase sólida, para la catálisis de reacciones o para la separación de los enantiómeros. Además puede emplearse para ocluir los compuestos sensibles en la síntesis química, tales como, por ejemplo, aquellos que sean sensibles frente a la oxidación o frente a la fotolisis, así como también compuestos fácilmente volátiles, difícilmente solubles o de olor desagradable. De este modo pueden protegerse, por ejemplo, frente a los efectos del medio ambiente, pueden fijarse o pueden solubilizarse. Esto puede llevarse a cabo preferentemente durante la síntesis de tales compuestos o durante su elaboración ulterior, por ejemplo en el momento de la aplicación física de tales compuestos sobre la fase sólida. Para la obtención de tales compuestos de oclusión son adecuadas las proteasas o los derivados según la invención con actividad de CGTasa.

En una forma preferente de realización se lleva a cabo este empleo para la obtención o como parte integrante de productos cosméticos o farmacéuticos.

Esto se debe a que las ciclodextrinas pueden emplearse, de acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente, tanto para la obtención de los compuestos correspondientes así como también para su almacenamiento, o bien para su encapsulación o enmascarado. Preferentemente posibilitan en este caso una liberación controlada de los productos activos. El empleo del propio enzima, que presente actividad amilolítica o actividad de CGTasa, en la industria cosmética es especialmente conveniente cuando deba actuar sobre un substrato de tipo polisacárido, por ejemplo para la eliminación de la placa dental.

Otro objeto de la invención consiste, por lo tanto, también en los propios productos cosméticos o farmacéuticos caracterizados porque contienen una proteína o derivado según la invención o, al menos, un componente que haya sido fabricado por medio del empleo de un enzima de este tipo, especialmente según una de las aplicaciones precedentemente descritas.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado, según la invención, para la obtención de artículos comestibles y/o de componentes para los artículos comestibles.

Siempre que juegue un papel el almidón como componente comestible, podrá emplearse una actividad amilolítica para su fabricación. Este aumenta la proporción en monosacáridos o en oligosacáridos frente a los azúcares polímeros, lo cual favorece el sabor, la aptitud a ser digerido o la consistencia del artículo comestible. Esto es necesario, por ejemplo, en el caso de la fabricación de jugos de frutas o de vino cuando deba reducirse la proporción en azúcares polímeros y cuando deba aumentarse la proporción de los azúcares dulces y/o fácilmente solubles.

Las amilasas y, especialmente, las CGTasas impiden además también la pérdida de sabor de los artículos de panadería, conocida como añejamiento (efecto anti staling). Para ello se añadirán de manera conveniente a la masa como paso previo a la cocción. Otras formas preferentes de realización de la presente invención consisten por lo tanto en aquellas en las que se emplea la proteína o el derivado según la invención para la fabricación de artículos de panadería.

La formación de las ciclodextrinas puede utilizarse en el caso de la fabricación de los artículos comestibles por ejemplo también para eliminar de los agentes comestibles, los componentes no deseados, hidrófobos, de tales artículos comestibles tales como el colesterol o las grasas.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado según la invención para la fabricación de pienso para los animales y/o de componentes para los piensos de los animales.

Esto se debe, también, a que pueden fabricarse o mejorarse los piensos para los animales, por ejemplo en el caso del engorde de los animales, de acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente en el caso de los artículos comestibles.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado según la invención para la restauración del papel. Además de otros productos naturales se utiliza también el almidón desde hace siglos como agente aglutinante en la fabricación del papel y para el pegado de diversos papeles y cartones. Esto se refiere por ejemplo a los artículos gráficos y a los libros. En el transcurso de un largo período de tiempo, tales papeles pueden ondularse o romperse bajo efectos desfavorables, tal como por ejemplo la humedad, lo cual puede conducir a su destrucción completa. En el caso de la restauración de tales papeles o cartones puede ser necesario el desprendimiento de la capa de pegamento, que se facilita considerablemente por medio del empleo de una proteína amilolítica según la invención.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de una proteína o derivado, según la invención, para la obtención o para el desprendimiento de uniones por pegado que contengan almidón o compuestos similares.

Los polímeros vegetales, tales como el almidón o la celulosa y sus derivados solubles en agua se utilizan entre otros, también como pegamentos o como engrudo. Para ello tienen que hincharse en primer lugar en agua y secarse tras la aplicación sobre el producto a ser pegado, con lo cual éste se fija sobre el soporte. Las proteínas o los derivados según la invención pueden ser añadidos a una suspensión acuosa de este tipo para influenciar las propiedades de adherencia del engrudo formado. Sin embargo pueden añadirse al engrudo también en lugar de ello o además de esta función, para permanecer inactivos sobre el producto pegado tras el secado durante un tiempo prolongado, por ejemplo durante algunos años. La modificación específica de las condiciones ambientales, por ejemplo por medio del humedecimiento, puede emplearse entonces para activarlos en un instante ulterior y, de este modo, para provocar un desprendimiento del engrudo. De este modo, puede desprenderse el engrudo más fácilmente de nuevo del soporte. En esta aplicación, las proteínas o los derivados según la invención actúan como agentes segregadores en un procedimiento de pegado temporal o como "conmutadores" para el desprendimiento del producto pegado.

Del mismo modo puede encontrar aplicación precisamente también la actividad de CGTasa de las proteínas o de los derivados, según la invención, para la síntesis de tales pegamentos.

Otro objeto de la invención consiste, de acuerdo con lo que se ha dicho precedentemente, también en los propios procedimientos de pegado temporal, caracterizados porque se emplea una proteína o derivado según la invención al menos en una de las etapas del procedimiento.

Ejemplos Ejemplo 1 Detección de una amilasa procedente de B. agaradherens

En el ámbito de una selección microbiana de los microorganismos que forman amilasa con el criterio de selección de crecimiento y de formación de halo sobre las placas de agar con un 1% de almidón de maíz como únicamente fuente de carbono se identificó la cepa del bacilo Bacillus agaradherens (DSM ID 94-759, depósito DSM 9948) como formadora de amilasa.

El cultivo se llevó a cabo en medio líquido constituido por 10 g/l de almidón soluble, 20 g/l de peptona, 1 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de K_{2}HPO_{4} y 5 g/l de NaCl. El valor del pH se ajustó a 10 tras el tratamiento en autoclave, con solución al 20% de carbonato de sodio. Se cargaron 25 ml de medio en matraces de Erlenmeyer estériles, de 100 ml, con placa desviadora y se inoculó con un cultivo de B. agaradherens (DSM 9948), que había crecido sobre una placa de agar con almidón de maíz. El cultivo se llevó a cabo a 30ºC durante 48 horas por medio de la aplicación de sacudidas a 140 rpm.

Mediante centrifugación del cultivo pudo separarse de la masa celular la actividad de amilasa en el sobrenadante y pudo someterse a ensayos más detallados.

Ejemplo 2 Clonación

Cada una de las etapas individuales de trabajo para la clonación se efectuaron de acuerdo con los métodos patrón, como los que han sido dados por ejemplo en el manual de Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.

Se identificó el gen correspondiente por medio de un método de clonación con perdigonada "shot-gun". Para ello se preparó, en primer lugar, ADN cromosómico de la cepa B. agaradherens (DSM 9948) y se incubó con el enzima Sau 3A. Tras la restricción se encajaron los fragmentos obtenidos con un peso molecular comprendido entre 1,5 y 5 kb en los puntos de corte de restricción Bam HI y Bg/II del vector pCB76C con un gen resistente a la canamicina como marcador de selección; este vector ya es conocido por la solicitud WO 91/02792.

El vector, obtenido de este modo, se transformó en un mutante negativo a la amilasa de la cepa Bacillus subtilis DB104 que había sido obtenido por medio de una deleción cromosómica parcial a partir del gen AmyE. Los clones positivos pudieron ser identificados por medio de la formación de halo sobre placas de agar que contenían amilosa. Se aislaron sus plásmidos, que contenían el inserto, y los insertos obtenidos se secuenciaron.

Ejemplo 3 Secuenciación

La secuenciación se llevó a cabo con ayuda de un estuche tradicional de acuerdo con el método de la rotura de las cadenas. Diversos clones secuenciados, independientes, contenían un inserto con un tamaño de 2.621 bp. En éste se encuentra el gen que comprende 2.142 bp para el enzima interesado. Su secuencia ha sido indicada en la SEQ ID NO. NO. 1 en el protocolo de secuencias de la presente solicitud. A éste le corresponde un polipéptido de 713 aminoácidos, con inclusión de un péptido de señal con una longitud aproximada de 34 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos, derivada de la secuencia de ADN está dada en la SEQ ID NO. NO. 2 en el protocolo de secuencias. El peso molecular deducido de la proteína es de 88,9 kD y cuando no se tiene en consideración el péptido de señal es de 76,4 kD.

Ejemplo 4 Homologías

Se llevaron a cabo comparaciones de las secuencias según el método FASTA (W. R. Pearson, D. J. Lipman, PNAS (1988) 85, páginas 2444-2448) el 25.5.2000 por medio del servidor del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) en Cambridge, Gran Bretaña (http://www.ebi.ac.uk) y, concretamente, con el programa Fasta3 (matriz: blosum62 y default parameters). Éstas caracterizaron al enzima como la ciclodextrinaglucanotransferasa (CGTasa), que dispone de manera natural también de una función amilolítica.

Los valores de homología de este enzima con respecto al enzima conocido, emparentado de la manera más próxima, identificado con este ensayo, tenían, como se ha mostrado en la tabla 2 siguiente, una identidad menor que el 57% y menos de un 70% de aminoácidos idénticos y conservados. Las correspondientes secuencias completas pueden ser obtenidas, por medio de las denominaciones indicadas en la tabla bajo la designación identificador EMBL/SW, por medio de cualquiera de los bancos de datos accesibles al público, tal como por ejemplo del banco de datos Swiss-PROT (Geneva Bioinformatics, Ginebra, Suiza; http://www.genebio.com/sprot.html).

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TABLA 2 Resultados de la comparación FASTA de la CGTasa procedente de B. agaradherens (DSM 9948, CDGT_BACAG) con las CGTasas conocidas hasta ahora, con el parentesco más estrecho

5

En la figura 1 se ha representado una alineación con las proteínas más parecidas. Ésta muestra los tres dominios A, B y C responsables de la actividad de \alpha-amilasa (posiciones 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2) y los dos dominios D y E responsables de la interacción con el substrato y de la ciclación de la ciclodextrina liberada a continuación; éstos últimos en las posiciones 527 hasta 713. La región de transición comprendida entre los dominios C y D se caracteriza en las proximidades de la posición 530 por medio de una doble flecha; la serie de aminoácidos VWE (posiciones 524 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2) se asocia todavía con el dominio C, mientras que la serie de aminoácidos PSI (posiciones 535 hasta 537 según la SEQ ID NO. 2) se asocia ya al dominio D. Por lo tanto se trata, también en lo que se refiere a la estructura primaria, de una ciclodextrina-glucanotransferasa (CGTasa), que dispone de manera natural de la actividad de una \alpha-amilasa.

El enzima más parecido a los dominios A hasta C de la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948), una CGTasa, dispone de una homología con respecto al mismo con una identidad de un 60,1% en el plano de los aminoácidos. En el plano del ADN el enzima más próximo dispone de una homología con una identidad del 61,1%.

Ejemplo 5 Cultivo

Se inocularon con una colonia monocelular de la cepa de laboratorio B. subtilis DB 104 con la CGTasa clonada, 100 ml de medio MLBSP (10 g/l de Casiton, firma Becton Dickinson, Cockeysville, USA; 20 g/l de triptona, firma Becton Dickinson, Cockeysville; 10 g/l de extracto de levadura, firma Becton Dickinson, Cockeysville; 5 g/l de NaCl; 27 g/l de succinato de sodio; 100 mg/l de MgSO_{4}*7 H_{2}O; 75 mg/l de CaCl_{2}*2 H_{2}O; 0,5 \muM de MnCl_{2}; 0,5 \muM de FeSO_{4}; 2% (p/v) glucosa; 50 mM de tampón de PIPES (procedente de una solución madre 1 M con pH 7,2); 75 mM de KPO_{4} (procedente de una solución madre 1,5 M con pH 7,0); pH = 7,0, ajustado con KOH, así como 25 mg/l de canamicina) y se incubaron en un matraz sometido a sacudidas, de 250 ml durante 24 horas a 37ºC y a 200 revoluciones por minuto. Un fermentador de laboratorio tradicional con 8 litros de medio MLBSP se inoculó con 80 ml de este cultivo previo y se llevó a cabo la fermentación a 37ºC bajo las condiciones usuales para la especie Bacillus. Una vez alcanzada la fase de crecimiento estacionario pudo obtenerse, a partir del sobrenadante del cultivo, el enzima amilolítico secretado.

Ejemplo 6 Obtención, purificación

A partir del medio de cultivo se obtuvo un enzima singular, a través de las siguientes etapas de purificación: precipitación del sobrenadante del cultivo con etanol; recogida del pellet de proteína en 50 mM de tampón tris/HCl, pH 8,6; cromatografía con intercambio de iones sobre Q-Sepharose® (firma Pharmacia-Amersham Biotech, Suecia), inversión del tamponamiento por medio de diálisis en 50 mM de tampón tris/HCl, pH 8,0; cromatografía con intercambio de iones a través de Mono-Q® (firma Pharmacia-Amersham Biotech, Suecia). A partir de 100 ml de medio de cultivo se obtuvieron, como se determinó por medio del método BCA (ácido bicincónico; ácido 2,2'-biquinolil-4,4'-dicarboxílico), 1,4 mg de una proteína pura según la electrofóresis de gel de SDS-poliacrilo y coloración Coomassie.

Ejemplo 7 Electrofóresis de gel de SDS-poliacrilo y focalización isoeléctrica

En el caso de la electrofóresis de gel desnaturalizante de SDS-poliacrilo en un gel al 8 hasta el 25%, en el sistema PHAST® de la firma Pharmacia-Amersham Biotech, Suecia, y por medio de la comparación con las marcas relevantes de tamaño, el enzima amilolítico nativo, procedente de B. agaradherens (DSM 9948), presenta un peso molecular aparente de 89 kD.

De acuerdo con la focalización isoeléctrica de pH 3 hasta 9 en el sistema PHAST® de la firma Pharmacia-Amersham, el punto isoeléctrico del enzima amilolítico nativo procedente de B. agaradherens (DSM 9948) es de 6,0.

Ejemplo 8 Actividad de CGTasa

La demostración de una actividad de CGTasa se basa en la formación selectiva de complejos de las ciclodextrinas con anaranjado de metilo en medio ácido; en presencia de una actividad de CGTasa se modifica la extinción de una solución correspondiente del substrato. La solución del substrato se prepara de la siguiente manera: se disuelven 0,011 g de anaranjado de metilo (0,3 mmoles), 0,680 g de imidazol (100 mmoles), 0,074 g de cloruro de calcio (5 mmoles), y 1 g de maltotriosa o 1 g de almidón en 100 ml de agua (bidestilada) y se ajusta el valor del pH a 6,8 con HCl. Para la medición se incubaron 1 ml de solución del substrato y 0,5 ml de la solución enzimática a ser ensayada, a 50ºC durante 60 minutos y la reacción se detuvo por medio de la adición de 20 \mul de HCl (2 M); se añadieron a los controles negativos, sin enzima, 0,5 ml de solución enzimática solamente en este instante y todas las muestras se enfriaron durante 10 minutos en el baño de hielo. A continuación se llevó a cabo la medición de la absorción a 505 nm frente al aire en el fotómetro. Para la evaluación se determina la actividad de CGTasa por medio de la cantidad formada de ciclodextrinas, relacionándose las actividades medidas con una curva calibrada (0,2 - 3 mg/ml de \beta-ciclodextrina). En este caso se resta el valor de los controles negativos del valor de la muestra correspondiente.

De acuerdo con este método se ensayaron las cuatro soluciones enzimáticas siguientes: (1.) sobrenadante del cultivo de B. agaradherens (DSM 9948; procedente del ejemplo 1), (2.) solución al 1% de CGTasa (firma Wacker-Chemie GmbH, München), (3.) solución al 1% de CGTasa (firma Amano Enzyme Europe Ltd., Milton Keynes, UK) y (4.) solución al 1% de Termamyl® (firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca). Los resultados se han reunido en la tabla 3 siguiente:

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TABLA 3 Actividad de CGTasa de diversas ciclodextrina-glucanotransferasas sobre diversos substratos

6

Mientras que para la \alpha-amilasa constituida por el Termamyl® no pudo detectarse de este modo, tal como se esperaba, una actividad de CGTasa, el sobrenadante del cultivo de B. agaradherens (DSM 9948) presenta ya una velocidad de formación de ciclodextrina, que puede ser medida claramente. Los controles positivos de las CGTasas, que pueden ser adquiridos en el comercio, certifican la posibilidad de aplicación de este método de detección.

Ejemplo 9 Otras propiedades bioquímicas Actividad de amilasa

El ensayo de la actividad de amilasa se llevó a cabo según el método para la determinación de las amilasas con el estuche "QuickStart®" de la firma Abbott GmbH Diagnostika, Wiesbaden-Delkenheim. Como substrato sirvió un p-nitrofenilmaltoheptaósido bloqueado, que es hidrolizado por las amilasas. Solamente por medio de esta disociación puede liberarse a continuación el colorante p-nitrofenol (pNP) por la glucoamilasa y por la glucosidasa. La intensidad de la formación de color por unidad de tiempo es proporcional a la actividad de la amilasa. El ensayo se lleva a cabo de la siguiente manera: de acuerdo con las instrucciones del fabricante se prepara el reactivo de substrato (0,8 ml de reactivo 1 + 20 ml de reactivo 2). Éste se diluye con agua bidestilada 1:2 para dar el denominado reactivo de trabajo. A continuación se combinan 980 \mul del reactivo de trabajo con 20 \mul de la solución enzimática (diluciones en 44,1 mg de dihidrato de cloruro de calcio + 247,5 \mug de Brij 35® (firma Fluka, Deisenhofen), agua bidestilada hasta 1 litro) y se someten a una incubación previa a 37ºC en un fotómetro termostatable. La representación de la cinética de absorción se llevó a cabo a 37ºC durante 3,5 minutos (se mide a intervalos de 30 segundos) a 405 nm contra un valor en blanco. La calibración del ensayo se llevó a cabo por medio de una serie de concentraciones enzimáticas de un enzima normalizado. La actividad se da en actividad con relación al patrón conocido (por ejemplo TAU = unidad de amilasa termoestable) por ml.

A continuación la actividad de amilasa, determinada de este modo, sirvió como parámetro para la estabilidad del enzima bajo las respectivas condiciones diferentes.

Estabilidad frente a la temperatura

La estabilidad frente a la temperatura del enzima amilolítico nativo, purificado como se ha descrito anteriormente, procedente de B. agaradherens (DSM 9948), se midió con una incubación durante 10 minutos a un valor del pH de 10. La actividad amilolítica es, a 30ºC, una actividad residual del 85% y, a 40ºC, es, al menos, una actividad residual del 80% con respecto a la muestra no incubada con una actividad inicial del 100%. A 50ºC se presenta con una actividad residual del 70%. A 60ºC este enzima de tipo natural es inactivo.

Estabilidad frente al pH

El enzima amilolítico procedente de B. agaradherens (DSM 9948) es ampliamente estable a valores del pH comprendidos entre 5 y 12, cuando sea incubado respectivamente durante 10 minutos a 40ºC.

El óptimo para el pH de su actividad amilolítica se encuentra en un 96% de actividad residual frente a una muestra no incubada con un 100% de actividad inicial a un valor del pH de 12. La actividad cae ligeramente a valores del pH por debajo de 12 de tal manera que, el enzima presenta todavía una actividad residual del 80% al valor ácido del pH de 5.

Estabilidad frente a los tensioactivos y frente a las proteasas

Para la caracterización adicional se examinó el efecto negativo sobre la actividad enzimática por parte de factores posiblemente perturbadores tales como las proteasas o los tensioactivos: tras la acción de una proteasa, concretamente de 0,66 unidades de la Novo-proteasa (NPU) constituido por el Savinase® 4.0 T (firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) por ml y de 0,1% de SDS a pH 10 durante 15 minutos y a 50ºC, el enzima presenta una actividad residual del 49%. En presencia de 3 mM de EDTA en lugar de SDS y de proteasa, bajo condiciones iguales por lo demás, presenta todavía un 20% de su actividad amilolítica.

Ejemplo 10

Se dotaron a artículos textiles de algodón, de manera normalizada, con las cuatro suciedades diferentes A (flan de chocolate), B (copos de avena con cacao), C (copos de avena con cacao y un poco de leche) y D (almidón de patata) y se ensayaron por medio del material, preparado de este modo, diversas recetas de agentes de lavado con el launderómetro con respecto a su rendimiento de lavado. Para ello se ajustó respectivamente una relación de baño de 1:12 y se llevó a cabo la colada durante 30 minutos a una temperatura de 30ºC. La dosificación fue de 5,88 g del correspondiente agente de lavado por litro de baño de lavado. La dureza del agua era de 16º de dureza alemana.

Como agente para el lavado de control sirvió para A, B y C una receta básica de agente para el lavado con la siguiente composición (todas las indicaciones en tanto por ciento en peso): 4% de alquilbencenosulfonato de sodio lineal (sal de sodio), 4% de sulfatos de alcoholes grasos con 12 a 18 átomos de carbono (sal de sodio), 5,5% de alcoholes grasos con 12 a 18 átomos de carbono con 7 EO, 1% de jabones de sodio, 11% de carbonato de sodio, 2,5% de disilicato de sodio amorfo, 20% de tetrahidrato de perborato de sodio, 5,5% de TAED, 25% de zeolita A, 4,5% de policarboxilato, 0,5% de fosfonato, 2,5% de granulado inhibidor de la espuma, 5% de sulfato de sodio, 1% de granulado de proteasa, resto: agua, abrillantadores ópticos, perfume, sales. Esta receta se combinó con diversas amilasas para las diversas series de ensayos de tal manera, que se produjese respectivamente na concentración final de 5,5 mg de enzima amilolítico por litro de baño de lavado. Se compararon los productos Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) con el enzima amilolítico esencial para la invención, constituido por la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948). Para la suciedad D se empleó la misma receta de base, pero sin proteasa y se empleó como controles, como en A - C, o bien se combinó con amilasas.

El grado de blancura de los artículos textiles se midió con el sistema CIELAB con el dispositivo de medición Minolta CR 310 antes y después de la colada en comparación con un patrón, que se había normalizado al 100%. Las diferencias entre los valores obtenidos han sido reunidas en la tabla 4 siguiente para los ensayos correspondientes. Los datos son los valores medios procedentes de 5 mediciones en cada caso. Éstos permiten deducir directamente la contribución del enzima obtenido sobre el rendimiento de lavado del agente empleado.

TABLA 4

7

Puede verse que la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948) contribuye mejor al rendimiento de lavado en el caso de la suciedad B que cada uno de los tres enzimas de referencia, y esto aún cuando en el agente de lavado está contenido un agente de blanqueo, al cual reacciona el enzima contenido, en general, de una manera muy sensible. En el caso de los restantes tipos de suciedad una contribución al menos comparable en el ámbito de los límites de error, que se encuentran siempre claramente por enzima de los valores comparativos sin el enzima amilolítico.

Ejemplo 11

Se dotaron a artículos textiles de algodón, de manera normalizada, con la suciedad C (copos de avena con cacao y un poco de leche). El ensayo con el launderómetro se llevó a cabo como se ha indicado en el ejemplo 1, por medio del empleo de otra receta de base para el agente de lavado, concretamente respectivamente en porcentaje en peso: 14% de alquilbencenosulfonato de Na, 6% de la sal de Na de sulfonatos de alcoholes grasos, 6% de alcoholes grasos con 12-18 átomos de carbono 7 veces etoxilados, 1% de jabones, 25% de zeolita Na-A, 10% de carbonato de Na, 5% de policarboxilato polímero (Sokalan CP5), 11% de dihidrato de citrato trisódico, 4% de ácido cítrico, 1% de inhibidor de la espuma confeccionado en forma de partículas, 1% de granulado de proteasa, 5% de sulfato de sodio, resto: agua y sales. Esta receta de base se utilizó para las diferentes series de ensayos con diversas amilasas de tal manera, que se produjese respectivamente una concentración final de 4,15 mg del enzima amilolítico por litro de baño para el lavado. Se compararon los productos Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) con el enzima amilolítico esencial para la invención, constituido por la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948). La dosificación fue de 4,45 g del correspondiente agente de lavado por litro de baño de lavado.

Tras el lavado se determinó el grado de blancura de los artículos textiles lavados como en el ejemplo precedente. Los respectivos valores por diferencia, obtenidos, se han reunido en la tabla 5 siguiente. Se trata respectivamente de valores medios procedentes de 5 mediciones, que permiten a su vez una deducción directa sobre la contribución del enzima correspondiente con respecto al rendimiento de lavado del agente.

TABLA 5

8

Puede verse que la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948) proporciona en esta receta de agente de lavado, exenta de agente de blanqueo, una mejor contribución al rendimiento de lavado que el de los enzimas de referencia.

Ejemplo 12

Se dotaron artículos textiles de algodón, de manera normalizada, con la suciedad E (cacao con leche). De este modo se llevó a cabo el ensayo por medio del launderómetro como se ha descrito en el ejemplo 10. Como agente de lavado de control sirvió la receta de base del agente de lavado del ejemplo 11, sin embargo sin proteasa. Ésta se combinó con diversas amilasas como en el ejemplo 11 y se empleó con la misma dosificación.

Tras el lavado se determinó el grado de blancura de los artículos textiles lavados en comparación con el sulfato de bario, que se tomó como el 100%. La medición se llevó a cabo en un espectrómetro Datacolor SF500-2 a 460 nm (filtro de bloqueo de los UV 3), diafragma 30 mm, sin brillo, tipo de luz de D65, 10º, d/8º. Los resultados obtenidos se han reunido en la tabla 6 siguiente como % de remisión, es decir como indicaciones en porcentaje en comparación con el sulfato de bario. El valor inicial era del 21,1%. Se han dado los valores medios de respectivamente 5 mediciones. Éstos permiten una deducción directa sobre la contribución del enzima amilolítico contenido en cada caso sobre el rendimiento de lavado del agente empleado.

TABLA 6

9

Puede verse que la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948) no proporciona en esta receta, en ningún caso, una contribución al rendimiento de lavado menor que la de todos los enzimas de referencia ensayados.

Ejemplo 13

Se dotaron recipientes con superficies duras, lisas, de manera normalizada, con copos de avena hinchados en agua y se fregaron a 45ºC con el programa normal de una máquina lavavajillas doméstica del tipo Miele® G 575. Por cada proceso de fregado se emplearon 20 g de agente para el fregado; la dureza del agua fue de 16º alemanes de dureza.

Como agente para el fregado sirvió la receta de base siguiente (todas las indicaciones respectivamente en porcentaje en peso): 55% de tripolifosfato de sodio (calculado como anhidro), 4% de silicato de sodio amorfo (calculado como anhidro), 22% de carbonato de sodio, 9% de perborato de sodio, 2% de TAED, 2% de tensioactivo no iónico, 1,4% de granulado de proteasa, resto: agua, colorantes, perfume. Esta receta de base se empleó para los diversos ensayos con diversas amilasas, concretamente con los productos Termamyl®, Duramyl®, BAN® (fabricante respectivamente: Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) o con el enzima amilolítico esencial para la invención, constituido por la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens DSM-9948, en cantidades activas de, respectivamente, 20 mg del enzima amilolítico correspondiente por proceso de limpieza. Tras el fregado se determinó el desprendimiento de la suciedad en porcentaje. Los resultados obtenidos han sido reunidos en la tabla 7 siguiente. En la misma se han dado los valores medios de respectivamente 8 mediciones. Éstos permiten deducir directamente la contribución del enzima contenido al rendimiento de limpieza del agente empleado.

TABLA 7

10

Estos resultados muestran que la CGTasa procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948) sobrepasa a todas las otras amilasas ensayadas en lo que se refiere a su contribución al rendimiento de limpieza de los agentes para el fregado de la vajilla a máquina, siendo al menos equivalente.

Descripción de las figuras Figura 1

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la CGTasa, según la invención, procedente de B. agaradherens (DSM 9948), según la invención, con la de los cuatro enzimas conocidos; cuya similitud mutua ha sido dada en el ejemplo 4.

En este caso significan:

CDGT_BACAG

la CGTasa según la invención procedente de B. agaradherens (DSM 9948)

CDGT_BACST

la CGTasa procedente de Bacillus stearothermophilus (Q9ZAQ0)

CDGT_BACOH

la CGTasa procedente de Bacillus ohbensis (P 27036)

CDGT_BACSP

la CGTasa procedente de Bacillus sp. cepa 1011 (P 30921)

CDGT_THETU

la CGTasa procedente de Thermoanaerobacter thermosulfurogenes (P 26827).

Consenso

La secuencia de consenso, que se deduce de esta alineación; en la misma puede indicarse los puntos en que son idénticos al menos tres de los cinco aminoácidos respectivos.

Aminoácidos, que coinciden en las cinco secuencias, se han señalado como bloques negros.

La región de transición de los dominios C y D se ha caracterizado con una doble fecha cerca de la posición 530; la serie de aminoácidos VWE (posiciones 524 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2) se asocia todavía con el dominio C, mientras que la serie de aminoácidos PSI (posiciones 535 hasta 537 según la SEQ ID NO.2) se asocia ya con el dominio D.

<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

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<120> Nueva ciclodextrina-glucanotransferasa (CGTasa) procedente de Bacillus agaradherens (DSM 9948) así como agentes para el lavado y la limpieza con esta nueva ciclodextrina-glucanotransferasa

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<130> H 4430 / H 4590

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<140>

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<141>

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<150> 10059108.6-41

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<151> 2000-11-28

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<150> 10059105.1-41

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<151> 2000-11-28

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 2142

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<212> DNA

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<213> Bacillus agaradherens (DSM 9948)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2142)

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<400> 1

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12

13

14

15

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<210> 2

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<211> 713

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<212> PRT

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<213> Bacillus agaradherens (DSM 9948)

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<400> 2

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16

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}

17

\newpage

18

Claims (65)

1. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa con una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. 2 en las posiciones 1 - 713 al menos en un 95%.

2. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 1, con una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos, indicada en la SEQ ID NO.2, en las posiciones 1 - 713 al menos en un 97%.

3. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa con una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos, indicada en la SEQ ID NO. 2, en las posiciones 35 hasta 713 al menos en un 95%.

4. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 3 con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos, indicada en la SEQ ID NO. 2 en las posiciones 35 hasta 713, al menos en un 97%.

5. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos, indicada en la SEQ ID NO. 2, en las posiciones 35 hasta 526 al menos en un 95%.

6. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 5, con una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos, indicada en la SEQ ID NO. 2, en las posiciones 35 hasta 526 al menos en un 97%.

7. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos, indicada en la SEQ ID NO. 1, con relación a las posiciones de los aminoácidos 1 - 713 al menos en un 95%, especialmente a través de una región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 713 según la SEQ ID NO. 2.

8. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 7, que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos, indicada en la SEQ ID NO. 1, que corresponde a las posiciones de los aminoácidos 1 - 713, al menos en un 97%, especialmente a través de la región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 713 según la SEQ ID NO. 2.

9. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos, dada en la SEQ ID NO. 1, que corresponde a la región parcial de los aminoácidos 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2, al menos en un 95%.

10. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 9, que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos, indicada en la SEQ ID NO. 1, que corresponde a la región parcial de los aminoácidos 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2, al menos en un 97%.

11. Proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según una de las reivindicaciones 1 a 10, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos, indicada en la SEQ ID NO. 2 completamente y/o en las posiciones 35 hasta 713 y/o en las posiciones 35 hasta 526 y/o que es idéntica a una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1 completamente y/o en las posiciones 35 hasta 713 y/o en las posiciones 35 hasta 526.

12. Proteína quimérica, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, que puede ser obtenida por medio de mutación por inserción o que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa que está constituida al menos en una parte que proporciona la actividad amilolítica y/o la actividad de CGTasa, por una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Derivado de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 12, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, que puede ser obtenido por medio del procesamiento con intervención del organismo huésped productor, por medio de una transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o por medio del enlace covalente con otro compuesto sobre la proteína.

14. Derivado, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 13, en el que el otro compuesto, enlazado de manera covalente, está constituido por polietilenglicol o por otra proteína.

15. Proteína, o derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizados porque pueden ser obtenidos a partir de una fuente natural, especialmente a partir de un microorganismo.

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16. Proteína, o derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 15, caracterizados porque el microorganismo es una bacteria gram-positiva.

17. Proteína, o derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 16, caracterizados porque la bacteria gram-positiva está constituida por una del género Bacillus.

18. Proteína, o derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según la reivindicación 17, caracterizado porque la especie Bacillus está constituida por un Bacillus alcalófilo, especialmente está constituida por Bacillus agaradherens, de forma muy especialmente preferente está constituido por Bacillus agaradherens (DSM 9948).

19. Ácido nucleico, que codifica una proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos, indicada en la SEQ ID NO. 1, al menos en un 95%, especialmente a través de una región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 713 según la SEQ ID NO. 2, de forma muy especialmente preferente a través de la región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2.

20. Ácido nucleico, que codifica una proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, según la reivindicación 19, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos, indicada en la SEQ ID NO. 1, al menos en un 97%, especialmente a través de la región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 713 según la SEQ ID NO. 2, de forma muy especialmente preferente a través de la región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2.

21. Ácido nucleico, que codifica una proteína, que presenta actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, según las reivindicaciones 19 o 20, que es idéntico a la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, en un 100%, especialmente a través de la región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 713 según la SEQ ID NO. 2, de forma muy especialmente preferente a través de la región parcial que corresponde a los aminoácidos 35 hasta 526 según la SEQ ID NO. 2.

22. Ácido nucleico, que codifica una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18.

23. Microorganismo, que forma de manera natural una de las proteínas o derivados según una de las reivindicaciones 1 a 18 o que contiene un ácido nucleico que codifique una proteína o derivado de este tipo.

24. Microorganismo según la reivindicación 23, caracterizado porque es una bacteria.

25. Microorganismo según la reivindicación 24, caracterizado porque la bacteria está constituida por una bacteria gram-positiva.

26. Microorganismo según la reivindicación 25, caracterizado porque la bacteria gram-positiva está constituida por una del género Bacillus, preferentemente está constituida por un Bacillus alcalífilo.

27. Microorganismo según la reivindicación 26, caracterizado porque la especie Bacillus está constituida por Bacillus agaradherens, especialmente está constituida por Bacillus agaradherens (DSM 9948).

28. Vector, que contiene una región de ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones 19 a 22.

29. Vector según la reivindicación 28, que está constituido por un vector de clonación.

30. Vector según la reivindicación 28, que está constituido por un vector de expresión.

31. Célula huésped aislada, que contiene uno de los ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones 19 a 22, preferentemente sobre un vector según una de las reivindicaciones 28 a 30.

32. Célula según la reivindicación 31, que expresa una de las proteínas o derivados según una de las reivindicaciones 1 a 18 o que puede ser activada para su expresión, especialmente con el empleo de un vector de expresión según la reivindicación 30.

33. Célula según una de las reivindicaciones 31 o 32, caracterizada porque es una bacteria, especialmente una que secrete en el medio circundante la proteína, o el derivado, que se han formado.

34. Célula según la reivindicación 33, caracterizada porque es una bacteria del género Bacillus, especialmente de la especie Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

35. Célula según una de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizada porque es una bacteria gram-negativa.

36. Célula según la reivindicación 35, caracterizada porque pertenece al género Escherichia, preferentemente de las especies Escherichia coli o Klebsiella, de forma especialmente preferente a una de las cepas E. coli JM 109, E. coli DH 100B, E. coli DH 12S o Klebsiella planticola (Rf).

37. Célula según las reivindicaciones 31 o 32, caracterizada porque es una célula eucariota, especialmente una que exprese la proteína, de forma especialmente preferente una que modifique de manera en el plano de la postraducción a la proteína.

38. Procedimiento para la obtención de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18 con empleo de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 19 a 22 y/o con empleo de un organismo según una de las reivindicaciones 23 a 27 y/o con empleo de un vector según una de las reivindicaciones 28 a 30 y/o con empleo de una célula según una de las reivindicaciones 31 a 37.

39. Agente para el lavado o para la limpieza, caracterizado porque contiene una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18.

40. Agente según la reivindicación 39, caracterizado porque contiene desde un 0,0001 por ciento en peso hasta un 5% en peso, especialmente desde un 0,001 hasta un 3% en peso de la proteína o del derivado que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, según una de las reivindicaciones 1 a 18.

41. Agente según las reivindicaciones 39 o 40, caracterizado porque adicionalmente contiene una o varias proteínas amilolíticas diferentes, especialmente \alpha-amilasas.

42. Agente según una de las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque adicionalmente contiene otros enzimas, especialmente una o varias proteasas, lipasas, óxidorreductasas, hemicelulasas y/o celulasas.

43. Agente según una de las reivindicaciones 39 a 42, caracterizado porque contiene ciclodextrinas, especialmente aquellas en las que estén ocluidos compuestos de bajo peso molecular.

44. Agente según una de las reivindicaciones 39 a 43, caracterizado porque está constituido por más de una fase.

45. Agente según una de las reivindicaciones 39 a 44, caracterizado porque es sólido y se presentan al menos dos componentes diferentes, especialmente polvos, granulados o cuerpos extruidos, mezclados entre sí en forma globalmente a granel.

46. Agente según una de las reivindicaciones 39 a 45, caracterizado porque está compactado.

47. Agente según una de las reivindicaciones 44 a 46, caracterizado porque al menos una de las fases contiene un material sensible a las amilasas, especialmente almidones o está rodeada o recubierta al menos en parte por el mismo.

48. Agente según una de las reivindicaciones 39 a 47, caracterizado porque es líquido, en forma de gel o pastoso y la proteína obtenida y/o al menos uno de los enzimas contenidos y/o al menos uno de los otros componentes contenidos se presentan en forma encapsulada individualmente o junto con otros componentes, preferentemente en microcápsulas, de forma especialmente preferente en aquellas que estén constituidas por un material sensible a las amila-
sas.

49. Agente según una de las reivindicaciones 39 a 48, caracterizado porque la actividad amilolítica y/o la actividad de CGTasa se modifica por medio de uno de los otros componentes del agente, especialmente se estabiliza o se acrecienta su contribución al rendimiento para el lavado o bien para la limpieza del agente.

50. Procedimiento para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, caracterizado porque se activa al menos en una de las etapas del procedimiento, una proteína o derivado, que presenten actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa según una de las reivindicaciones 1 a 18.

51. Procedimiento para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, caracterizado porque se emplea al menos en una de las etapas del procedimiento un agente según una de las reivindicaciones 39 a 49.

52. Procedimiento según las reivindicaciones 50 o 51, caracterizado porque la proteína o el derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa se emplean en la etapa correspondiente del procedimiento en una cantidad comprendida entre 0,035 mg y 2.000 mg, preferentemente comprendida entre 0,3 mg y 1.500 mg.

53. Empleo de una proteína o derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, según una de las reivindicaciones 1 a 18, individualmente o conjuntamente con al menos otro producto activo con actividad limpiadora o que favorezca el efecto limpiador, para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras.

54. Empleo de un agente según una de las reivindicaciones 39 a 49 para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras.

55. Empleo según las reivindicaciones 53 o 54, caracterizado porque se utilizan por cada aplicación, preferentemente por cada aplicación en una máquina lavavajillas o en una máquina lavadora, cantidades comprendidas entre 0,035 mg y 2.000 mg, preferentemente comprendidas entre 0,3 mg y 1.500 mg de la proteína o del derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa.

56. Empleo de una proteína o derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, según una de las reivindicaciones 1 a 18, individualmente o junto con al menos otro producto activo con actividad de limpieza o que refuerce el efecto de limpieza en un agente para el lavado o la limpieza constituido por más de una fase, para la activación de la propia fase o de otras fases.

57. Empleo de una proteína o derivado, que presentan actividad amilolítica y/o actividad de CGTasa, según una de las reivindicaciones 1 a 18, individualmente o junto con al menos otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca el efecto de limpieza en un agente para el lavado o la limpieza con componentes encapsulados para la liberación de los componentes a partir de las cápsulas.

58. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18 para el tratamiento de materiales en bruto o de productos semielaborados en la fabricación de artículos textiles, especialmente para el desencolaje del algodón o para la eliminación de capas protectoras de almidón o similares al almidón de productos industriales semielaborados.

59. Procedimiento para la licuación del almidón, especialmente para la producción de etanol, caracterizado porque se emplea en el mismo al menos en una etapa del procedimiento, una proteína o derivado según las reivindicaciones 1 a 18.

60. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18 para la licuación del almidón, especialmente en un procedimiento para la producción de etanol.

61. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18 para la obtención o para la modificación de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta, especialmente de una proteína o derivado de este tipo, cuya actividad de CGTasa haya sido limitada por deleción.

62. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18 para la obtención, la modificación o la hidrólisis de ciclodextrinas.

63. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 18 para la absorción o la liberación de compuestos de bajo peso molecular o de elevado peso molecular en o bien a partir de soportes de polisacáridos, especialmente ciclodextrinas.

64. Empleo según la reivindicación 63 para la estabilización de compuestos químicos durante su fabricación o transformación.

65. Empleo según las reivindicaciones 63 o 64 para la fabricación o como parte integrante de productos cosméticos o farmacéuticos.