ES2294704T3 - Nuevas proteasas y detergentes limpiadores que las contienen. - Google Patents

Abstract

Una proteasa alcalina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 4 al menos en 90% o es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 7 al menos en 87.5%.

Description

Nuevas proteasas y detergentes y limpiadores que las contienen.

La presente invención se refiere a dos nuevas proteasas alcalinas similares una a la otra, cuyo ADN se ha obtenido de muestras de suelo, el terminal C se ha suprimido, también a los fragmentos activos proteolíticamente de las mismas y a todas las proteasas alcalinas y ácidos nucleicos suficientemente similares, y a las posibilidades de uso de estas proteasas, ante todo su uso en detergentes y limpiadores.

Las proteasas pertenecen a las enzimas industrialmente más importantes en general. Entre éstas, a su vez, las de mayor importancia particular son las proteasas de serina (subtilasas, subtilopeptidasas, EC 3.4.21.62) las cuales contienen aminoácidos catalíticamente activos. Estas enzimas son endopeptidasas no específicas, es decir que hidrolizan enlaces de amida ácida que se encuentran en el interior de péptidos o proteínas. Su pH óptimo usualmente se encuentra en el rango claramente alcalino. El artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" (Subtilasas: proteasas del tipo subtilisina) de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes" (Enzimas de subtilisina), editado por R. Bott y C. Betzel, New York, 1996, ofrece por ejemplo un resumen de esta familia. Las subtilasas se forman naturalmente a partir de microorganismos. Entre estas subtilasas, las subtilisinas formadas y secretadas por las especies Bacillus son el grupo de mayor significancia.

Las proteasas, junto a otras enzimas, son ingredientes establecidos de detergentes y limpiadores. En tal caso provocan la degradación de suciedad que contiene proteína sobre el objeto que se limpia. En el caso más favorable los efectos sinérgicos se originan entre las enzimas y los otros componentes presentes en las composiciones involucradas. Entre las proteasas de detergentes y limpiadores las subtilasas se prefieren particularmente debido a sus propiedades enzimáticas favorables, incluyendo la estabilidad y el pH óptimo. Además, también son adecuadas por un número grande de otros usos industriales, como componentes de cosméticos y en la síntesis de químicos orgánicos, por
ejemplo.

El procedimiento clásico para la obtención de nuevas enzimas consiste en retirar muestras que contienen microorganismos de sus hábitats naturales y cultivarlos en condiciones consideradas adecuadas - por ejemplo en medio alcalino. De esta manera se obtienen cultivos enriquecidos de microorganismos que con cierta probabilidad contienen también enzimas, entre las cuales proteasas alcalinas, que son activas en las condiciones concernientes. Los microorganismos que producen las enzimas más eficientes se seleccionan y se purifican, por ejemplo, mediante preparación de cultivos en placas de agar que contienen proteína y medición de los halos de lisis formados, o bien se clonan los genes involucrados. Un procedimiento así se describe por ejemplo en el libro de texto "Alkalophilic Mikroorganisms".

"A new microbial world" (Microorganismos alcalofílicos. Un nuevo mundo microbiano) de K. Horikoshi y T. Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, capítulo 2, páginas 9-26.

De esa manera ya se usan proteasas alcalinas formadas naturalmente, preferiblemente a partir de microbios, en detergentes y limpiadores. Según la solicitud WO 93/07276 A1, por ejemplo, la proteasa 164-A1 que se obtiene a partir de Bacillus spec. 164-A1, de las empresas Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, y Vista Chemical Company, Austin, TX, USA, es adecuada para usar en detergentes y limpiadores. Otros ejemplos son las proteasas alcalinas de Bacillus sp. PD138, NCIMB 40338 de la empresa Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca, (WO 93118140 A1), la proteinasa K-16 que proviene de Bacillus sp. ferm. BP-3376 de la empresa Kao Corp., Tokyo, Japan, (patente USA 5344770) y la proteasa descrita en WO 96/25489 A1 (empresa Procter & Gamble, Cincinatti, OH, USA) del organismo psicrofílico Flavobacterium balustinum.

Las proteasas naturales pueden optimizarse para usarse en detergentes y limpiadores mediante métodos de mutagénesis conocidas en la técnica. Tales métodos incluyen mutagénesis de punto, deleción, inserción o fusión con otras proteínas o partes de proteína o por otras modificaciones habituales. La estrategia de introducir mutaciones de punto específicas a moléculas conocidas, para mejorar por ejemplo el desempeño de lavado de las subtilisinas, se denomina como diseño racional de proteína. Una estrategia similar de mejoramiento de desempeño consiste en modificar las cargas superficiales y/o el punto isoeléctrico de las moléculas y de esa manera sus interacciones con el sustrato. Así puede modificarse por ejemplo la carga neta de la subtilisina mediante mutaciones de punto para influir de esa manera en el enlazamiento de sustrato particularmente para el uso en detergentes y limpiadores. Otra estrategia particularmente complementaria consiste en incrementar la estabilidad de las proteasas para de esta manera aumentar su efectividad. Una estabilización mediante el acoplamiento a un polímero se describe para proteasas usadas en cosméticos, por ejemplo en la patente US 5230891; Una proteasa así va acompañada de una mejorada compatibilidad con la piel. Por el contrario, la estabilización por mutaciones de punto son corrientes para detergentes y
limpiadores.

Una nueva dirección en el desarrollo de enzimas consiste en combinar elementos de proteínas conocidas, relacionadas unas con otras, mediante métodos estadísticos para generar nuevas enzimas con características hasta ahora no logradas. Tales métodos se recogen bajo el concepto general de Directed Evolution (evolución dirigida). Este concepto incluye por ejemplo los siguientes métodos: el método StEP (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., volumen 16, página 258-261), Random priming recombination (recombinación de impregnación aleatoria) (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., volumen 26, páginas 681-683), DNA-Shuffling (recomposición de ADN) (Stemmer, W.P.C. (1994), Nature, volumen 370, página 389-391) o RACHITT (Coco, W.M. et al. (2001), Nat. Biotechnol., volumen 19, página 354-359). Otro método de recomposición (Shuffling) con la denominación "Recombining ligation reaction" (Reacción de ligación recombinante) (RLR) se describe en WO 00/09679 A1.

De aquí en adelante se suministra una sinopsis de las proteasas alcalinas más importantes técnicamente del tipo subtilisina. La subtilisina BPN', que procede de Bacillus amyloliquefaciens, o bien de B. subtilis, se conoce a partir de los trabajos de Vasantha et al. (1984) en J. Bacteriol., Volumen 159, páginas 811-819 y de J. A. Wells et al. (1983) en Nucleic Acids Research, Volumen 11, páginas 7911-7925. La subtilisina BPN' sirve particularmente como enzima de referencia de la subtilisina con respecto a la numeración de las posiciones de amino ácidos.

Por ejemplo, la posición de mutaciones de punto en la subtilisina descrita en la solicitud EP 251446 A1 se indican usando la numeración de BPN' como referencia. La empresa Procter & Gamble Comp., Cincinnati, Ohio, USA, se refiere a este material como "proteasa B". Las variantes de BPN' de la solicitud EP 199404 A1 son referidas por parte de Procter & Gamble Comp. como "Proteasa A". Las "Proteasas C" se distinguen a su vez según la solicitud WO 91/06637 A1 por otras mutaciones de punto de BPN'. La "Proteasa D" se refiere a variantes de la proteasa de Bacillus lentus, según WO 95/10591 A1.

La proteasa subtilisina Carlsberg se describe en las publicaciones de E. L. Smith et al. (1968) en J. Biol. Chem., Volumen 243, páginas 2184-2191, y de Jacobs et al. (1985) en Nucl. Acids Res., volumen 13, páginas 8913-8926. Se forma de manera natural del Bacillus licheniformis y se podía, o bien se puede, obtener bajo el nombre comercial Maxatase® de la empresa Genencor International Inc., Rochester, New York, USA, así como bajo el nombre comercial Alcalase® de la empresa Novozymes A/S, Bagsv\aerd, Dinamarca.

La proteasa PB92 se produce naturalmente por la bacteria alcalífila Bacillus nov. spec. 92 y pudo obtenerse bajo el nombre comercial Maxacal® de la empresa Gist-Brocades, Delft, Holanda. En su secuencia original se describe en la solicitud de patente EP 283075 A2.

La subtilisina 147 y 309 se comercializan bajo los nombres comerciales Esperase®, o bien Savinase® de la empresa Novozymes. Proceden originalmente de cepas de bacilo que se divulgaron en GB 1243784 A.

La subtilisina DY se describió originalmente por Nedkov et al. 1985 en Biol. Chem. Hoppe-Seyler, volumen 366, páginas 421-430.

Las proteasas alcalinas de B. Lentus se refieren a una proteasa alcalina de las especies bacilos que se describen en la solicitud WO 91/02792 A1. Esta posee ya de por sí una estabilidad comparativamente alta frente a la oxidación y a la acción de detergentes. En la solicitud WO 91/02792 A1, o bien en las patentes EP 493398 B1 y US 5352604, se describe su expresión heteróloga en el huésped B. licheniformis ATCC 53926. En las reivindicaciones de la patente de Estados Unidos mencionada se refieren a las posiciones 208, 210, 212, 213 y 268 como características para la proteasa alcalina de B. lentus; estas corresponden, en la numeración de la proteína madura, a las posiciones 97, 99, 101, 102 y 157, en las cuales esta enzima se distingue de la subtilisina madura 309 (savinasa®). La estructura tridimensional de esta enzima se describe en la publicación de Goddette et al. (1992) en J. Mol. Biol., volumen 228, páginas 580-595: "The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4 \ring{A} resolution" (La estructura cristalina de proteasa alcalina de Bacillus lentus, subtilisina BL, a una resolución de 1,4 \ring{A}). Variantes industrialmente importantes de esta enzima que se estabilizan mediante mutagénesis de punto y que son adecuadas en particular para el uso en productos de lavado y limpieza se divulgan, entre otras, en las solicitudes WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2) y WO 03/038082 A2.

La enzima termitasa formada naturalmente por Thermoactinomyces vulgaris se describió originalmente por Meloun et al. (FEBS Lett., 1983, páginas 195-200). Esta es una molécula que exhibe, como un todo, discrepancias sustanciales de secuencia comparadas con otras subtilisinas. La homología entre la termitasa madura y las proteínas de proteasa alcalina de B. lentus DSM 5483 (ver abajo) no es muy alta (45% de identidad y 62% de aminoácidos similares).

La proteinasa K también es una proteasa que muestra homología comparativamente baja con la proteasa alcalina de B. lentus: solo 33% de identidad al nivel de la proteína madura (46% de aminoácidos similares). La proteinasa K proviene originalmente del microorganismo Tritirachium album Limber y se describió por K.-D. Jany y B. Mayer 1985 en Biol. Chem. Hoppe-Seyler, volumen 366, páginas 485-492.

WO 88/07581 A1 divulga proteasas TW3 y TW7, que son muy similares una a otra, que se usan entre otras cosas para productos de aseo.

La bacilopeptidasa F de Bacillus subtilis posee solo una similitud de 30% de identidad a nivel de aminoácidos con la proteasa alcalina de B. lentus. Esta enzima se discute en el trabajo arriba mencionado de Siezen et al. Pero hasta ahora no se ha descrito o reivindicado para usar en productos de lavado y limpieza.

De la solicitud WO 01/68821 A2 se infieren nuevas subtilisinas con un buen desempeño frente a la suciedad de huevo.

Otras proteasas alcalinas que se forman por microorganismos, que pueden aislarse de hábitats naturales se describen por ejemplo en las solicitudes WO 03/054185 A1 (de Bacillus gibsonii (DSM 14391)), WO 03/056017 A2 (de Bacillus sp. (DSM 14390)), WO 03/055974 A2 (de Bacillus sp. (DSM 14392)) y WO 03/054184 A1 (de Bacillus gibsonii (DSM 14393)). Todas estas solicitudes divulgan también los agentes detergentes y limpiadores correspondientes que contienen estas nuevas proteasas alcalinas.

Otro grupo de proteasas técnicamente importantes son las metaloproteasas, es decir aquellas que requieren un catión metálico como cofactor. Representantes de estos pueden asignarse también a la familia de las subtilasas. Por ejemplo, las metaloproteasas de microorganismos gram-positivos tales como B. subtilis, aunque también de S. cerevisiae, S. pombe, E. coli y H. influenzae, se describen en la solicitud US 2003/0113895 A1. Las solicitudes WO 00/60042 A1 y WO 02/36727 A1 divulgan, por ejemplo, detergentes y limpiadores con metaloproteasas. La solicitud DE 10360805.2 publicada previamente divulga una metaloproteasa alcalina cuyo ADN correspondiente pudo aislarse de una muestra de suelo, así como su uso en agentes detergentes y limpiadores.

Una gran cantidad de nuevas proteasas para prácticamente todos los campos de aplicación se infieren de la solicitud WO 2004/033668 A2. Otra proteasa conocida es StmPr2 de Stenotrophomonas maltophilia, que está depositada bajo el código de entrada AY253983 en el GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) y que ha sido publicada.

Otras proteasas conocidas son las enzimas que pueden obtenerse bajo los nombres comerciales Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase® y Kannase® de la empresa Novozymes, bajo los nombres comerciales Maxapem®, Purafect®, Purafect OxP® y Properase® de la empresa Genencor, bajo el nombre comercial Protosol® de la empresa Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India y bajo el nombre comercial Wuxi® de la empresa Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China.

Como documentan todos estos trabajos, realizados durante un largo segmento de tiempo, existe una gran necesidad de proteasas capaces de aplicarse técnicamente que se distingan en parte drásticamente y en parte solo en algunas posiciones de las proteasas conocidas hasta ahora. Deben cubrir un amplio espectro de diferencias de desempeño, lo cual ante todo es adecuado para su uso en detergentes y limpiadores que por su parte representan un campo amplio de aplicación. Una proteasa adecuada para detergentes o limpiadores se distingue preferiblemente por cierta insensibilidad frente a las condiciones correspondientes - la presencia de surfactantes que desnaturalizan de por sí, de blanqueadores, altas temperaturas, etc. - y por buenos desempeños frente a los sustratos correspondientes como por ejemplo las proteínas que se encuentran en los residuos de alimentos.

También existe una continua necesidad, ahora como antes, de nuevas proteasas alcalinas que son ya de por sí útiles y pueden optimizarse específicamente más mediante diversas posibilidades de mutagénesis. Particularmente, debido a las más recientemente establecidas tecnologías de shuffling (barajado), estas nuevas proteasas de este tipo son de interés. Puesto que las secuencias de nucleótidos hasta ahora desconocidas amplían - también si la enzima involucrada tiene desempeño comparativamente modesto - el espacio de varianza para nuevas fórmulas de barajado, por ejemplo con secuencias conocidas, y de esa manera a su vez para enzimas artificiales totalmente nuevas.

La tarea de la presente solicitud consistió en detectar nuevas proteasas alcalinas. Particularmente debían encontrarse tales que efectuaban ya de manera natural un mejoramiento del desempeño a los detergentes o limpiadores.

Una tarea parcial fue establecer un método adecuado para el aislamiento de una proteasa de este tipo. Otras tareas parciales consistieron en suministrar ácidos nucleicos que codificaran para proteasas de este tipo para obtener de esa manera elementos de tecnología genética y microbiológicos que pudieran usarse para la obtención y desarrollo ulterior de proteasas de este tipo y opcionalmente pudieran producirse mediante barajado. Además, debían suministrarse los agentes correspondientes, particularmente detergentes y limpiadores, así como los métodos de lavado y limpieza y los métodos correspondientes y las posibilidades de uso de las proteasas de este tipo. Finalmente, debían definírselas posibilidades técnicas de empleo de las proteasas encontradas.

Para resolver esta tarea se aprovechó un camino hasta ahora no recorrido. No se aplicó un cultivo clásico de enriquecimiento para microorganismos alcalífilos, proteasapositivos sino que, sin este desvío, de las muestras de suelo se aislaron ácidos nucleicos que codifican eventualmente para proteasas. Debido a que los ácidos nucleicos involucrados no pueden asignarse a una cepa específica de bacterias, es decir a un genoma especial, tales ácidos nucleicos se denominan ADN-metagenoma.

De manera sorprendente se identificaron dos proteasas novedosas según este método las cuales tienen una similitud extraordinaria una a la otra y son susceptibles de emplearse exitosamente en detergentes y limpiadores como enzimas completamente maduras o como mutantes de deleción de terminal C.

La tarea puesta se soluciona mediante una proteasa alcalina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 4 al menos en un 90% o a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 7 al menos en un 87,5%.

Así las cosas, otros objetos de la invención son los ácidos nucleicos correspondientes, las células naturales correspondientes, los métodos adecuados para su identificación, particularmente métodos de biología molecular que se sustentan en los ácidos nucleicos y elementos procedimentales como también productos, detergentes y limpiadores, métodos de lavado y limpieza y posibilidades de uso distinguidas por las proteasas involucradas.

Tal como lo confirman los ejemplos de realización las enzimas indicadas en SEQ ID NO. 4 y 7, o bien las enzimas maduras correspondientes, muestran ya actividades proteolíticas útiles para detergentes y limpiadores. Debido al suministro de ADN son posibles las optimizaciones adicionales de estas enzimas, por ejemplo mediante más mutaciones de punto. Además, estos ADN pueden someterse a procedimientos de barajado y usarse de esta manera para la generación de proteasas completamente novedosas.

Por una proteína se entiende en el sentido de la presente solicitud un polímero compuesto de los aminoácidos naturales, estructurado linealmente en gran medida, que para ejercer su función adopta casi siempre una estructura tridimensional. En la presente solicitud se denominan 19 L-aminoácidos proteinogénicos de procedencia natural con los códigos habituales a nivel internacional de 1 y 3 letras. La combinación de una de estas denominaciones con un número designa la proteína correspondiente cuyo residuo de aminoácido la lleva en la posición respectiva. Para mutaciones de punto se establecen denominaciones análogas. Si no se declara otra cosa, las indicaciones de posición se refieren a las formas maduras de las proteínas, por ejemplo a proteínas que carecen de péptidos de señalización (ver abajo).

En el sentido de la presente solicitud se entiende por una enzima a una proteína que ejerza una determinada función bioquímica. Por ejemplo, por enzimas proteolíticas o enzimas con función proteolítica se entienden en general aquellas que hidrolizan los enlaces de amida ácida de las proteínas.

Numerosas proteínas se forman como las, así llamadas, preproteínas; es decir, que se forman con un péptido de señal, el cual se debe entender como la parte terminal-N de la proteína cuya función casi siempre consiste en garantizar la expulsión de la proteína formada de la célula productora al periplasma o al medio circundante y/o su envolvimiento correcto. A continuación, el péptido de señal se separa de la proteína restante en condiciones naturales mediante una peptidasa de señal, de modo que la proteína ejerza su propia actividad catalítica sin los aminoácidos terminales-N presentes inicialmente.

Para aplicaciones técnicas, debido a su actividad enzimática, se prefieren los péptidos maduros, o sea las enzimas procesadas después de su preparación, frente a las preproteínas.

Las pro-proteínas son pre-etapas inactivas de proteínas. Sus precursores con secuencia de señal se denominan pre-pro-proteínas.

Por ácidos nucleicos en el sentido de la presente solicitud deben entenderse las moléculas conformadas de manera natural de nucleótidos, las cuales sirven como vehículos de información, que codifican para secuencias lineales de aminoácidos en proteínas o enzimas. Pueden existir como moléculas de una sola cuerda o de cuerda doble. Para trabajos de biología molecular se prefiere el ácido nucleico ADN como vehículo de información más duradero de manera natural. Por otro lado, se forma un ARN para la realización de la invención en ambiente natural, como por ejemplo en una célula que expresa, por lo cual las moléculas - ARN esenciales para la invención representan así mismo formas de realización de la presente invención. A partir de las mismas pueden derivarse a su vez moléculas - (c-)ADN a través de trascripción reversa.

La unidad de información de un ácido nucleico correspondiente a una proteína se denomina también como gen en el sentido de la presente solicitud. En el ADN, las secuencias de ambas cuerdas complementarias deben tomarse en consideración en todos los tres marcos de lectura posibles. Además, debe tomarse en consideración que las diferentes tripletas codones pueden codificar para los mismos aminoácidos de tal manera que ciertas secuencias de aminoácidos puedan derivarse de manera posible de varias secuencias nucleótidas diversas, algunas de las cuales presentan sólo baja identidad. (Degeneración del código genético). Además, los diversos organismos presentan diferencias en el uso de estos codones. Por estas razones tanto las secuencias de aminoácidos como también las secuencias de nucleótidos deben tomarse en la consideración del rango de protección y las secuencias de nucleótidos indicadas deben considerarse respectivamente sólo como una codificación a manera de ejemplo para una determinada secuencia de aminoácido.

En la actualidad es posible mediante métodos conocidos en general para una persona técnica en la materia tales como, por ejemplo, la síntesis química o la reacción en cadena - polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) en combinación con métodos estándar de biología molecular y/o de química de proteínas, producir genes completos mediante secuencias de ADN y/o aminoácidos. Métodos de este tipo se describen, por ejemplo en "Lexikon der Biochemie" (Léxico de la bioquímica), Spektrum Akademischer Verlag (editorial), Berlin, 1999, volumen 1, páginas 267-271 y volumen 2, páginas 227-229. Esto es particularmente posible en el caso si puede recurrirse a una cepa depositada en un conjunto de cepas. Por ejemplo con iniciadores (primers) de PCR que pueden sintetizarse por medio de una secuencia conocida y/o mediante una molécula - mARN a partir de esas cepas los genes involucrados se sintetizan, clonan o se procesan aún más, si se desea, por ejemplo se mutagenizan.

Modificaciones a la secuencia nucleótida, como pueden ocasionarse mediante métodos de biología molecular de por sí conocidos, se denominan mutaciones. Según el tipo de la mutación se conocen por ejemplo mutaciones de deleción, inserción o sustitución o aquellas en las que diversos genes o partes de genes se fusionan unos con otros (shuffling o barajado); estas son mutaciones de genes. Los organismos correspondientes se denominan mutantes. Las proteínas derivadas de ácidos nucleicos mutados se denominan variantes. Así, las mutaciones de deleción, de inserción o de substitución o las fusiones conducen a las variantes respectivas mutadas de deleción, inserción, o genes de fusión y a nivel de proteínas a las respectivas variantes de deleción, inserción o sustitución, o bien a proteínas de fusión.

Para la descripción de mutaciones de punto que involucran exactamente una posición de aminoácido (intercambio de aminoácido), se aplica la siguiente convención: inicialmente, los aminoácidos presentes naturalmente se designan en forma del código internacional habitual de una letra, luego sigue la posición de secuencia correspondiente y, finalmente, los aminoácidos insertados. Varios intercambios dentro de la misma cadena de polipéptidos se separan unos de otros por medio de barras oblicuas.

En el sentido de la presente invención se entiende por vectores los elementos que se componen de ácidos nucleicos que contienen un gen de interés en calidad de rango distintivo de ácidos nucleicos. Éstos pueden establecer esto en una especie o una línea celular por varias generaciones o divisiones celulares como elemento genético genéticamente estable que se replica independientemente del genoma. Los vectores son plásmidos especiales, en particular al usar en bacterias; es decir, elementos genéticos circulares. En la tecnología de genes se distingue por un lado entre tales vectores que sirven para el almacenamiento, y así de cierta manera para el trabajo de tecnología de genes, a los así llamados vectores de clonación; y por otro lado aquellos que cumplen la función de producir los genes de interés en las células hospedantes; es decir, los que hacen posible la expresión de la proteína involucrada. Estos vectores se denominan vectores de expresión.

Tanto células bacteriales como también eucarióticas que contienen los vectores mencionados, se denominan generalmente como células independientemente de sus diferencias. Tales células que contienen un vector, particularmente un vector de expresión y que de esa manera pueden excitarse para la expresión de un transgen, se denominan como células hospedantes puesto que albergan el sistema genético de interés.

La homologación es la comparación de una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos con la de genes o proteínas conocidas. Ésta se efectúa por ejemplo mediante una alineación (alignment). La medida para la homología es un porcentaje de identidad tal como puede determinarse según el método indicado por D. J. Lipman y W. R. Pearson en Science, volumen 227 (1985), páginas 1435-1441. Preferiblemente, esto ocurre por algoritmos que se usan en programas de ordenador comercialmente disponibles. Esto incluye por ejemplo el programa Vector NTI® Suite 7.0, disponible de la empresa InforMax, Inc., Bethesda, USA, preferiblemente con los parámetros dados de antemano por default. Los datos de homología pueden referirse a la proteína total o al intervalo por asignarse respectivamente. Otro concepto de homología usado más ampliamente se refiere a las variaciones conservadas; es decir, a aminoácidos que tienen estructuras químicas similares que usualmente ejercen actividades químicas similares dentro de la proteína. Con ácidos nucleicos solo se conoce el porcentaje de identidad.

Mediante homologación las funciones de rangos de secuencias individuales y la actividad enzimática de la enzima entera pueden determinarse de la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos. Los rangos homólogos de las diferentes proteínas son aquellos que tienen funciones comparables que pueden reconocerse por identidad o intercambios conservados en la secuencia primaria de aminoácidos. Comprenden aminoácidos individuales, regiones muy pequeñas, "cajas" que son unos cuantos aminoácidos en longitud, hasta regiones largas en la secuencia primaria de aminoácidos. Por funciones de las regiones homólogas deben entenderse entonces a subfunciones muy pequeñas de la función ejercida por la proteína entera tal como, por ejemplo, la formación de enlaces de hidrógeno para la complejación de un sustrato o de un complejo de transición. Otras regiones de la proteína que no están involucradas en la reacción enzimática real pueden modificarlas de manera cualitativa o cuantitativa. Esto se refiere, por ejemplo, a la estabilidad de la enzima, la actividad, las condiciones de reacción o a la especificidad del sustrato.

Por el término enzima proteolítica o proteasa se entiende por lo tanto, más allá de las funciones de los pocos residuos de aminoácidos del centro catalíticamente activo, todas las funciones producidas por la acción de la otra proteína entera o de una parte o de un número de partes de la otra proteína en las regiones activas propiamente de manera catalítica. Es posible además que todas las actividades de otras proteasas se modifiquen cualitativa y cuantitativamente por una o más partes, por ejemplo de la proteína según la invención. Esta influencia de otros factores es considerada así mismo como una actividad proteolítica. Las enzimas activas proteolíticamente son también aquellas proteasas cuya actividad en un punto dado del tiempo se bloquea por parte de un inhibidor, por ejemplo. Para la correspondiente reacción de proteólisis es decisivo que en principio sea adecuado.

Por fragmentos se entienden todas las proteínas o péptidos que son más pequeños que las proteínas naturales o aquellas que corresponden a genes completamente trasladados, y, por ejemplo, pueden obtenerse también sintéticamente. A cuenta de sus secuencias de aminoácidos pueden asignarse a las proteínas completas involucradas. Pueden, por ejemplo, adoptar estructuras idénticas o ejercer actividades proteolíticas o subactividades. Los fragmentos y variantes de deleción de proteínas de partida son similares en principio; mientras los fragmentos son más bien pedazos más pequeños, los mutantes de deleción carecen más bien sólo de regiones cortas y de esta manera solo subfunciones individuales.

Por quimeras o proteínas híbridas se entienden en el sentido de la presente solicitud aquellas proteínas que están compuestas de elementos que se originan naturalmente de cadenas polipeptídicas diferentes del mismo organismo o de diferentes organismos. Este procedimiento se llama también shuffling (barajado) o mutagénesis de fusión. La idea de esta fusión consiste, por ejemplo, en producir o modificar una función enzimática con la ayuda de la parte de proteína fusionada según la invención.

Por proteínas obtenidas por mutación de inserción se entienden tales variantes que han sido obtenidas por medio de métodos conocidos de por sí mediante inserción de un fragmento de ácido nucleico o de fragmento de proteína a las secuencias de partida. Deben asimilarse a proteínas quiméricas debido a su similitud en principio. Se distinguen de éstas solo en la proporción de tamaño entre la parte de proteína inmodificada y el tamaño de la proteína entera. En tales proteínas de inserción - mutadas, la proporción de la proteína foránea es más baja que en las proteínas quiméricas.

La mutagénesis de inversión, es decir una reversión de secuencia parcial, puede considerarse como una forma especial tanto de deleción como también de inserción. Esto mismo aplica para un nuevo agrupamiento de diferentes partes moleculares que difieren de la secuencia original de aminoácidos. Puede considerarse tanto como una variante de deleción como una variante de inserción, y como una variante de barajado de la proteína original.

En el sentido de la presente solicitud, se entienden por derivados aquellas proteínas cuya cadena pura de aminoácidos se ha modificado químicamente. Tales derivaciones pueden efectuarse, por ejemplo, biológicamente en conexión con la biosíntesis de proteína por parte del organismo hospedante. Para esto, por ejemplo, pueden emplearse métodos de biología molecular como, por ejemplo, co-transformación con genes que proporcionan la modificación de interés. Las derivaciones, sin embargo, pueden realizarse también químicamente, por ejemplo mediante conversión química de una cadena lateral de aminoácido o mediante enlace covalente de otro compuesto a la proteína. Un compuesto así puede ser, por ejemplo otras proteínas que, por ejemplo, están enlazadas a proteínas según la invención por medio de enlaces químicos bifuncionales. Tales modificaciones, por ejemplo, influencian la especificidad de sustrato o la fuerza de enlace al sustrato o provocan un bloqueo temporal de la actividad enzimática, si la sustancia acoplada es un inhibidor. Esto es útil, por ejemplo, para el período de tiempo de almacenamiento. Así mismo, la derivación debe entenderse como un enlace covalente al vehículo macromolecular.

En el sentido de la presente invención se resumen bajo el término proteína a todas las enzimas, proteínas, fragmentos, proteínas de fusión y derivados, siempre que no se aborden para usarse explícitamente como tales.

En el sentido de la presente invención por desempeño de una enzima se entiende su efectividad en el campo industrial correspondientemente considerado, preferiblemente en el contexto de una composición alineada de manera correspondiente. Esto se basa en la actividad enzimática real, pero depende además de otros más factores relevantes para el proceso particular. Estos incluyen, por ejemplo, estabilidad, sustrato, enlace, interacción con el material que sirve de vehículo para el sustrato o interacciones con otros componentes, en particular sinergias.

Por desempeño de lavado o desempeño de limpieza de un detergente o de un limpiador se entiende, en el sentido de la presente solicitud, el efecto que la composición considerada ejerce sobre el artículo ensuciado, por ejemplo textiles o artículos con superficies sólidas. Los componentes individuales de tales composiciones, por ejemplo enzimas individuales, se evalúan con respecto a su contribución al desempeño de lavado o limpieza del detergente entero o el limpiador entero. A partir de las propiedades enzimáticas de una enzima no puede hacerse una conclusión sin problemas sobre su contribución al desempeño de lavado de una composición. Aquí en la remoción de mugre juegan un papel, como otros factores más, la estabilidad, el enlace del sustrato, el enlace a los artículos por limpiarse o las interacciones con otros componentes del detergente o del limpiador, en sinergias particulares, por ejemplo.

Las secuencias de aminoácido indicadas en SEQ ID NO. 4 y 7 han sido derivadas, tal como se describe en los ejemplos de la presente solicitud, a partir de ácidos nucleicos que se han aislado de muestras de suelos. Sus secuencias se indican bajo SEQ ID NO. 3 o bien 6. Las proteínas derivadas se designan según la invención como proteasa HP70 (para SEQ ID NO. 3 y 4) o bien HP53 (para SEQ ID NO. 6 y 7). Tal como puede comprenderse con la ayuda de alineación, por ejemplo por medio de la figura 4, tienen una homología de una a otra a nivel de aminoácido de 93,9% de identidad.

Una proteasa de serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) a partir de Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913), que tiene número de acceso NP636242 del GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) se determinó como la enzima descrita más similar a las dos proteasas encontradas y caracterizadas según los ejemplos de la presente solicitud. La homología de esta enzima determinada con los parámetros por defecto, como todos los valores siguientes de homología mediante el programa de ordenador Vector NTI® Suite 7.0, disponible de la empresa Informax, Inc., Bethesda, USA, es de HP70 75,0% de identidad a nivel de aminoácido y de HP53 75,4% de identidad.

Otras enzimas similares determinadas se resumen en los ejemplos 4 y 5 en forma de tablas; cada una de ellas es proteasa extracelular a partir de Xanthomonas campestris y X axonopodis. Se obtiene como resultado una homología de 26,2% de identidad y a nivel de nucleótidos de 33,6% en la proteasa alcalina establecida B. lentus (WO 92/21760 A1) por sobre toda la longitud de la proteasa alcalina HP70 a nivel de aminoácido. HP53 tiene valores de homología de 25,9% y de 33,5% de identidad con la proteasa alcalina B. lentus.

Estos datos compilados según los ejemplos pueden actualizarse de la manera siguiente: la proteasa StmPr2 de St. maltophilia, (GenBank: AY253983) tiene una homología de secuencia de 84,7% con la proteasa HP70 según la invención (SEQ ID NO. 4) y de 82,5% de identidad con HP53 (SEQ ID NO. 7). La proteasa revelada bajo la SEQ ID NO. 66 en WO 2004/033668 A2 es de 83,1% idéntica con HP70 y de 81,1% idéntica a HP53. En comparación con la proteasa divulgada bajo SEQ ID NO. 70 en WO 2004/033668 A2, resultan valores de homología de 85,0% de identidad con HP70 y de 82,3% de identidad con HP53.

Las proteasas alcalinas que pueden incluirse dentro del alcance de protección de la presente solicitud son las que tienen secuencias de aminoácidos que se codifican por la SEQ ID NO. 4 o por secuencias que sean al menos 90% idénticas a la misma, o por SEQ ID NO. 7 o secuencias que son al menos 87,5% idénticas a la misma.

Entre estas se prefieren proteasas alcalinas funcionales; es decir, no proteasas defectuosas o simplemente putativas sino aquellas que efectivamente debido a esta actividad enzimática pueden aprovecharse para una aplicación técnica.

De manera creciente se prefieren todas aquellas proteasas de este tipo cuyas secuencias de aminoácidos son idénticas a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 4 en al menos 95% y de manera creciente se prefiere en al menos 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100% o idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 7 en al menos 90% y de manera creciente se prefiere en al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente en 100% de identidad a la misma, incluyendo de manera correspondiente todos los valores intermedios de números enteros o fraccionarios.

Los vectores asociados descritos en los ejemplos, que codifican para las proteínas que se derivan del vector mostrado en la Figura 3, obtuvieron las denominaciones 70-pUC(AWB403) para HP70 y 53-pUC(AWB403) para HP53. Se depositaron bajo este nombre el día 2.10.2003 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) y llevan los números de depósito DSM 15977 o bien DSM 15976. La vitalidad correspondiente de la DSMZ se confirmó el día 17.10.2003. Las proteasas codificadas por estos vectores, investigadas en los ejemplos de la presente solicitud y por eso las más preferidas se denominan como HP70 o bien HP53, respectivamente.

Otras proteasas alcalinas preferidas según la invención son aquellas en las que los valores de homología son válidos respectivamente para el rango que corresponde a las posiciones de aminoácidos 33 hasta 581 según SEQ ID NO. 4 o 39 hasta 586 según SEQ ID NO. 7.

Con esto se refiere a la proteína realmente madura porque ésta ejerce la función técnicamente relevante. En la actualidad no se puede afirmar aún sin dudas cuál aminoácido en cada caso representa el terminal - N de la proteína madura. Hoy día el principio en las posiciones 33 ó 39 sólo aparece como lo más probable. Si resultara luego que otros aminoácidos representan el terminal - N respectivo, el campo reivindicado de protección se basará en el lugar donde la posición mencionada en cada caso designe el primer aminoácido de la proteína madura.

Una comparación de secuencia de estas enzimas maduras llevada a cabo en el ejemplo 4 con las más cercanamente similares del estado de la técnica ha rendido el siguiente resultado: la proteasa (presuntamente) madura HP70 (SEQ ID NO. 4, posiciones 33 hasta 581) es idéntica a la región homóloga de la SEQ ID NO. 66 de WO 2004/033668 A2 en 84,2%, al de la SEQ ID NO. 70 de WO 2004/033668 A2 en 86,2% y al de la proteasa STmPr2 en 85,8%. La proteasa (presuntamente) madura HP53 (SEQ ID NO. 7, posiciones 39 hasta 586) es idéntica a la región homóloga de la SEQ ID NO. 66 de WO 2004/033668 A2 en 83,8%, al de la SEQ ID NO. 70 de WO 2004/033668 A2 en 85,0% y al de la proteasas STmPr2 en 85,2%.

Algo similar es válido para el terminal - C. En la actualidad las posiciones 581 y 586 parecen plausibles para serlo según SEQ ID NO. 4 o bien 7 porque las posiciones de nucleótidos 1744 hasta 1746 según SEQ ID NO. 3 y las posiciones 1759 hasta 1761 según SEQ ID NO. 6 representan respectivamente un stop-codón (codón de parada). Si después resultare que por el procesamiento, no obstante, otro aminoácido fuera el terminal C de la proteína madura, activa, el alcance reivindicado de protección se relacionará con el sitio donde los números indicados en cada caso designan el último aminoácido de la proteína activa, madura. En principio esto mismo aplica para el caso de la maduración de la proteína se extirpan eventualmente los fragmentos internos. La secuencia de aminoácidos de la proteína madura activa es particularmente preferida en cada caso.

Además, se prefiere cualquiera de las proteasas alcalinas descritas hasta ahora en las que los valores de homología de al menos 90% de identidad aplican respectivamente para la región que corresponde a las posiciones de aminoácidos 33 hasta 470 según SEQ ID NO. 5 o 33 hasta 470 según SEQ ID NO. 8.

Tal como se describe en los ejemplos, las regiones de C- terminal mencionadas aquí y excluidas así del alcance preferido de protección podían suprimirse (deleted) tanto de HP70 como también de HP53 sin que las variantes de pierdan su actividad de proteasa, en particular la actividad proteolítica necesaria durante el proceso de lavado o limpiado. La ventaja en esta deleción drástica consiste en el ahorro de costos y recursos en la preparación biotecnológica de la proteína de interés. Así, en un tiempo más corto se obtienen más enzimas susceptibles de usar según la invención, particularmente para uso en detergentes y limpiadores, lo cual va acompañado también, por ejemplo, de un a mejor utilización de los componentes del medio necesarios para la fermentación de los microorganismos producidos.

Una comparación de secuencia de estas enzimas maduras y C-terminalmente suprimidas (deleted) con las más cercanamente similares del estado de la técnica llevada a cabo como en el ejemplo 4 ha arrojado el siguiente resultado: la proteasa (presuntamente) madura y C-terminalmente suprimida (deleted) HP70 (SEQ ID NO. 5, posiciones 33 hasta 470) es idéntica a la región homóloga de SEQ ID NO. 66 de WO 2004/033668 A2 en 85,2%, a la de SEQ ID NO. 70 de WO 2004/033668 A2 en 88, 1% y a la de la proteasa STmPr2 en 87,7%. La proteasa (presuntamente) madura y suprimida C-terminalmente HP53 (SEQ ID NO. 8,posiciones 33 hasta 470) es idéntica a la región homóloga de SEQ ID NO. 66 de WO 2004/033668 A2 en 85,4%, a la de SEQ ID NO. 70 de WO 2004/033668 A2 en 87,0% y a la de la proteasa STmPr2 así mismo en 87,0%.

Cualquiera de las proteasas alcalinas descritas hasta ahora que tiene una secuencia de aminoácido tal como en la secuencia de consenso de SEQ ID NO. 9, preferiblemente en la región de las posiciones de aminoácidos 39 hasta 587, particularmente preferible en la región de las posiciones de aminoácidos 39 hasta 476.

SEQ ID NO. 9 representa la secuencia de consenso que puede obtenerse de las dos secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 4 y 7, tal como puede establecerse, por ejemplo, mediante la alineación de la figura 4. Esta comprende aquellas proteasas cuyas secuencias de aminoácidos en cada una de sus posiciones puede rastrearse atrás ya sea a la SEQ ID NO. 4 o a la SEQ ID NO. 7. Estas dos secuencias suministran así información de secuencia para proteasas de subtilisina relacionadas con o similares una a la otra. Tienen la secuencia general indicada en SEQ ID NO. 9 donde en las siguientes 35 posiciones pueden estar presentes dos aminoácidos diferentes en cada caso o un aminoácido determinado (indicado en el código de tres letras) o ningún aminoácido (-); se definen las siguientes posibilidades, a saber (en el protocolo de secuencia definido respectivamente como "variantes"): posición 2: - o lle, posición 3: Ser o Thr, posición 4: His o Asn, posición 5: Asp o Ser, posición 7: - o Ser, posición 8: - o Val, posición 9: - o Pro, posición 10: - o Gly, posición 11: - o Asp, posición 12: Gln o Pro, posición 13: Pro o Gln, posición 25: Ala o Gly, posición 48: Ser o Ala, posición 65: Asn o Thr, posición 66: Leu o Asp, posición 82: Ser o Gin, posición 149: Ala o Ser, posición 234: Ser o Ala, posición 236: Ile o Tyr, posición 259: Ser o Thr, posición 267: Phe o Tyr, posición 321: Thr o Ser, posición 386: Ile o Val, posición 406: Thr o Ala, posición 438: Thr o Ser, posición 487: Thr o -, posición 488: Val o Thr, posición 501: Ala o Ser, posición 507: Ser o Ala, posición 511: Val o Ala, posición 522: Ser o Thr, posición 527: Ser o Thr, posición 546: Asn o Thr, posición 562: Ser o Ala y, finalmente, posición 574: Gly o Ala.

Puesto que ambas enzimas HP70 y HP53 en las investigaciones documentadas por los presentes ejemplos tienen ventajas según la invención y además están de acuerdo en un 93,9% es de esperar que cada enzima más que pertenece a esta subfamilia de proteasa tenga propiedades comparativamente favorables.

Esto aplica de manera correspondiente a lo que se ha dicho arriba, en particular para las partes de la proteína respectivamente madura, es decir activa, y muy particularmente para aquellas variantes de deleción en las que se retiran grandes partes del terminal C sin pérdida notable de la actividad de proteasa.

Se prefiere además cada una de las proteasas alcalinas descritas hasta ahora que se codifique por una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 3 al menos en 85% y de manera creciente se prefiere en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100%, particularmente para la región que corresponde a las posiciones de nucleótidos 97 hasta 1746 según SEQ ID NO. 3, muy particularmente para la región que corresponde a las posiciones de nucleótidos 97 hasta 1410 según SEQ ID NO. 3, o que se codifica por una secuencia de nucleótido que es idéntica a la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO. 6 al menos en 85% y de manera creciente preferible en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100%, particularmente para la región que corresponde a las posiciones de nucleótidos 115 hasta 1761 según SEQ ID NO. 6, muy particularmente para la región que corresponde a las posiciones de nucleótidos 115 hasta 1428 según SEQ ID NO. 6, incluyéndose correspondientemente en cada caso todos los valores intermedios enteros o fraccionarios.

Tal como se infiere de lo ya dicho y particularmente de los ejemplos, las proteasas particularmente preferidas no se detectan de por sí ni a través de un microorganismo correspondiente sino se codifican por los ácidos nucleicos descubiertos en relación con la presente invención.

Tal como se explica en los ejemplos 3 y 4, la enzima similar más cercana a HP70 y HP53 a nivel de nucleótidos, una proteasa de serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) de Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913; NP636242), tal como puede determinarse por medio del programa de ordenador Vector NTI® Suite 7.0, disponible de la empresa InforMax, Inc., Bethesda, USA, con los parámetros pre-especificados por defecto, tiene una homología de 74,4 o bien de 75,0% de identidad a nivel de nucleótidos. Por consiguiente, todas las proteasas alcalinas y proteínas que se codifican por ácidos nucleicos significativamente más similares se incluyen en el alcance de protección.

Estos datos procesados según los ejemplos pueden actualizarse de la siguiente manera: la proteasa StmPr2 de St. maltophilia, (GenBank: AY253983) tiene una homología de secuencia de 80,8 a nivel de ADN con la proteasa HP70 de la invención (SEQ ID NO. 3) en la región homologable y con la secuencia de ADN de HP53 (SEQ ID NO. 6) de 81,2% de identidad. La secuencia de ADN de proteasa divulgada en la SEQ ID NO. 65 en WO 2004/033668 A2 es idéntica a la de HP70 en 79,6% y a la de HP53 en 79,9%. En comparación con la secuencia de ADN que codifica proteasa divulgada bajo SEQ ID NO. 69 en WO 2004/033668 A2, resultaron valores de homología de 81,3% de identidad con el ADN de HP70 y de 81,1% de identidad con el ADN de HP53.

Las realizaciones de hasta ahora aplican de manera correspondiente particularmente para las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas maduras y muy particularmente para las variantes de las mismas proteolíticamente activas, suprimidas (deleted) C-terminalmente. Estas son enzimas cuyas actividades proteolíticas y en particular cuya contribución al desempeño de lavado o de limpiado de las formulaciones correspondientes están cubiertas en los ejemplos de la presente solicitud.

Una comparación de secuencia de estas secciones de ADN que codifican para las enzimas maduras realizada tal como en el ejemplo 4 con las más cercanamente similares del estado de la técnica ha arrojado el siguiente resultado: el gen para la proteasa (presuntamente) madura HP70 (SEQ ID NO. 3, posiciones 97 hasta 1746) es idéntica a la región homóloga de SEQ ID NO. 65 de WO 2004/033668 A2 en 80,0%, a la de SEQ ID NO. 69 de WO 2004/033668 A2 en 81,8% y a la de la proteasa STmPr2 en 81,3%. El gen para la proteasa (presuntamente) madura HP53 (SEQ ID NO. 6, posiciones 115 hasta 1761) es idéntica a la región homóloga de SEQ ID NO. 65 de WO 2004/033668 A2 en 81,0%, a la de SEQ ID NO. 69 de WO 2004/033668 A2 en 82,2% y a la de la proteasa STmPr2 en 82,9%.

Se prefieren las proteasas alcalinas correspondientemente derivadas de las mismas.

Otra comparación de secuencia de las secciones de ADN, que codifican para estas enzimas maduras y suprimidas (deleted) C-terminalmente se proporciona en el ejemplo 4, con las más cercanamente similares del estado de la técnica arroja el siguiente resultado: el gen para la proteasa (presuntamente) madura y suprimida (deleted) C-terminalmente HP70 (SEQ ID NO. 3, posiciones 97 hasta 1410) es idéntica a la región homóloga de SEQ ID NO. 65 de WO 2004/033668 A2 en 81,4%, a la de SEQ ID NO. 69 de WO 2004/033668 A2 en 83,7% y a la de la proteasa STmPr2 en 83,2%. El ácido nucleico que codifica para la proteasa (presuntamente) madura y suprimida (deleted) C-terminalmente HP53 (SEQ ID NO. 6, posiciones 115 hasta 1428) es idéntico a la región homóloga de SEQ ID NO. 65 de WO 2004/033668 A2 en 82,1%, a la de SEQ ID NO. 69 de WO 2004/033668 A2 en 83,6% y a la de la proteasa STmPr2 en 83,9%.

De manera correspondiente, las proteasas alcalinas derivadas de estas secciones de ADN son particularmente preferidas.

Además, se prefiere cada una de las proteasas alcalinas descritas hasta ahora según la invención las cuales sean aislables de un hábitat natural o que se deriven de un ácido nucleico aislable de un hábitat natural.

Debe suponerse que los ADNs aislados usando el método descrito en los ejemplos se han formado a partir de organismos naturales y codifican también in vivo para proteínas funcionales. Así, las enzimas asociadas mismas deben también ser capaces de encontrarse por medio de métodos análogos, en particular si no son pseudogenes sino proteínas formadas realmente. Por otra parte, el aislamiento de los ácidos nucleicos conduce inmediatamente a un gen que puede introducirse a caracterizaciones biológicas moleculares y producirse. Además, no puede esperarse siempre que los genes de interés se expresen en todas las condiciones para que los genes no traducidos sean accesibles también instantáneamente por medio de aislamiento de ácido nucleico.

Además, se prefiere cada una de las proteasas alcalinas según la invención tal como se describe hasta ahora, las cuales mismas o cuyos ácidos nucleicos asociados se origina a partir de un organismo que puede aislarse de un hábitat natural.

Esta forma de realización es particularmente ventajosa porque entonces el organismo asociado mismo puede tomarse al cultivo. Ventajosamente, las proteasas según la invención pueden aislarse y prepararse a partir de sus extractos de célula o sobrenadantes de cultivo.

Entre éstas, se prefieren aquellas proteasas alcalinas donde se involucra a un microorganismo, preferiblemente un hongo o una bacteria, entre éstas preferiblemente una bacteria gram-positiva y particularmente una del género Bacillus.

Particularmente para estos organismos se conocen métodos de cultivo establecidos en el estado de la técnica. Esto aplica en particular para Bacilli, que desempeñan un papel relevante en la producción industrial de enzimas. Aquellas proteasas alcalinas y proteínas que se originan a partir de especies de Xanthomonas son otra realización. De una de estas especies gram-negativas se originan las enzimas conocidas determinadas como las más cercanamente similares (ver arriba); también hay experiencia en la fermentación biotecnológica de xanthomonadas.

Las proteasas alcalinas derivadas de una de las proteasas alcalinas según la invención descrita hasta ahora mediante fragmentación o mutagénesis de deleción o proteínas que tienen al menos 100 y preferiblemente de manera creciente al menos 150, 200, 250 y muy particularmente preferible al menos 300 aminoácidos ya conectados en la molécula de partida.

Así es posible, por ejemplo, suprimir (delete) aminoácidos individuales en los terminales o en los bucles de la enzima sin que por eso la actividad proteolítica se pierda. Tales mutaciones se describen, por ejemplo, en WO 99/49057 A1. WO 01/07575 A2 enseña que por medio de tales deleciones puede disminuirse la alergicidad de las proteasas y de esta manera mejorarse su capacidad de empleo de manera general. La fragmentación favorece la mutagénesis de inserción o de sustitución y/o fusión llevadas a cabo luego con otras enzimas. Con respecto al uso pretendido de estas enzimas se prefiere si tienen también una actividad proteolítica después de la fragmentación o mutagénesis de deleción. Se prefiere particularmente si tienen una actividad adicionalmente incrementada por este
medio.

Se prefieren además las proteasas alcalinas o proteínas tal como se han descrito previamente según la invención y se derivan de una de las proteasas alcalinas o proteínas descritas hasta ahora mediante mutagénesis de inserción, mediante mutagénesis de sustitución y/o mediante fusión con al menos otra proteína.

Numerosos documentos del estado de la técnica divulgan efectos ventajosos de inserciones y sustituciones en proteasas; entre ellos también las publicaciones mencionadas WO 99149057 A1 y WO 01/07575 A2. En principio, éstas también incluyen reemplazos individuales de aminoácidos, sin embargo, también puede reemplazarse por otros un números de aminoácidos conectados. Éstos también incluyen combinaciones novedosas de secciones de enzima relativamente grandes, es decir los fragmentos arriba mencionados con otras proteasas o proteínas de otra función. De esta manera es posible, por ejemplo conforme a WO 99/57254 A1, proporcionar una proteína, o partes de la misma, según la invención mediante enlazantes de péptido o directamente como una proteína de fusión con dominios enlazantes de otras proteínas, por ejemplo el dominio enlazante de celulosa, y como resultado hacer más efectiva la hidrólisis del sustrato. Así mismo, las proteínas según la invención pueden, por ejemplo, enlazarse también con amilasas o celulasas para ejercer una función doble.

Entre éstas se prefieren las proteasas o proteínas que tienen uno o más reemplazos de aminoácidos en las posiciones 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 y 268 en la numeración de la proteasa alcalina de Bacillus lentus, donde estas posiciones deben asignarse por medio de la alineación en la figura 1.

Aquí, los siguientes residuos de aminoácido se encuentran en la molécula de tipo silvestre de la proteasa alcalina de B. lentus: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, 1102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 o bien T268.

Puesto que además de la proteasa alcalina de Bacillus licheniformis, la proteasa alcalina de B. lentus en el estado de la técnica es una molécula de referencia importante para la descripción de proteasas novedosas y de mutaciones de punto, la proteasa descrita aquí y también su secuencia eran desconocidas hasta ahora, parece ventajoso referirse a esta numeración en la asignación de las mutaciones de punto. Por otra parte, la numeración en general depende de la proteína madura y tal como se menciona arriba aún no está definido en la actualidad con cuál aminoácido empieza la proteína madura. En la numeración de SEQ ID NO. 4 (HP70) estas posiciones - como puede entenderse por medio de la figura 1 - corresponden a los siguientes números de posición: P140, N141, T182, N188, Y195, A204, G209, T245, K264, K273, (-), Y277, T278, D280, V296, E304, 1306, S317, G326, V328, S329, S341, V345, A376, S381, S393, G399, Y406, V419, Q424, T432, P433, T438, L439, G453 y V466.

En la numeración de SEQ ID NO. 7, es decir HP53, éstas son las siguientes posiciones: P146, N 147, T188, N 194, Y201, A210, G215, T251, K270, K279, (-), Y283, T284, D286, V302, E310, 1312, S323, G332, V334, S335, S347, V351, A382, S387, S399, G405, Y412, V425, Q430, S438, P439, T444, L445, G459 y V472.

Así, a partir de la solicitud WO 92/21760 A1 se infieren variantes individuales y múltiples de la subtilisina de Bacillus lentus DSM 5483 en las siguientes posiciones: 3, 4, 36, 42, 47, 56, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 y 268. La solicitud WO 95/23221 A1 divulga adicionalmente reemplazos en esta molécula en las posiciones 99, 154 y 211, particularmente R99G, R99A, R99S, S154D, S154E, L211 D y L211 E. Tales variantes son válidas según la solicitud WO 95/07770 A1 para uso en cosméticos. Además de otros reemplazos, el reemplazo L211G también se describe en la solicitud WO 02/088340 A2 y el reemplazo G61A en WO 03/038082 A2.

Entre estos, por consiguiente se prefieren aquellos en los cuales están presentes los otros reemplazos de aminoácidos en una o más de las posiciones 3, 4, 61, 188, 193, 199 y 211. En HP70, las posiciones P140, N141, G209, A376, S381, S393 y Y406 corresponden a esto o bien en HP53 las posiciones P146, N147, G215, A382, S387, S399 y Y412.

Entre éstas, en correspondencia con los que se ha dicho, se prefieren a su vez aquellos que son uno o más de los reemplazos de aminoácidos 3T, 41, 61A, 188P, 193M, 1991 y 211 D o 211G, siempre que las correspondientes posiciones de homología no se adopten ya naturalmente por uno de estos aminoácidos preferidos.

Los reemplazos S3T y V41 conducen, como ya se explica en particular en WO 02/088340 A2, presuntamente por medio de un efecto estabilizante sobre la molécula, a un mejoramiento de su contribución al desempeño de lavado de un detergente o de un limpiador. Los reemplazos S3T, V41, A188P, V193M, V1991 y L21 1 D caracterizan la proteasa denominada como F49 según WO 95/23221 A1 la cual se ha usado en los ejemplos 7 y 8 de la presente solicitud como una enzima de comparación eficiente establecida en el estado de la técnica. Por otra parte, las proteasas HP70 y HP53 aún son moléculas de tipo silvestre inmodificadas cuya actividad, en particular su contribución al desempeño de lavado, podría mejorarse por los mismos reemplazos.

También se prefiere una proteasa alcalina descrita de antemano según la invención o una proteína tal que adicionalmente se estabilice.

Un incremento en la estabilidad durante el almacenamiento y/o durante el uso, por ejemplo en el proceso de lavado, conduce a que su actividad dure más y de esta manera se incremente en acción. Como posibilidades de estabilización se toman en consideración todas las estrategias que se describen y son convenientes en el estado de la técnica, por ejemplo según US 5230891 el acoplamiento covalente a un polímero.

Se prefieren estabilizaciones que sean posibles por medio de mutagénesis de punto de la molécula misma. Estas no necesitan más pasos de procesamiento, además de la obtención de la proteína. Algunas mutaciones de punto adecuadas para esto se conocen de por sí a partir del estado de la técnica. Así, según las patentes US 6087315 y US 6110884 pueden estabilizarse reemplazando ciertos residuos de tirosina por otros.

Otras posibilidades son, por ejemplo:

- modificación del enlace de iones metálicos, en particular de los sitios de enlace de calcio, por ejemplo según las enseñanza de las solicitudes WO 88/08028 A1 y WO 88/08033 A1; según la primera de estos documentos, uno o más de los residuos de aminoácidos involucrados en el enlace de calcio debe reemplazarse por aminoácidos cargados negativamente; según la enseñanza de la solicitud WO 88/08033, para la estabilización por medio de enlace de calcio, deben introducirse mutaciones de punto simultáneamente a al menos una de las secuencias de los dos radicales arginina/glicina;

- Según la patente US 5453372 pueden protegerse las proteínas contra la influencia de agentes desnaturalizantes tales como surfactantes por medio de ciertas mutaciones sobre la superficie.

Otra posibilidad para la estabilización con respecto a la temperatura incrementada y la acción de los surfactantes sería, aplicando las enseñanzas de WO 92/21760 A1, WO 02/088340 A2 y WO 03/038082 A2 la estabilización por medio del reemplazo de aminoácidos que se encuentran cerca del Terminal N por aquellos que entran en contacto presuntamente con el resto de la molécula por medio de interacciones no covalentes y hacen así una contribución al mantenimiento de la estructura globular. Esto es aconsejable particularmente para proteasas alcalinas que se han obtenido originalmente como B. lentus, Mutantes apropiados que tienen las variantes SEQ ID NO. 12 y 16 se describen en los ejemplos de la presente solicitud.

Las formas de realización preferidas son aquellas en las que la molécula se estabiliza en un número de maneras. Por ejemplo, según WO 89/09819 A1 puede suponerse que un número de mutaciones estabilizantes actúa de manera aditiva.

También se prefiere una proteasa alcalina según la invención descrita previamente o una proteína tal que se deriva adicionalmente.

Por derivados se entienden tales proteínas que se derivan por medio de una modificación adicional de las proteínas producidas. Tales modificaciones pueden, por ejemplo, influencias la estabilidad, la especificidad del sustrato o la fuerza de enlace al sustrato o la actividad enzimática. Pueden servir también para reducir la alergicidad y/o inmunogenicidad de la proteína y de esa manera, por ejemplo aumentar su compatibilidad con la piel.

Tales derivaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo, biológicamente, por ejemplo en conexión con la biosíntesis de proteína produciendo el organismo hospedante. Aquí debe hacerse énfasis particular en el acoplamiento de compuestos de bajo peso molecular tales como lípidos u oligosacáridos.

Las derivaciones, sin embargo, pueden llevarse a cabo también mediante conversión química, por ejemplo, de una cadena lateral o mediante enlace covalente de otro compuesto, por ejemplo macromolecular, a la proteína. Se describe una modificación química, por ejemplo, en la solicitud DE 4013142 A1. El acoplamiento de aminas a grupos carboxílicos de una enzima para modificación del punto isoeléctrico se infiere de WO 95/26398 A1, por ejemplo. Por ejemplo, pueden enlazarse macromoléculas tales como proteínas a las proteínas según la invención, por medio de compuestos químicos bifuncionales, por ejemplo. Aplicando las enseñanzas de WO 99/57154 A1 es posible proporcionar una proteína según la invención con un dominio de enlace específico también por medio de un enlazante no proteínico. Tales derivados son particularmente adecuados para usar en detergentes y limpiadores. Análogamente a WO 00/01831 A2, los inhibidores de proteasa pueden enlazarse también a las proteínas según la invención por medio de enlazantes, en particular enlazantes de aminoácidos. Los acoplamientos con otros compuestos macromoleculares, tales como, por ejemplo, glicol de polietileno, mejoran la molécula con respecto a otras propiedades tales como la estabilidad o la compatibilidad con la piel; esto ya se ha explicado.

Por derivados de proteínas según la invención también pueden entenderse en el sentido más amplio las preparaciones de estas enzimas. Dependiendo de la obtención, procesamiento o preparación, una proteína puede asociarse con otras sustancias diversas, por ejemplo del cultivo de los microorganismos que producen. Una proteína puede también haber sido tratada, por ejemplo para aumentar su estabilidad de almacenamiento, específicamente con ciertas otras sustancias. Todas las preparaciones de una proteína según la invención están por lo tanto conformes con la invención. Esto también es independiente de si aquella realmente muestra su acción enzimática o no en una cierta preparación. Puede ser deseable que durante el almacenamiento no presente actividad o solo muy baja y solo presente su función proteolítica en el momento de usarla. Esto puede controlarse, por ejemplo, por medio de sustancias concomitantes apropiadas. En particular, la preparación conjunta de de proteasas con inhibidores de proteasa es ventajosa y se conoce a partir del estado de la técnica (WO 00/01826 A2).

Más allá se prefiere una proteasa alcalina descrita previamente según la invención o una proteína tal que tienen al menos un determinante antigénico en común con una de las proteasas alcalinas o proteínas designadas previamente, en particular por sobre al menos de las regiones epítopes, dentro de las cuales las posiciones 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 y 268 se encuentran en la numeración de la proteasa alcalina de Bacillus lentus, por asignarse por medio de la alineación en la figura 1.

Esto aplica en particular para las variantes en estas posiciones descritas arriba, puesto que por una parte se prefieren de por sí y por otra parte pueden diferenciarse por medio de anticuerpos que se han formado específicamente frente a estas regiones a partir de proteasas que coinciden en estas posiciones con la molécula de tipo silvestre.

La solución de un subproblema y así un objeto independiente de la invención son los ácidos nucleicos que tienen una secuencia nucleótida que es idéntica a la secuencia nucleótida indicada en SEQ ID NO. 3 al menos en 85% o a la secuencia nucleótida indicada en SEQ ID NO. 6 en al menos 85%.

Por una parte, la detección de la proteasa descrita en los ejemplos se basa en el aislamiento del ADN asociado. Por otra parte, los ácidos nucleicos pueden clonarse inmediatamente e incorporarse así a la producción por ingeniería genética de las enzimas buscadas.

Entre éstas se prefieren de manera creciente aquellas que son idénticas a una de las secuencias nucleótidas indicadas preferiblemente en al menos 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferiblemente en 100%, incluyéndose en cada caso todos los valores intermediarios íntegros o fraccionarios.

En correspondencia a las realizaciones hechas arriba y tal como se describe en los ejemplos, como secuencias nucleótidas más cercanamente similares a la SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 6 sólo aquellas que tienen 74,4% o bien 75,0% de identidad pudieron encontrarse en el estado de la técnica.

Las otras secuencias de ADN según WO 2004/033668 A2 y la entrada de GenBank AY253983 ya han sido discutidas arriba y son suficientemente diferentes de las secuencias nucleótidas según la invención descrita aquí.

Se prefieren aquellos ácidos nucleicos según la invención en los que los valores de homología en cada caso aplican para la región que corresponde a las posiciones de nucleótidos 97 hasta 1746 según SEQ ID NO. 3 o a las posiciones de nucleótidos 115 hasta 1761 según SEQ ID NO. 6.

En correspondencia con lo que se ha dicho arriba, nos referimos a la región que codifica para la proteína respectivamente madura, es decir activa. El stop codón también se incluye porque su existencia asegura que no se forme una proteína mayor, posiblemente ya no funcional, de fusión no intencional. Así en la clonación se debe tener cuidado de que un stop codón se encuentre así mismo en esta posición, si no debe causarse específicamente una fusión de proteína por medio del terminal C. Si luego resulta que la proteína madura se forma de otra parte de esta secuencia, el alcance de la protección es válido correspondientemente para esta parte.

Según la invención se prefieren además aquellos ácidos nucleicos en los cuales los valores de homología aplican respectivamente para la región que corresponde a las posiciones nucleótidas 97 hasta 1410 según SEQ ID NO. 3 o bien a las posiciones nucleótidas 115 hasta 1428 según SEQ ID NO. 6.

Tal como se describe en los ejemplos, basta en el caso de las proteínas HP70 y HP53 usar la parte Terminal N de la proteína total; una deleción considerable de Terminal C en ambos casos condujo a una enzima proteolíticamente activa en detergentes y limpiadores, lo cual ha suministrado un contribución correspondientes al desempeño total de limpieza de la composición de interés. Los ácidos nucleicos que codifican para tales variantes son por lo tanto realizaciones preferidas porque hacen posible una preparación biotecnológica más eficiente en costos de las proteínas de
interés.

Además, y en correspondencia con las realizaciones previas, según la invención se prefieren aquellos ácidos nucleicos que codifican para una proteasa alcalina o una proteína del primer objeto de la invención.

Las mismas proteínas deben hacerse proporcionarse mediante la presente solicitud de modo que los ácidos nucleicos que codifican para solo proteínas inactivas no son una solución según la invención. Se prefieren aquellos ácidos nucleicos que codifican para proteínas maduras y de manera creciente particularmente aquellos que codifican para variantes de manera creciente más activas.

Además se prefieren aquellos de dichos ácidos nucleicos según la invención de los cuales uno o preferiblemente más codones se reemplazan por codones sinónimos.

Este aspecto se refiere en particular a la expresión heteróloga de las proteasas de interés. Así cada organismo, en particular cada cepa de producción, tiene un cierto uso de codón. Aquí pueden ocurrir cuellos de botella en la biosíntesis de proteína si los codones que se encuentran sobre el ácido nucleico transgénico en laceada hospedante están opuestos a un número comparativamente pequeño de tARNs cargados. Los codones sinónimos codifican, por otra parte, para los mismos aminoácidos y pueden traducirse mejor, dependiendo del hospedante. Esta trascripción necesaria opcionalmente depende de la elección del sistema de expresión. En particular con muestras de organismos desconocidos, posiblemente no cultivables, puede ser necesario un ajuste correspondiente.

En correspondencia con las realizaciones hechas arriba, las células de un organismo en el alcance de la protección se incluyen además y son un objeto individual de la invención, las cuales naturalmente contienen un ácido nucleico según la invención.

Por medio de su cultivo pueden ser accesibles directamente las enzimas deseadas.

Particularmente se prefieren entre éstas aquellas células que expresan naturalmente y secretan preferiblemente una proteasa o una proteína del objeto de la invención.

Por medio de esto, las proteasas según la invención pueden ensayarse inmediatamente con respecto a su área destinada de aplicación y obtenerse posiblemente en cargas relativamente grandes cultivando de manera inmediata este organismo.

Entre éstas, a su vez, se prefieren aquellas células que son microorganismos, preferiblemente hongos o bacterias, entre ellos preferiblemente bacterias gram-positivas y particularmente aquellas del género Bacillus o bacterias gram-negativas del género Xanthomonas.

Con microorganismos, en el estado de la técnica ha habido una experiencia extensa con respecto a las técnicas de biología molecular y la producción. Esto aplica particularmente para bacterias gram-positivas de las cuales aquellas del género Bacillus pertenecen a las cepas de producción más corrientes. No menos preferidas, sin embargo, son las bacterias gram-negativas del género Xanthomonas, que hasta ahora fueron utilizadas en particular para la producción de xantan polisacárido extracelular. Debido a las comparaciones de homología ya discutidas y mostradas en los ejemplos, parece además posible que cepas de este género produzcan naturalmente las proteasas particularmente preferidas según la invención HP70 y HP53. Al menos, su producción en cepas íntimamente relacionadas debería ser de manera particular ventajosamente realizable, por ejemplo hasta tanto su uso de codón sea de interés.

Otro objeto independiente de la invención son métodos para la identificación de una proteasa alcalina del primer objeto de la invención, los cuales se basan en el aislamiento de un ácido nucleico a partir de un hábitat naturalmente colonizado.

Tal como se confirma en la presente invención, para la identificación de proteasas novedosas tampoco es absolutamente necesario aislar las proteasas y microorganismos de interés desde la naturaleza. En particular mediante clonación en perdigonada o de manera alterna por medio de iniciadores PCR para motivos de secuencia conocidos es posible descubrir los ácidos nucleicos de interés directamente. Tal método se presenta en los ejemplos 1 a 3 de la presente solicitud. Por consiguiente, es posible por ejemplo, cultivar la flora de microorganismos de muestras de suelo, aislar ADN de allí y por medio de clonación ensayar en un vector de expresión para expresión de
proteasa.

Entre dichos métodos se prefieren aquellos en los que se usa uno, preferiblemente dos, oligonucleótidos que corresponden uno al otro, los cuales pueden servir como iniciadores PCR y se derivan de una de las dos secuencias SEQ ID NO. 3 ó 6.

Una apreciación comparable basada en un PCR que usa iniciadores (primers) adecuados se infiere, por ejemplo, de la solicitud WO 03/002711 A2 en el ejemplo de \alpha-amilasas. De esta manera es posible, en vez de cultivar los microorganismos y preparar de allí el ADN, amplificar directamente los ácidos nucleicos contenidos en una muestra de suelo. Para esto, las secuencias nucleótidas indicadas bajo SEQ ID NO. 3 y 6 pueden servir como un prototipo para el diseño de iniciadores PCR correspondientes. Es ventajoso aquí diseñar iniciadores (primers) según los métodos conocidos de por sí, los cuales comprenden exclusivamente o en particular terminales N un poco más que la proteína madura; además, el conocimiento obtenido de las variantes dc (ejemplo 6) puede utilizarse para que por medio de PCR solo se amplifiquen ácidos nucleico que codifiquen para proteínas truncadas de manera correspondiente.

Además, se prefieren aquellos métodos en los cuales se clona el ácido nucleico aislado, preferiblemente expresado y particularmente preferible identificado como una proteasa por medio de la actividad de proteasa del producto de expresión.

La clonación representa usualmente, incluso si un PCR no ha sido llevado a cabo previamente, el paso esencial de biología molecular mediante el cual se inicia la obtención de la enzima asociada. La expresión sirve para la caracterización bioquímica de la proteína derivada del ácido nucleico. En particular, si el ensayo para actividad de proteasa, por ejemplo por medio de la degradación de un sustrato de proteína (ejemplos comparativos) es exitoso, es posible estar seguro de haber encontrado una proteasa, que puede investigarse en pruebas posteriores con respecto a su capacidad de uso industrial.

Otro objeto independiente de la invención son vectores que contienen una región de ácido nucleico según la invención designada de antemano.

Para tratar con los ácidos nucleicos relevantes para la invención, y de esa manera en particular para prepararse para la producción de proteínas según la invención, están ligados adecuadamente en vectores. Tales vectores y los métodos asociados de trabajo se describen detalladamente en el estado de la técnica. Los vectores están disponibles comercialmente en gran número y amplitud de variación, tanto para clonación y para expresión. Estos incluyen, por ejemplo, vectores que se derivan de plásmidos bacterianos, a partir de bacteriófagos o de virases, o principalmente vectores sintéticos. Además, están diferenciados por la clase de tipos de células en las cuales son capaces de establecerse, por ejemplo mediante vectores para bacterias gram-negativas, para gram-positivas, para levaduras o para eucariotas más altas. Forman puntos de partida adecuados, por ejemplo, para investigaciones de biología molecular y bioquímicas y para la expresión del gen de interés o proteína asociada.

En una forma de realización los vectores según la invención son vectores de clonación.

Los vectores de clonación son adecuados, además de para el almacenamiento, la amplificación biológica o la selección del gen de interés, para su caracterización molecular biológica. Simultáneamente, son formas transportables y almacenables de los ácidos nucleicos reivindicados y también son puntos de partida para técnicas de biología molecular, que no está ligadas a células, tales como por ejemplo PCR o métodos de mutagénesis in Vitro.

Preferiblemente los vectores según la invención son vectores de expresión.

Tales vectores de expresión son la base para producir los ácidos nucleicos correspondientes en sistemas de producción biológica y de esa manera producir las proteínas asociadas. Las realizaciones preferidas de este objeto de la invención son vectores de expresión que llevan los elementos genéticos necesarios para expresión, por ejemplo el promotor natural, localizado originalmente antes de este gen, o un promotor de otro organismo. Estos elementos pueden arreglarse, por ejemplo, en forma de un casete de expresión. De manera alterna, pueden hacerse disponibles elementos individuales o todos los elementos de regulación mediante la célula hospedante respectiva. Particularmente preferible, los vectores de expresión se ajustan con respecto a otras propiedades tales como, por ejemplo, el número óptimo de copia, con el sistema de expresión elegido, en particular la célula hospedante (ver abajo).

Un objeto independiente de la invención son células que después de modificación por ingeniería genética contienen una de las regiones de ácido nucleico según la invención designada de antemano.

Estas células contienen la información genética para la síntesis de una proteína según la invención. Entre ellas, en contraste con los productores naturales reivindicados también descritos arriba, nos referimos a aquellas células que según los métodos conocidos de por sí han sido suministradas con los ácidos nucleicos según la invención, o los cuales se derivan de tales células. Para esto, aquellas células hospedantes se seleccionan adecuadamente, las cuales pueden cultivarse de manera comparativamente simple y/o producen altos rendimientos de producto.

Hacen posible, por ejemplo, la amplificación de los genes correspondientes, pero también su mutagénesis o transcripción y traslación y finalmente la producción biotecnológica de las proteínas de interés. Esta información genética puede estar presente extracromosomáticamente como un elemento genético separado, es decir en bacterias en locación plásmica, o integradas a un cromosoma. La elección de un sistema adecuada depende de cuestiones tales como, por ejemplo, el tipo y duración del almacenamiento del gen, o del organismo o el tipo de mutagénesis o selección. Por ejemplo, en el estado de la técnica (WO 97/09446 A1) se describen métodos de mutagénesis y selección para el desarrollo de enzimas detergentes a base de bacteriófagos - y sus células hospedantes
específicos.

En los países donde las leyes nacionales apropiadas demandan que se excluyan las células madres embrionarias humanas de tal objeto de aplicación, la presente invención se reivindica sólo para un objeto restringido de manera correspondiente.

Preferiblemente, dicha región de ácido nucleico se encuentra sobre uno de los vectores según la invención designado arriba, en particular sobre un vector de clonación o de expresión.

De esta manera se vuelven relevantes para la realización de la presente invención.

Además, se prefieren aquellas células que expresan, preferiblemente secretan, una proteasa alcalina o una proteína del primer objeto de la invención.

Las células hospedantes que forman proteínas hacen posible su producción biotecnológica. Células hospedantes adecuadas para expresión de proteína son en principio todos los organismos, es decir procariotas, eucariotas o cianofitas. Se prefieren aquellas células hospedantes que genéticamente pueden tratarse fácilmente, lo cual incumbe la transformación con el vector de expresión, su establecimiento estable y la regulación de la expresión, por ejemplo hongos monocelulares o bacterias. Además, las células hospedantes preferidas se distinguen por una buena capacidad de manejo microbiológico y biotecnológico. Esto se refiere, por ejemplo, para fácil capacidad de de cultivo, altas velocidades de crecimiento, bajos requisitos para medios de fermentación y buenas velocidades de producción y secreción para proteínas foráneas. Preferiblemente, se escogen las variedades de laboratorio que se orientan a expresión. Tales variedades son obtenibles comercialmente o por medio de colecciones de variedades generalmente accesibles. Cada proteína según la invención puede de esta manera obtenerse teóricamente a partir de un gran número de organismos hospedantes. A partir de la abundancia de diversos sistemas disponibles según el estado de la técnica, los sistemas de expresión óptima para el caso individual deben determinarse experimentalmente.

Particularmente ventajosas son las células hospedantes que son ellas mismas proteasa negativas y de esta manera no degradan las proteínas formadas.

Las realizaciones preferidas son aquellas células hospedantes que debido a elementos genéticos apropiados son regulables en su actividad, por ejemplo por la adición controlada de compuestos químicos, por modificación de las condiciones de cultivo o como una función de la densidad celular respectiva. Esta expresión controlable hace posible una producción muy económica de las proteínas de interés; es realizable, por ejemplo, por medio de un elemento apropiado sobre el vector involucrado. Adecuadamente, se ajustan unos a otros gen, vector de expresión y célula hospedante, en cuanto concierne a los elementos genéticos necesarios para expresión (sitio de enlace de ribosoma, promotores, terminadores) o el uso de codón.

Entre éstos, se prefieren células hospedantes que se caracterizan por ser bacterias.

Las bacterias se caracterizan por tiempos cortos de generación y bajas demandas en las condiciones de cultivo. De esta manera también pueden establecerse métodos no costosos. Además, se tiene una rica experiencia con bacterias en tecnología de fermentación. Las bacterias gram-negativas o gram-positivas pueden ser adecuadas para una producción especial por las razones más diferentes, determinarse experimentalmente en el caso individual, tal como fuentes de nutrientes, velocidad de formación de producto, necesidad de tiempo, etc.

En una forma preferida de realización, éstas son bacterias gram-negativas, en particular de los género Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, especialmente variedades de E. coli K12, E. coli B o Klebsiella planticola, y muy particularmente derivados de las variedades de Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5\alpha, E. coli JM1 09, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).

En bacterias gram-negativas, tales como, por ejemplo E. coli, se secreta una gran cantidad de proteínas al espacio periplasmática. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. En la solicitud WO 01/81597 A1, se divulga un método según el cual se logra que las bacterias gram-negativas expelan las proteínas expresadas. Un sistema tal es también adecuado para la producción de proteínas según la invención. Las bacterias gram-negativas mencionadas como preferidas son fácilmente accesibles por lo general, es decir comercialmente o mediante colecciones públicas de variedades, y optimizables a condiciones específicas de producción en interacción con otros componentes así mismo disponibles en gran número tales como, por ejemplo, vectores.

Tal como se mencionó arriba, Xanthomonas y también Pseudomonas son células hospedantes prometedoras debido a su supuesta relación con las variedades que producen HP70 y/o HP53 in vivo; no en último lugar también debido a un uso de codón presuntamente similar.

En una realización alternativa, no menos preferida, éstas son una bacteria gram-positiva, en particular uno de los géneros Bacillus, Staphylococcus o Corynebakterium, muy particularmente de la especie Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus o Corynebacterium glutamicum.

Las bacterias gram-positivas tienen, en comparación con las bacterias gram-negativas, la diferencia básica de liberar proteínas secretadas inmediatamente al medio nutriente que rodea las células, de las cuales, si se desea, las proteínas expresadas según la invención pueden purificarse directamente del medio nutriente. Además, se relacionan o son idénticas a la mayoría de los organismos de origen para subtilisinas industrialmente importantes y usualmente forman ellas mismas subtilisinas comparables, de manera que pueden tener un uso similar de codón y su aparato de síntesis de proteína se orienta naturalmente de manera acorde. Otra desventaja puede consistir en el hecho de que mediante este método puede obtenerse una mezcla de proteínas según la invención con las subtilisinas formadas endógenamente de las variedades hospedantes. Una coexpresión así se infiere también de la solicitud WO 91102792. Si no se desean, los genes de proteasa presentes naturalmente en la célula hospedante deben desactivarse permanentemente o temporalmente.

También se prefieren células hospedantes que son células eucarióticas, preferiblemente del género Saccharomyces.

Ejemplos de éstas son hongos tales como actinomycetes o simplemente levaduras tales como Saccharomyces o Kluyveromyces. Están presentes sistemas de expresión termofílica fúngica en WO 96/02653 A1, por ejemplo. Estas son particularmente adecuadas para la expresión de variantes resistentes a temperatura. Las modificaciones que los sistemas eucarióticos llevan a cabo, particularmente en conexión con síntesis de proteínas, incluyen por ejemplo enlazar compuestos de bajo peso molecular tales como anclas de membranas u oligosacáridos. Las modificaciones de oligosacáridos de este tipo pueden ser deseables, por ejemplo, para disminuir la alergicidad. La coexpresión con las enzimas formadas naturalmente de células de este tipo, tales como por ejemplo, celulasas, pueden ser ventajosas también.

Un objeto independiente de la invención son métodos para la producción de una proteasa alcalina o de una proteína según el primer objeto de la invención.

Esto incluye todos los métodos para la producción de una proteína según la invención descrita arriba, por ejemplo métodos químicos de síntesis.

Por otra parte, sin embargo, se prefieren todos los métodos de biología molecular, microbiológicos o biotecnológicos de preparación establecidos en el estado de la técnica, ya discutidos arriba en aspectos individuales.

Preferiblemente, estos son métodos que se llevan a cabo usando un ácido nucleico según la invención designado arriba, preferiblemente llevados a cabo usando un vector designado previamente y particularmente preferible usando una célula designada previamente.

Por medio de dichos ácidos nucleicos, en particular los ácidos nucleicos indicados en el protocolo de secuencia bajo SEQ ID NO. 3 ó 6, la información genética correspondientemente preferida se hace disponible en forma microbiológicamente utilizable, es decir para métodos de ingeniería genética de producción. De manera creciente se prefiere el suministro de un vector particularmente exitoso utilizable por la célula hospedante o por tales células mismas. Los métodos de producción involucrados se conocen de por sí por parte de la persona versada en la materia.

Las formas de realización de la presente invención a base de las secuencias de aminoácidos asociadas pueden ser también sistemas de expresión libres de células en los que está comprendida la biosíntesis de proteína. Todos los elementos ya mencionados arriba pueden combinarse también para dar métodos novedosos para producir proteínas según la invención. En este caso, para cada proteína según la invención es concebible un gran número de posibilidades de combinación de pasos de proceso, de modo que los procesos óptimos para cada caso individual debe determinarse experimentalmente.

En correspondencia con lo que se ha dicho arriba sobre los métodos asociados a células, se prefieren aquellos en los que la secuencia nucleótida se ha adaptado en uno o preferiblemente más codones al uso de codón de la variedad hospedante.

Un objeto propio de la invención son las composiciones que comprenden una proteasa alcalina según la invención descrita arriba.

Así, todos los tipos de composiciones, en particular mezclas, recetas, soluciones, etc., cuya empleabilidad se mejora por la adición de una proteína según la invención descrita arriba, se incluyen en el alcance de protección de la presente invención. Aquí, dependiendo del área de uso, ésta puede ser, por ejemplo, mezclas sólidas, por ejemplo polvos que contienen proteínas secadas por congelamiento o encapsuladas, o composiciones gelatinosas o líquidas. Las recetas preferidas contienen, por ejemplo, sustancias tampón (búfer), estabilizadores, participantes de reacción y/o cofactores de las proteasas y/o otros ingredientes sinérgicos con las proteasas. En particular, entre éstas deben entenderse composiciones para las áreas de uso mencionadas en detalle abajo. Otras áreas de aplicación se infieren del estado de la técnica y se presentan, por ejemplo, en el manual "Industrial enzymes and their applications" (Enzimas industriales y su aplicación) de H. Uhlig, editorial Wiley, New York, 1998.

Como una realización preferida deben incluirse en este objeto de la invención las composiciones que son detergentes o limpiadores.

Tal como se muestra en los ejemplos de realización de la presente solicitud, fue sorprendentemente posible para detergentes y limpiadores que contienen una proteasa preferida según la invención observar un incremento de desempeño comparado con la composición libre de proteasa.

El objeto de la invención incluye todos los tipos concebibles de agentes limpiadores, tanto concentrados como composiciones que se usan sin diluir, para uso a escala comercial, en una máquina lavadora o lavando a mano o limpiando a mano. Estos incluyen, por ejemplo detergentes para textiles, tapetes o fibras naturales para las cuales se usa la denominación detergente según la presente invención. Estos incluyen, por ejemplo, líquidos de limpieza para lavadoras de platos o líquidos de limpieza para lavado a mano o limpiadores de superficies sólidas tales como metal, vidrio, porcelana, cerámica, azulejos, piedra, superficies lacadas, plásticos, madera o cuero; según la presente invención la denominación limpiador se usa para éstos.

Las formas de realización de la presente invención incluyen todas las formas de administración establecidas según el estado de la técnica y/o todas las formas convenientes de los detergentes o limpiadores según la invención. Estas incluyen, por ejemplo, composiciones sólidas, polvorientas, líquidas, gelatinosas o pastosas, que opcionalmente consisten también en un número de fases, comprimidas o no comprimidas; y además incluyen, por ejemplo, extrudidos, gránulos, tabletas o bolsas, empacados tanto en tambores grandes como en porciones.

Además de una proteasa alcalina del tipo de subtilisina según la invención, un detergente o limpiador según la invención contienen opcionalmente, según su área de uso, otros ingredientes tales como otras enzimas, estabilizadores de enzima, surfactantes, por ejemplo surfactantes no iónicos, aniónicos y/o anfotéricos, y/o blanqueadores, y/o constructores y opcionalmente otros ingredientes acostumbrados, los cuales se mencionan con mayor detalle abajo.

En una forma preferida de realización, los detergentes o limpiadores según la invención contienen las proteasas alcalinas del tipo de subtilisina según la invención descritas arriba en una cantidad desde 2 \mug hasta 20 mg, preferiblemente desde 5 \mug hasta 17,5 mg, particularmente preferible desde 20 \mug hasta 15 mg, muy particularmente preferible desde 50 \mug hasta 10 mg por gramo de la composición. Se incluyen todos los valores enteros y no enteros que se encuentren respectivamente entre estos números.

La actividad de proteasa en composiciones de este tipo puede determinarse según el método descrito en Tenside, volumen 7 (1970), páginas 125-132. Se indica correspondientemente en PE (unidades de proteasa, por sus siglas en alemán).

En la comparación de los desempeños de dos enzimas detergentes como, por ejemplo, en los ejemplos de la presente solicitud, debe hacerse una distinción entre uso de igualdad de proteína y de igualdad de actividad. En particular en el caso de preparaciones obtenidas por ingeniería genética libres en gran medida de actividad adicional, es apropiado el uso de igualdad de proteína. De esa manera es posible una declaración sobre si las mismas cantidades de proteína - como una medida del rendimiento de la producción fermentativa - conducen a resultados comparables. Si las proporciones respectivas entre sustancia activa y proteína total (los valores de la actividad específica) divergen, debe recomendarse una comparación de igualdad de actividad, puesto que por este medio se comparan las respectivas propiedades enzimáticas. Generalmente, es válido que una actividad específica puede compensarse mediante adición de una cantidad relativamente grande de proteína. Esto es, al final, una consideración económica.

Ahora sigue una compilación no exhaustiva de ingredientes importantes habituales para detergentes y limpiadores. Como una alternativa o de manera complementaria pueden adicionarse otros ingredientes adecuados para el propósito respectivo.

En calidad de surfactantes no iónicos, preferiblemente alcoxilados, ventajosamente etoxilados, se emplean en particular alcoholes primarios que tienen preferiblemente 8 a 18 átomos de C y en promedio de 1 a 12 moles de óxido de etileno (EO, por sus siglas en inglés) por mol de alcohol, en los cuales el radical alcohol puede ser lineal o preferiblemente ramificado con metilo en la segunda posición, o puede contener residuos lineales o ramificados con metilo en la mezcla, es decir, como se presentan habitualmente en residuos de oxoalcoholes. En particular, sin embargo, se prefieren alcoholes etoxilados que tienen residuos lineales de alcoholes de origen nativo que tienen de 12 a 18 átomos de C, por ejemplo de coco, palma, grasa de sebo o alcohol oleico, y en promedio de 2 a 8 EO por mol de alcohol. Los alcoholes etoxilados preferidos incluyen, por ejemplo, alcoholes de C_{12-14} con 3 EO ó 4 EO, alcoholes de C_{9-11} con 7 EO, alcoholes de C_{13-15} con 3 EO, 5 EO, 7 EO ó 8 EO, alcoholes de C_{12-18} con 3 EO, 5 EO ó 7 EO y mezclas de los mismos, tal como mezclas de alcoholes de C_{12-14} con 3 EO y alcoholes de C_{12-18} con 5 EO. Los grados de etoxilación indicados son valores promedios estadísticos que pueden ser números enteros o fraccionarios para un producto específico. Los alcoholes etoxilados preferidos tienen una distribución homóloga concentrada (etoxilados de rango estrecho o por sus siglas en inglés, NRE). Adicionalmente a estos surfactantes no iónicos, pueden emplearse también alcoholes grasos que tienen más de 12 EO. Ejemplos de éstos son alcoholes grasos sebásicos que tienen 14 EO, 25 EO, 30 EO ó 40 EO.

Otra clase de surfactantes no iónicos preferiblemente empleados que se emplean ya sea como un solo surfactante no iónico o en combinación con otros surfactantes no iónicos, son ésteres alquílicos de ácido graso alcoxilados, preferiblemente etoxilados o etoxilados o propoxilados que tienen preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono en la cadena alquílica, en particular ésteres metilo de ácido graso.

Otra clase de surfactantes no iónicos que pueden emplearse ventajosamente son los alquilpoliglicosidos (APG). Los alquilpoliglicosidos empleables satisfacen la fórmula general RO(G)_{z}, en la cual R es un radical alifático ramificado con metilo en la segunda posición, saturado o insaturado, que tiene de 8 a 22, preferiblemente de 12 a 18 átomos de C y G es el símbolo que representa una unidad de glicosa que tiene 5 ó 6 átomos de C, preferiblemente una glucosa. El grado de glicosilación z aquí se encuentra entre 1,0 y 4,0, preferiblemente entre 1,1 y 1,4. Preferiblemente se emplean alquilpoliglucosidas lineales, es decir alquilpoliglicosidas en las que el radical poliglicosilo es un radical glucosa y el radical alquilo es un radical n-alquilo.

Surfactantes no iónicos del tipo de óxido de amina, por ejemplo óxido de N-cocoalquil-N,N-dimetilamina y óxido de N-seboalquil-N,N-dihidroxietilamina, y de tipo de alcanolamidas de ácido graso, pueden ser adecuados. El contenido de estos surfactantes no iónicos preferiblemente no se encuentra encima del de los alcoholes grasos alcoxilados, en particular no es mayor de la mitad de éste.

Otros surfactantes adecuados son amidas de ácido polihidroxigraso de la fórmula (II),

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En la cual RCO es un radical acilo alifático que tiene de 6 a 22 átomos de carbono, R^{1} es hidrógeno, un radical alquilo o hidroxialquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono y [Z] es un radical de polihidroxialquilo lineal o ramificado que tiene de 3 a 10 átomos de carbono y de 3 a 10 grupos hidroxilo. Las amidas de ácido polihidroxigraso son sustancias conocidas que pueden obtenerse habitualmente mediante aminación reductiva de un azúcar reductor con amoniaco, una alquilamina o una alcanolamina y acilación subsiguiente con un ácido graso, un éster alquilo de ácido graso o un cloruro de ácido graso.

El grupo consistente de las amidas de ácido polihidroxigraso también incluye compuestos de la fórmula (III),

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en la cual

R es un radical alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 7 a 12 átomos de carbono, R^{1} es un radical alquilo lineal, ramificado o cíclico, o un radical arilo, de 2 a 8 átomos de carbono y R2 es un radical alquilo lineal, ramificado o cíclico, o un radical arilo, o un radical oxialquilo, de 1 a 8 átomos de carbono, prefiriéndose radicales alquilo de C_{1-4} o radicales fenilo y [Z] es un radical de polihidroxialquilo lineal, cuya cadena de alquilo se sustituye por al menos dos grupos hidroxilo, o derivados alcoxilados, preferiblemente etoxilados o propoxilados de este radical.

[Z] se obtiene preferiblemente mediante aminación reductiva de un azúcar reductor, por ejemplo glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, galactosa, mannosa o xilosa. Los compuestos sustituidos N-alcoxi o N-ariloxi pueden convertirse, por ejemplo, en las amidas de ácido polihidroxigraso deseadas mediante reacción con ésteres metilo de ácido graso en presencia de un alcóxido como catalizador.

Los surfactantes aniónicos empleados son, por ejemplo, aquellos del tipo que consiste en sulfonatos y sulfatos. Posibles surfactantes del tipo sulfonato son en este caso preferiblemente alquilbencenosulfonatos de C_{9-13}, olefinsulfonatos, es decir mezclas de alqueno e hidroxialcanosulfonatos, así como disulfonatos, tal como se obtienen, por ejemplo, a partir de monoolefinas de C_{12-18}- con enlace doble final o interno mediante sulfonación con trióxido de azufre gaseoso y a continuación hidrólisis alcalina o ácida de los productos de sulfonación. También son adecuados alcanosulfonatos que se obtienen de alcanos de C_{12-18}, por ejemplo, mediante sulfocloración o sulfoxidación con hidrólisis subsiguiente o neutralización. Así mismo, también son adecuados los ésteres de ácidos \alpha-sulfograsos (éster sulfonatos), por ejemplo los ésteres metilo \alpha-sulfograsos de los ácidos grasos hidrogenados de coco, palma, palmiste o sebo.

Otros surfactantes aniónicos adecuados son ésteres de glicerina de ácidos grasos. Por ésteres de glicerina de ácido graso se entienden los mono-, di- y triésteres y sus mezclas, tal como se obtienen en la preparación por esterificación de una monoglicerina que tiene 1 a 3 moles de ácido graso o en la transesterificación de triglicéridos que tienen de 0,3 a 2 moles de glicerina. Los ésteres de glicerina de ácido graso sulfatados preferidos aquí son los productos de sulfatación de ácidos grasos saturados que tienen 6 a 22 átomos de carbono, por ejemplo ácido cáprico, ácido caprílico, ácido caproico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido behénico.

Los alqu(en)ilsulfatos preferidos son las sales de metal alcalino y en particular las de sodio de los semiésteres de ácido sulfúrico de los alcoholes grasos de C_{12}-C_{18}, por ejemplo de alcohol graso de coco, alcohol graso de sebo, alcohol laurílico, miristílico, cetílico o estearílico o los oxoalcoholes de C_{10}-C_{20} y aquellos semiésteres de alcoholes secundarios de estas longitudes de cadena. Además se prefieren alqu(en)ilsulfatos de la longitud de cadena mencionada que contiene un radical alquilo sintético de cadena recta, preparado a base de petroquímica, que tienen una conducta análoga de degradación como los compuestos adecuados a base de materia prima de la química grasa. Por el interés de la tecnología de lavandería se prefieren los alquilsulfatos de C_{12}-C_{16} y alquilsulfatos de C_{12}-C_{15} así como alquilsulfatos de C_{14}-C_{15}. 2,3-alquilsulfatos también son surfactantes aniónicos adecuados.

También son adecuados los monoésteres de ácido sulfúrico de alcoholes etoxilados de C_{7-21} de cadena recta o ramificada con 1 a 6 moles de óxido de etileno, tales como alcoholes de C_{9-11} ramificados con 2-metilo que tienen en promedio 3,5 moles de óxido etilénico (EO) o alcoholes grasos de C_{12-18} con 1 a 4 EO. Se emplean solo en cantidades relativamente pequeñas en los limpiadores debido a su gran conducta espumante, por ejemplo en cantidades de hasta 5% en peso, habitualmente de 1 a 5% en peso.

Otros surfactantes aniónicos adecuados son también las sales de ácido alquilsuccínico que también se denominan alquilsuccinatos o ésteres de ácido sulfosuccínico, y los monoésteres y/o diésteres de ácido sulfosuccínico con alcoholes, preferiblemente alcoholes grasos y en particular alcoholes grasos etoxilados. Los sulfosuccinatos preferidos contienen radicales de alcohol graso de C_{8-18} o mezclas de éstos. En particular, los sulfosuccinatos preferidos contienen un radical de alcohol graso que se deriva de alcoholes grasos etoxilados que se consideran de por sí surfactantes no iónicos (para la descripción véase arriba). Aquí, a su vez, se prefieren particularmente los sulfosuccinatos cuyos radicales de alcohol graso se derivan de alcoholes grasos etoxilados que tienen una distribución homóloga concentrada. Así mismo, también es posible emplear ácido alqu(en)ilsuccínico que tenga preferiblemente de 8 a 18 átomos de carbono en la cadena alqu(en)ílica o sus sales.

Otros surfactantes aniónicos posibles son en particular los jabones. Los jabones ácidos grasos saturados, tales como las sales de ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido erúcico hidrogenado y ácido behénico y en particular las mezclas de jabón derivadas de ácidos grasos naturales, por ejemplo coco, palma palmiste o ácidos grasoso de sebo, son adecuadas.

Los surfactantes aniónicos que incluyen los jabones pueden estar presentes en forma de sus sales de sodio, potasio o amonio y como sales solubles de bases orgánicas, tales como mono-, di- o trietanolamina. Preferiblemente, los surfactantes aniónicos están presentes en forma de sus sales de sodio o de potasio, en particular en forma de sus sales de sodio.

Los surfactantes pueden contenerse en los limpiadores o detergentes de la invención en una cantidad de preferiblemente 5% en peso a 50% en peso, particularmente de 8% en peso a 30% en peso, con respecto al producto terminado.

Los detergentes o limpiadores según la invención pueden contener blanqueadores. Entre los compuestos que sirven como blanqueadores, que arrojan H_{2}O_{2} al agua, tienen particular importancia el percarbonato de sodio, el tetrahidrato perborato de sodio y monohidrato perborato de sodio. Otros blanqueadores utilizables son, por ejemplo, peroxipirofosfatos, perhidratos de citrato y sales perácidas que suministran H_{2}O_{2}, tales como persulfatos y ácido persulfúrico. También es utilizable la percarbamida peroxihidrato urea que puede describirse por la fórmula H_{2}N-CONH_{2}\cdotH_{2}O_{2}. En particular al usar las composiciones para limpiar superficies duras, por ejemplo en lavado de platos mecánico, aquellas pueden, si se desea, contener también blanqueadores del grupo consistente en blanqueadores orgánicos, aunque en principio su uso también es posible en composiciones para lavado de textiles. Los blanqueadores orgánicos típicos son los peróxidos de diacilo, tales como, por ejemplo peróxido de dibenzoilo. Otros blanqueadores orgánicos típicos son los peroxi ácidos, donde se mencionan de manera particular como ejemplos los alquilperoxi ácidos y los arilperoxi ácidos. Los representantes preferidos son el ácido peroxibenzoico y sus derivados sustituidos en anillo, tales como ácidos alquilperoxibenzóicos, aunque también ácido peroxi-\alpha-naftoico y monoperftalato de magnesio, los peroxi ácidos alifáticos o alifáticos sustituidos, tales como ácido peroxiláurico, peroxiesteárico, ácido \varepsilon-ftalimidoperoxicaproico (ácido ftalimidoperoxihexanoico, PAP por sus siglas en inglés), ácido o-carboxibenzamidoperoxicaproico, ácido N-nonenilamidoperadipinico y N-nonenilamidopersuccinato, y ácidos alifáticos y aralifáticos peroxidicarboxílicos, tales como ácido 1,12-diperoxicarboxílico, ácido 1,9-diperoxiazelaico, ácido diperoxisebácico, ácido diperoxibrasílico, pueden emplearse los ácidos diperoxiftálicos, diácido 2-decildiperoxibutan-1,4-oico, ácido N,N-tereftaloil-di(6-aminopercapronoico).

El contenido de blanqueador en los detergentes o limpiadores puede ser de 1 a 40% en peso y particularmente 10 a 20% en peso, empleándose ventajosamente monohidrato de perborato o percarbonato.

Al lavar a temperaturas de 60º C y menores, y en particular durante el pretratamiento de lavado, para alcanzar una acción blanqueadora mejorada, las composiciones pueden contener también activadores de blanqueamiento. Los activadores de blanqueamiento empleados pueden ser compuestos que, en condiciones de perhidrólisis, producen ácidos peroxocarboxílicos alifáticos que tienen preferiblemente 1 a 10 átomos de C, en particular 2 a 4 átomos de C, y/o ácido perbenzoico opcionalmente sustituido. Sustancias adecuadas son aquellas que llevan grupos O- y/o N-acilo de dicho número de átomos de C y/o grupos benzoilo opcionalmente sustituidos. Se prefieren alquilendiaminas poliaciladas, en particular tetraacetiletilendiamina (TAED), derivados de triazina acilados, particularmente 1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina (DADHT), glicolurilo acilado, particularmente 1,3,4,6-tetraacetilglicolurilo (TAGU), N-acilimida, particularmente N-nonanoilsuccinimida (NOSl), fenosulfonatos acilados, particularmente n-nonanoil- o isononanoiloxibencenosulfonato (n- o bien iso-NOBS), ácidos hidroxicarboxílicos acilados, como trietil-O-acetilcitrato (TEOC), anhídridos de ácido carboxílico, particularmente anhídrido de ácido ftálico, anhídrido de ácido isatoico y/o anhídrido de ácido succínico, amidas de ácido carboxílico, como N-metildiacetamida, glicólido, alcoholes polihídricos acilados, particularmente triacetina, etilenglicoldiacetato, isopropenilacetato, 2,5-diacetoxi-2,5-dihidrofurano y los ésteres enólicos conocidos de las solicitudes alemanas de patente DE 196 16 693 y DE 196 16 767 así como sorbitol y manitol acetilados o bien sus mezclas (SORMAN)descritas en la solicitud europea de patentes EP 0 525 239, derivados acilados de azúcar, particularmente pentaacetilglucosa (PAG), pentaacetilfructosa, tetraacetilxilosa y octaacetillactosa así como glucamina N-acetilada opcionalmente o bien gluconolactona, triazol o bien derivados de triazol y/o caprolactama en forma de partículas y/o derivados de caprolactama, preferiblemente lactama N-acilada, por ejemplo N-benzoilcaprolactama y N-acetilcaprolactama, que se conocen de las solicitudes internacionales de patente WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 y WO 95/17498. Los acetilacetales sustituidos hidrofílicamente conocidos de la solicitud alemana DE 196 16 769 y las acillactama descritas en la solicitud alemana de patente DE 196 16 770 así como en la solicitud internacional de patente WO 95/14075 se emplean también preferiblemente. También pueden emplearse las combinaciones de activadores de blanqueadores convencionales conocidas de la solicitud alemana de patente DE 44 43 177. Así mismo pueden emplearse derivados de nitrilo como cianopiridina, nitrilquats, por ejemplo N-alquilamonioacetonitrilo, y/o derivados de cianamida. Los activadores de blanqueador preferidos son sodio-4-(octanoiloxi)-bencenosulfonato, n-nonanoil- o isononanoiloxibencenosulfonato (n- o bien iso-NOBS), undecenoiloxibencenosulfonato (UDOBS), sodiododecanoiloxibencenosulfonato (DOBS), ácido decanoiloxibenzoico (DOBA, OBC 10) y/o dodecanoiloxibencenosulfonato (OBS 12), así como N-metilmorfolino-acetonitrilo (MMA). Activadores de blanqueador de este tipo pueden contenerse en el intervalo habitual de cantidades desde 0,01 hasta 20% en peso, preferiblemente en cantidades desde 0,1 hasta 15% en peso, particularmente 1% en peso hasta 10% en peso, con respecto a la totalidad de la composición.

Adicionalmente a los activadores convencionales de blanqueamiento o en su lugar, pueden contenerse también los así llamados catalizadores de blanqueamiento. Estas sustancias son sales de metales de transición o complejos de metales de transición que refuerzan el blanqueamiento tales como, por ejemplo, complejos "salene" o complejos carbonilo de Mn, Fe, Co, Ru o Mo. También son adecuados como catalizadores de blanqueo los complejos de Mn, Fe, Co, Ru, Mo, Ti, V y Cu con ligandos trípode que contienen N así como complejos amino de Co, Fe, Cu y Ru, empleándose preferiblemente los compuestos que se describen en la DE 19709284 A1.

Los detergentes o limpiadores según la invención por regla contienen uno o más armadores (builder), en particular zeolitas, silicatos, carbonatos, co-armadores orgánicos y - cuando no haya razones ecológicas que hablen en contra de su uso - también los fosfatos. Estos últimos son armadores preferibles de usarse en limpiadores para el lavado de platos.

Pueden mencionarse aquí silicatos de sodio cristalinos laminados de la fórmula general NaMSi_{x}O_{2x+1}\cdotyH_{2}O, donde M es sodio o hidrógeno, x es un número de 1,6 a 4, preferiblemente 1,9 hasta 4,0 e y es un número de 0 a 20 y los valores preferidos para x son 2, 3 ó 4. Silicatos laminados cristalinos de ese tipo se describen por ejemplo en la solicitud europea de patente EP 164514. Los silicatos laminados cristalinos preferidos de la fórmula indicada son aquellos en los que M es sodio y x asume los valores 2 ó 3. En particular, tanto los disilicatos \beta- como \delta-sódico Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O se prefieren. En el comercio se encuentran compuestos de este tipo, por ejemplo, bajo el nombre SKS® (empresa Clariant). Así, SKS-6® es principalmente un \delta-sodio disilicato con la fórmula Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, en el caso de SKS-7®, éste es principalmente el \beta-sodio disilicato. Mediante reacción con ácidos (por ejemplo ácido cítrico o ácido carbónico) se forma kanemita a partir de \delta-sodio disilicato NaHSi_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, comercialmente bajo las denominaciones SKS-9® o SKS-10® (empresa Clariant). Puede ser ventajoso también emplear modificaciones químicas de estos silicatos laminados. Por ejemplo la alcalinidad de los silicatos laminados puede influenciarse de manera adecuada. En comparación con el \delta-sodio disilicato los silicatos laminados modificados con fosfato o con carbonato tienen morfologías cristalinas modificadas, se disuelven más rápidamente y en comparación con \delta-sodio disilicato muestran una potencia incrementada de enlace de calcio. Así, en la solicitud de patente DE 196 01 063 los silicatos laminados de la fórmula general empírica x Na_{2}O \cdot ySiO_{2} \cdot z P_{2}O_{5}, en la cual la relación entre x e y corresponde a un número desde 1,75 a 1200 y la relación entre y y z corresponde a un número desde 4 hasta 2800. La solubilidad de los silicatos laminados puede incrementarse empleando particularmente silicatos laminados finamente divididos. También pueden emplearse composiciones de los silicatos laminados cristalinos con otros ingredientes. Aquí en particular pueden mencionarse composiciones con derivados de celulosa que tienen ventajas en la acción desintegrante y se emplean en particular en tabletas de detergentes, y composiciones con policarboxilatos, por ejemplo copolímeros de ácido acrílico.

También son empleables los silicatos de sodio amorfos que tienen un módulo de Na_{2}O : SiO_{2} de 1:2 hasta 1:3,3, preferiblemente desde 1:2 hasta 1:2,8 y particularmente de 1:2 hasta 1:2,6, los cuales se disuelven con retardo y tienen propiedades de lavado secundarios. El retardo en la solución comparado con los silicatos de sodio amorfos convencionales puede haberse producido de diversas maneras, por ejemplo mediante tratamiento de superficie, formación de composiciones, compactación/compresión o mediante sobre-secado. En el marco de esta invención, por el término "amorfo" se entiende también como "amorfo en rayos X". Esto significa que en los experimentos de difracción de rayos X los silicatos no producen ninguna reflexión aguda de rayos X, como es típico para sustancias cristalinas, sino a lo sumo uno o más máximos de la radiación dispersa de rayos X, los cuales tienen una amplitud de un número de unidades de grado del ángulo de difracción. Sin embargo, puede ser muy probable que se llegue incluso a propiedades armadoras particularmente buenas si las partículas de silicato en experimentos de difracción electrónica producen máximos de difracción indistintos o incluso agudos. Esto se debe interpretar de tal manera que los productos tienen regiones microcristalinas del tamaño de 10 a unos cuantos cientos de nm, prefiriéndose valores de a lo sumo 50 nm y en particular a lo sumo 20 nm. En particular, se prefieren los silicatos amorfos comprimidos/compactados, silicatos amorfos en composiciones y silicatos amorfos en rayos X sobresecos.

Una zeolita que contiene agua enlazada, sintética, cristalina fina, opcionalmente empleable es zeolita A y/o P. Como zeolita P, se prefiere particularmente zeolita MAP® (producto comercial de la empresa Crosfield). Sin embargo, la zeolita X y las mezclas de A, X y/o P también son adecuadas. También obtenibles comercialmente y en el marco de la presente invención, preferiblemente empleable es, por ejemplo, un co-cristalizado de zeolita X y zeolita A (cerca de 80% en peso de zeolita X), la cual se comercializa por la empresa CONDEA Augusta S.p.A. bajo el nombre comercial VEGOBOND AX® y puede describirse por la fórmula

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las zeolitas adecuadas tienen un tamaño promedio de partícula de menos de 10 \mum (distribución de volumen; métodos de medición: contador Coulter) y contiene preferiblemente 18 a 22% en peso, en particular 20 a 22% en peso de agua enlazada.

Obviamente, el uso de los fosfatos generalmente conocidos como sustancias armadoras (builder) también es posible, siempre y cuando no deba evitarse un uso de este tipo por razones ecológicas. Entre el gran número de fosfatos obtenibles comercialmente, los fosfatos de metal alcalino, con particular preferencia de trifosfato pentasódico o pentapotáisco (tripolifosfato de sodio o potasio), tienen la mayor importancia en la industria de detergentes y limpiadores.

Fosfatos de metal alcalino es en este caso la denominación resumida para las sales de metal alcalino (en particular sodio y potasio) de diversos ácidos fosfóricos, en los cuales puede hacerse una distinción entre ácidos metafosfóricos (HPO_{3})_{n} y ácidos ortofosfóricos H_{3}PO_{4} además de los representantes de mayor peso molecular. Los fosfatos combinan aquí un número de ventajas en sí mismos: actúan como vehículos alcalinos, previenen los depósitos de limo en las partes de la máquina o incrustaciones de lino en telas y además contribuyen al desempeño de limpieza.

El dihidrofosfato de sodio, NaH_{2}PO_{4}, existe como dihidrato (densidad 1,91 gcm^{-3}, punto de fusión 60º) y como monohidrato (densidad 2,04 gcm^{-3}). Ambas sales son polvos blancos muy fácilmente solubles en agua los cuales al calentar pierden el agua de cristalización y a 200ºC se convierten en el difosfato débilmente ácido (hidrodifosfato de sodio, Na_{2}H_{2}P_{2}O_{7}), a una temperatura más alta en trimetafosfato de sodio (Na_{3}P_{3}O_{9}) y sal de Maddrell (ver abajo). NaH_{2}PO_{4} tienen una reacción ácida; se forma cuando el ácido fosfórico se ajusta con solución de hidróxido de sodio a un pH de 4,5 y se asperge la mezcla. El dihidrofosfato de potasio (fosfato de potasio primario o monobásico, bifosfato de potasio, KDP, por sus siglas en inglés), KH_{2}PO_{4}, es una sal blanca de densidad 2,33 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 253ºC [descomposición con formación de polifosfato de potasio (KPO_{3})_{x}] y es fácilmente soluble en agua.

Hidrofosfato disódico (fosfato de sodio secundario), Na_{2}HPO_{4}, es unas sal cristalina incolora, muy fácilmente soluble en agua. Existe en forma anhidra y con 2 moles (Densidad 2,066 gcm^{-3}, pérdida de agua a 95º), 7 moles (densidad 1,68 gcm^{-3}, punto de fusión 48ºC con una pérdida de 5 H_{2}O) y 12 moles de agua (densidad 1,52 gcm^{-3}, punto de fusión 35ºC con una pérdida de 5 H_{2}O) se vuelve anhidra a 100ºC y se convierte en el difosfato Na_{4}P_{2}O_{7} calentándolo fuerte. El hidrofosfato disódico se prepara mediante neutralización de ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio usando fenolftaleína como un indicador. El hidrofosfato dipotásico (fosfato de potasio secundario o dibásico), K_{2}HPO_{4}, es una sal blanca amorfa que es fácilmente soluble en agua.

El fosfato trisódico, fosfato de sodio terciario, Na_{3}PO_{4}, son cristales incoloros que como dodecahidratos tienen una densidad de 1,62 gcm^{-3} y un punto de fusión 73-76ºC (descomposición), como decahidrato (que corresponde a 19-20% P_{2}O_{5}) tiene un punto de fusión de 100ºC y en forma anhidra (que corresponde a 39-40% P_{2}O_{5}) tiene una densidad de 2,536 gcm^{-3}. El fosfato trisódico es fácilmente soluble en agua con una reacción alcalina y se prepara evaporando una solución de exactamente 1 mol de fosfato disódico y 1 mol de NaOH. El fosfato tripotásico (fosfato de potasio terciario o tribásico), K_{3}PO_{4}, es un polvo blanco, delicuescente, granulado de densidad 2,56 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 1340º y es fácilmente soluble en agua con una reacción alcalina. Se forma, por ejemplo, al calentar escoria de Thomas con carbón y sulfato de potasio. A pesar del precio relativamente alto, en la industria de limpiadores se prefieren ampliamente los fosfatos de potasio más fácilmente solubles, por lo tanto altamente activos, en comparación con los compuestos correspondientes de sodio.

El difosfato tetrasódico (pirofosfato de sodio), Na_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma anhidra (densidad 2,534 gcm^{-3}, punto de fusión 988ºC, también indicado como 880ºC) y como decahidrato (densidad 1,815-1,836 gcm^{-3}, punto de fusión 94ºC con pérdida de agua). Ambas sustancias son cristales incoloros solubles en agua con una reacción alcalina. Na_{4}P_{2}O_{7} se forma al calentar fosfato disódico hasta >200ºC o haciendo reaccionar ácido fosfórico con carbonato de sodio en la proporción estequiométrica y deshidratando la solución mediante aspersión. Los decahidratos acomplejan sales de metal pesado y a los formadores de dureza y por lo tanto disminuye la dureza del agua. El difosfato de potasio (pirofosfato de potasio), K_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma del trihidrato y es un polvo incoloro, higroscópico que tiene la densidad 2,33 gcm^{-3}, el cual es soluble en agua, el pH de la solución al 1% de fuerza es de 10,4 a 25ºC.

Por medio de condensación de NaH_{2}PO_{4} o bien de KH_{2}PO_{4} se forman fosfatos de sodio y potasio de alto peso molecular, en los cuales pueden diferenciarse los representantes cíclicos, los metafosfatos de sodio o potasio y los tipos en forma de cadena, los polifosfatos de sodio o potasio. En particular para los últimos está en uso un largo número de denominaciones: fosfatos fundibles o calcinados, sal de Gram., sal de Kurrol y sal de Maddrekk. Todos los fosfatos mayores de sodio y potasio se denominan juntos como fosfatos condensados.

El trifosfato pentasódico industrialmente importante (Na_{5}P_{3}O_{10}; tripolifosfato de sodio) es una sal anhidra o que cristaliza con 6 H_{2}O, no higroscópica, blanca, soluble en agua de la fórmula general NaO-[P(O)(ONa)-O]_{n}-Na donde n=3. En 100 g de agua se disuelven aproximadamente 17 g, a 60ºC cerca de 20 g, a 100ºC alrededor de 32 g de la sal libre de agua de cristalización; después de calentar por dos horas la solución a 100ºC se forman por hidrólisis alrededor de 8% de ortofosfato y 15% de difosfato. En la preparación de trifosfato pentasódico, el ácido fosfórico reacciona con solución de carbonato de sodio o solución de hidróxido de sodio en una relación estequiométrica y la solución se deshidrata mediante aspersión. De manera similar a la sal de Gram. y al difosfato de sodio, el trifosfato pentasódico disuelve muchos compuestos metálicos insolubles (jabones de limo, etc.). El trifosfato pentapotásico, K_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato de potasio), se comercializa, por ejemplo, en forma de una solución al 50% en peso (> 23% P_{2}O_{5}, 25% K_{2}O). Los polifosfatos de potasio se usan ampliamente en la industria de detergentes y limpiadores. Además, también existen tripolifosfatos de sodio potasio que también son empleables en el marco de la presente invención. Estos se forman, por ejemplo, cuando se hidroliza trimetafosfato de sodio usando KOH:

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Estos son empleables según la invención precisamente como tripolifosfato de sodio, tripolifosfato de potasio o mezclas de estos dos; mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de potasio sodio o mezclas de tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio potasio o mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio potasio también son empleables según la invención.

Los co-armadores que pueden emplearse en los detergentes y limpiadores según la invención son en particular policarboxilatos o ácidos policarboxílicos, policarboxilatos poliméricos, ácido poliaspártico, poliacetales, opcionalmente dextrinas oxidadas, otros co-armadores orgánicos (ver abajo) así como fosfonatos. Estas clases de sustancias se describen abajo.

Sustancias armadoras orgánicas que pueden usarse son, por ejemplo, los ácidos policarboxílicos empleables en forma de sus sales de sodio, entendiéndose por ácidos policarboxílicos aquellos ácidos carboxílicos que llevan más de una función ácida.

Por ejemplo, estos son ácido cítrico, ácido adipínico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácidos de azúcar, ácidos aminocarboxílicos, ácido nitrilotriacético (NTA), siempre que un uso de este tipo deba ser evitado por razones ecológicas, y mezclas de éstos. Las sales preferidas son sales de los ácidos policarboxílicos tales como ácido cítrico, ácido adipínico, ácido succínico, ácido glutámico, ácido tartárico, ácidos de azúcar y mezclas de éstos.

Los ácidos de por sí también pueden usarse. Adicionalmente a su acción armadora, típicamente tienen también la propiedad de un componente de acidificación y así también sirven para establecer un pH relativamente bajo y relativamente suave de detergentes o limpiadores, siempre que el pH resultante no se desee debido a la mezcla de otros componentes. En particular, aquí pueden mencionarse los ácidos tolerables al sistema y al medio ambiente tales como ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido málico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido glutámico, ácido adipínico, ácido glucónico y cualesquiera mezclas deseadas de éstos. Sin embargo, los ácidos minerales, en particular ácido sulfúrico o bases, en particular hidróxidos de amonio o de metales alcalinos también pueden servir como reguladores de pH. Los reguladores de este tipo están contenidos en las composiciones según la invención en cantidades de preferiblemente no más de 20% en peso, particularmente de 1,2% en peso hasta 17% en peso.

Como armadores, son adecuados otros policarboxilatos poliméricos; estos son, por ejemplo, las sales de metal alcalino de ácido poliacrílico o de ácido polimetacrílico, por ejemplo los que tienen una masa molecular relativa de 500 hasta 70 000 g/mol.

En el sentido de esta publicación, las masas molares indicadas para policarboxilatos poliméricos son masas molares de peso promedio Mw de la forma respectiva de ácido, que fueron determinadas básicamente por medio de cromatografía de permeación de gel (GPC, por sus siglas en inglés), usándose un detector de UV. La medición se llevó a cabo frente a un estándar externo de ácido poliacrílico que debido a su relación estructural con los polímeros investigados arroja valores de peso molecular reales. Estos datos difieren distintivamente de los datos de peso molecular en los que se emplean ácidos poliestirenosulfónicos en calidad de estándar. Las masas molares mediadas frente a ácidos poliestirenosulfónicos son por regla distintivamente más altas que las masas molares indicadas en esta
divulgación.

Polímeros adecuados son en particular poliacrilatos que tienen preferiblemente una masa molecular de 2 000 a 20 000 g/mol. Debido a su solubilidad superior, de este grupo, a su vez, pueden preferirse los poliacrilatos de cadena corta que tienen masas molares de 2 000 hasta 10 000 g/mol, y particularmente preferible de 3 000 hasta 5 000 g/mol.

Además, son adecuados policarboxilatos copolímericos, en particular aquellos de ácido acrílico con ácido metacrílico y ácido acrílico o ácido metacrílico con ácido maleico. Los copolímeros de ácido acrílico con ácido maleico han probado ser particularmente adecuados, los cuales contienen 50 hasta 90% en peso de ácido acrílico y 50 hasta 10% en peso de ácido maleico. Su masa molecular relativa, basada en ácidos libres, es en general de 2 000 hasta 70 000 g/mol, preferiblemente 20 000 hasta 50 000 g/mol y particularmente 30 000 hasta 40 000 g/mol. Los policarboxilatos (co-) poliméricos pueden emplearse ya sea como un polvo o como una solución acuosa. El contenido de policarboxilatos (co-)poliméricos en las composiciones puede ser de 0,5 hasta 20% en peso, particularmente 1 hasta 10% en peso.

Para el mejoramiento de la solubilidad en agua, los polímeros pueden contener también ácidos alilsulfónicos, tales como, por ejemplo, ácido aliloxibencenosulfónico y ácido metalilsulfónico, en calidad de monómeros.

Particularmente se prefieren polímeros biodegradables de más de dos unidades monoméricas diferentes, por ejemplo aquellas que como monómeros contienen sales de ácido acrílico y de ácido maleico y alcohol vinílico o derivados de alcohol vinílico o los cuales como monómeros contienen sales de ácido acrílico y ácido 2-alquilalilsulfónico y derivados de azúcar.

Otros copolímeros preferidos son aquellos que en calidad de monómeros contienen preferiblemente acroleína y ácido acrílico/sales de ácido acrílico o acroleína y acetato de vinilo.

Así mismo, otras sustancias armadoras preferidas que pueden mencionarse son ácidos aminodicarboxílicos poliméricos, sus sales o sus sustancias precursoras. Los ácidos poliaspárticos y sus sales y derivados son particularmente preferidos.

Otras sustancias armadoras adecuadas son poliacetales que pueden obtenerse mediante reacción de dialdehídos con ácidos poliolcarboxílicos que tienen 5 a 7 átomos de C y al menos 3 grupos hidroxilo. Los poliacetales preferidos se obtienen a partir de dialdehídos tales como glioxal, glutaraldehído, tereftalaldehído y sus mezclas y a partir de ácidos poliolcarboxílicos tales como ácido glucónico y/o ácido glucoheptónico.

Otras sustancias armadoras orgánicas adecuadas son dextrinas, por ejemplo oligómeros y polímeros de carbohidratos que pueden obtenerse mediante hidrólisis parcial de almidones. La hidrólisis puede realizarse según métodos habituales, por ejemplo métodos de catálisis ácida o enzimática. Preferiblemente, son productos de hidrólisis que tienen masas molares promedio en el rango de 400 a 500 000 g/mol. Aquí se prefiere un polisacárido que tiene un equivalente de dextrosa (DE) en el rango de 0,5 a 40, en particular de 2 a 30, siendo DE una mediad habitual de la acción reductora de un polisacárido en comparación con la dextrosa, que tiene un DE de 100. Son usables ambas maltodextrinas que tienen un DE entre 3 y 20 y jarabes de glucosa seca que tienen un DE entre 20 y 37 y también "dextrinas amarillas" y "dextrinas blancas" que tienen masas molares relativamente altas en el rango de 2000 a 30 000 g/mol.

Los derivados oxidados de dextrinas de este tipo son sus productos de reacción con oxidantes capaces de oxidar al menos una función de alcohol del anillo sacárido para formar la función de ácido carboxílico. Los armadores orgánicos particularmente preferidos para las composiciones según la invención son almidones oxidados o sus derivados a partir de las solicitudes EP 472042, WO 97/25399, y EP 755944.

Los oxidisuccinatos y otros derivados de disuccinatos, preferiblemente disuccinato de etilendiamina, también son otros armadores adecuados. Aquí se usa preferiblemente etilendiamina-N,N'-disuccinato (EDDS) en forma de sus sales de sodio o magnesio. Además, a este respecto también se prefieren disuccinatos de glicerina y trisuccinatos de glicerina. Las cantidades de uso adecuadas en las formulaciones que contienen zeolita, carbonato y/o silicato se encuentran entre 3 y 15% en peso.

Otros co-armadores orgánicos usables son, por ejemplo, ácidos hidrocarboxílicos acetilados y sus sales, los cuales pueden también estar presentes opcionalmente en forma de lactona y que contienen al menos 4 átomos de carbono y al menos un grupo hidroxilo y también a lo sumo dos grupos ácidos.

Otra clase de sustancia con propiedades de co-armador son los fosfonatos. Estos son en particular fosfonatos de hidroxialcano o aminoalcano. Entre los fosfonatos de hidroxialcano, el 1-hidroxietan-1,1-difosfonato (HEDP) es de particular importancia como co-armador. Se emplea preferiblemente como la sal de sodio, la sal disódica que tiene una reacción neutra y la sal tetrasódica en reacción alcalina (pH 9).Los fosfonatos de aminoalcano adecuados son preferiblemente etilendiamintetrametilenfosfonato (EDTMP), dietilentriaminpentametilenfosfonato (DTPMP) y sus homólogos superiores. Preferiblemente se emplean en forma de sales de sodio que reaccionan neutralmente, por ejemplo como la sal hexasódica de EDTMP o como la sal hepta- y octasódica de DTPMP. Como un armador, d la clase de los fosfonatos aquí se usa preferiblemente HEDP. Los fosfonatos de aminoalcano además tienen un marcado poder de enlace de metal pesado. Por consiguiente, en particular si las composiciones también contienen blanqueador, puede preferirse usar fosfonatos de aminoalcano, en particular DTPMP, o mezclas de dichos
fosfonatos.

Además, todos los compuestos capaces de formar complejos con iones de metales alcalinos pueden emplearse como co-armadores.

Las sustancias armadoras pueden estar presentes opcionalmente en los detergentes o limpiadores según la invención en cantidades de hasta 90% en peso. Preferiblemente están presentes en cantidades de hasta 75% en peso. Los detergentes de la invención tienen contenidos de armador de, en particular, 5% en peso hasta 50% en peso. En composiciones de la invención para limpiar superficies duras, en particular para la limpieza mecánica de platos, el contenido de sustancias armadoras es en particular de 5% en peso a 88% en peso, preferiblemente sin emplear materiales armadores insolubles en agua en composiciones de este tipo. En una realización preferida de composiciones según la invención para, en particular, limpieza mecánica de platos, están presentes 20% en peso hasta 40% en peso de armador orgánico insoluble en agua, particularmente de citrato de metal alcalino, 5% en peso hasta 15% en peso de carbonato de metal alcalino y 20% en peso hasta 40% en peso de disilicato de metal alcalino.

Los solventes que pueden emplearse en las composiciones líquidas a gelatinosas de detergentes y limpiadores se originan, por ejemplo, del grupo consistente de alcoholes mono- y polihídricos, alcanolaminas o éteres glicólicos, siempre que sean miscibles con agua en el rango de concentraciones indicado. Preferiblemente, los solventes se seleccionan de etanol, n- o i-propanol, butanoles, etilenglicolmetileter, etilenglicoletileter, etilenglicolpropileter, etilenglicolmono-n-butileter, dietilenglicol-metileter, dietilenglicoletileter, propilenglicolmetil-, -etil- o -propil-eter, dipropilenglicolmonometil-, o -etileter, di-isopropilenglicolmonometil-, o -etileter, metoxi-, etoxi- o butoxitriglicol, 1-butoxietoxi-2-propanol, 3-metil-3-metoxibutanol, propilen-glicol-t-butileter y mezclas de estos solventes.

Los solventes pueden emplearse en los detergentes líquidos a gelatinosos según la invención en cantidades entre 0,1 y 20% en peso, pero preferiblemente por debajo de 15% en peso y en particular debajo de 10% en peso.

Para ajustar la viscosidad pueden adicionarse uno o más espesantes o sistemas espesantes a la composición de la invención. Estas sustancias de alto peso molecular que también se llaman agentes hinchantes, usualmente absorben los líquidos y se hinchan allí para finalmente volverse soluciones viscosas verdaderas o coloidales.

Espesantes adecuados son compuestos inorgánicos o poliméricos orgánicos. Los espesantes inorgánicos incluyen, por ejemplo, ácidos polisilícicos, minerales de arcilla tales como montmorilonita, zeolita, sílices y bentonitas. Los espesantes orgánicos se originan de los grupos consistentes en polímeros naturales, de los polímeros modificados naturalmente y de los polímeros totalmente sintéticos. Tales polímeros que se originan de la naturaleza son por ejemplo agar-agar, carrageno, tragacanto, goma arábica, alginato, pectina, poliosas, harina de guar, harina de algarrobo, almidones, dextrinas, gelatina y caseína. Sustancias naturales modificadas que se usan como espesantes se originan especialmente del grupo consistente en los almidones modificados y las celulosas modificadas. A manera de ejemplo pueden mencionarse aquí carboximetilcelulosa y otros éteres de celulosa, hidroxietil- y -propilcelulosa y éteres de harina de pepita. Espesantes totalmente sintéticos son polímeros tales como composiciones poliacrílicas y polimetacrílicas, polímeros de vinilo, ácidos policarboxílicos, oliéteres, poliiminas, poliamidas y poliuretanos.

Los espesantes pueden estar presentes en una cantidad de hasta 5% en peso, preferiblemente de 0,05 hasta 2% en peso, y particularmente preferible de 0,1 hasta 1,5% en peso, con respecto a la composición preparada.

El detergente y limpiador según la invención pueden opcionalmente contener como otros ingredientes habituales a agentes secuestrantes, electrolitos y otros auxiliares, tales como abrillantadores ópticos, inhibidores de agrisamiento, inhibidores de corrosión de la plata, inhibidores de transferencias de color, inhibidores de espuma, abrasivos, colorantes y/o aromas, y compuestos microbialmente activos, absorbentes UV y/o estabilizadores de enzimas.

Los detergentes para textiles de la invención pueden contener como abrillantadores ópticos a los derivados de ácido diaminoestilbendisulfónico o sus sales de metal alcalino. Por ejemplo son adecuadas las sales de 4,4'-bis(2-anilino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)estilben-2,2'-disulfónico o compuestos sintetizados similarmente, los cuales en vez de un grupo morfolino llevan un grupo dietanolamina, un grupo metilamino, un grupo anilino o un grupo 2-metoxietilamino. Además, pueden estar presentes los abrillantadores del tipo consistente en difenilestirilos sustituidos, Por ejemplo las sales de metal alcalino de 4,4'-bis(2-sulfoestiril)-difenilos, 4,4'-bis(4-cloro-3-sulfoestiril)-difenilos, o 4-(4-cloroestiril)-4'-(2-sulfoestiril)-difenilos. También pueden usarse mezclas de los abrillantadores ópticos arriba mencionados.

Los inhibidores de agrisamiento tiene el objetivo de mantener la mugre arrancada de las fibras textiles suspendidas en el líquido de lavado. Para esto, son adecuados coloides solubles en agua, usualmente de naturaleza orgánica como, por ejemplo, almidón, cola, gelatina, sales de éteres de ácidos carboxílicos o éteres de ácidos sulfónicos de almidón o de celulosa o sales de ésteres ácidos de ácido sulfúrico de celulosa o de almidón. Poliamidas solubles en agua que contienen grupos ácidos también son adecuadas para este propósito. Además, pueden usarse otros derivados diferentes de los derivados de almidón arriba mencionados, por ejemplo almidones aldehído. Preferiblemente, se usan éteres de celulosa tales como carboxiimetilcelulosa (sal de Na) metilcelulosa, hidroxialquilcelulosa y éteres mezclados, como metilhidroxietilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y sus mezclas, por ejemplo en cantidades de 0,1 hasta 5% en peso, con respecto a la composición.

Para ejercer una protección frente a la corrosión de la plata pueden emplearse inhibidores de corrosión de plata en los limpiadores para los platos de la invención. Tales inhibidores se conocen del estado del arte, por ejemplo, benzotriazoles, cloruro de hierro (III) o CoSO_{4}. Tal como se conoce, por ejemplo, de la publicación europea de patente EP 0 736 084 B1, los inhibidores de corrosión de plata particularmente adecuados para uso conjunto con enzimas son sales y/o complejos de manganeso, titanio, circonio, hafnio, vanadio, cobalto o cerio, en los cuales dichos metales se presentan en uno de los estados de oxidación II, III, IV, V o VI. Ejemplos de compuestos de este tipo son MnSO_{4}, V_{2}O_{5}, V_{2}O_{4}, VO_{2},TiOSO_{4}, K_{2}TiF_{6}, K_{2}ZrF_{6}, Co(NO_{3})_{2}, Co(NO_{3})_{3}, y sus mezclas.

Los compuestos activos de "soil-release" (liberación de mugre) o "soil-repellents" (repelentes de mugre) son usualmente polímeros que al usar en un detergente imparten propiedades repelentes de mugre para lavar fibras y/o ayudar al poder de retirar la mugre que tienen otros ingredientes del detergente. Un efecto comparable puede observarse también en su uso en limpiadores para superficies duras.

Compuestos activos de liberación de mugre que son particularmente efectivos y se han conocido por un largo tiempo son copoliésteres con ácido dicarboxílico, glicol de alquileno y unidades de glicol de polialquileno. Ejemplos de éstos son copolímeros o polímeros mezclados de polietilentereftalato y polioxietilenglicol (DT 16 17 141, o bien DT 22 00 911). En la publicación alemana DT 22 53 063 se mencionan composiciones ácidas que entre otros contienen un copolímero de un ácido dicarboxílico dibásico y un poliglicol de alquileno o cicloalquileno. Los polímeros de etilentereftalato y polietilenoxid-tereftalato y su uso en los detergentes se describen en las publicaciones alemanas DE 28 57 292 y DE 33 24 258 y la publicación de patente europea EP 0 253 567. La patente europea EP 066 944 se refiere a composiciones que contienen un poliéster de glicol de etileno, glicol de polietileno, ácido dicarboxílico aromático y ácido dicarboxílico aromático sulfonado en proporciones molares específicas. A partir de la patente europea EP 0 185 427 se conocen poliésteres con grupo extremo metilo o etilo con tereftalato de etileno y/o propileno y unidades de terefatalato de polietilenóxido y detergentes que contienen polímeros liberadores de mugre de este tipo. La patente europea EP 0 241 984 se refiere a un poliéster que, además de los grupos de oxietileno y las unidades de ácido tereftálico, contiene también unidades de etileno sustituido y unidades de glicerina. De la patente europea EP 0 241 985 se conocen poliésteres que además de los grupos de oxietileno y las unidades de ácido tereftálicos, contienen grupos 1,2-propileno, 1,2-butileno y/o 3-metoxi-1,2-propileno y unidades de glicerina se cierran con grupos extremos alquilo de C_{1}-C_{4}. De la solicitud de patente europea EP 0 272 033 se conocen poliésteres cerrados con grupos extremos, al menos parcialmente, de alquilo C_{1-4} o radicales acilo con unidades de tereftalato de propileno y tereftalato de polioxietileno. La patente europea EP 0 274 907 describe poliésteres liberadores de mugre que contienen tereftalato con grupos extremos de cierre sulfoetilo. Según la solicitud europea de patente EP 0 357 280 se preparan poliésteres de liberación de mugre que tienen tereftalato, glicol de alquileno y unidades de glicol de C_{2-4} mediante sulfonación de grupos extremos insaturados. La solicitud internacional de patente WO 95/32232 se refiere a poliésteres ácidos aromáticos que promueven el retiro de mugre. De la solicitud internacional de patente WO 97/31085 se conocen compuestos activos no poliméricos repelentes de mugre para materiales hechos de algodón y los cuales tienen un número de unidades funcionales: una primera unidad que, por ejemplo, puede ser catiónica, es capaz de adsorción sobre la superficie de algodón mediante interacción electroestática, y una segunda unidad que es de un diseño hidrofóbico, es responsable por que el compuesto activo se mantenga en la interfaz agua/algodón.

Los inhibidores de transferencia de color adecuados para usar en detergentes de textiles según la invención en particular incluyen polivinilpirrolidona, polivinilimidazol, N-óxidos poliméricos como poli-(vinilpiridin-N-óxido) y copolímeros de vinilpirrolidona con vinilimidazol.

Al usar en métodos de limpieza mecánica puede ser ventajoso adicionar inhibidores de espuma a las composiciones de interés. Inhibidores de espuma adecuados son, por ejemplo, jabones de origen natural o sintético, que tienen un alto contenido de ácidos grasos de C_{18}-C_{24}. Los inhibidores de espuma tipo no surfactantes adecuados son, por ejemplo, organopolisiloxanos y sus mezclas con ácido silícico microfino, opcionalmente silanizado y parafinas, ceras, ceras microcristalinas y sus mezclas con ácido silícico silanizado o bisesteariletilendiamida. Las mezclas de diversos inhibidores de espuma también se usan ventajosamente, por ejemplo aquellos que consisten en siliconas, parafinas o ceras. Preferiblemente, los inhibidores de espuma, en particular inhibidores de espuma que contienen silicona y/o parafina, están enlazados a una sustancia vehículo granulada soluble en agua o capaz de dispersarse en agua. En particular se prefieren mezclas de parafinas y bisesteariletilendiamidas.

Un limpiador para superficie duras según la invención puede contener además componentes que tienen acción abrasiva, en particular del grupo que comprende polvo de cuarzo, aserrín, polvo plástico, tiza y microesferas de vidrio. Los abrasivos están presentes en los limpiadores según la invención preferiblemente en no más del 20% en peso, en particular de 5% en peso hasta 15% en peso.

Los colorantes y fragancias se adicionan a detergentes y limpiadores para mejorar la impresión estética de los productos y para proporcionar al consumidor, además del desempeño de lavado y limpieza, un producto visualmente y sensorialmente "típico e impecable". Los aceites de perfume y fragancias que pueden usarse son erotizantes individuales, por ejemplo los productos sintéticos del tipo que consiste en los ésteres, éteres, aldehídos, cetonas, alcoholes e hidrocarburos. Los odorizantes que consisten en el grupo de ésteres son, por ejemplo, acetato de benzilo, isobutirato de fenoxietilo, acetato de p-terc.-butilciclohexilo, acetato de linalilo, acetato de dimetilbenzil-carbinilo, acetato de feniletilo, benzoato de linalilo, formiato de benzilo, glicinato de etilmetilfenilo, alilciclohexilpropionato, propionato de estiralilo y salicilato de benzilo. Los éteres incluyen el benziletiléter, los aldehídos incluyen por ejemplo los alcanales lineales con 8-18 átomos de C, citral, citronelal, citroneliloxiacetaldehído, ciclamenaldehído, hidroxicitronelal, lilial y bourgeonal, las cetonas incluyen por ejemplo las iononas, \alpha-isometilionona y metil-cedrilcetona, los alcoholes incluyen anetol, citronelol, eugenol, geraniol, linalool, feniletilalcohol y terpineol, los hidrocarburos incluyen principalmente los terpenos como limoneno y pineno. Preferiblemente, sin embargo, se usan mezclas de varios odorizantes, los cuales juntos producen una nota fragante agradable. Tales aceites de perfume pueden contener también odorizantes naturales, tales como los que son accesible de fuentes vegetales, por ejemplo pino, cítrico, jazmín, aceite de patchouli, rosa o ilang-ilang. Asimismo son adecuados el moscatel, el aceite de salvia, aceite de manzanilla, aceite de clavo, aceite de melisa, aceite de menta, aceite de hojas de canela, aceite de flores de tilo, aceite de enebrina, aceite de vetiver, aceite de olíbano, aceite de galbano y aceite de labdano así como aceite de flores de naranjo, neroliol, aceite de cáscaras de naranja y aceite de sándalo. Usualmente el contenido de los colorantes en detergentes y limpiadores se encuentra por debajo de 0,01% en peso, mientras que el de las fragancias puede constituir hasta 2% en peso de la formulación total.

Las fragancias pueden incorporarse directamente a los detergentes y limpiadores, pero puede ser ventajoso de aplicar las fragancias a vehículos que aumenten la adhesión del perfume al material por limpiarse y por medio de una liberación más lenta de fragancia proporcionan una fragancia duradera, en particular textiles tratados. Tales materiales vehículos que han probado ser adecuados son, por ejemplo, ciclodextrinas, pudiendo los complejos de ciclodextrina-perfumes recubrirse también adicionalmente con otros auxiliares. Otro vehículo preferido para fragancias es la zeolita X descrita, la cual también puede absorber fragancias en lugar de o en mezcla con surfactantes. Por lo tanto se prefieren los detergentes y limpiadores que contienen la zeolita X descrita y las fragancias que se adsorben preferiblemente al menos parcialmente sobre la zeolita.

Los colorantes preferidos cuya elección no causa dificultad alguna para la persona técnica en la materia tienen una gran estabilidad de almacenamiento e insensibilidad frente a otros ingredientes de las composiciones y frente a la luz y no tienen una sustantividad marcada con las fibras de textiles con el fin de no tinturarlas.

Para el control de microorganismos, los detergentes y limpiadores pueden contener compuestos activos antimicrobianos. Aquí se hace una distinción dependiendo del espectro y mecanismo de acción antimicrobiano, entre los bacteriostáticos y los bactericidas, fungistáticos y fungicidas, etc. Las sustancias importantes de estos grupos son, por ejemplo, cloruros de benzalconio, alquilarilsulfonatos, halogenofenoles y acetato de fenolmercurio. En el marco de las enseñanzas de acuerdo con la presente invención, los términos acción antimicrobiana y compuestos activo antimicrobiano tienen el significado estándar en la práctica, que se da, por ejemplo por K. H. Wallhäußer en "Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshigiene" [Práctica de esterilización, desinfección - conservación: identificación de microorganismos] (5. edición - Stuttgart; New York : Thieme, 1995) donde pueden emplearse todas las sustancias allí descritas que tienen acción antimicrobiana. Los compuestos activos antimicrobianos adecuados se seleccionan preferiblemente de los grupos que consisten de alcoholes, aminas, aldehídos, ácidos antimicrobianos o sus sales, ésteres de ácidos carboxílicos, amidas ácidas, fenoles, derivados de fenol, difenilos, difenilalcanos, derivados de urea, acetales y formales de oxígeno y nitrógeno, benzamidinas, isotiazolinas, derivados de ftalimida, derivados de piridina, compuestos antimicrobianos tensioactivos, guanidinas, compuestos antimicrobianos anfotéricos, quinolinas, 1,2-dibrom-2,4-dicianobutano, yodo-2-propil-butil-carbamato, yodo, yodoforos, compuestos peroxo, compuestos de halógeno y mezclas cualesquiera de los anteriores. El compuesto activo antimicrobiano puede seleccionarse aquí de etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butandiol, fenoxietanol, 1,2-propilenglicol, glicerina, ácido undecilenoico, ácido bencénico, ácido salicílico, ácido dihidracético, o-fenilfenol, N-metilmorfolinacetonitrilo (MMA), 2-benzil-4-clorfenol, 2,2'-metilen-bis-(6-brom-4-clorfenol), 4,4'-diclor-2'-hidroxidifeniléter (Diclosan), 2,4,4'-triclor-2'-hidroxidifeniléter (Triclosan), clorhexidina, N-(4-clorfenil)-N-(3,4-diclorfenil)-urea, N,N'-(1,10-decan-diildi-1-piridinil-4-iliden)-bis-(1-octanamin)-dihidrocloruro, N,N'-bis-(4-clorfenil)-3, 12-diimino-2,4,11, 13-tetraaza-tetradecandiimidamida, glucoprotaminas, compuestos antimicrobianos tensioactivos cuaternarios, guanidinas que incluyen las bi- y poliguanidinas, como por ejemplo 1,6-bis-(2-etilhexil-biguanido-hexan)-dihidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-fenildiguanido-N5,N5')-hexan-tetrahidocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-fenil-N1,N1-metildiguanido-N5,N5')-hexan-dihidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-o-clorofenildiguanido-N5,N5')-hexan-dihidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-2,6-diclorofenildiguanido-N5,N5')hexan-dihidrocloruro, 1,6-Di-[N1,N1'-beta-(p-methoxifenil)diguanido-N5,N5']-hexane-dihidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-alfa-metil-.beta.-fenildiguanido-N5,N5')-hexan-dihidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-p-nitrofenildiguanido-
N5,N5')hexan-dihidrocloruro, omega:omega-Di-(N1,N1'-fenildiguanido-N5,N5')-di-n-propileter-dihidrocloruro,
omega:omega'-di-(N1,N1'-p-clorofenildiguanido-N5,N5')-di-n-propileter-tetrahidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-2,4-
diclorofenildiguanido-N5,N5')hexan-tetrahidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-p-metilfenildiguanido-N5,N5')hexandihidro-
cloruro, 1,6-di-(N1,N1'-2,4,5-triclorofenildiguanido-N5,N5')hexan-tetrahidrocloruro, 1,6-di-[N1,N1'-alfa-(pclorofe-
nil)etildiguanido-N5,N5']hexan-dihidrocloruro, omega:omega-Di-(N1,N1'-p-clorofenildiguanido-N5,N5')m-xilen-
dihidrocloruro, 1,12-di-(N1,N1'-p-clorofenildiguanido-N5,N5')dodecan-dihidrocloruro, 1,10-di-(N1,N1'-fenildiguanido-N5,N5')-decan-tetrahidrocloruro, 1,12-di-(N1,N1'-fenildiguanido-N5,N5')dodecantetrahidrocloruro, 1,6-di-
(N1,N1'-o-clorofenildiguanido-N5,N5')hexan-dihidrocloruro, 1,6-di-(N1,N1'-o-clorofenildiguanido-N5,N5')hexan-tetrahidrocloruro, etilen-bis-(1-tolil biguanid), etilen-bis-(p-tolil biguanida), etilen-bis-(3,5-dimetilfenilbiguanida), etilen-bis-(p-terc-amilfenilbiguanida), etilen-bis-(nonilfenilbiguanida), etilen-bis-(fenilbiguanida), etilen-bis-(N-butilfenilbiguanida), etilen-bis (2,5-diethoxifenilbiguanida), etilen-bis (2,4-dimetilfenil biguanida), etilen-bis (o-difenilbiguanida), etilen-bis (amilnaftilbiguanida mixta), N-butil-etilen-bis-(fenilbiguanida), Trimetilen bis (o-tolilbiguanida), N-butil-trimetile-bis-(fenil biguanida) y las sales correspondientes como acetatos, gluconatos, hidrocloruros, hidrobromuros, citrates, bisulfitos, fluoruros, polimaleatos, N-cocoalquilsarcosinatos, fosfitos, hipofosfitos, perfluorooctanoatos, silicatos, sorbatos, salicilatos, maleatos, tartratos, fumaratos, etilendiamintetraacetatos, iminodiacetatos, cinnamatos, tiocianatos, arginatos, piromelitatos, tetracarboxibutiratos, benzoatos, glutaratos, monofluorfosfatos, perfluoropropionatos así como mezclas cualesquiera de los mismos. Además son adecuados los derivados halogenados de xileno y cresol, como p-clormetacresol o p-clormetaxileno, y compuestos activos naturales antimicrobianos de origen vegetal (por ejemplo de raíces y hierbas), de origen animal o microbiano. Preferiblemente pueden emplearse compuestos cuaternarios tensioactivos que tienen actividad antimicrobiana, un compuesto activo antimicrobiano natural de origen vegetal y/o un compuesto activo antimicrobiano de origen animal, extremadamente preferible al menos un compuesto activo antimicrobiano natural de origen vegetal del grupo que comprende cafeína, teobromina y teofilina y aceites etéricos como eugenol, timol y geraniol, y/o al menos un compuesto activo antimicrobiano natural de origen animal del grupo que comprende enzimas como albúmina de leche, lisozima y lactoperoxidasa, y/o al menos un compuesto cuaternario tensioactivo que tiene actividad antimicrobiana que contiene un grupo amonio, sulfonio, fosfonio, yodonio o arsonio, compuestos peroxo y compuestos de cloro. También pueden emplearse sustancias de origen microbiano, "bacteriocinas".

Los compuestos cuaternarios de amonio (QAC, por sus siglas en inglés) adecuados como compuestos activos antimicrobianos tienen la fórmula general (R1)(R2) (R3)(R4) N+ X-, en la cual R1 hasta R4 son radicales de alquilo de C_{1}-C_{22}, radicales aralquilo de C_{7}-C_{28} o radicales heterocíclicos, idénticos o diferentes, donde dos o, en el caso de una integración aromática como en piridina, incluso tres radicales juntos con el átomo de nitrógeno del heterociclo, por ejemplo un compuesto piridinio o imidazolio, y X- son iones haluro, iones sulfato, iones hidróxido o aniones similares. Para una acción antimicrobiana óptima, preferiblemente al menos uno de los radicales tiene una longitud de cadena de 8 hasta 18, en particular de 12 a 16, átomos de C.

QAC pueden prepararse mediante reacción de aminas terciarias con agentes de alquilación tales como, por ejemplo, cloruro de metilo, cloruro de benzilo, sulfato de dimetilo, dodecilbromuro, aunque también óxido de etileno. La alquilación de aminas terciarias que tienen un radical alquilo largo y dos grupos metilo es particularmente posible de manera fácil, y la cuaternización de aminas terciarias que tienen dos radicales largos y un grupo metilo pueden llevarse a cabo en condiciones suaves con la ayuda de cloruro de metilo. Las aminas que tienen tres radicales de alquilo largo o radicales de alquilo hidrosustituido son las menos reactivas y se cuaternizan preferiblemente usando sulfato de dimetilo.

Las QAC adecuadas son, por ejemplo, benzalconio cloruro (N-alquil-N,N-dimetil-benzil-amonio cloruro, CAS No. 8001-54-5), benzalcon B (m,p-diclorbenzil-dimetil-C12-alquilamonio cloruro, CAS No. 58390-78-6), benzoxonio cloruro (benzil-dodecil-bis-(2-hidroxietil)-amonio-cloruro), cetrimonio bromuro (N-hexadecil-N,N-trimetilamonio bromuro, CAS No. 57-09-0), benzetonio cloruro (N,N-dimetil-N-[2-[2-[p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenoxi]etoxi]etil]-benzilamonio cloruro, CAS No. 121-54-0), cloruro de dialquildimetilamonio como di-n-decildimetil-amonio cloruro (CAS No. 7173-51-5-5), didecildimetilamonio bromuro (CAS No. 2390-68-3), Dioctildimetil-amonio clórico, 1-cetilpiridinio cloruro (CAS No. 123-03-5) y tiazolinio yoduro (CAS No. 15764-48-1) y sus mezclas. QAC particularmente preferidas son los cloruros de benzalconio que tienen radicales de alquilo de C_{8}-C_{18}, en particular cloruro de alquilbenzil-dimetil-amonio de C_{12}-C_{14}.

Los haluros de benzalconio y/o haluros de benzalconio sustituidos están comercialmente disponibles como
Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex y Hiamine® ex Lonza, así como Bardac® ex Lonza. Otros compuestos activos antimicrobianos disponibles comercialmente son N-(3-cloralil)-hexaminio cloruro como Dowicide® y Dowicil® ex Dow, benzetonio cloruro como Hiamine® 1622 ex Rohm & Haas, metilbenzetonio cloruro como Hiamine® 10X ex Rohm & Haas, cetilpiridinio cloruro como Cepacolcloruro ex Merrell Labs.

Los compuestos activos antimicrobianos se emplean en cantidades de 0,0001% en peso hasta 1% en peso, preferible de 0,001% en peso hasta 0,8% en peso, particularmente preferible de 0,005% en peso hasta 0,3% en peso y particularmente de 0,01 hasta 0,2% en peso.

Los detergentes y limpiadores de la invención pueden contener absorbentes UV (UV- absorber) que se pegan a los textiles tratados y mejoran la resistencia a la luz de las fibras y/o la resistencia a la luz de otros componentes de la receta. Por absorbentes UV se entienden sustancias orgánicas (filtros de protección de luz) que son capaces de absorber rayos ultravioleta y emiten la energía absorbida de nuevo en la forma de radiación de onda más larga, por ejemplo calor.

Los compuestos que tienen estas propiedades deseadas son, por ejemplo, los compuestos y derivados de benzofenona que tienen sustituyentes en la 2- y/o 4- posición que son efectivos mediante desactivación sin radiación. Además, también son adecuados los benzotriazoles sustituidos, los acrilatos sustituidos con fenilo en la 3 posición (derivados de ácido cinámico, que opcionalmente tienen grupos ciano en la 2 posición), salicilatos, complejos orgánicos de Ni y sustancias naturales tales como umbeliferona y los ácidos endógenos urocánicos. Los derivados de bifenilo y especialmente de estilbeno tales como se describen, por ejemplo, en EP 0728749 A y obtenibles comercialmente como Tinosorb® FD o Tinosorb® FR ex Ciba, tienen particular importancia. Los siguientes pueden mencionarse como absorbentes UV-B: 3-benziliden alcánfor o 3-benzilidennoralcánfor y sus derivados, por ejemplo 3-(4-metilbenziliden)alcánfor, como se describe en la EP 0693471 B1; derivados de ácido 4-aminobenzoico, preferiblemente ácido 4-(dimetilamino)benzoico-2-etilhexiléster, ácido 4-(dimetilamino)benzoico-2-octiléster y ácido 4-(dimetilamino)benzoico amilester; ésteres del ácido cinámico, preferiblemente ácido 4-metoxicinámico-2-etilhexiléster, ácido 4-metoxicinámico propilester, ácido 4-metoxicinámico isoamilester,ácido 2-ciano-3,3-fenilcinámico-2-etilhexiléster (octocrileno); éster del ácido salicílico, preferiblemente ácido salicílico-2-etilhexiléster, ácido salicílico-4-isopropilbenziléster, ácido salicílicohomomentiléster; derivados de la benzofenona, preferiblemente 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, 2-hidroxi-4-metoxi-4'-metilbenzofenona, 2,2'-dihidroxi-4-metoxibenzofenona; ésteres de ácido benzalmalónico, preferiblemente ácido 4-metoxibenzo malónico di-2-etilhexilester; derivados de triazina, como por ejemplo 2,4,6-trianilino-(p-carbo-2'-etil-1'-hexiloxi)-1,3,5-triazina y triazona de octilo, como se describen en la EP 0818450 A1 o dioctil butamido triazona (Uvasorb® HEB); propan-1,3-diona, como, por ejemplo, 1-(4-terc.butilfenil)-3-(4'methoxifenil)propan-1,3-diona; derivados de cetotriciclo(5.2.1.0)decano, como se describe en la EP 0694521 B1. Además son adecuados el ácido 2-fenilbenzimidazol-5-sulfónico y sus sales de metal alcalino, alcalino térreo, amonio, alquilamonio, alcanolamonio y glucamonio; derivados de ácido sulfónico de benzofenonas, preferiblemente ácido de 2-hidroxi-4-metoxibenzofenon-5-sulfónico y sus sales; derivados de ácido sulfónico de 3-benzilidenalcánfor, como por ejemplo 4-(2-oxo-3-bornilidenmetil)bencenosulfónico y ácido 2-metil-5-(2-oxo-3-borniliden)sulfónico y sus sales.

Filtros UV-A típicos son, en particular, derivados de benzoilmetano, tales como, por ejemplo0, 1-(4'-terc.butilfe-
nil)-3-(4'-metoxifenil)propan-1,3-diona, 4-terc.-butil-4'-metoxidibenzoilmetano (Parsol 1789), 1-fenil-3-(4'-isopropilfenil)-propan-1,3-diona así como compuestos de enamina, como se describen en la DE 19712033 A1 (BASF). Los filtros UV-A y UV-B pueden obviamente emplearse en mezclas. Además de las sustancias solubles mencionadas, también son adecuados pigmentos insolubles de protección de luz, a saber óxidos metálicos finamente dispersos, nanoizados preferiblemente. Ejemplos de óxidos metálicos adecuados son en particular óxido de cinc y dióxido de titanio y óxidos de hierro, circonio, silicio, manganeso, aluminio y cerio y sus mezclas. Como sales, pueden emplearse silicatos (talco), sulfato de bario o estearato de cinc. Los óxidos y sales ya se usan en forma de pigmentos para emulsiones de cuidado para la piel y de protección de la piel y cosméticos decorativos. Las partículas en este caso tienen un diámetro promedio de menos de 100 nm, preferiblemente entre 5 y 50 nm y en particular entre 15 y 30 nm. Pueden tener forma esférica pero también pueden usarse aquellas partículas que tienen una forma elipsoidal o una forma que difiera de otras formas de la forma esférica. Los pigmentos también pueden estar presentes en forma de superficie tratada, es decir hidrofilizada o hidrofobizada. Ejemplos típicos son dióxidos de titanio revestidos, tales como, por ejemplo dióxido de titanio T 805 (Degussa) o Eusolex® T2000 (Merck; agentes de revestimiento hidrofóbicos adecuados para esto son preferiblemente siliconas y particularmente preferibles trialcoxioctilsilanos o simeticonas. Preferiblemente se usa óxido de cinc micronizado. Otros filtros protectores de luz UV adecuados pueden tomarse de la investigación de P. Finkel en SÖFW-Journal 122 (1996), p. 543.

Los absorbentes UV se emplean habitualmente en cantidades de 0,01% en peso hasta 5% en peso, preferiblemente de 0,03% en peso hasta 1% en peso.

Para aumentar el desempeño de lavado o de limpieza, las composiciones de la invención pueden contener otras enzimas, donde en principio pueden emplearse todas las enzimas establecidas para estos propósitos en el estado de la técnica. Estas incluyen, en particular, otras proteasas, amilasas, lipasas, hemicelulasas, celulasas u oxidoreductasas, y preferiblemente sus mezclas. Estas enzimas son en principio de origen natural; se encuentran disponibles variantes mejoradas empezando por las moléculas naturales, para uso en detergentes y limpiadores, que de manera correspondiente se emplean preferiblemente. Las composiciones de la invención contienen enzimas preferiblemente en cantidades totales de 1 x 10^{-8} hasta 5 por ciento de peso con respecto a la proteína activa.

Entre otras proteasas, se prefieren aquellas del tipo subtilisina. Ejemplos de éstas son las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB92, la subtilisina 147 y 309, las proteasas alcalinas de Bacillus lentus, subtilisina DY y las enzimas termitasa, proteinasa K y las proteasas TW3 y TW7 a ser asignadas a las subtilasas pero ya no a las subtilisinas en el sentido más estrecho. La subtilisina Carlsberg está disponible en otra forma desarrollada bajo el nombre comercial Alcalase® de la empresa Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca. La subtilisina 147 y 309 se comercializan bajo los nombres comerciales Esperase®, o Savinase® de la empresa Novozymes. De la proteasa de Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) se derivan las variantes conocidas bajo la denominación BLAP®, que se describen particularmente en WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 y WO 03/038082 A2. Otras proteasas utilizables de diversos Bacillus sp. y B. gibsonii se infieren de las solicitudes de patente WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 y WO 03/054184 A1 ya mencionadas en forma introductoria.

Otras proteasas empleables son, por ejemplo, las enzimas obtenibles bajo los nombres comerciales Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® y Ovozymes® de la empresa Novozymes, las enzimas obtenibles bajo los nombres comerciales Purafect®, Purafect® OxP y Properase® de la empresa Genencor, las enzimas obtenibles bajo el nombre comercial Protosol® de la empresa Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, las enzimas obtenibles bajo el nombre comercial Wuxi® de la empresa Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, las enzimas obtenibles bajo los nombres comerciales Proleather® y Protease P® de la empresa Amano Farmaceuticals Ltd., Nagoya, Japón, y la enzima obtenible bajo el nombre Proteinase K-16 de la empresa Kao Corp., Tokio, Japón.

Los ejemplos de amilasas empleables según la invención son las \alpha-amilasas de Bacillus licheniformis, de B. amiloliquefaciens o de B. stearothermofilus y sus otros desarrollos mejorado para usar en detergentes y limpiadores. La enzima de B. licheniformis es obtenible de la empresa Novozymes bajo el nombre Termamil® y de la empresa Genencor bajo el nombre Purastar®ST.

Otros productos de desarrollo de esta \alpha-amilasa son obtenibles de la empresa Novozymes bajo los nombres comerciales Duramil® y Termamil®ultra, de la empresa Genencor bajo el nombre Purastar®OxAm y de la empresa Daiwa Seiko Inc., Tokio, Japón, como Keistase®. La \alpha-amilasa de B. amiloliquefaciens se comercializa de la empresa Novozymes bajo el nombre BAN® y las variantes derivadas de la \alpha-amilasa de B. stearothermofilus bajo los nombres BSG® y Novamil®, también de la empresa Novozymes.

Además, para este propósito debe resaltarse la \alpha-amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) divulgada en la solicitud WO 02/10356 A2 y la ciclodextrina Glucanotransferase (CGTase) de B. agaradherens (DSM 9948) divulgada en la solicitud WO 02/44350 A2. Además, pueden emplearse las enzimas amilolíticas que participan en el espacio de secuencia de a-amilasas, lo cual se define en la solicitud WO 03/002711 A2 y que se describen en la solicitud WO 03/054177 A2. Así mismo, pueden emplearse los productos de fusión de dichas moléculas, por ejemplo aquellos de la solicitud DE 10138753 A1.

Además, son adecuados otros desarrollos de la \alpha-amilasa de Aspergillus niger y A. oryzae obtenibles bajo el nombre comercial Fungamil® de la empresa Novozymes. Otro producto comercial es por ejemplo la amilasa-LT®.

Las composiciones según la invención pueden contener lipasas o cutinasas, en particular debido a sus actividades de escisión de triglicéridos, sino también para producir perecidos in situ a partir de precursores adecuados. Estos incluyen, por ejemplo, las lipasas obtenibles originalmente a partir de humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus), u otras lipasas desarrollados, en particular aquellas que tienen el reemplazo aminoácido D96L. Ellas se mercadean, por ejemplo, por la empresa Novozymes bajo los nombres comerciales Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® y Lipex®. Además, por ejemplo, pueden emplearse las cutinasas que originalmente se han aislado a partir de Fusarium solani pisi y Humicola insolens. Así mismo, las lipasas usables son obtenibles de la empresa Amano bajo los nombres Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B®, o Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillis sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase MAP® y Lipase AML®. De la empresa Genencor, pueden emplearse, por ejemplo, las lipasas o cutinasas cuyas enzimas iniciales han sido aisladas originalmente de Pseudomonas mendocina y Fusarium solanii. Otros productos comerciales importantes que pueden mencionarse aquí son las preparaciones M1 Lipase® y Lipomax® mercadeadas originalmente por la empresa Gist-Brocades y las enzimas mercadeadas por Meito Sangyo KK, Japón, bajo los nombres Lipase MY-30®, Lipase OF® y Lipase PL®, además el producto Lumafast® de la empresa Genencor.

Las composiciones según la invención, en particular si están destinadas para el tratamiento de textiles, pueden contener celulasas, dependiendo del propósito como enzimas puras, como preparaciones de enzima o en forma de mezclas, en las cuales los componentes individuales ventajosamente se complementan uno al otro con respecto a su diversos aspectos de desempeño. Estos aspectos de desempeño incluyen, en particular, contribuciones al desempeño primario de lavado, al desempeño secundario de lavado de la composición (acción de antiredeposición o inhibición de agrisamiento) y avivamiento (acción del tejido), hasta ejercer el efecto de "stone-washed" (lavado en piedra).

Una preparación útil fúngica de celulosa rica en endoglucanase(EG), o sus desarrollos ulteriores se suministran por la empresa Novozymes bajo los nombres comerciales Celluzyme®. Los productos obtenibles de la empresa Novozymes Endolase® y Carezyme® se basan en la 50 kD-EG, o bien la 43 kD-EG de H. insolens DSM 1800. Otros productos comerciales empleables de esta empresa son Cellusoft® y Renozyme®. Este último se basa en la solicitud WO 96/29397 A1. Las variantes de celulasa mejoradas en su desempeño se infieren, por ejemplo, de la solicitud WO 98112307 A1. Así mismo, pueden emplearse las celulasas divulgadas en la solicitud WO 97/14804 A1; por ejemplo, la 20 kD-EG de Melanocarpus allí divulgada, que es obtenible de la empresa AB Enzymes, Finlandia, bajo los nombres comerciales Ecostone® y Biotouch®. Otros productos comerciales de la empresa AB Enzymes son Econase® y Ecopulp®. Otras celulasas adecuadas de Bacillus sp. CBS 670.93 y CBS 669.93 se divulgan en WO 96/34092 A2, siendo obtenible bajo el nombre comercial Puradax® de la empresa Genencor CBS 670.93 de Bacillus sp. Otros productos comerciales de la empresa Genencor son "Genencor detergent cellulase L" [Celulasa de detergente Genencor] y IndiAge®Neutra.

Las composiciones según la invención pueden contener, en particular para la remoción de cierto problema de ensuciamiento, otras enzimas que pueden resumirse bajo el término de hemicelulasas. Estas incluyen, por ejemplo mannanasas, xantanliasas, pectinliasas (=pectinasas), pectinesterasas, pectatliasas, xiloglucanasas (=xilanasas), pululanasas y \beta-glucanasas. Mannasas adecuadas son obtenibles por ejemplo bajo los nombres Gamanase® y Pektinex AR® de la empresa Novozymes, bajo el nombre Rohapec® B1L de la empresa AB Enzymes y bajo el nombre Pirolase® de la empresa Diversa Corp., San Diego, CA, USA. Una \beta-glucanasa adecuada de B. alcalofilus se infiere por ejemplo de la solicitud WO 99/06573 A1. La \beta-glucanase obtenida de B. subtilis está disponible bajo el nombre Cereflo® de la empresa Novozymes.

Para elevar la acción de blanqueamiento, los detergentes y limpiadores según la invención pueden contener oxireductasas, por ejemplo oxidasas, oxigenasas, catalasas, peroxidasas, tales como halo, cloro, bromo, lignina, glucosa o manganeso-peroxidasas, dioxigenasas o laccasas (fenoloxidasas, polifenoloxidasas). Productos comerciales adecuados que pueden mencionarse son Denilite® 1 y 2 de la empresa Novozymes. Ventajosamente se adicionan compuestos preferiblemente orgánicos, particularmente preferible aromáticos que interactúan con las enzimas con el fin de aumentar la actividad de las oxireductasas de interés (promotores) o con el fin de, en el caso de potenciales redox muy diferentes entre las enzimas oxidantes y el ensuciamiento, garantizar el flujo de electrones (mediadores).

Las enzimas empleadas en composiciones según la invención se derivan o bien originalmente de microorganismos, por ejemplo de los géneros Bacillus, Streptomyces, Humicola, o Pseudomonas, y/o producidas por microorganismos adecuados mediantes métodos bio-tecnológicos conocidos de por sí, por ejemplo mediante hospedantes de expresión transgénica del género Bacillus u hongos filamentosos.

La purificación de las enzimas de interés se lleva a cabo más favorablemente mediante métodos establecidos de por sí, por ejemplo mediante precipitación, sedimentación, concentración, filtración de las fases, microfiltración, ultrafiltración, acción de químicas, desodorización o combinaciones de estos pasos.

Las enzimas pueden adicionarse a las composiciones según la invención en cualquier forma establecida según la invención. Estas incluyen, por ejemplo, las preparaciones sólidas obtenidas mediante granulación, extrusión o liofilización o, en particular en el caso de composiciones líquidas o gelatinosas, soluciones de las enzimas, ventajosamente tan concentrada como sea posible, bajo en agua y/o tratadas con estabilizantes.

Alternativamente, las enzimas pueden encapsularse tanto para administración sólida como las líquida, por ejemplo mediante secado por aspersión o extrusión de la solución de la enzima junto con un polímero preferiblemente natural o en forma de cápsulas, por ejemplo aquellas en las que las enzimas se envuelven como en un gel solidificado o en aquellas del tipo de concha-núcleo, en la que un núcleo que contiene enzima se cubre con una capa protectora impermeable al agua, aire y/o a los químicos. En capas superimpuestas, pueden aplicarse otros compuestos activos, por ejemplo los estabilizadores, emulsificantes, pigmentos, blanqueadores o colorantes. Se aplican cápsulas de este tipo mediante métodos conocidos de por sí, por ejemplo mediante granulación de agitador o rodillo o en procesos de lecho fluidizado. Ventajosamente, los gránulos de este tipo son bajos en polvo, por ejemplo como resultado de aplicar agentes poliméricos de formación de película, y estables durante el almacenamiento a causa del revestimiento.

Además, es posible empacar dos o más enzimas juntas, de modo que los gránulos individuales tienen un número de actividades de enzima.

Una proteína y/o enzima contenida en una composición según la invención puede protegerse, particularmente durante el almacenamiento, contra daños tales como, por ejemplo, inactivación, desnaturalización o desintegración, por ejemplo por medio de influencias físicas, oxidación o escisión proteolítica. En el caso de preparación microbiana de las proteínas y/o enzimas, se prefiere particularmente una inhibición de la proteólisis, en particular si las composiciones contienen también proteasas. Las composiciones preferidas según la invención para este propósito contienen estabilizadores.

Un grupo de estabilizadores son inhibidores reversibles de proteasa. Frecuentemente, para este propósito se emplean benzamidina-hidrocloruro, bórax, ácidos bóricos, ácidos borónicos o sus sales o ésteres, entre ellos especialmente derivados que tienen grupos aromáticos, por ejemplo ácidos fenilborónicos orto-, meta- o para-sustituidos, particularmente ácido 4-formilfenil-borónico, o bien las sales o ésteres de los compuestos mencionados. Los aldehídos de péptido, es decir los oligopéptidos que tienen un Terminal C reducido, en particular aquellos que consisten en 2 a 50 monómeros, también se emplean para este propósito. Los inhibidores de proteasa reversibles peptídicos incluyen, entre otros, ovomucoide y leupeptina. También son adecuados para esto los inhibidores reversibles de péptido, específicos para la proteasa subtilisina y proteínas de fusión de proteasas e inhibidores específicos de péptido.

Otros estabilizadores de enzima son aminoalcoholes como mono-, di-, trietanol- y -propanolamina y sus mezclas, ácidos carboxílicos alifáticos hasta C_{12}, como pro ejemplo ácido succínico, otros ácidos dicarboxílicos o sales de dichos ácidos. También son adecuados para este propósito alcoxilados de amidas de ácido graso cerrados con grupo extremo. Ciertos ácidos orgánicos empleados como armadores son capaces de estabilizar adicionalmente una enzima presente, tal como se divulga en WO 97/18287.

Los alcoholes alifáticos inferiores, ante todo sin embargo los polioles tales como, por ejemplo, glicerina, etilenglicol, propilenglicol o sorbita son otros estabilizadores de enzima aplicados con frecuencia. El fosfato de diglicerina también protege contra la desnaturalización por influencias físicas. Así mismo se emplean las sales de calcio y/o magnesio, tal como por ejemplo acetato de calcio o formato de calcio.

Los oligómeros de poliamida o compuestos poliméricos tales como lignina, copolímeros de vinilo solubles en agua o éteres de celulosa, polímeros acrílicos y/o poliamidas estabilizan la preparación de enzima, entre otras, frente a las influencias físicas o variaciones de pH. Los polímeros de poliamina que contienen N-óxidos actúan simultáneamente como estabilizadores de enzima y como inhibidores de transferencia de color. Otros estabilizadores poliméricos son polioxialquilenos lineales de C8-C18. Los alquilpoliglicósidos pueden también estabilizar los componentes enzimáticos de la composición según la invención y son capaces preferiblemente de aumentar adicionalmente el desempeño de éstos. Los compuestos reticulados que contienen N cumplen preferiblemente una función dual como agentes de liberación de mugre y como estabilizadores de enzima. El polímero hidrofóbico, no iónico en particular estabiliza una celulasa contenida opcionalmente.

Los agentes de reducción y antioxidantes incrementan la usabilidad de las enzimas frente a la desintegración oxidativa; los reductores que contienen azufre, por ejemplo, son comunes para esto. Otros ejemplos son sulfito de sodio y azúcar reductor.

Particularmente se prefiere emplear combinaciones de estabilizantes, por ejemplo de polioles, ácido bórico y/o bórax, la combinación de ácido bórico o borato, sales reductoras y ácido succínico u otros ácidos dicarboxílicos o la combinación de ácido bórico o borato con polioles o compuestos de poliamino y con sales reductoras. La acción de estabilizantes de péptido - aldehído se incrementa de manera más favorable mediante la combinación con ácido bórico y/o derivados de ácido bórico y polioles y aún más allá mediante la acción adicional de cationes divalentes, tales como, por ejemplo, iones de calcio.

Puesto que las composiciones de la invención pueden suministrarse en todas las formas concebibles, las enzimas de la invención, o las proteínas en todas las formulaciones convenientes para la adición a las composiciones respectivas, son realizaciones respectivas de la presente invención. Estas incluyen, por ejemplo, formulaciones líquidas, gránulos sólidos o cápsulas.

La forma encapsulada se sugiere para proteger las enzimas u otros ingredientes de otros componentes tales como, por ejemplo, blanqueadores o para hacer posible una liberación controlada. Dependiendo del tamaño de estas cápsulas se hace una distinción de acuerdo con mili-, micro- y nanocápsulas, siendo las microcápsulas particularmente preferidas para las enzimas. Tales cápsulas se divulgan, por ejemplo en las solicitudes de patente WO 97/24177 y DE 19918267. Un método posible de encapsulamiento consiste en que las proteínas, a partir de una mezcla de la solución de proteína con una solución o suspensión de almidón o un derivado de almidón, se encapsulan en esta sustancia. Un proceso de encapsulamiento así se describe en la solicitud WO 01/38471.

En el caos de composiciones sólidas, las proteínas pueden emplearse, por ejemplo en forma seca, granulas y/o encapsulada. Pueden adicionarse por separado, es decir como una fase individual, o con otros componentes juntos en la misma fase, con o sin compactación. Si las enzimas microencapsuladas deben procesarse en forma sólida, el agua puede retirarse de las soluciones acuosas resultando del procesamiento que usa procesos conocidos del estado de la técnica, tales como secado por aspersión, centrifugación o resolubilización. Las partículas obtenidas de esta manera tienen habitualmente un tamaño de partícula entre 50 y 200 \mum.

Las enzimas y también la proteína según al invención a partir de una obtención de proteína y preparación llevada a cabo según el estado de la técnica, pueden adicionarse a composiciones líquidas, gelatinosas o pastosas según la invención en solución, suspensión o emulsión, concentradas acuosas o no acuosas, pero también en forma de gel o encapsuladas o como un polvo seco. Tal tipo de detergentes o limpiadores según la invención se preparan normalmente mezclando simplemente los ingredientes que pueden adicionarse a una mezcladora automática en sustancia o como solución.

Además del desempeño de lavado primario, las proteasas contenidas en detergentes pueden cumplir además la función de activar otros componentes enzimáticos mediante la escisión proteolítica o desactivando después de un tiempo apropiado de acción, es decir, tal como se ha revelado, por ejemplo en las solicitudes WO 94/29426 o EP 747471. También son posibles las funciones regulatorias comparables por medio de la proteína según la invención. Una realización de la presente invención son además aquellas composiciones que contienen cápsulas de material sensible a proteasa, el cual, por ejemplo, se hidroliza por proteínas según la invención a un punto destinado en el tiempo y libera su contenido. Un efecto comparable puede lograrse también con otras composiciones de múltiples fases.

Otra realización son composiciones para el tratamiento de materia prima textil o para el cuidado de textiles, las cuales contienen una proteasa alcalina según la invención.

Otra forma de realización son las composiciones para el tratamiento de fibras o textiles que contienen componentes naturales, en particular aquellos que contienen lana o seda.

Las fibras naturales, tales como, por ejemplo, lana o seda, se distinguen por una característica, estructura de superficie microscópica. Esto puede conducir a largo plazo, como se ha explicado en el ejemplo de lana en el artículo de R. Breier en Melliand Textilberichte (Reporte de textiles) del 1.4.2000 (página 263) a efectos indeseados tales como, por ejemplo, afieltrado. Para evitar tales efectos, las materias primas naturales se tratan con composiciones según la invención que, por ejemplo, contribuyen a dar tersura a la estructura escamosa de la superficie con base en estructuras proteínicas y de esa manera contrarresten el afieltrado.

En otra forma de realización preferible, la composición es concebida usando una proteasa según la invención de tal manera que puede usarse regularmente como una composición para el cuidado, por ejemplo, adicionándola al proceso de lavado, usándola después de lavar o aplicándola independientemente del lavado. El efecto deseado consiste en obtener una estructura de superficie tersa del textil por un período largo de tiempo y/o previniendo y/o reduciendo el daño a la tela.

Un objeto propio de la invención son los métodos para la limpieza mecánica de textiles o de superficie duras, en las que una proteasa alcalina según la invención se vuelve activa al meno en uno de los pasos del método.

Entre estos, se prefieren aquellos métodos en los que la proteasa alcalina según la invención se emplea en una cantidad desde 40 \mug hasta 4 g, preferiblemente desde 50 \mug hasta 3 g, particularmente preferible de 100 \mug hasta
2 g y muy particularmente preferible de 200 \mug hasta 1 g por aplicación. Se incluyen todos los valores, enteros y no enteros, respectivos que se encuentren entre estos números.

Entre estos caben métodos tanto manuales como mecánicos, prefiriéndose los métodos mecánicos debido a su capacidad de controlarse más precisamente en cuanto a las cantidades empleadas y tiempos de acción concierne.

Los métodos para limpiar textiles son en general distinguidos porque en un número de pasos de método se aplican al artículo por limpiarse diversas sustancias activas para la limpieza y, después del tiempo de acción, se lavan para retirarlas, o porque el artículo a limpiarse se trata de otra manera con un detergente o una solución de esta composición. Lo mismo aplica para métodos para la limpieza de todos los materiales diferentes de textiles que se resumen bajo el término superficies duras. Todos los métodos de lavado y limpieza concebibles pueden enriquecerse en al menos uno de los pasos de método con proteínas según la invención y son entonces realizaciones de la presente invención.

Puesto que las enzimas preferidas según la invención tienen ya naturalmente una actividad de disolución de proteína y presentan ésta también en los medios que de otra manera no tendrían poder de limpieza, tales como, por ejemplo, en simples búferes, un subpaso individual de tal método para la limpieza mecánica de textiles puede consistir en aplicar una enzima según la invención como el único componente activo de limpieza, si se desea, además de compuestos estabilizantes, sales o sustancias búfer. Esto es una realización particularmente preferida de la presente invención.

En otra forma de realización preferible de estos métodos, la proteasa alcalina según la invención se prepara dentro del alcance de una de las rectas detalladas arriba para composiciones según la invención, preferiblemente detergentes o limpiadores, según la invención.

Formas de realización preferidas de este objeto de la invención son métodos para el tratamiento de materias primas textiles o para el cuidado de los textiles, en los que en al menos uno de los pasos de método se vuelve activa una proteasa alcalina según la invención.

Entre éstos se prefieren métodos para materias primas textiles, fibras o textiles que contienen componentes naturales, y muy particularmente para aquellos que contienen lana o seda.

En este caso, por ejemplo, puede tratarse de métodos en los que se preparan los materiales para procesamiento de textiles, por ejemplo para el acabado antifieltrado, o por ejemplo, los métodos que enriquecen la limpieza de textiles usados con un componente para el cuidado. Debido a la acción descrita arriba de proteasas sobre materias primas naturales que contienen proteína, en las formas preferidas de realización éstos son métodos para el tratamiento de materias primas textiles, fibras o textiles que contienen componentes naturales, en particular que contienen lana o seda.

Un objeto propio de la invención es el uso de una proteasa alcalina según la invención descrita arriba para la limpieza de textiles o de superficies duras.

Por consiguiente, los rangos de concentración mencionados arriba son válidos para estos usos.

Las proteasas según la invención pueden usarse, en particular según las propiedades descritas arriba y a los métodos descritos arriba para eliminar las impurezas que contienen proteína de textiles o de superficies duras. Las realizaciones son, por ejemplo, el lavado de manos, la remoción manual de manchas de los textiles o de las superficies duras o el uso en conexión con un método mecánico.

En una forma de realización preferida de este uso las proteasas alcalinas según la invención se preparan dentro del alcance de una de las recetas arriba mencionadas para composiciones de la invención, preferiblemente detergentes o limpiadores.

Otra forma de realización de este objeto de la invención es el uso de una proteasa alcalina de la invención para la activación o desactivación de ingredientes de detergentes o limpiadores.

Como se conoce, los componentes de proteína de detergentes o limpiadores pueden desactivarse por la acción de una proteasa. Emplear este efecto, de otra manera más bien indeseado, es un objeto de la presente solicitud. Así mismo, es posible tal como se describe arriba que mediante proteólisis se active primero otro componente, por ejemplo si se trata de una proteína híbrida de la enzima actual y del inhibidor apropiado para la misma, tal como se divulgado, por ejemplo, en la solicitud WO 00/01831 A2. Otro ejemplo de una regulación así es aquel en el que un componente activo se presenta encapsulado en un material atacado por proteólisis, para la protección o para el control de su actividad. Las proteínas de la invención pueden usarse entonces para reacciones de desactivación, activación o liberación, en particular en composiciones de múltiples fases.

En correspondencia con lo dicho arriba, los siguientes usos son formas de realización de la presente invención:

- El uso de una proteasa alcalina de la invención para la preparación o tratamiento de materias primas o intermediarios en la producción textil, en particular para la remoción de capas protectoras en las telas;

- El uso de una proteasa alcalina de la invención para el tratamiento de materias primas textiles o para el cuidado de los textiles y entre éstos preferiblemente

- El uso correspondiente para materias primas textiles, fibras o textiles que contienen componentes naturales y muy particularmente para aquellos que contienen lana o seda.

La presente invención se realiza también en forma de aquellas composiciones que comprende una proteasa alcalina de la invención, que son cosméticos. Entre éstos se entienden todos los tipos de composiciones de limpieza y cuidado para la piel o pelo humanos, en particular composiciones para la limpieza.

Las proteasas desempeñan también un papel crucial en el proceso de renovación de células de la piel humana (descamación) (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., volumen 71 (1991), páginas 471-474). Por consiguiente, las proteasas también se usan como componentes bioactivos en composiciones de cuidado de la piel para ayudar al rompimiento de las estructuras desmosomáticas que se incrementan en la piel seca. El uso de proteasas subtilisinas con reemplazos aminoácidos en las posiciones R99G/A/S, S154D/E y/o L211 D/E para propósitos cosméticos se describe, por ejemplo, en WO 97/07770 A1. En correspondencia con lo que se ha dicho arriba, las proteasas de la invención pueden desarrollarse aún más por medio de las mutaciones de punto correspondientes. De esta manera las proteasas de la invención son también adecuadas, en particular aquellas, por ejemplo, después de la mutagénesis o por la adición de sustancias correspondientes que interactúan con ellas, se controlan en su actividad como componentes activos en composiciones para la limpieza de la piel o el pelo o para el cuidado. Se prefieren particularmente aquellas preparaciones de estas enzimas que, como se describe arriba, por ejemplo acoplándose a vehículos de macromoléculas (compare US 5230891) se estabilizan y/o derivatizan por mutaciones de punto en posiciones altamente alergénicas tales que tienen para los humanos una alta compatibilidad con la piel.

Por consiguiente, la limpieza cosmética correspondiente y los métodos de cuidado y el uso de enzimas proteolíticas de este tipo para propósitos cosméticos también se incluyen en este objeto de la invención, en particular en composiciones correspondientes, tales como, por ejemplo, shampoos, jabones o lociones de lavado, o en composiciones para el cuidado suministradas, por ejemplo, en forma de cremas. El uso en un medicamento para la peladura de piel, o para su producción, también se incluye en esta reivindicación.

Junto al uso en detergentes y limpiadores y cosméticos, en el estado de la técnica se establecen numerosas posibilidades de aplicación de proteasas, en particular subtilasas. El libro de texto "Industrial enzymes and their applications" (Enzimas industriales y sus aplicaciones) de H. Uhlig, editorial Wiley, New York, 1998, presenta una visión general de esto. Todas estas técnicas pueden enriquecerse con proteasa alcalinas de la invención. Si resulta que luego éstas pueden desarrollarse aún más por el uso de las proteasas de la invención, éstas se incluyen en el alcance de la presente invención. Esto incluye, en particular, las siguientes áreas de uso:

- el uso de una proteasa alcalina de la invención para el análisis bioquímico o para la síntesis de compuestos de bajo peso molecular o de proteínas;

- entre ellos preferiblemente el uso para la determinación de grupo extremo en el alcance de un análisis de secuencia de un péptido;

- el uso de una proteasa alcalina de la invención para la preparación, purificación o síntesis de sustancias naturales o sustancias biológicas valiosas preferiblemente dentro del alcance de las composiciones o métodos correspondientes;

- el uso de una proteasa alcalina según la invención para la síntesis de proteínas u otros compuestos químicos de bajo peso molecular;

- el uso de una proteasa alcalina de la invención para el tratamiento de materias primas naturales, en particular para el tratamiento de superficie, muy particularmente en un método para el tratamiento de cuero, preferiblemente dentro del alcance de las composiciones y métodos correspondientes;

- el uso de una proteasa alcalina de la invención para el tratamiento de películas fotográficas, en particular para la remoción de capas protectoras que contienen gelatina o similares; y

- el uso de una proteasa alcalina según la invención para la preparación de alimentos o de comida para animales.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin limitarla por ellos.

Ejemplos

Todos los pasos de trabajo de biología molecular siguen los métodos estándar, tal como se indican en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual" (Clonación molecular: un manual de laboratorio), Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, o trabajos relevantes comparables. Las enzimas y kits se emplearon según las instrucciones de los respectivos fabricantes.

Ejemplo 1

Obtención de material celular a partir de hábitats de suelo

Se tomaron muestras de suelo de diversas locaciones en Alemania; las sustancias tomadas en agua y las sustancias suspendidas se sedimentaron dejándolas paradas por 30 minutos. El sobrenadantes se cultiva en placas de agar al 5% usando medio sólido HSP10 (0,1 g extracto de levadura, Difco, Heidelberg; 0,1 g caseína-peptona, digerida tripticamente, Difco; 0,1 g de almidones solubles (Merck, No. de orden 1.01251); 2 g Na_{2}CO_{3}; ad 1000 ml de agua destilada; pH10) y se deja cultivando por cerca de 2 semanas a 30ºC. el césped de bacterias obtenido se recupera mecánicamente de la superficie de agar.

Ejemplo 2

Instalación de un banco de genes de expresión

El sistema de expresión elegido fue el vector pUC18 (GenBank, National Institutes of Health, Betesda, MD, USA; número de acceso L08752; Fig. 3) en Escherichia coli DH12S. Este vector lleva el promotor de \beta-galactosidasa de la lac-operon inducible por adición de IPTG, de modo que en estas células es posible una expresión controlada de esta manera de ADN integrado en el sitio de clonación múltiple. La cepa DH12S es adecuada debido a su genotipo laclq para la inducción de IPTG y ventajosa para un tamizado (screening) de actividad de proteasa, debido a que tiene una actividad proteolítica endógena suficientemente baja. Los experimentos preliminares habían mostrado que E. coli JM109 también cumplía los mismos requerimientos.

El procesamiento del ADN de la muestra obtenida según el ejemplo 1 se llevó a cabo según Zhou et al. (1996), Appl. Environ. Microbiol., volumen 62, páginas 316-322. Este ADN metagenómico purificado (ver abajo) fue sometido a una restricción parcial preparativa usando la enzima de restricción Alu l para la preparación de fragmentos con tamaños en el rango de 2 hasta 10 kb.

Para esto se determinó primero el período óptimo de incubación - restricción registrando una cinética de la enzima. Para esto se incubaron 2,8 \mug de preparación de ADN a 37ºC en el búfer de reacción apropiado suministrado por el fabricante de Alu I (New England Biolabs, Schwalbach, Alemania; No de catálogo R0137S). Mediante adición de 0,2 U de Alu I por \mug de ADN fue iniciada la reacción en un volumen total de 21 \mul y luego en intervalos de dos minutos en cada caso se tomaron 1,5 \mul de la tanda en los cual en cada caso la reacción finalizaba inmediatamente por la adición de 10 mM Tris/HCl, pH 7,0; 20% de glicerina; 0,1% SDS y enfriar a 0ºC. Mediante un análisis subsiguiente sobre un gel de azarosa al 0,7% se determinó el período óptimo de restricción para una digestión parcial. Para el aislamiento del ADN aislado según el ejemplo 1, tarda cerca de 6 a 7 minutos para obtener fragmentos en el rango de 2 a 10 kb.

La digestión parcial preparativa se llevó a cabo por consiguiente en 30 tandas paralelas. Después de parar apropiadamente la reacción, la tanda se separó electroforéticamente en un gel de agarosa preparativo al 0,7%, la región de gel que contiene ADN de los tamaños 2 hasta 10 kb fue extirpada y esta se aisló por medio de electroelución en tubos de diálisis a 4ºC. El ADN fue precipitado finalmente con 1/10 de acetato de Na a 3M y 2,5 veces de volumen de etanol y llevado a un volumen adecuado. Para la separación ulterior de cualquier posible fragmento presente más pequeño de ADN, se repitieron el gel de electroforesis, la electroporación y la precipitación.

440 ng de ADN metagenómico fragmentado obtenido de esa manera se ligaron por una noche a 16ºC en un volumen total de 15 \mul con 150 ng del vector pUC18 con adición de 400 NEB unidades de T4-DNA-ligasa en búfer 1xligasa. Este vector había sido linealizado previamente con Sma 1 y desfosforilado con fosfatasa alcalina de timo de ternera.

La transformación de células E. coli DH12S competentes (Gibco Life Technologies, Karlsruhe, número de catálogo 18312017) se llevó a cabo por medio de electrotransformación, Para esto se mezclaron 1 \mul de la tanda de ligación y 25 \mul de células, se incubaron en hielo en una cubeta de electroevaporación por 1 minuto y se trataron en el electroporador (BTX® ECM630, Genetronics Inc. San Diego, USA) según las instrucciones del fabricante. Después de transferir inmediatamente a 1 ml de medio SOC (2% Bacto-Trypton; 0,5% de extracto de levadura; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; pH 7,0, ajustado con NaOH; autoclavado; complementado con 10 mM MgSO_{4} y MgCl_{2} así como 20 mM D(+)glucosa), seguido de una fase de recuperación de 1 hora a 37ºC y como en el ejemplo 1 una puesta a cultivar en placas de agar con medio HSP10.

Ejemplo 3

Tamizado (screening) para actividad proteolítica

Para la investigación de la calidad del banco de genes preparado según el ejemplo 2 en E. coli DH12S el número de transformante producidos juntos y el números de clones de inserción - soportes se determinó por medio de selección azul/blanco en un cultivo de prueba. Para esto, se pusieron a cultivar en una placa 1 y 10 \mul de cada tanda de transformación en placas de agar al 5% con medio LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 1 ml 1 N de NaOH por I), lo cual fue tratado adicionalmente con 100 \mug/ml de ampicilina, 0,2 mM (ó 4 \mug/ml) de IPTG y 0,2 mM (ó 1 \mug/ml) de X-Gal, se incubó por una noche a 37ºC. De 10 colonias blancas, es decir transformantes, los plásmidos se aislaron por medio de minipreparación (Kit de Qiagen, Hilden, Alemania), se llevó a cabo una digestión de restricción usando las enzimas de restricción Sac 1 y Hind III para la extirpación del inserto (compare la figura 3) y se separaron los fragmentos sobre un gel de agarosa al 0,7%. De hecho, todos los vectores contenían insertos de cerca de 2 hasta 10 kb de tamaño.

El tamizaje del banco de genes producido según el ejemplo 2 fue llevado a cabo en placas de agar al 5%, de 14 cm de diámetro, usando medio LB ampicilina/IPTG/X-Gal (ver arriba) y adicionalmente 2% de leche magra en polvo (Skim Milk, Difco, número de orden 232100). En 10 de estas placas de agar de selección, que corresponden al título del volumen de banco de la tanda de transformación de, en cada caso, aproximadamente 10 000 cfu fueron cultivados en placas de manera uniforme por medio de esferas de vidrio (cultivo primario).

Después de incubación de 16 horas a 37ºC, las placas se incubaron por hasta dos semanas a 28ºC. Durante este tiempo los clones formadores de proteasa se revelaron a sí mismos por medio de halos de clarificación en el sustrato turbio. No fue necesaria una lisis de células por separado para la detección de proteasas no exportadas. La validación de la formación de proteasa mediada con plásmido se llevó a cabo mediante aislamiento fresco de los clones primarios y a continuación por aislamiento de los vectores relevantes que contienen inserto pUC18, la retransformación y el tamizaje fresco (como arriba; cultivo secundario). Los transformantes que siguen esto mostraron así mismo formación de halo en el medio de leche magra y confirmaron así la localización de un gen de proteasa en el fragmente de ADN clonado en cada caso.

Ejemplo 4

Análisis de secuencia de un clon activo proteolíticamente (HP70Pa2)

De un clon positivo a proteasa que tenga la denominación HP70Pa2 obtenido según el ejemplo 3, fue aislado ADN de plásmido según métodos estándares, el inserto se preparó por medio de digestión Sac I/Hind III (ver arriba) y secuenciado según métodos estándar. Aquí se usaron primero los iniciadores específicos para el vector y que flanquean el inserto según SEQ ID NO. 1 y 2 con las denominaciones M13f o bien M13r, seguido de "primer-walking" (marcha de iniciador), como se conoce del estado de la técnica (R.J.Kaiser et al. (1989): "Specific primer-directed DNA sequencing using automated fluorescence detection"; Nucl. Acids Res., 17 (15), páginas 6087-6102).

La secuenciación de este clon produjo una región que tiene un marco de lectura abierto cuya secuencia de ADN se indica en SEQ ID NO. 3. Debido a su origen, se marca como el organismo "desconocido" y adicionalmente se declara que esta secuencia se debe atribuir a un aislado de ADN. Además, debido a los datos actuales (en particular por medio de comparaciones de secuencia, ver abajo) debe suponerse que las posiciones nucleótidas 1 a 96 codifican para el péptido de señal y conjuntamente la región codificante se extiende desde 1 a 1746. SEQ ID NO. 4 divulga la secuencia de aminoácidos derivada de allí, que tiene los mismos datos con respecto al origen.

Descrita como la enzima más cercanamente similar, una proteasa serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) de Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913) fue encontrada, la cual lleva el número de acceso NP636242 t en el banco de genes GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Betesda, MD, USA). La homología a nivel de aminoácido determinada por medio del programa de ordenador Vector NTI® Suite 7.0, disponible de la empresa InforMax, Inc., Betesda, USA, con los parámetros especificados por defecto es 75,0% de identidad a HP70. Otras proteínas encontradas en esta búsqueda las cuales al nivel de aminoácido aún parecen las más similares, se compilan en la tabla 1 de abajo.

TABLA 1 Secuencias encontradas más cercanamente similares a HP70 a nivel de aminoácido

1

Al nivel de ADN resulta una identidad de 74,4% con el gen de la proteasa serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) de Xanthomonas campestris pv. campestris (Gen ID XCC0851).

Así, la proteasa encontrada es la más altamente probable similar a proteasa serina. Una homología de 26,2% de identidad con la proteasa alcalina de B. Lentus establecida (WO 92/21760 A1) resulta al nivel de aminoácido y una identidad de 33,6% al nivel de ácido nucleico.

El vector asociado que tiene la denominación 70-pUC(AWB403) se depositó el día 2.10.2003 en el Deutschen Sammlung de Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.
de) y lleva allí el número de depósito DSM 15977. La proteasa codificada de esta manera se denomina como HP70.

Ejemplo 5

Análisis de secuencia de un clon activo proteolíticamente (HP53Pa2)

A partir de otro clon positivo a proteasa que tiene la denominación HP53Pa2 se preparó el inserto y se secuenció como en el ejemplo 4.

Las secuencias obtenidas se muestran en SEQ ID NO. 6 y 7. Debido a su origen allí se marca como organismo "desconocido" y se indica adicionalmente que estas secuencias deben atribuirse a un asilado de ADN. Además, debido a los datos actuales (en particular por medio de comparaciones de secuencia, ver abajo) debe suponerse que las posiciones nucleótidas 1 a 114 codifican para el péptido de señal y conjuntamente la región codificante se extiende desde 1 hasta 1761.

Se trata de nuevo de una proteasa subtilisina que a nivel de aminoácido tiene una homología de 75,4% de identidad con la proteasa serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) de Xanthomonas campestris pv. Campestres (ATCC 33913; ver arriba) determinada también en este caso como la más cercanamente similar. Otras proteínas, encontradas en esta búsqueda y que al nivel de aminoácidos aún parecen ser las más similares, se compilan en la tabla 2 de abajo.

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TABLA 2 Secuencias encontradas más cercanamente similares a HP53 a nivel de aminoácido

2

Al nivel de ADN resulta una identidad de 75,0% con el gen de la proteasa serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) de Xanthomonas campestris pv. Campestris.

A nivel de aminoácido resulta una homología de 25,9% de identidad y a nivel de ácido nucleico una identidad de 33,5% con la proteasa alcalina establecida de B. lentus (WO 92/21760 A1).

El vector asociado que tiene la denominación 53-pUC(AWB403) se depositó el día 2.10.2003 en la Deutschen Sammlung de Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.
de) y lleva allí el número de depósito DSM 15976. La proteasa codificada de esta manera se denomina como HP53.

Ejemplo 6

Producción de mutantes de deleción C-terminales de HP70 y HP53 HP70dc

De las proteasas obtenidas según el ejemplo 3 y descritas en el ejemplo 4 del clon con la denominación HP70Pa2 se suprimieron C'-terminalmente 332 bp. Esta secuencia de aminoácidos HP70 deltaC está representada en SEQ ID NO. 5. Debido a su construcción se marca allí que es una secuencia sintética, concretada con el detalle "aislado de ADN, Delta C". Según SEQ ID NO. 3 y 4 la sección de las posiciones 1 a 32 puede a su vez considerarse como un péptido de señal.

Para esto, un fragmento de ADN de 1413 bp de tamaño se genera del ADN indicado en SEQ ID NO. 3 usando los oligonucleótidos HP70f (SEQ ID NO. 10) y HP70r (SEQ ID NO. 11) como iniciadores en condiciones PCR estándar. Después de procesar el fragmento obtenido con las endonucleasas EcoRI y BamHI, se clona el fragmento hacia los sitios de corte correspondientes del vector de expresión de E. colli pUC18 y se transforma en una cepa adecuada (por ejemplo E. coli DH12S). De los transformantes obtenidos puede identificarse el candidato deseado mediante selección azul/blanca, activamente expresado y obtenido así en una cantidad suficiente para más investigaciones.

HP53dc

De la proteasa del clon con la denominación HP53Pa2, obtenida según el ejemplo 3 y descrita en el ejemplo 5, se suprimieron 330 bp C'-terminalmente. Esta secuencia de aminoácidos HP53 deltaC está representada en SEQ ID NO. 8.

Para esto se genera un fragmento de ADN de un tamaño de 1303 bp a partir del ADN indicado en SEQ ID NO. 6 usando los oligonucleótidos HP53f (SEQ ID NO. 12) y HP53r (SEQ ID NO. 13) como iniciadores en condiciones PCR estándar. Después de procesar el fragmento obtenido usando las endonucleasas Blpl y BamHl se clona el fragmento hacia los sitios de corte correspondientes del vector de expresión de E. coli pUC18HP70dc obtenido previamente según la primera parte del ejemplo, el cual ha sido procesado previamente usando las mismas endonucleasas.

Después de la transformación en una cepa apropiada (por ejemplo E. coli DH12S) el candidato deseado puede identificarse, expresarse activamente y obtenerse así en una cantidad adecuada para otras investigaciones a partir de los transformantes obtenidos mediante análisis de restricción usando Sacll (pUCHP53dc contiene tal sitio de
corte).

Debido a esta construcción en SEQ ID NO. 8 se marca que se trata, tal como en el caso de SEQ ID NO. 5, de una secuencia artificia concretizada con el detalle "aislado de ADN, Delta C". Además, la sección de posiciones 1 hasta 32 según SEQ ID NO. 5 fue introducida aquí de modo que esto debe considerarse como un péptido de señal de HP70.

Ejemplo 7

Obtención cuantitativa de las proteasas de la invención y su caracterización bioquímica

Los clones de expresión obtenidos según los ejemplos 3 a 6 se llevaron hasta 100 ml de medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl) y cultivados en un balón Erlenmeyer de 500 ml a 37ºC y con agitación a 200 rpm.

A continuación se caracterizaron bioquímicamente. Aquí, la actividad proteolítica determinada por medio de un "ensayo MTP", que se basa en un sustrato de caseína acoplado a fluorescencia (BODIPI®FL Conjugate, Molecular Probes, Göttingen, Alemania; número de orden #6638) al cual se acoplan fluoroforos (emisores) y amortiguadores (extinguidores). En el sustrato intacto se suprime la fluorescencia de los emisores por los extinguidores. En la hidrólisis de la caseína los oligopéptidos con los grupos acoplados a ellos se alejan unos de otros y ocurre una emisión de fluorescencia de excitación correspondiente cuya intensidad es así una medida de la proteólisis.

Para la determinación de la actividad, en cada caso se incuban 5 \mul de una muestra de proteasa según el ejemplo 5 en 100 mM Tris/HCl con el valor de pH deseado y 4,5 \mug/ml de BODIPI® FL Conjugate en un volumen total de 100 \mul por 1 h a la temperatura de interés. Todas las mediciones indicadas abajo se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pozos (Opaque® Plates, negro; Corning BV Life Sciences, Schifol-Rijk, Holanda; número de orden #3915) con la ayuda de un aparato de medición de fluorescencia FLUOstar® (BMG Lab Technologies, Offenburg, Alemania).

pH- y Temperatura óptimas

Para la proteasa HP53 mostrada en SEQ ID NO. 7 resultan los siguientes parámetros bioquímicos: pH óptimo a 37ºC: 8,6 y temperatura óptima a un pH 8,6: 37ºC.

Influencia de los formadores de complejos

La influencia de formadores de influencia se investigó mediante adición de 1 mM EDTA a pH 8,6 en el ensayo indicado arriba, a saber a 37ºC y 50ºC. El valor medido sin adición de EDTA fue establecido a 100%. Por contraste, la actividad proteolítica relativa a 50ºC fue 27% y a 37ºC fue de 10%.

Medición de estabilidad

Para la medición de la estabilidad, la muestra de la proteasa empleada se preincubó primero por 15 minutos a 50ºC en búfer de NaHCO_{3} de 50 mM, pH 10,9 y luego se midió la actividad residual en el ensayo arriba mencionado a 37ºC y 50ºC, a un pH de 8,6 en cada caso. Aquí la actividad del mismo extracto sin preincubación pero de otra manera tratamiento idéntico fue en cada caso establecida a 100%. De esta manera se determinó una actividad residual de 11% para 37ºC y de 13% para 50ºC.

De esta manera se trata de moléculas que son relativamente estables a pH altos y esto incluso casi independiente de la temperatura.

Ejemplo 8

Contribución de la proteasa HP70 de la invención al desempeño de lavado a temperatura relativamente baja

Para este ejemplo se emplearon textiles estandarizados suministrados con mugre los cuales habían sido ordenados de la Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gallen, Suiza (EMPA). En este caso, las siguientes suciedades y textiles fueron usados: A (sangre/leche/tinta sobre algodón), B (sangre/leche/tinta sobre tela mezclada de poliéster - algodón) y C (huevo/hollín sobre algodón).

Usando este material de ensayo se investigaron diversas recetas en la lavandería para su desempeño de lavado. Para esto, en cada caso se estableció un líquido de baño de 1:12 y se llevo a cabo el lavado por 30 minutos a una temperatura de 40ºC. La dosificación fue de 5,9 g de la composición respectiva por litro de líquido de lavado. La dureza del agua fue de 16º de durea alemana.

El detergente de control usado fue una receta a base de detergente de la siguiente composición (todos los datos en porcentaje en peso): 4% de alquilbencenosulfonato lineal (sal de sodio), 4% de sulfato de alcohol graso de C_{12}-C_{18} (sal de sodio), 5,5% de alcohol graso de C_{12}-C_{18} con 7 EO, 1% de jabón de sodio, 11% carbonato de sodio, 2,5% disilicato de sodio amorfo, 20% tetrahidrato-perborato de sodio, 5,5% de TAED, 25% de zeolita A, 4,5% de policarboxilato, 0,5% de fosfonato, 2,5% inhibidor de espuma granulado, 5% de sulfato de sodio, resto: agua, abrillantador óptico, sales.

Se trató en tandas paralelas en cada caso igualmente activas con la proteasa según la invención y una proteasa de control. Para el control se usó la proteasa alcalina de B. lentus F49 (WO 95/23221 A1; fabricante: Biozym, Kyl, Austria). Esta tenía una actividad específica (determinable según los métodos indicados en la descripción) de cerca de 200.000 PE/g, por lo cual resultó con 0,2% en peso una concentración de F49 de alrededor de 40.000 PE por 100 g de la composición y una actividad de cerca de 2.400 PE por litro de líquido de lavado. Adicionalmente se prepararon recetas que prescindiendo de una cantidad correspondiente de sales contenía en cada caso 0,5%, es decir dos y media veces la cantidad de proteasa. La proteasa según la invención se adicionó a la misma receta base en la misma concentración de actividad. A este respecto los valores de % en peso indicados para F49 en la tabla de abajo son correctos y son válidos para HP70 a manera de aproximación.

Después de lavar, el grado de blancura de los textiles lavaos se midió en comparación con el de sulfato de bario el cual se había estandarizado a 100%. La medición se realizó en un espectrómetro Datacolor SF500-2 a 460 nm (filtro de trampa UV 3), diafragma 30 mm, sin brillo, tipo de luz D65, 10º, d/8º. Los resultados obtenidos se compilan como reflexión porcentual, es decir como porcentajes en comparación con el sulfato de bario junto con los valores iniciales respectivos en la tabla 3 de abajo. Se indican los valores promedio de tres mediciones en cada caso. Permiten una conclusión inmediata sobre la contribución de la enzima presente al desempeño de lavado de la composición usada.

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TABLA 3 Contribución de la proteasa HP70 de la invención al desempeño de lavado a una temperatura de 40ºC

4

Todas las tres series de mediciones verifican que la proteasa HP70 según la invención comparada con los detergentes libres de proteasa permite un mejoramiento en el desempeño de lavado sobre suciedades que contienen proteína. Es decir, también muestra una actividad proteolítica en presencia de agentes desnaturalizantes tales como, por ejemplo, tensioactivos. Los valores determinados para la proteasa alcalina de B. Lentus F49, una molécula optimizada para esta área de uso por medio de mutagénesis de punto (compare WO 95/23221 A1) verifican si el procedimiento de ensayo fue correcto. En las series de medición A y a una concentración más baja en series de medición B, HP70 excedió incluso los resultados para F49: los otros valores son comparables con aquellos para F49.

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Ejemplo 9

Contribución de la proteasa HP53 según la invención al desempeño de lavado a temperatura más baja

El anterior ensayo se repitió usando la proteasa HP53 según la invención. Las condiciones fueron las mismas. Sin embargo, el desempeño se determinó en la suciedad D en lugar de en la suciedad C (sangre sobre algodón). El resultado se compila en la tabla 4 de abajo.

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TABLA 4 Contribución de la proteasa HP53 según la invención al desempeño de lavado a una temperatura de 40ºC

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6

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Estas serie de medición verifican que la proteasa HP53 según la invención también aporta un mejoramiento del desempeño de lavado sobre suciedades que contienen proteína comparado con detergentes libres de proteasa. Es decir, también muestra una actividad proteolítica en la presencia de agentes desnaturalizantes tales como, por ejemplo tensioactivos o blanqueadores. Los valores determinados son comparables al menos con aquellos para la alcalina proteasa F49 de B. lentus, incluso distintivamente mejor en las series de medición A y B.

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Ejemplo 10

Contribución de la proteasa HP53dc según la invención al desempeño de lavado a temperatura más baja

Como en los dos ejemplos precedentes, la variante HP53dc también se investigó con respecto a su contribución al desempeño respecto de las suciedades A, B y C. Las condiciones fueron de nuevo las mismas. El resultado se compiló en la tabla 5 de abajo.

TABLA 5 Contribución de la proteasa HP53dc según la invención al desempeño de lavado a una temperatura de 40ºC

7

Estas series de medición verifican que la proteasa HP53dc según la invención también aporta un mejoramiento del desempeño de lavado en suciedades que contienen proteína comparado con detergentes libres de proteasa. Es decir muestra una actividad proteolítica incluso en la presencia de agentes desnaturalizantes tales como, por ejemplo, tensioactivos o blanqueadores. Los valores determinados en las series de medición A y B son claramente superiores a aquellos para la proteasa alcalina F49 de B. lentus y en la serie C al menos comparable.

Ejemplo 11

Contribución de la proteasa HP53dc según la invención al desempeño de lavado a temperatura más alta

El ensayo precedente se repitió con HP53 en las dos suciedades A y B a una temperatura de lavado de 60ºC en las demás condiciones idénticas. El resultado se compila en la tabla 6 de abajo.

TABLA 6 Contribución de la proteasa HP53dc según la invención al desempeño de lavado a 60ºC

8

También a la temperatura de 60ºC en las series de medición A y B se muestra la superioridad de la proteasa HP53dc según la invención frente a la proteasa alcalina B. lentus F49. Afortunadamente, la proteasa HP53dc según la invención a 60ºC no se desnaturaliza notablemente, de tal modo que es adecuada en particular como una proteasa de detergente.

Descripción de la figuras

Figura 1: Alineamiento de las proteasas alcalinas HP70 y HP53 (SEQ ID NO. 4 ó 7) según la invención con proteasas alcalinas del estado de la técnica. Allí significan:

HP70:

Proteasas alcalinas según la invención según SEQ ID NO. 4;

HP53:

Proteasas alcalinas según la invención según SEQ ID NO. 7;

SP:

Proteasa- serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) de Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913) (No de acceso NP636242 en el GenBank);

BLAP:

Proteasas alcalinas de Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1).

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Figura 2: Alineamiento de los genes de la alcalina proteasa según la invención HP70 y HP53 (SEQ ID NO. 3 o 6) con los de la proteasas alcalina del estado de la técnica. Allí significan:

HP70:

Gen de la proteasa alcalina HP70, según la invención, según SEQ ID NO. 3;

HP53:

Gen de la proteasa alcalina HP53, según la invención, según SEQ ID NO. 6;

SP:

Gen de la proteasa - serina extracelular (E.C. 3.4.21.-) de Xanthomonas campestris pv. campestris (ATCC 33913) (número de acceso NP636242 en el GenBank);

BLAP:

Gen de la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1).

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Figura 3: Representación esquemática de un vector de plásmido pUC18 para el establecimiento de un banco de genes de expresión según el ejemplo 2.

El vector se linealizó con Sma I para el registro del ADN - metagenómico digerido con Alu.

Allí significan:

ORI:

Origen de replicación

Plac:

lac-Promotor

lacZ-alfa:

Gen para el alfa-péptido de la beta-galactosidasa

ampR:

Beta-Lactamasa que proporciona resistencia a ampicilina

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Figura 4: Alineación de las secuencias de aminoácido de ambas proteasas HP70 (SEQ ID NO. 4) y HP53 (SEQ ID NO. 7), según la invención, para el desarrollo de la secuencia de consenso de SEQ ID NO. 9.

Las posiciones de aminoácidos allí designadas como variables X pueden referenciarse según esta ilustración ya sea a HP70 o a HP53.

<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

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<120> Nuevas proteasas alcalinas y detergentes y limpiadores que contienen estas nuevas proteasas alcalinas

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<130> H 05925 PCT

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> DE102004019751.2

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2004-04-23

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<160> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador M13f

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaacgac ggccag

\hfill

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador M13r

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1777

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción del organismo desconocido: aislado de ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sigpeptide

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<222> (1)..(96)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1746)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 581

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción del organismo desconocido: aislado de ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 470

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: aislado de ADN, Delta C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(32)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1761

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción del organismo desconocido: aislado de ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sigpeptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(114)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1761)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 586

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción del organismo desconocido: aislado de ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

20

21

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 470

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: aislado de ADN, Delta C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de señal a partir de HP70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 587

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Consensos-Secuencia

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> - o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His o Asn

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> - o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> - o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> - o Pro

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> - o Gli

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> - o Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gln o Pro

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro o Gln

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Gli

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser or Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (65)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (66)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu o Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (82)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Gln

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (149)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (234)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (236)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile o Tyr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (259)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (267)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fe o Tyr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (321)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (386)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (406)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (438)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (487)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr o -

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (488)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (501)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (507)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (511)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (522)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (527)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Thr

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (546)

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<223> Asn o Thr

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (562)

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<223> Ser o Ala

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (574)

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<223> Gli o Ala

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<400> 9

24

25

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<210> 10

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador HP70f

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaattcgatg tctcatgatt cgcaacc

\hfill

27

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<210> 11

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<211> 29

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador HP70r

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<400> 11

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcctcac agcgccgccg tgaccgccg

\hfill

29

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<210> 12

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador HP53f

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctgagcggc ctggcctcgg ccccg

\hfill

25

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<210> 13

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<211> 29

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador HP53r

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcctcac agcgccgccg tgacggccg

\hfill

29

Claims (53)

1. Una proteasa alcalina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 4 al menos en 90% o es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 7 al menos en 87.5%.

2. La proteasa alcalina tal como se reivindicó en la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 4 de manera crecientemente preferible en al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100% o es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 7 de manera creciente preferible en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100%.

3. La proteasa alcalina como se reivindicó en la reivindicación 1 ó 2, donde los valores de homología en cada caso son válidos para la región que corresponde a las posiciones de aminoácidos 33 a 581 como en SEQ ID NO. 4 ó 39 a 586 como en SEQ ID NO. 7.

4. La proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 3, donde los valores de homología de al menos 90% de identidad en cada caso aplican para la región que corresponde a las posiciones de aminoácidos 33 a 470 como en SEQ ID NO. 5 ó 33 a 470 como en SEQ ID NO. 8.

5. La proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene una secuencia de aminoácidos como en la secuencia de consenso de SEQ ID NO. 9, preferiblemente en el rango de las posiciones de aminoácidos 39 a 587, particularmente preferible en el rango de las posiciones de aminoácido 39 a 476.

6. La proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 5, que se codifica por una secuencia nucleótida que es idéntica a la secuencia nucleótida indicada en SEQ ID NO. 3 al menos en 85% y de manera creciente preferiblemente en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100%, en particular para las región que corresponde a las posiciones nucleótidas 97 a 1410 como en SEQ ID NO. 3, o que se codifica por una secuencia nucleótida que es idéntica a la secuencia nucleótida indicada en SEQ ID NO. 6 al menos en 85% y de manera creciente preferiblemente en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100%, en particular para la región que corresponde a las posiciones nucleótidas 115 a 1761 como en SEQ ID NO. 6, muy particularmente para la región que corresponde a las posiciones nucleótidas 115 a 1428 como en SEQ ID
NO. 6.

7. La proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 6, que es aislable de un hábitat natural o que se deriva de un ácido nucleico aislable de un hábitat natural.

8. La proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 7, la cual, o cuyo ácido nucleico asociado, se origina de un organismo que es aislable de un hábitat natural.

9. La proteasa alcalina como se reivindicó en la reivindicación 8, donde es un microorganismo, preferiblemente un hongo o una bacteria, entre éstas preferiblemente una bacteria gram-positiva y particularmente preferible una del género de Bacillus.

10. Una proteasa alcalina o proteína derivada de una proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 9 mediante fragmentación o mutagénesis de deleción que tiene al menos 100 y de manera creciente preferiblemente al menos 150, 200, 250 y muy particularmente preferible al menos 300 aminoácidos ya conectados en la molécula de inicio.

11. La proteasa alcalina o proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 10, derivada de una proteasa alcalina o una proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 10 mediante mutagénesis de inserción, mediante mutagénesis de sustitución y/o mediante fusión con al menos otra proteína.

12. La proteasa alcalina o proteína como se reivindicó en la reivindicación 11 que tiene uno o más reemplazos de aminoácido en las posiciones 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 y 268 en la numeración de la proteasa alcalina de Bacillus lentus, a ser asignados por medio de la alineación en la figura 1.

13. La proteasa alcalina o proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 12, la cual adicionalmente se estabiliza.

14. La proteasa alcalina o proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 13, la cual se derivatiza adicionalmente.

15. La proteasa alcalina o proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 14, la cual tiene al menos un determinante antígeno en común con una de las proteasas alcalinas o proteínas designadas en las reivindicaciones 1 a 14, precisamente por sobre al menos una de las regiones epítopes, dentro de las cuales las posiciones 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61; 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 y 268 se encuentran en la numeración de la proteasa alcalina de Bacillus lentus, a ser asignadas por medio de la alineación en la figura 1.

16. Un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleótida, que es idéntica a la secuencia nucleótida indicada en SEQ ID NO. 3 al menos en 85% o a la secuencia nucleótida indicada en SEQ ID NO. 6 al menos en 85%.

17. El ácido nucleico como se reivindicó en la reivindicación 16, cuya secuencia es idéntica de manera creciente preferible en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y muy particularmente preferible en 100% a una de las secuencias nucleótidas indicadas.

18. El ácido nucleico como se reivindicó en la reivindicación 16 ó 17, donde los valores de homología en cada caso aplican para la región que corresponde a las posiciones nucleótidas 97 a 1746 como en SEQ ID NO, 3 o a las posiciones nucleótidas 115 a 1761 como en SEQ ID NO. 6.

19. El ácido nucleico como se reivindicó en una de las reivindicaciones 16 a 18, donde los valores de homología en cada caso aplican para la región que corresponde a las posiciones nucleótidas 97 a 1410 como en SEQ ID NO. 3 o a las posiciones nucleótidas 115 a 1428 como en SEQ ID NO. 6.

20. El ácido nucleico como se reivindicó en una de las reivindicaciones 16 a 19, que codifica para una proteasa alcalina o una proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 16.

21. El ácido nucleico como se reivindicó en una de las reivindicaciones 16 a 20, del cual uno o preferiblemente mas codones se reemplazan por codones sinónimos.

22. Una célula de un organismo que contiene naturalmente un ácido nucleico como se reivindicó en una de las reivindicaciones 16 a 21.

23. La célula como se reivindicó en la reivindicación 22, la cual expresa naturalmente, preferiblemente secreta, una proteasa o una proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 15.

24. La célula como se reivindicó en la reivindicación 22 ó 23, la cual es un microorganismo, preferiblemente un hongo o una bacteria, entre ellas preferiblemente una bacteria gram-positiva y particularmente preferible una del género Bacillus o una bacteria gram-negativa del género Xanthomonas.

25. Un método para la identificación de una proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 15, el cual se basa en el aislamiento de un ácido nucleico de un hábitat naturalmente colonizado.

26. El método como se reivindicó en la reivindicación 25, usando un, preferiblemente dos, oligonucleótidos que corresponden el uno al otro, los cuales pueden servir como iniciador (primer) PCR y se derivan de una de las dos secuencias SEQ ID NO. 3 ó 6.

27. El método como se reivindicó en la reivindicación 25 ó 26, donde el ácido nucleico aislado se clona, preferiblemente se expresa y particularmente preferible se identifica como una proteasa por medio de la actividad de proteasa del producto de expresión.

28. Un vector que contiene una región de ácido nucleico designada en las reivindicaciones 16 a 21.

29. Un vector de clonación como se reivindicó en la reivindicación 28.

30. Un vector de expresión como se reivindicó en la reivindicación 28.

31. Una célula que después de la modificación por ingeniería genética contiene una región de ácido nucleico designada en las reivindicaciones 16 a 21.

32. La célula como se reivindicó en la reivindicación 31, donde dicha región de ácido nucleico se encuentra en un vector, en particular en un vector como se reivindicó en una de las reivindicaciones 28 a 30.

33. La célula como se reivindicó en la reivindicación 31 ó 32, que expresa, preferiblemente secreta, una de las proteasas alcalinas o proteínas designadas en una de las reivindicaciones 1 a 15.

34. La célula como se reivindicó en una de las reivindicaciones 31 a 33, la cual es una bacteria.

35. La célula como se reivindicó en la reivindicación 34, la cual es una bacteria gram-negativa, en particular una del género Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, en particular cepas de E. coli K12, E. coli B o Klebsiella planticola, y muy particularmente derivados de las variedades Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5\alpha, E. coli JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).

\newpage

36. La célula como se reivindicó en la reivindicación 34, la cual es una bacteria gram-positiva, en particular una del género Bacillus, Stafilococcus o Corynebacterium, muy particularmente de las especies Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amiloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalofilus, Stafilococcus carnosus o Corynebacterium glutamicum.

37. La célula como se reivindicó en una de las reivindicaciones 31 a 33, la cual es una célula eucariótica, preferiblemente una del género Saccharomyces.

38. Un método para la producción de una proteasa alcalina o de una proteína como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 15.

39. El método como se reivindicó en la reivindicación 38 usando un ácido nucleico como se reivindicó en una de las reivindicaciones 16 a 21, preferiblemente usando un vector como se reivindicó en una de las reivindicaciones 28 a 30, particularmente preferiblemente usando una célula como se reivindicó en una de las reivindicaciones 31 a 37.

40. El método como se reivindicó en la reivindicación 38 ó 39, donde la secuencia nucleótida se ha adaptado en uno o preferiblemente más codones al uso de codón de la cepa hospedante.

41. Una composición que comprende una proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 15.

42. La composición como se reivindicó en la reivindicación 41, la cual es un detergente o un limpiador.

43. La composición como se reivindicó en la reivindicación 42, que contiene la proteasa alcalina en una cantidad desde 2 \mug a 20 mg, preferiblemente desde 5 \mug hasta 17.5 mg, particularmente preferible desde 20 \mug hasta 15 mg, muy particularmente preferible desde 50 \mug hasta 10 mg por g de la composición.

44. La composición como se reivindicó en la reivindicación 42 ó 43, que adicionalmente contiene otras enzimas, en particular otras proteasas, amilasas, celulasas, hemicelulasas, oxidoreductasas y/o lipasas.

45. La composición como se reivindicó en la reivindicación 41, la cual es una composición para el tratamiento de materias primas textiles o para el cuidado de textiles.

46. La composición como se reivindicó en la reivindicación 41 para el tratamiento de fibras o textiles que contienen componentes naturales, en particular de aquellos que contienen lana o seda.

47. Un método para la limpieza mecánica de textiles o de superficie duras, donde en al menos uno de los pasos de método se vuelve activa una proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 15.

48. El método como se reivindicó en la reivindicación 47, donde la proteasa alcalina se emplea en una cantidad desde 40 \mug hasta 4 g, preferiblemente desde 50 \mug hasta 3 g, particularmente preferible desde 100 \mug hasta 2 g y muy particularmente preferible desde 200 \mug hasta 1 g por aplicación.

49. Un método para el tratamiento de materias primas textiles o para el cuidado de textiles donde en al menos uno de los pasos de método se vuelve activa una proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 15.

50. El método como se reivindicó en la reivindicación 49 para materias primas de textiles, fibras o textiles que contienen componentes naturales y muy particularmente para aquellos que contienen lana o seda.

51. El uso de una proteasa alcalina como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 15 para la limpieza de textiles o de superficies duras.

52. El uso como se reivindicó en la reivindicación 51, donde la proteasa alcalina se emplea en una cantidad desde 40 \mug hasta 4 g, preferiblemente desde 50 \mug hasta 3 g, particularmente preferible desde 100 \mug hasta 2 g y muy particularmente preferible desde 200 \mug hasta 1 g por aplicación.

53. La composición como se reivindicó en la reivindicación 41, la cual es un cosmético.