CN114127256A

CN114127256A - 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺

Info

Publication number: CN114127256A
Application number: CN202080027831.1A
Authority: CN
Inventors: A·道布; A·戈拉布吉尔安巴拉尼; T·克莱因; S·弗赖尔; T·克丁; M·F·费勒; P·I·科斯特亚
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2019-02-20
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2022-03-01
Also published as: MX2021010109A; WO2020169564A1; US20220186234A1; EP3927809A1

Abstract

本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的工业发酵工艺以及生产感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：提供化学确定的发酵培养基，用包含编码感兴趣的蛋白的基因的芽孢杆菌细胞接种发酵培养基，在有助于芽孢杆菌细胞生长和感兴趣的蛋白表达的条件下于发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞，其中培养芽孢杆菌细胞包括向发酵培养基加入一种或多种补料溶液，所述一种或多种补料溶液含有一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子。

Description

用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺

技术领域

本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的工业发酵工艺以及生产感兴趣的蛋白的方法，包括以下步骤：提供化学确定的发酵培养基，用包含编码感兴趣的蛋白基因的芽孢杆菌细胞接种发酵培养基，在有利于芽孢杆菌细胞生长和感兴趣的蛋白表达的条件下于发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞，其中培养芽孢杆菌细胞包括向发酵液加入包含一种或多种化学确定的碳源的一种或多种补料溶液以及含有一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液。

发明背景

芽孢杆菌属的微生物广泛用作生产有价值化合物的工业主力，特别是蛋白如具有洗涤和/或清洁活性的酶。这些有用物质的生物技术生产经发酵和后续产物纯化来实施。芽孢杆菌能够分泌大量蛋白到发酵液。这允许与胞内生产相比简单的产物纯化工艺并解释了芽孢杆菌在工业应用中的成功。

工业发酵通常在大型发酵罐(工作体积超过1m³)中于需氧条件下通过控制若干工艺变量进行，所述变量包括但不限于通气速率、搅拌速度、pH、各种营养素的初始浓度、一种或多种营养素的补料(feeding)速率概况。为培养和生产感兴趣产物，微生物除了微量营养素如微量元素例如铁、铜、锰、锌等和维生素之外，还需要若干大量营养素，如碳、氮、磷、硫。这些营养素能在发酵培养基中提供或经一种或多种补料溶液于发酵工艺过程中补充。

与工业应用相关的发酵工艺涉及向细胞补充大量碳源以确保足够量的生长的可及性和感兴趣的产物前体的可用性。大部分情况下，所提供的碳源量超过每初始体积的用于发酵工艺的发酵培养基200g纯组分(如葡萄糖)。

一般，发酵工艺能用复合或化学确定的培养基进行。复合培养基包括使用复合原料，如大豆粕、大豆水解物和玉米浆。复合原料含有蛋白、碳水化合物、脂质、维生素、矿物质和其他生物相关分子的混合物。复合原料是化学成分不确定的。另一方面，确定成分的培养基工艺使用已知量的化学确定的组分作为微生物的营养源。在发酵工艺中使用复合培养基能在营养素对细胞的可用性和同步提供方面具有优势，如微量元素和维生素。此含有多种营养素的性质在微生物精确营养需求未知的情况中是有用的。然而，使用复合原料还具有明显的劣势。首先，采用复合原料的工艺，其结果(质量属性)容易出现较大偏差，如产品滴度和产品纯度，这是因为复合原料品质的季节和地理变化。第二，复合原料对下游加工产生负面影响，增加加工成本。例如，发酵液的固体含量可能增加，导致生物质分离所需努力更多。复合原料还引起颜色形成和影响产品气味，这使得脱色和除臭需要更大努力。此外，使用复合原料使得更难以分析发酵工艺的重要质量特性。例如，一旦使用带有不溶性成分的复合原料，测量发酵工艺生物质含量的传统方法就会无效。因此，采用化学确定的培养基的发酵工艺在改善质量均一性和鉴定及分析工艺的优越可能性方面提供明显益处。

出于这些原因，发酵工业在过去的几十年中，只要有可能，即工业微生物的营养需求能用确定成分培养基工艺满足，就从基于复合原料的生产工艺移向确定成分培养基生产工艺。US20140342396A1给出用广泛的生物体基于确定成分的培养基工艺生产多种有价值产物的实施例：用变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的葡萄糖异构酶生产，用产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的青霉素V生产，用产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的7-ADCA生产，用土曲霉(Aspergillus terreus)的洛伐他汀生产，用棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的克拉维酸生产，用黑曲霉(Aspergillus niger)的淀粉转葡糖苷酶生产，用红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的虾青素生产，用高山被孢霉(Mortierella alpina)的花生四烯酸生产，用红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraca)的红霉素生产，用三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的β-胡萝卜素生产。然而，US20140342396A1未公开用芽孢杆菌物种的生产工艺。

WO9110721A2显示使用化学确定的培养基以生产大肠杆菌(Escherichia coli)生物质的实施例。该工艺未教导设计采用芽孢杆菌生产蛋白的工艺的相关信息。

出于小规模实验室工艺的科学目的，确定成分培养基用于芽孢杆菌。这些工艺的特征是规模小于50升、低生物质浓度和低碳源浓度，自然导致低生产率。因此，这些工艺与工业应用不相关，其不提供关于如何基于确定成分培养基建立工业相关工艺的任何教导。例如，EP0406711A1教导了用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DSM 1969生产枯草杆菌蛋白酶，采用化学确定的培养基与铵限制工艺控制策略。铵控制到0.15mM(0.26mg/L)的极低浓度，通过闭环控制使连续测量过程期间的铵浓度成为必需。然而，该方法与工业生产工艺不相关，因为生物质和碳源的量低于(每升92g碳源)用芽孢杆菌的发酵工艺所需的量(其可视作工业相关)。另外，铵限制的推荐工艺太复杂，而不易转移到生产环境。例如，没有可用的可靠的用于氨的在线探头，其能在生产中的无菌条件下使用，且人工取样以可靠地控制氨浓度到推荐工艺所需的低值是常规生产中不想要的。

在EP0631585B1中，尝试通过加入硫酸铵以在发酵工艺期间沉淀感兴趣的蛋白克服芽孢杆菌细胞工业发酵中使用基本发酵培养基的问题。EP0631585B1中指出在没有沉淀情况下，使用基本培养基不是复合培养基的替代选择。然而，由于感兴趣的蛋白的沉淀，在EP0631585B1在所述的工艺不允许从生物质方便地分离感兴趣的蛋白。

因此，对于迄今用芽孢杆菌的工业相关的蛋白生产，一般认为不可能采用化学确定的培养基且必须应用复合培养基：

Rahse,W.(2012)("Enzymes for Detergents."Chemie Ingenieur Technik 84(12):2152-2163)指出用芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶工业生产基于富蛋白的发酵培养基，Maurer,K.H.(2004)("Detergent proteases."Current Opinion in Biotechnology 15(4):330-334)解释了用芽孢杆菌的工业发酵“通常基于复合、便宜的氮源”。Maksym,L.(2010)(Industrielle Fermentation von Bacillus licheniformis zur Produktionvon Proteasen)认为容易获得的培养基组分如葡萄糖和氨抑制芽孢杆菌物种中的蛋白酶生产。因此，必须使用复合培养基组分。来自复合培养基组分的营养素代谢缓慢，因为其必须酶促释放，然后可用于细胞。这避免分解代谢产物阻遏。Maksym推断基于复合原料的蛋白生产使得生产率比用确定成分培养基的蛋白生产高数倍。同样，Schuegerl,K.(2004)("Prozessentwicklung in der Biotechnologie-Ein Rueckblick."Chemie IngenieurTechnik76(7):989-1003)报道了其发现用确定成分培养基的极低生产率。他们认为调控效应是需要复合原料用于芽孢杆菌的蛋白生产的主要因素。氨抑制蛋白酶生产，而蛋白能作为氮源有利地使用，且发现玉米浆改善产物形成，这是因为生长因子也影响生产率。此外，Huebner,U.,U.Bock和K.Schuegerl(1993)("Production of alkaline serine proteasesubtilisin Carlsberg by Bacillus licheniformis on complex medium in a stirredtank reactor."Applied Microbiology and Biotechnology 40(2):182-188)比较复合vs.确定成分的矿质培养基用于通过地衣芽孢杆菌在aprE基因天然启动子控制下生产碱性丝氨酸蛋白酶的性能，发现复合培养基的生产率显著优于化学确定的培养基(多至1000倍)，结论是化学确定的培养基不适合用芽孢杆菌的蛋白酶生产。

在一个涉及aprE启动子控制下于枯草芽孢杆菌内生产淀粉酶的进一步研究中，为了高淀粉酶生产率选择基于复合基质的分批培养(Chen,J.,Y.Gai,G.Fu,W.Zhou,D.Zhang和J.Wen.2015.Enhanced extracellular production of alpha-amylase in Bacillussubtilis by optimization of regulatory elements and over-expression of PrsAlipoprotein.Biotechnol.Lett.37:899-906)。

基于复合培养基的已确立工业规模的枯草杆菌蛋白酶生产工艺示例由Kueppers,T.,V.Steffen,H.Hellmuth,T.O'Connell,J.Bongaerts,K.H.Maurer和W.Wiechert(2014)给出("Developing a new production host from a blueprint:Bacillus pumilus asan industrial enzyme producer."Microbial Cell Factories 13(1):46)，其中使用来自地衣芽孢杆菌ATCC53926的aprE启动子以及短小芽孢杆菌Jo2DSM14395的aprE1和aprE2基因启动子。

芽孢杆菌的aprE基因编码胞外蛋白酶枯草杆菌蛋白酶，这是生物技术工业的有价值的酶产物(Marcus Schallmey,Ajay Singh,Owen P Ward,2004,Developments in theuse of Bacillus species for industrial production,Canadian Journal ofMicrobiology,2004,50:1-17)。广泛研究了枯草芽孢杆菌的aprE基因和其表达调控。

诱导子独立型启动子如aprE启动子常用于蛋白在芽孢杆菌中的异源表达，但工业规模的蛋白生产用这类启动子通过化学确定的发酵培养基尚未成功。

Wenzel,M.,Müller,A.,Siemann-Herzberg,M.和Altenbuchner,J.(2011)(“Self-inducible Bacillus subitilis expression system for reliable and inexpensiveprotein production by high-cell-density fermentation”,Applied andEnvironmental Microbiology,77(18),第6419-6425页)在化学确定的发酵培养基中用枯草芽孢杆菌发酵获得高蛋白滴度的绿色荧光蛋白，这是通过修饰甘露糖操纵子的甘露糖诱导型表达系统以使其不依赖于甘露糖作为诱导物且依赖于葡萄糖限制条件下的去阻遏。然而，为了获得基于不依赖于诱导物的PmanP启动子的不依赖于诱导物的功能表达系统，枯草芽孢杆菌细胞的甘露糖代谢中的驯化是必需的，即枯草芽孢杆菌细胞的manA和manP基因缺失，其分别编码6-磷酸异构酶和磷酸转移酶系统。

由此，迄今未显示化学确定的培养基用于芽孢杆菌，采用广泛用于芽孢杆菌中蛋白表达的标准不依赖于诱导物的启动子系统如aprE启动子的蛋白生产的工业应用。事实上，迄今认为使用标准启动子系统需要应用复合发酵培养基。

因此，需要稳健的、有成本效益的、易于操作的工业发酵工艺以在用于芽孢杆菌的化学确定培养基中生产蛋白，所述芽孢杆菌具有工业上验证的不依赖于诱导物的启动子系统，这是因为这些工艺一般在工业操作中相较于复合培养基工艺具有的优势。

发明概述

作为上述问题的解决方案，本发明涉及工业相关的发酵工艺以在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞，包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

(b)用芽孢杆菌细胞接种步骤(a)的发酵培养基，所述细胞包含在不依赖于诱导物的启动子控制下的编码感兴趣的蛋白的基因，

(c)在有助于芽孢杆菌细胞生长和感兴趣的蛋白表达的条件下，在发酵培养基中培养所述芽孢杆菌细胞，

其中培养芽孢杆菌细胞包括向所述发酵培养基加入一种或多种补料溶液，所述一种或多种补料溶液包含一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子，和

其中在所述发酵工艺中加入的化学确定的碳源总量高于每升初始发酵培养基200g碳源，和

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌。

此外，本发明还涉及生产感兴趣的蛋白的方法，包括使用本文所述的发酵工艺。此外，本发明涉及增加生产工艺中感兴趣的蛋白滴度的方法，包括使用本文所述的发酵工艺。本发明的主题还是包含感兴趣的蛋白的组合物，其通过包括使用本文所述的发酵工艺的方法生产。

附图简要说明

图1：图1显示在根据本发明的工业相关的发酵工艺中随着时间的蛋白酶滴度发展。

图2：图2显示在本发明的工业相关的发酵工艺结束时的蛋白酶滴度。

发明详述

参考以下发明优选实施方案的详细描述和本文所包括的实施例可以更容易地理解本发明。

定义

除非另有说明，本文所用术语应根据相关领域普通技术人员的常规用法理解。

应理解如本说明书和权利要求所用，根据其使用的上下文，“一(a或an)”能指一种或多种。因此，例如，提及“一个细胞”可能意味着可使用至少一个细胞。

本申请中，引用多个出版物。所有这些出版物的公开内容和这些出版物内引用的那些参考文献在此通过引用全文纳入本申请以更充分描述本发明所涉及领域的状态。

术语“工业发酵”或“工业相关的发酵”指其中加入每升初始发酵培养基至少200g碳源的发酵工艺。

“发酵工艺”描述一系列活动，包括制备发酵培养基和在发酵培养基中培养细胞。“培养细胞”或“细胞生长”不理解为限于有高速细胞分裂的指数生长期，还可包括接种后细胞开始生长和静止期的生理状态。发酵工艺能通过限制或防止细胞生长的适当措施终止，例如但不限于降低发酵液温度。

术语“发酵培养基”指基于水的溶液，其含有一种或多种能支持细胞生长的化学化合物。

术语“化学确定的发酵培养基”(也称为“化学确定的培养基”、“确定成分的培养基”或“合成培养基”)应理解为用于发酵培养基，其基本由化学确定的组分以已知浓度构成。“化学确定的组分”是通过其化学式已知的组分。基本由化学确定的组分构成的发酵培养基包括不含有复合营养源的培养基，尤其是没有复合碳和/或氮源，即不含有具有化学未确定的组成的复合原料。基本由化学确定的组分构成的发酵培养基还可包括包含很少量复合营养源，例如复合碳和/或氮源，的培养基，如下所定义的量，其一般不足以维持微生物生长和/或确保形成充足量的生物质。

在此方面，复合原料具有化学未确定的组成，这是因为例如这些原料含有许多不同化合物，其中有复杂的杂聚化合物，且由于季节变化和地理起源差异而组成可变。复合原料在发酵中起到复合碳和/或氮源作用的典型示例是大豆粕、棉籽粕、玉米浆、酵母提取物、酪蛋白水解物、糖蜜等。

本发明所述的化学确定的培养基中可存在很少量的复合碳和/或氮源，例如作为来自用于主发酵的接种体的遗留物(carry-over)。用于主发酵的接种体不必定通过在化学确定的培养基上发酵获得。更通常的是，来自接种体的遗留物可通过主发酵的化学确定培养基中存在少量复合氮源而检测出。少量复合培养基组分如复合碳和/或氮源也可通过向发酵培养基加入少量这些复合组分引入发酵培养基。在用于主发酵的接种体发酵过程中使用复合碳和/或氮源可能是有利的，例如用于加速生物质形成，即增加微生物生长速率和/或帮助内部pH控制。出于同一原因，向主发酵初始阶段加入很少量复合碳和/或氮源如酵母提取物可能是有利的，尤其是在发酵过程早期加速生物质形成。

可在本发明所述发酵工艺中加入发酵培养基的很少量复合营养源定义为最多10％各营养素总量的量，其在发酵过程中添加。特别地，可在本发明所述发酵工艺中加入发酵培养基的很少量复合碳和/或氮源定义为产生最多10％碳总量的复合碳源量和/或产生最多10％氮总量的复合氮源量，其在发酵过程中添加，优选产生最多5％碳总量的复合碳源量和/或产生最多5％氮总量的复合氮源量，更优选产生最多1％碳总量的复合碳源量和/或产生最多1％氮总量的复合氮源量，其在发酵过程中添加。优选地，最多10％碳总量和/或最多10％氮总量优选最多5％碳总量和/或最多5％氮总量，更优选最多1％碳总量和/或最多1％氮总量经来自接种体的遗留物加入，其在发酵过程中添加。最优选地，在发酵过程没有向发酵培养基加入复合碳和/或氮源。

应理解本发明所用术语“化学确定的发酵培养基”包括其中除了化学确定的碳源和化学确定的微量元素源外，所有组分在接种芽孢杆菌细胞前加入培养基的培养基，且进一步包括其中部分组分在接种前加入且部分在接种后加入培养基，优选作为一种或多种补料溶液加入，的培养基。

术语“初始化学确定的发酵培养基”或“初始发酵培养基”或“初始培养基”或“分批培养基”指接种细胞前的发酵培养基。因此，初始化学确定的发酵培养基包含除了补料化学碳源和化学确定的补料微量元素源外的，在发酵过程中加入的所有营养源或发酵过程中加入的仅部分营养源，其中在后一种情况下，剩余部分在接种细胞后加入。

术语“化学确定的营养源”(如“化学确定的碳源”或“化学确定的氮源”)应理解为用于由化学确定的化合物构成的营养源。

术语“发酵液”指含有细胞的发酵培养基。因此，术语“在细胞培养期间加入发酵培养基的”指向含有细胞的发酵培养基即发酵液加入组分。

术语“补料(feed)溶液”在本文中用于在初始发酵培养基接种细胞后，于发酵过程中加入发酵培养基的溶液，其包含支持细胞生长的化合物。在本文中应理解至少部分作为补料溶液提供的化合物能在所述化合物补料前以某种程度存在于发酵培养基。本领域已知多种补料方案(profile)。补料溶液能在发酵过程中连续或间断加入。间断加入补料溶液可以以单一剂量(bolus)在发酵过程中进行一次，或者以不同或同一体积进行数次。连续加入补料溶液可在发酵过程中以相同或不同速度(即体积/时间)进行。还能在发酵过程中应用连续和间断补料方案的组合。作为补料溶液提供的发酵培养基组分能在一种补料溶液中加入或以不同补料溶液加入。在应用超过一种补料溶液的情况下，补料溶液可具有与上述相同或不同的补料方案。优选地，在整个发酵过程中提供一种或多种补料溶液，以连续补料或者以不同或同一体积数次分开剂量添加。

本文所用的“微量元素”是取自下表的元素：铁、铜、锰、锌、钴、镍、钼、硒和硼。

本文所用术语“感兴趣的蛋白的滴度”应理解为以升计的每体积发酵液以g计的感兴趣的蛋白的量。

关于发酵培养基中某一化合物的量，术语“在发酵工艺中加入”或“在发酵工艺期间加入”描述发酵过程中加入的所述化合物的总量，即包括初始发酵培养基中的所述化合物的量以及通过一种或多种补料溶液在培养细胞期间加入的量。

对于本发明，“向发酵培养基加入一种或多种补料溶液，所述一种或多种补料溶液包含一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子”应理解为在接种后向发酵培养基即发酵液加入化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子，在同一补料溶液中或通过分开的补料溶液或其组合加入。一种或多种不同碳源或者一种或多种不同微量元素离子源能用相同或不同补料溶液加入发酵培养基。这意味着不同微量元素离子源能用相同或不同补料溶液加入发酵培养基。

术语“纯化(purification或purifying)”指其中发酵液的至少一种组分如感兴趣的蛋白与至少另一组分如颗粒物分离，转移入不同区室或相的过程，其中不同区室或相不必定需要通过物理屏障分开。这类不同区室的示例是由过滤膜或布分开的2个区室，即滤液与保留物；这类不同相的示例分别是沉淀与上清或滤饼与滤液。

“亲代”序列(如“亲代酶”或“亲代蛋白”)是用于(例如通过引入一个或多个氨基酸取代)引入序列变化的起始序列，从而产生亲代序列的“变体”。因此，术语“酶变体”或“序列变体”或“蛋白变体”参考作为各变体酶起源的亲代酶使用。因而，亲代酶包括野生型酶和用于开发进一步的变体的野生型酶的变体。变体酶与亲代酶的氨基酸序列差异达到一定程度；然而，变体至少维持各亲代酶的酶特性。在一个实施方案中，所述变体酶的酶特性相较于各亲代酶改善。在一个实施方案中，所述变体酶相较于各亲代酶具有至少相同的酶活性，或变体酶相较于各亲代酶具有增加的酶活性。

酶变体可通过相较于亲代酶的序列相同性来定义。序列相同性通常以“％序列相同性”或“％相同性”提供。为在第一步中测定2条氨基酸序列之间的相同性百分比，在所述2条序列之间产生成对序列比对，其中2条序列在其完整长度上对齐(即成对全局比对)。比对用实施Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,第443-453页)的程序产生，优选用程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，采用程序默认参数(缺口开放＝10.0,缺口延伸＝0.5且矩阵＝EBLOSUM62)。用于本发明目的的优选比对是从中能确定最高序列相同性的比对。

2条序列比对后，在第二步中，相同性值应从所述比对确定。因此，根据本发明，应用下列相同性百分比计算：

％相同性＝(相同残基/比对区域长度，其显示完整长度的本发明各序列)*100。因此，涉及此实施方案所述2条氨基酸序列比较的序列相同性如下计算：相同残基数除以比对区域长度，其显示完整长度的本发明各序列。该值乘以100产生“％相同性”。

对于计算2条DNA序列的相同性百分比，与计算2条氨基酸序列相同性百分比的情况相同，除了一些技术规范：

对于编码蛋白的DNA序列，成对比对应在编码区完整长度进行，从起始到终止密码子，排除内含子。

对于非蛋白编码DNA序列，成对比对应在本发明序列完整长度进行，从而本发明完整序列与另一序列或另一序列外的区域作比较。

此外，对于DNA序列，实施Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,第443-453页)的优选比对程序是“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，采用程序默认参数(缺口开放＝10.0,缺口延伸＝0.5且矩阵＝EDNAFULL)。

对于本发明的启动子序列，与任何其他序列的序列相同性如下计算：

第一步，本发明的启动子序列通过局部比对与第二序列比对，例如用程序Blast(NCBI,核苷酸默认设置)或Water(EMBOSS,核苷酸默认设置)。仅考虑局部比对并用于计算相同性，其中所述比对包含本发明启动子序列的至少190个碱基。％相同性随后计算为：％相同性＝(相同残基/比对区域长度)。该值乘以100产生“％相同性”。

术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多肽在本文中定义为对宿主细胞而言非天然的多肽，对宿主细胞而言天然的多肽，其中通过重组DNA技术进行结构修饰如缺失、取代和/或插入以改变天然多肽，或者对宿主细胞而言天然的多肽，其表达定量改变或其表达来自不同于天然宿主细胞的基因组位置，这是由重组DNA技术操纵宿主细胞DNA如启动子更强的结果。类似地，术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多核苷酸指对宿主细胞而言非天然的多核苷酸，对宿主细胞而言天然的多核苷酸，其中通过重组DNA技术进行结构修饰如缺失、取代和/或插入以改变天然多核苷酸，或者对宿主细胞而言天然的多核苷酸，其表达定量改变，这是由重组DNA技术操纵多核苷酸调控元件如启动子更强的结果，或者对宿主细胞而言天然、但未整合入其天然遗传环境的多核苷酸，这是由重组DNA技术进行遗传操纵的结果。关于2种或更多的多核苷酸序列或者2种或更多的氨基酸序列，术语“异源”用于表征2种或更多的多核苷酸序列或者2种或更多的氨基酸序列与彼此特定组合不天然出现。

出于本发明目的，涉及细胞或生物体的“重组”(或转基因)意味着细胞或生物体包含通过基因技术人为引入的异源多核苷酸，涉及多核苷酸则包括通过基因技术/重组DNA技术人为带来的所有这些构建，其中

(a)多核苷酸序列或其部分，或

(b)一种或多种可操作连接多核苷酸的遗传控制序列，包括但不限于启动子，或者

(c)a)和b)

不位于其野生型遗传环境或经修饰。

术语“天然”(或野生型或内源)细胞或生物体和“天然”(或野生型或内源)多核苷酸或多肽指自然界中发现的细胞或生物体以及分别在细胞中发现以其天然形式和在天然遗传环境中发现的所讨论的多核苷酸或多肽(即没有任何人工干预)。

本文所用术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或修饰成包含核酸区段，所述核酸在自然界中不存在或是合成的。当核酸构建体包含多核苷酸表达所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。

术语“控制序列”在本文中定义为包括影响多核苷酸表达的所有序列，包括但不限于编码多肽的多核苷酸表达。各控制序列可对多核苷酸而言是天然或外来的，或彼此是天然或外来的。这类控制序列包括但不限于启动子序列、5’-UTR(也称为前导序列)、核糖体结合位点(RBS，夏因-达尔加诺序列)、3’-UTR、转录起始和终止位点。

涉及调控元件的术语“功能连接”或“可操作连接”应理解为指有序排列的调控元件(包括但不限于启动子)与待表达核酸序列和(若适当)进一步的调控元件(包括但不限于终止子)，从而各调控元件能完成预定功能以允许、修饰、促进或另外影响所述核酸序列表达。例如，控制序列相对于多核苷酸序列编码序列位于合适位置，从而控制序列指导多肽序列编码序列的表达。

“启动子”或“启动子序列”是位于基因上游，与基因处于同一条链，使基因能够转录的核苷酸序列。启动子后面是基因转录起始位点。启动子由起始转录的RNA聚合酶(以及任何所需转录因子)识别。启动子的功能片段或功能变体是可由RNA聚合酶识别且能够起始转录的核苷酸序列。

“活性启动子片段”、“活性启动子变体”、“功能启动子片段”或“功能启动子变体”描述仍具有启动子活性的启动子核苷酸序列片段或变体。

“诱导物依赖性启动子”在本文中理解为在向发酵培养基加入“诱导物分子”后活性增加以使基因转录可行的启动子，启动子可操作连接该基因。因此，对于诱导物依赖性启动子，诱导物分子的存在经信号转导引起了可操作连接启动子的基因表达增加。通过诱导物分子存在而激活前的基因表达不需要不存在，但能以基础基因表达的低水平存在，其在加入诱导物分子后增加。“诱导物分子”是发酵培养基中存在的分子，能够通过提高可操作连接基因的诱导物依赖性启动子活性而影响基因表达增加。优选地，诱导物分子是碳水化合物或其类似物。在一个实施方案中，所述诱导物分子是芽孢杆菌细胞的次级碳源。在碳水化合物的混合物存在情况下，细胞选择性摄取为其提供最大能量和生长优势的碳源(主要碳源)。同时，其抑制参与分解代谢和摄取不太优选碳源(次级碳源)的各种功能。通常，芽孢杆菌细胞的主要碳源是葡萄糖，芽孢杆菌用各种其他糖和糖代谢物作为次级碳源。次级碳源包括例如甘露糖或乳糖，但不限于这些。

诱导物依赖性启动子示例在下表中通过参考各操纵子给出：

相反，不依赖加入发酵培养基的诱导物分子存在的启动子活性(本文称为“不依赖于诱导物的启动子”)是组成型活性或能增加，无论加入发酵培养基的诱导物分子是否存在。

在一个优选实施方案中，所述不依赖于诱导物的启动子是aprE启动子。

“aprE启动子”或“aprE启动子序列”是位于aprE基因(即编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因)上游，与所述aprE基因在同一条链，使得所述aprE基因能够转录的核苷酸序列(或其部分或变体)。

术语“转录起始位点(transcription start site或transcriptional startsite)”应理解为转录在基因序列5’末端起始的位置。在原核生物中，称为+1的第一核苷酸一般是腺苷(A)或鸟苷(G)核苷酸。在此背景下，术语“位点”和“信号”能在本文中互换使用。

术语“表达”或“基因表达”指一个或多个特定基因或者特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”具体指一个或多个基因或者遗传构建体转录成结构RNA(如rRNA、tRNA)或mRNA，后者随后翻译或不翻译成蛋白。所述过程包括DNA转录和所得的mRNA产物加工。

术语“表达载体”在本文中定义为线性或环状DNA分子，包括可操作连接一种或多种控制序列的多核苷酸，其提供多核苷酸表达。

本文所用术语“宿主细胞”包括易受用核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、接合等影响的任何细胞类型。

术语“向细胞引入DNA”和其变化形式在本文中定义为DNA转移入宿主细胞。DNA引入宿主细胞能通过本领域已知的任何方法完成，包括但不限于转化、转染、转导、接合等。

术语“供体细胞”在本文中定义为作为通过任意方式引入另一细胞的DNA来源的细胞。

术语“受体细胞”在本文中定义为DNA引入其中的细胞。

“HMM得分”是通过用于实施例2的方法获得的分值。

详细描述

本发明涉及工业相关的发酵工艺，以用化学确定的发酵培养基在芽孢杆菌细胞中生产感兴趣的蛋白。本文所述的发酵工艺延伸常用实验室规模发酵范围。具体而言，本发明的发明人揭示将微量元素离子-通常在工业相关发酵中在分批培养基中提供-在芽孢杆菌细胞培养期间补料到化学确定的发酵培养基可生产具有工业相关滴度的生物质和蛋白产量。因此，在一个实施方案中，本发明提供在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

(b)用芽孢杆菌细胞接种步骤(a)的发酵培养基，所述细胞包含在不依赖于诱导物的启动子控制下的编码感兴趣的蛋白的基因，和

其中在所述发酵工艺中加入的化学确定的碳源总量高于每升初始发酵培养基200g碳源；和

化学确定的发酵培养基

在化学确定的发酵培养基中培养微生物要求细胞在含有多种化学确定营养源的培养基中培养，所述营养源选自化学确定的氢源、化学确定的氧源、化学确定的碳源、化学确定的氮源、化学确定的硫源、化学确定的磷源、化学确定的镁源、化学确定的钠源、化学确定的钾源、化学确定的微量元素源和化学确定的维生素源。除非另有注明，在本说明书内，即使没有明确提及，用于制备化学确定发酵培养基的营养源应理解为化学确定的营养源。

优选地，所述化学确定的碳源选自碳水化合物、有机酸、碳氢化合物和醇及其混合物。优选的碳水化合物选自葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、乳糖、葡聚糖、麦芽糖糊精、淀粉和菊粉及其混合物。优选的醇选自甘油、甲醇和乙醇、肌醇、甘露醇和山梨醇及其混合物。优选的有机酸选自乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和高级烷酸及其混合物。优选地，化学确定的碳源包含葡萄糖或蔗糖。更优选地，化学确定的碳源包含葡萄糖，优选其中主要量的化学确定碳源以葡萄糖提供。最优选地，化学确定的碳源是葡萄糖。应理解，化学确定的碳源能以糖浆优选葡萄糖浆形式提供。如本文所理解，术语“葡萄糖”应包括葡萄糖浆。葡萄糖浆是高糖浓度的粘性糖溶液。葡萄糖浆中的糖主要是葡萄糖，较小程度上根据糖浆质量等级也有不同浓度的麦芽糖和麦芽三糖。优选地，除了葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖外，糖浆能包含至多10％，优选至多5％，更优选至多3％的杂质。糖浆优选是玉米糖浆。化学确定的氮源优选选自尿素、氨、硝酸、硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵和硝酸铵以及氨基酸如谷氨酸或赖氨酸及其组合。化学确定的氮源更优选选自氨、硫酸铵和磷酸铵。化学确定的氮源最优选是氨。氨用作化学确定的氮源具有以下优势：氨能额外起到pH调节剂作用。优选地，在初始发酵培养基中，每升初始发酵培养基加入至少0.1g氮。

在细胞培养期间通常提供氧，这是通过搅拌或充气给发酵培养基通气进行的。由于水性发酵培养基中存在水，通常提供氢。然而，氢和氧也包含于化学确定的碳和/或化学确定的氮源并能以该方式提供。

镁能通过一种或多种镁盐以化学确定的形式提供给发酵培养基，优选选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁和磷酸镁中的一种或多种，或通过氢氧化镁，或通过一种或多种镁盐与氢氧化镁的组合。优选地，在初始发酵培养基中，每升初始发酵培养基加入至少0.1g镁。

钠能通过一种或多种钠盐以化学确定的形式加入发酵培养基，优选选自氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、磷酸钠、氢氧化钠和其组合。优选地，在初始发酵培养基中，每升初始发酵培养基加入至少0.1g钠。

钙能通过一种或多种钙盐以化学确定的形式加入发酵培养基，优选选自硫酸钙、氯化钙、硝酸钙、磷酸钙、氢氧化钙和其组合。优选地，在初始发酵培养基中，每升初始发酵培养基加入至少0.01g钙。

钾能通过一种或多种钾盐以化学确定的形式加入发酵培养基，优选选自氯化钾、硝酸钾、硫酸钾、磷酸钾、氢氧化钾和其组合。优选地，在初始发酵培养基中，每升初始发酵培养基加入至少0.4g钾。

磷能通过包含磷的一种或多种盐以化学确定的形式加入发酵培养基，优选选自磷酸钾、磷酸钠、磷酸镁、磷酸和其组合。优选地，在初始发酵培养基中，每升初始发酵培养基加入至少1g磷。

硫能通过包含硫的一种或多种盐以化学确定的形式加入发酵培养基，优选选自硫酸钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸和其组合。优选地，在初始发酵培养基中，每升初始发酵培养基加入至少0.15g硫。

优选地，初始化学确定的发酵培养基包含选自以下的一种或多种：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁。

更优选地，初始化学确定的发酵培养基包含：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁。

除了经一种或多种补料溶液提供的微量元素离子，额外微量元素离子可以化学确定的形式加入初始发酵培养基。这些微量元素离子选自铁、铜、锰和锌。还能加入选自钴、镍、钼、硒和硼的一种或多种微量元素离子。优选地，加入微量元素离子铁、铜、镁和锌，且选自钴、镍和钼中的一种或多种任选地加入发酵培养基。对于加入各微量元素，优选能使用选自氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐中的一种或多种或者微量元素氢氧化物，或者一种或多种微量元素盐与一种或多种微量元素氢氧化物的组合。优选地，初始化学确定的发酵培养基包含：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁；和

任选存在的选自以下的一种或多种：

每升初始培养基50μmol-5mmol铁；

每升初始培养基40μmol-4mmol铜；

每升初始培养基30μmol-3mmol锰；和

每升初始培养基40μmol-2mmol锌；和

任选存在的选自以下的一种或多种：

每升初始培养基1μmol-100μmol钴；

每升初始培养基2μmol-200μmol镍；和

每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼。

任选地，可纳入化学确定培养基的化合物是螯合剂如柠檬酸、MGDA、NTA或GLDA，和缓冲剂如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾、碳酸钙等。化学确定的发酵培养基优选包含柠檬酸。当处理无外来pH控制的工艺时，优选加入缓冲剂。另外，消泡剂可在发酵工艺之前和/或期间给予。

化学确定的培养基还可包含维生素。维生素指一组结构不相关的有机物，其是细胞正常代谢所必需的。维生素应加入不能合成所述维生素的芽孢杆菌细胞发酵培养基。维生素能选自硫胺素、核黄素、吡哆醛、烟酸或烟酰胺、泛酸、氰钴维生素、叶酸、生物素、硫辛酸、嘌呤、嘧啶、肌醇、胆碱和氯高铁血红素。

优选地，发酵培养基还包含选择剂，如抗生素例如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素、链霉素或腐草霉素，细胞的选择性标记提供对其的抗性。

加入化学确定培养基的必需化合物含量主要取决于发酵工艺所形成生物质的量。所形成生物质的量通常可变化，从约10到约150克干细胞质量/升发酵液。通常，对于蛋白生产，生产生物质的量低于约10g干细胞质量/升发酵液的发酵工艺不视作工业相关。

化学确定的培养基的各组分最优量取决于在确定成分培养基中进行发酵的芽孢杆菌菌株的类型、生物质的量和待形成的感兴趣的蛋白。使用化学确定的培养基因而有利地允许各培养基组分不依赖于其他组分的浓度变化，此方式促进培养基组成优化。一般，芽孢杆菌细胞生长必需的培养基组分含量可与发酵所用碳源量相关确定，因为所形成生物质的量主要通过所用碳源量确定。

工业相关发酵工艺优选涵盖体积规模涉及标称发酵罐尺寸为至少1m³的发酵工艺，优选至少5m³，更优选至少10m³，甚至更优选至少25m³，最优选至少50m³。工业相关发酵工艺优选涵盖体积规模涉及标称发酵罐尺寸为1-500m³的发酵工艺，优选5-500m³，更优选10-500m³，甚至更优选25-500m³，最优选50-500m³。

优选在接种前，化学确定的培养基和补料溶液进行灭菌处理以防止或减少发酵工艺期间的微生物生长，所述微生物不同于接种的芽孢杆菌细胞。灭菌处理能用本领域已知方法实施，例如但不限于高压灭菌或无菌过滤。培养基组分能与其他培养基组分分开灭菌以防止培养基组分在灭菌处理期间相互作用或防止培养基组分在无菌条件下分解。

化学确定的培养基pH优选在接种前调整。化学确定的培养基pH优选在接种前，但灭菌处理后调整。化学确定的培养基pH优选在接种前调至pH 6.6-9，优选pH 6.6-8.5，更优选pH 6.8-8.5，最优选pH 6.8-pH 8.0。

发酵工艺

如上所述，本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

(b)用芽孢杆菌细胞接种此初始发酵培养基，所述细胞包含在不依赖于诱导物的启动子控制下的编码感兴趣的蛋白的基因，

其中培养芽孢杆菌细胞包括向包含所述细胞的发酵培养基即发酵液加入一种或多种补料溶液，所述一种或多种补料溶液包含一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子，和

本发明的发酵工艺包括以下步骤：制备上述初始发酵培养基，用芽孢杆菌细胞接种发酵培养基，在发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞。任选地，在初始化学确定的发酵培养基接种芽孢杆菌细胞前，初始化学确定的发酵培养基进行灭菌处理且任选地设置初始pH。

因此，在第一步中，制备本文所述化学确定的发酵培养基。发酵培养基随后用本领域已知方法灭菌以防止或减少发酵工艺期间的微生物生长，所述微生物不同于接种入发酵培养基的微生物。

用芽孢杆菌细胞接种化学确定的发酵培养基可通过有或没有起始培养(预培养)情况下的接种完成。优选地，用在本领域技术人员已知条件下生长的预培养物接种发酵物。通过在化学确定的预培养基或复合预培养基中培养细胞，能获得预培养物。化学确定的预培养基可与发酵工艺期间所用化学确定的发酵培养基相同或不同。复合预培养基能包含复合氮和/或复合碳源。优选地，预培养物用复合培养基获得。预培养发酵液能全部或部分加入主发酵培养基。用于接种的预培养液与主发酵培养基体积比优选是0.1-30％。

本发明的主发酵工艺是补料分批工艺。在补料分批工艺中，仅发酵工艺所用化学确定的发酵培养基的部分化合物在发酵培养基接种细胞和发酵开始前加入发酵培养基，剩余部分的化合物在发酵工艺期间加入。根据本发明，至少部分化学确定的碳源和至少部分微量元素离子在细胞培养期间加入发酵培养基。在特定实施方案中，所述本发明发酵工艺能以重复补料分批工艺或连续发酵工艺实现。在重复补料分批或连续发酵工艺中，在发酵期间额外加入完全起始培养基。起始培养基能与其他补料一起或分开加入。在重复补料分批工艺中，含生物质的部分发酵液以固定时间间隔移出，而在连续工艺中，连续发生部分发酵液的移出。发酵工艺因而以对应于取出的发酵液量的部分新鲜培养基补充。

包含为补料所选定的特定营养源的化学确定的化合物可与初始发酵培养基中所提供包含该特定营养源的化学确定的化合物相同或不同。

为补料发酵培养基选定的化学确定化合物能在一种补料溶液中共同加入或在不同补料溶液中彼此分开加入和其组合。细胞培养期间加入的化合物可部分地存在于分批培养基。补料溶液能在发酵过程中连续或间断加入。间断加入补料溶液可在发酵过程中以单一剂量进行一次，或以不同或同一体积进行数次。连续加入补料溶液可在发酵过程中以相同或不同速度(即体积/时间)出现。在发酵过程中还能应用连续和间断补料方案的组合。优选地，连续加入一种或多种补料溶液。以补料溶液提供的发酵培养基组分能在一种补料溶液中或以不同补料溶液加入。在应用超过一种补料溶液的情况下，补料溶液可具有与上述相同或不同的补料方案。优选地，在整个发酵过程中提供一种或多种补料溶液，以连续补料或者以不同或同一体积数次分开剂量添加。

在本发明的发酵工艺中，至少一种或多种化学确定的碳源和一种或多种化学确定的微量元素离子源(选自Fe、Cu、Mn和Zn的一种或多种，任选存在的选自Co、Ni和Mo的另外一种或多种)至少部分作为补料溶液提供。优选地，至少一种或多种化学确定的碳源和微量元素离子Fe、Cu、Mn及Zn的一种或多种化学确定的来源至少部分作为补料溶液提供。这允许在工业相关发酵条件下，使用化学确定的发酵培养基获得高蛋白产量。一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子能在一种或超过一种补料溶液中加入，后者一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子存在于分开的补料溶液。优选地，一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子用分开的补料溶液加入。不同微量元素能用单一补料或分开的补料溶液加入。优选地，不同微量元素离子用单一补料溶液加入。在本发明的一个优选实施方案中，化学确定的氮源和/或化学确定的硫源和/或化学确定的磷源和/或镁源或其至少部分也补料到发酵工艺。在一个更优选实施方案中，所述化学确定的碳和化学确定的氮源以及化学确定的微量元素离子源或其至少部分补料到发酵工艺。更优选补料化学确定的碳和化学确定的氮源及化学确定的微量元素离子源以及化学确定的硫源或其至少部分。进一步优选的是，补料化学确定的碳、化学确定的氮源、化学确定的微量元素离子源或其至少部分以及化学确定的硫源和化学确定的磷源或其至少部分。

在一个进一步优选的实施方案中，所述镁离子或其至少部分也作为补料溶液提供。因此，在此优选实施方案中，所述化学确定的碳源和微量元素离子及镁离子至少部分作为补料溶液提供。这允许在工业相关发酵条件下，使用化学确定的发酵培养基获得高蛋白产量。因此，更优选补料化学确定的碳、化学确定的氮源、化学确定的微量元素离子源、化学确定的镁源、化学确定的硫源和化学确定的磷源或其至少部分。

化学确定的碳源、微量元素离子和镁离子能在一种或超过一种补料溶液中加入，后者有化学确定的碳源、微量元素离子和镁离子存在于分开的补料溶液。优选地，化学确定的碳源、微量元素离子和镁离子用分开的补料溶液加入。优选地，化学确定的氮源作为额外单独补料溶液加入。不同微量元素能用单一补料或分开的补料溶液加入。优选地，不同微量元素离子用单一补料溶液加入。

在此方面，优选的化学确定的碳源是葡萄糖且优选的化学确定的氮源是氨和/或铵盐。优选的镁源是硫酸镁。

优选地，本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍、每升初始培养基至少0.3μmol钼。

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍好和每升初始培养基至少0.3μmol钼。

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼。

优选地，本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入微量元素离子，选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼。

优选地，至少50％化学确定的碳源和至少50％微量元素离子在发酵工艺中作为补料溶液提供。在一个实施方案中，所述至少50％化学确定的碳源、至少50％微量元素离子和至少50％化学确定的氮源在发酵工艺中作为补料溶液提供。在一个实施方案中，所述至少50％化学确定的碳源、至少50％微量元素离子和至少50％镁离子在发酵工艺中作为补料溶液提供。在一个实施方案中，所述至少50％化学确定的碳源、至少50％微量元素离子、至少50％镁离子和至少50％化学确定的氮源在发酵工艺中作为补料溶液提供。在一个实施方案中，所述至少50％化学确定的碳源、至少50％微量元素离子、至少50％镁离子、至少50％化学确定的氮源和至少50％化学确定的硫源在发酵工艺中作为补料溶液提供。在一个实施方案中，所述至少50％化学确定的碳源、至少50％微量元素离子、至少50％镁离子、至少50％化学确定的氮源、至少50％化学确定的硫源和至少50％化学确定的磷源在发酵工艺中作为补料溶液提供。

优选地，发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％化学确定的碳源作为补料溶液提供给发酵工艺。更优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％化学确定的碳源作为补料溶液提供给发酵工艺。

优选地，发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％微量元素离子作为补料溶液提供给发酵工艺。更优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％微量元素离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

优选地，发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％镁离子作为补料溶液提供给发酵工艺。更优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％镁离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

优选地，发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％化学确定的氮源作为补料溶液提供给发酵工艺。更优选地，至少90％或100％化学确定的氮源作为补料溶液提供给发酵工艺。

优选地，发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％化学确定的硫源作为补料溶液提供给发酵工艺。

优选地，发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％化学确定的磷源作为补料溶液提供给发酵工艺。

最优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％化学确定的碳源、至少90％或100％微量元素离子和至少90％或100％化学确定的氮源作为补料溶液提供给发酵工艺，优选另外，发酵工艺中提供的至少90％或100％镁离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

使用补料分批培养基通常能够使用比分批培养基所用显著更高量的碳和化学确定的氮源。特别地，补料分批工艺中施用的化学确定的碳和化学确定的氮源可以比分批工艺所施用最高量高至少约2倍。这进而引起补料分批工艺形成显著更高量的生物质。

在本发明的发酵工艺中，向发酵液加入包含一种或多种化学确定的碳源的一种或多种补料溶液。优选地，一种或多种化学确定的碳源补料溶液连续加入。在发酵工艺中加入的化学确定的碳源优选葡萄糖总量每升初始发酵培养基高于200g碳源。在发酵工艺中加入的化学确定的碳源总量每升初始发酵培养基优选高于300g，更优选高于400g加入发酵工艺的碳源。优选地，至少50％化学确定的碳源在发酵工艺中作为补料溶液提供，更优选发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％化学确定的碳源作为补料溶液提供给发酵工艺。加入这样的量的化学确定的碳源允许使用学成分确定的培养基以工业发酵工艺所需的量形成生物质和感兴趣的蛋白。

在本发明的发酵工艺中，在细胞培养期间向发酵液加入包含微量元素离子的一种或多种补料溶液。优选地，一种或多种微量元素补料溶液连续加入。本发明的发明人揭示了以补料溶液加入微量元素可增加生物质和感兴趣的蛋白的滴度。通过以补料溶液提供显著量的微量元素，蛋白滴度明显改善。

这些微量元素选自铁、铜、锰和锌。还能加入选自钴、镍、钼、硒和硼的一种或多种微量元素。优选向发酵培养基加入微量元素离子铁、铜、锰和锌，任选地加入选自钴、镍和钼的一种或多种。微量元素离子能通过一种或多种补料溶液加入。补料溶液能包含一种或多种微量元素离子。在细胞培养期间经一种或多种补料溶液加入的微量元素离子优选是铁、铜、锰和锌，以及任选存在的钴、镍和钼的一种或多种。

一种或多种微量元素离子在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌。优选地，一种或多种微量元素离子在细胞培养期间通过含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌。

优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基至少50μmol铁。优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基50μmol-5mmol铁。

更优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基至少50μmol铁和每升初始培养基至少40μmol铜。更优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基50μmol-5mmol铁和每升初始培养基40μmol-4mmol铜。

甚至更优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜和每升初始培养基至少30μmol锰。甚至更优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜和每升初始培养基30μmol-3mmol锰。

更优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌。更优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和40μmol-2mmol锌。

更优选地，微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量是每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼。更优选地，微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量是每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol镁和每升初始培养基40μmol-2mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼。

更优选地，微量元素离子在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰、每升初始培养基至少40μmol锌和每升初始培养基至少1μmol钴。更优选地，微量元素离子在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌和每升初始培养基1μmol-100μmol钴。

更优选地，微量元素离子在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰、至少40μmol锌、至少1μmol钴和至少2μmol镍。更优选地，微量元素离子在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol镁、每升初始培养基40μmol-2mmol锌、每升初始培养基1μmol-100μmol钴和每升初始培养基2μmol-200μmol镍。

最优选地，微量元素离子在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰、每升初始培养基至少40μmol锌、每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼。最优选地，微量元素离子在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰、每升初始培养基40μmol-2mmol锌、每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼。

优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶加入发酵培养基的微量元素离子还包含每升初始培养基至少1μmol硒和/或每升初始培养基至少1μmol硼。优选地，在细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶加入发酵培养基的微量元素离子还包含每升初始培养基1μmol-200μmol硒和/或每升初始培养基1μmol-200μmol硼。

在一个优选实施方案中，所述微量元素离子和化学确定的碳源优选葡萄糖，通过分开的补料溶液加入。

优选地，一种或多种微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵液，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰、每升初始培养基至少40μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼。

优选地，一种或多种微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵液，所加入的量选自每升初始培养基至多5mmol铁、每升初始培养基至多4mmol铜、每升初始培养基至多3mmol锰和每升初始培养基至多2mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至多100μmol钴、每升初始培养基至多200μmol镍和每升初始培养基至多50μmol钼。

优选地，一种或多种微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵液，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼。

更优选地，一种或多种微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵液，所加入的量选自每升初始培养基至少250μmol铁、每升初始培养基至少200μmol铜、每升初始培养基至少150μmol锰和每升初始培养基至少100μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少7μmol钴、每升初始培养基至少15μmol镍和每升初始培养基至少1μmol钼。

更优选地，一种或多种微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵液，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基200μmol-4mmol铜、每升初始培养基150μmol-3mmol锰和每升初始培养基100μmol-2mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基7μmol-100μmol钴、每升初始培养基15μmol-200μmol镍和每升初始培养基1μmol-50μmol钼。

优选地，一种或多种微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵液，所加入的量选自每升初始培养基250μmol-2mmol铁、每升初始培养基80μmol-1.5mmol铜、每升初始培养基150μmol-2mmol锰和每升初始培养基100μmol-1.5mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基5μmol-70μmol钴、每升初始培养基10μmol-100μmol镍和每升初始培养基1μmol-30μmol钼。

优选地，一种或多种微量元素离子在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵液，所加入的量选自每升初始培养基250μmol-1mmol铁、每升初始培养基200μmol-1mmol铜、每升初始培养基150μmol-1mmol锰和每升初始培养基100μmol-1mmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基7μmol-70μmol钴、每升初始培养基15μmol-80μmol镍和每升初始培养基1μmol-20μmol钼。

优选至少50％微量元素离子在发酵工艺中作为补料溶液提供，更优选发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％微量元素离子作为补料溶液提供给发酵工艺。更优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％微量元素离子作为补料溶液提供给发酵工艺。最优选地，发酵工艺中提供的至少90％微量元素离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的Fe离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的Cu离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的Mn离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的Zn离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的Co离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的Ni离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的Mn离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的硒离子作为补料溶液提供给发酵工艺。优选地，发酵工艺中提供的至少90％或100％的硼离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌，以及额外地任选存在的选自每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼的一种或多种，

其中至少50％的化学确定的碳源和至少50％的微量元素离子源在发酵工艺中作为补料溶液提供，更优选发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％或100％的化学确定的碳源和至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％或100％的化学确定微量元素离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

为加入微量元素离子，能使用来自氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐中的一种或多种或者微量元素氢氧化物，或者微量元素盐与微量元素氢氧化物的组合。

优选地，在发酵工艺期间没有化合物以使得感兴趣的蛋白以晶体和/或无定形沉淀物形式从溶液中沉淀的量加入。优选地，在细胞培养期间没有硫酸盐优选没有硫酸铵以使得感兴趣的蛋白从溶液中沉淀的量加入。

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中培养芽孢杆菌细胞包括向包含所述细胞的发酵培养基加入一种或多种补料溶液，所述一种或多种补料溶液包含一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子，和

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼，和

其中发酵工艺不包括在细胞培养期间通过以导致感兴趣的蛋白沉淀的量向发酵培养基加入化合物沉淀感兴趣的蛋白的步骤。

优选地，在发酵工艺期间加入一种或多种化学确定的营养源，包含选自以下的一种或多种：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁。

更优选地，在发酵工艺期间加入化学确定的营养源，包含：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁。

在一个实施方案中，本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼；和

其中在发酵工艺期间加入化学确定的营养源，包含：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁；

优选地，其中选自至少50％的氮、至少50％的磷、至少50％的硫、至少50％的钾、至少50％的钠、至少50％的钙和至少50％的镁的一种或多种在细胞培养期间通过一种或多种补料溶液提供；优选其中至少50％的氮和至少50％的硫且优选至少50％的镁在细胞培养期间通过一种或多种补料溶液提供。

在另一实施方案中，所述初始化学确定的发酵培养基包含一种或多种化学确定的营养源，包含选自以下的一种或多种：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁。

优选地，初始化学确定的发酵培养基包含化学确定的营养源，包含：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁。

在一个实施方案中，本发明涉及在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及任选存在的一种或多种额外微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼；

其中，初始化学确定的发酵培养基包含选自以下的一种或多种：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁。

在一个实施方案中，包含镁离子的一种或多种补料溶液在细胞培养期间加入发酵液。优选的，一种或多种镁补料溶液连续加入。镁作为补料溶液加入可在使用化学确定的发酵培养基的发酵工艺中增加生物质和感兴趣的蛋白的滴度。通过以补料溶液而不是在初始分批发酵培养基中提供显著量的镁，蛋白滴度进一步改善。优选地，在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含镁离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入每升初始发酵培养基至少0.1克镁离子。在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含镁离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入每升初始发酵培养基优选至少0.3克镁离子，更优选至少0.4克镁离子。优选每升初始发酵培养基总共至多10g镁离子，更优选每升初始发酵培养基至多5g镁离子，甚至更优选每升初始发酵培养基至多2g镁离子，最优选每升初始发酵培养基至多1g镁离子在发酵工艺中加入。在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含镁离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入每升初始发酵培养基优选量为每升初始发酵培养基0.1-10g镁离子，更优选0.3-8g，甚至更优选0.3-2g，甚至更加优选0.4-1g镁离子，最优选0.4-0.9g镁离子的镁离子。

优选至少50％的镁离子在发酵工艺中作为补料溶液提供，更优选发酵工艺中提供的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的镁离子作为补料溶液提供给发酵工艺。更优选发酵工艺中提供的至少90％的镁阳离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

优选地，镁离子通过一种或多种镁盐或通过氢氧化镁，或通过一种或多种镁盐与氢氧化镁的组合提供，优选地，所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁和磷酸镁的一种或多种。

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌，以及额外的任选存在的选自以下的一种或多种每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼；和

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含镁离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入每升初始发酵培养基至少0.1克镁离子。

在一个实施方案中，所述发酵工艺中提供的至少70％、至少80％、至少90％或100％的化学确定的碳源，至少70％、至少80％、至少90％或100％的化学确定的微量元素离子源和至少70％、至少80％、至少90％或100％的镁离子作为补料溶液提供给发酵工艺。

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及额外的任选存在的选自以下的一种或多种每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼；

其中在发酵工艺中加入一种或多种化学确定的营养源，包含选自以下的一种或多种：

每升初始发酵培养基0.1-5g氮；

每升初始发酵培养基1-6g磷；

每升初始发酵培养基0.15–2g硫；

每升初始发酵培养基0.4–8g钾；

每升初始发酵培养基0.1–2g钠；

每升初始发酵培养基0.01–3g钙；和

每升初始发酵培养基0.1–10g镁；和

其中本文所述至少部分化学确定的氮源、至少部分化学确定的镁离子和至少部分化学确定的硫源在细胞培养期间通过一种或多种补料溶液提供。

在一个实施方案中，所述发酵工艺中提供的至少70％、至少80％、至少90％或100％的碳，至少70％、至少80％、至少90％或100％的化学确定的氮源，至少70％、至少80％、至少90％或100％的化学确定的微量元素离子源，至少70％、至少80％、至少90％或100％的镁离子和至少70％、至少80％、至少90％或100％的化学确定的硫源作为补料溶液在发酵工艺中提供。

优选地，接种细胞前的发酵培养基包含选自以下的一种或多种化合物：化学确定的氮源、化学确定的钙源、化学确定的钾源、化学确定的磷源、化学确定的镁源、化学确定的硫源、化学确定的钠源和化学确定的螯合剂，其在水中。优选地，接种细胞前的发酵培养基包含化学确定的氮源、化学确定的钙源、化学确定的钾源、化学确定的磷源、化学确定的镁源、化学确定的硫源、化学确定的钠源和化学确定的螯合剂，其在水中。更优选地，接种细胞前的发酵培养基包含钙盐、KH₂PO₄、MgSO₄、柠檬酸和水。

优选地，接种细胞前的发酵培养基包含选自以下的一种或多种化合物：化学确定的氮源、化学确定的钙源、化学确定的钾源、化学确定的磷源、化学确定的镁源、化学确定的硫源、化学确定的微量元素源、化学确定的钠源和化学确定的螯合剂，其在水中。优选地，接种细胞前的发酵培养基包含化学确定的氮源、化学确定的钙源、化学确定的钾源、化学确定的磷源、化学确定的镁源、化学确定的硫源、化学确定的微量元素源、化学确定的钠源和化学确定的螯合剂，其在水中。更优选地，接种细胞前的发酵培养基包含钙盐、KH₂PO₄、MgSO₄、微量元素、柠檬酸和水。更优选地，接种细胞前的发酵培养基包含钙盐、KH₂PO₄、MgSO₄、微量元素(优选选自铁、铜、锰和锌，以及任选存在的钴、镍和钼的一种或多种)、柠檬酸和水。更优选地，接种细胞前的发酵培养基包含钙盐、KH₂PO₄、MgSO₄、微量元素铁、铜、锰、锌、钴、镍和钼、柠檬酸和水。更加优选接种细胞前的发酵培养基仅包含化学确定的氮源、化学确定的钙源、化学确定的钾源、化学确定的磷源、化学确定的镁源、化学确定的硫源、化学确定的钠源、一种或多种化学确定的微量元素源和任选存在的化学确定的螯合剂作为水中的培养基组分。甚至更加优选接种细胞前的发酵培养基仅包含氨、钙盐、钾盐、含磷的盐、含硫的盐、氢氧化钠、镁盐和一种或多种微量元素离子盐以及任选存在的螯合剂作为水中的培养基组分。最优选接种细胞前的发酵培养基仅包含氨、钙盐、钾盐、含磷的盐、含硫的盐、氢氧化钠、镁盐、一种或多种微量元素离子盐(优选地所述微量元素选自Fe、Cu、Mn和Zn，及任选存在的另外选自Co、Ni和Mo的一种或多种微量元素，优选Fe、Cu、Mn和Zn的全部，和优选额外选自Co、Ni和Mo的一种或多种微量元素)，以及任选存在的螯合剂，优选柠檬酸盐，作为水中的培养基组分。

优选地，接种细胞前初始发酵培养基中的化学确定的碳源优选葡萄糖的量低于50％、低于40％、低于30％，优选低于20％，或更优选至多10％的在发酵工艺中提供给发酵培养基的化学确定的碳源的量。

优选地，接种细胞前初始发酵培养基中的微量元素离子的量低于50％、低于40％、低于30％，优选低于20％，或更优选至多10％的在发酵工艺中提供给发酵培养基的微量元素离子的量。

优选地，接种细胞前初始发酵培养基中的镁离子的量低于50％、低于40％、低于30％，优选低于20％，或更优选至多10％的在发酵工艺中提供给发酵培养基的镁离子的量。

优选地，芽孢杆菌细胞培养期间的发酵液pH调至或高于pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.2、pH 7.4或pH 7.6。优选地，芽孢杆菌细胞培养期间的发酵液pH调至pH 6.6-9，优选pH 6.6-8.5，更优选pH 7.0-8.5，最优选pH 7.2-pH 8.0。培养期间的发酵液pH优选用氨和/或氢氧化钠调整，优选用氢氧化钠和氨。在本发明的一个优选实施方案中，所述化学确定的氮源是氨且仅以pH调整必需的量加入发酵工艺。这允许化学确定的氮源完全转化成感兴趣的蛋白和生物质产生，而不需形成盐。在此实施方案中，所述化学确定的单独氮源补料可省略。在氢氧化钠用于pH调整的情况下，不需补料额外的钠源。

在一个实施方案中，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的化学确定的氮源在发酵工艺中作为补料溶液提供。优选地，接种细胞前初始发酵培养基中化学确定的氮源的量低于50％，优选低于40％、低于30％、低于20％或低于10％的在发酵工艺中提供给发酵培养基的化学确定的氮源的量。

发酵工艺期间优选细胞培养期间通过一种或多种补料溶液向化学确定的培养基加入的化学确定的氮源的总量可变化，每升初始发酵培养基0.5到50g氮(N)，优选每升初始发酵培养基1-25g N，更优选每升初始发酵培养基10-25g N，其中N以凯氏氮表示。发酵工艺期间加入的化学确定的碳与化学确定的氮源之比可变化，其中化学确定的碳与化学确定的氮源之间最优比的一个决定因素是待形成的感兴趣的蛋白的元素组成。

优选地，本发明的发酵工艺不在氮限制下进行。更优选地，本发明的发酵工艺不在氨限制下进行。

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基50μmol-5mmol铁、每升初始培养基40μmol-4mmol铜、每升初始培养基30μmol-3mmol锰和每升初始培养基40μmol-2mmol锌，以及额外任选存在的选自以下的一种或多种：每升初始培养基1μmol-100μmol钴、每升初始培养基2μmol-200μmol镍和每升初始培养基0.3μmol-50μmol钼；和

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含镁离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入每升初始发酵培养基至少0.1克镁离子；和

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含化学确定的氮源的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入每升初始发酵培养基至少0.5g N，其来自化学确定的氮源优选氨。

优选地，培养期间的发酵液温度是25℃-45℃，优选27℃-40℃，更优选27℃-37℃。

优选地，氧在培养期间加入发酵培养基，优选通过搅拌和充气(优选用0-3bar空气或氧气)。

优选地，发酵时间是1-200小时，优选1-120小时，更优选10-90小时，甚至更优选20-70小时。

宿主细胞

本发明的发酵工艺用于在芽孢杆菌细胞中生产感兴趣的蛋白。

芽孢杆菌细胞优选是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、Bacillus jautus、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。所述芽孢杆菌优选是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。所述芽孢杆菌优选是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。最优选的是衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌ATCC53926。

芽孢杆菌细胞能内源包含编码感兴趣的蛋白的基因(即感兴趣的基因)或者感兴趣的基因对于芽孢杆菌细胞可以是异源的。编码感兴趣的蛋白的基因优选对于宿主细胞是异源的。

包含编码感兴趣的蛋白的基因的核酸构建体包含一种或多种不依赖于诱导物的启动子序列，其指导感兴趣的基因在芽孢杆菌细胞中表达，且进一步包含转录和翻译起始及终止子。

不依赖于诱导物的启动子序列对于宿主细胞可以是天然或异源的。

优选地，不依赖于诱导物的启动子序列是组成型启动子序列，优选sigma A依赖性启动子序列，或受加入发酵培养基的诱导物分子以外的因子调节的启动子序列。

优选地，不依赖于诱导物的启动子序列选自组成型、sigma A依赖性启动子序列(优选描述于Helmann,J.D.1995.Compilation and analysis of Bacillus subtilissigma A-dependent promoter sequences:evidence for extended contact betweenRNA polymerase and upstream promoter DNA.Nucleic Acids Res.23(13),2351-2360)，优选Pveg、PlepA、PserA、PymdA或Pfba的启动子序列，和其有不同强度基因表达的衍生物(优选描述于Guiziou,S.,Sauveplane,V.,Chang,H.J.,Clerte,C.,Declerck,N.,Jules,M.和Bonnet,2016.J.A part toolbox to tune genetic expression in Bacillussubtilis.Nucleic Acids Res.44(15),7495-7508)，以及其组合，和其活性片段或变体。

或者，由加入发酵培养基的诱导物分子以外的因子调节的不依赖于诱导物的启动子序列选自以下的启动子序列：aprE启动子，来自解淀粉芽孢杆菌的amyQ启动子，来自地衣芽孢杆菌的amyL启动子和其变体(优选描述于US5698415)，噬菌体SPO1启动子，优选启动子P4、P5或P15(优选描述于WO15118126或Stewart,C.R.,Gaslightwala,I.,Hinata,K.,Krolikowski,K.A.,Needleman,D.S.,Peng,A.S.,Peterman,M.A.,Tobias,A.和Wei,P.1998,Genes and regulatory sites of the"host-takeover module"in the terminalredundancy of Bacillus subtilis bacteriophage SPO1.Virology 246(2),329-340)，来自苏云金芽孢杆菌的cryIIIA启动子(优选描述于WO9425612或Agaisse,H.和Lereclus,D.1994.Structural and functional analysis of the promoter region involved infull expression of the cryIIIA toxin gene of Bacillusthuringiensis.Mol.Microbiol.13(1).97-107.)，以及其组合，和其活性片段或变体。

优选地，如本文所述，启动子序列能与对宿主细胞而言天然或异源的5’-UTR序列组合。

优选地，启动子序列选自veg启动子、lepA启动子、serA启动子、ymdA启动子、fba启动子、aprE启动子、amyQ启动子、amyL启动子、噬菌体SPO1启动子、cryIIIA启动子、其组合和其活性片段或变体。更优选地，不依赖于诱导物的启动子序列选自aprE启动子、amyL启动子、veg启动子、噬菌体SPO1启动子和cryIIIA启动子，以及其组合，或其活性片段或变体，优选aprE启动子序列。

在进一步优选的实施方案中，所述不依赖于诱导物的启动子序列选自aprE启动子、SPO1启动子(优选P4、P5或P15)(优选描述于WO15118126)、包含启动子序列amyl和amyQ的串联启动子(优选描述于WO9943835)以及包含启动子序列amyL、amyQ和cryIIIa的三重启动子(优选描述于WO2005098016)。

优选地，不依赖于诱导物的启动子序列是aprE启动子序列。

在一个优选实施方案中，所述感兴趣基因在芽孢杆菌细胞中的表达受来自编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的天然启动子(也称为aprE启动子)或其活性片段或活性变体控制。

本领域详细描述了编码来自枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的天然启动子，也称为aprE启动子。aprE基因由sigma因子A(sigA)转录且其表达受到数个调节物的高度控制——DegU用作aprE表达激活因子，而AbrB、ScoC(hpr)和SinR是aprE表达的阻遏物(Ferrari,E.,D.J.Henner,M.Perego和J.A.Hoch.1988.Transcription of Bacillussubtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants.JBacteriol 170:289-295；Henner,D.J.,E.Ferrari,M.Perego和J.A.Hoch.1988.Locationof the targets of the hpr-97,sacU32(Hy),and sacQ36(Hy)mutations in upstreamregions of the subtilisin promoter.J.Bacteriol.170:296-300；Park,S.S.,S.L.Wong,L.F.Wang和R.H.Doi.1989.Bacillus subtilis subtilisin gene(aprE)isexpressed from a sigma A(sigma 43)promoter in vitro and in vivo.J Bacteriol171:2657-2665；Gaur,N.K.,J.Oppenheim和I.Smith.1991.The Bacillus subtilis singene,a regulator of alternate developmental processes,codes for a DNA-bindingprotein.J Bacteriol 173:678-686；Kallio,P.T.,J.E.Fagelson,J.A.Hoch和M.A.Strauch.1991.The transition state regulator Hpr of Bacillus subtilis is aDNA-binding protein.Journal of Biological Chemistry 266:13411-13417)。包含sigma因子A结合位点-35和-10的核心启动子区相对于转录起始位点定位于nt-1-nt-45(Park,S.S.,S.L.Wong,L.F.Wang和R.H.Doi.1989.Bacillus subtilis subtilisin gene(aprE)is expressed from a sigma A(sigma 43)promoter in vitro and in vivo.JBacteriol 171:2657-2665)。WO0151643描述通过野生型aprE启动子的-35位点从TACTAA突变为经典的TGACA-35位点基序增加表达(Helmann,J.D.1995.Compilation and analysisof Bacillus subtilis sigma A-dependent promoter sequences:evidence forextended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA.NucleicAcids Res.23:2351-2360)。

转录起始位点(TSS)相对于aprE基因的起始GTG位于nt-58。5’UTR包含核糖体结合位点(夏因-达尔加诺(Shine Dalgarno))和相对于起始GTG的nt-58–nt-33之内的序列，形成mRNA 5’末端非常稳定的茎环结构，其负责多至25分钟的高mRNA转录物稳定性(Hambraeus等,2000；Hambraeus等,2002)。相对于转录起始位点的nt-141–nt–161区域显示负责以DegU(SacU)和DegQ(SacQ)依赖性方式的完全诱导，而nt-200直到nt-600的5’区由ScoC(Hpr)负调控(Henner,D.J.,E.Ferrari,M.Perego和J.A.Hoch.1988.Location of thetargets of the hpr-97,sacU32(Hy),and sacQ36(Hy)mutations in upstream regionsof the subtilisin promoter.J.Bacteriol.170:296-300)。对枯草芽孢杆菌aprE启动子区内的ScoC(hpr)结合位点进行了更精确的作图，揭示了上述核心启动子区内的额外结合位点(Kallio,P.T.,J.E.Fagelson,J.A.Hoch和M.A.Strauch.1991.The transition stateregulator Hpr of Bacillus subtilis is a DNA-binding protein.Journal ofBiological Chemistry 266:13411-13417)。抑制性过渡态调节物ArbB的结合位点定位到相对于转录起始位点的nt-58-+nt 15(Strauch,M.A.,G.B.Spiegelman,M.Perego,W.C.Johnson,D.Burbulys和J.A.Hoch.1989.The transition state transcriptionregulator abrB of Bacillus subtilis is a DNA binding protein.EMBO J 8:1615-1621)。阻遏物SinR的结合位点定位到相对于转录起始位点的nt-233–nt-268(Gaur,N.K.,J.Oppenheim和I.Smith.1991.The Bacillus subtilis sin gene,a regulator ofalternate developmental processes,codes for a DNA-binding protein.J Bacteriol173:678-686)。

Jakobs等(Jacobs,M.,M.Eliasson,M.

and J.I.Flock.1985.Cloning,sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacilluslicheniformis.Nucleic Acids Res 13:8913-8926；Jacobs,M.F.1995.Expression ofthe subtilisin Carlsberg-encoding gene in Bacillus licheniformis and Bacillussubtilis.Gene 152:69-74)公开了地衣芽孢杆菌NCIB6816菌株的aprE(subC)基因和其5’区的序列(GenBank登录号X03341)。描述了枯草杆菌蛋白酶Carlsberg aprE(subC)基因的表达调控和参与的DNA序列。转录起始位点(TSS)相对于起始ATG位于nt-73，因而5’UTR包含nt-73-nt-1。核糖体结合位点(夏因-达尔加诺)位于nt-16–nt-9位置。sigma因子A的识别序列-10-位点(TATAAT盒)高度保守且位于nt-84–nt-79，而-35位点(TACCAT)位于-10位点上游的17nt，其相较于芽孢杆菌中的标准sigma因子A依赖性启动子不太保守(Helmann,1995)。在调节物DegU(degU32H)或DegQ(degQ36H)提高的枯草芽孢杆菌菌株中，从5’末端的启动子截短(包含nt-122–nt-1和nt-181-nt-1,分别是如Jacobs等,1995所述的突变体771和突变体770)显示枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶表达活性相较于用枯草芽孢杆菌中启动子片段nt-225–nt-1(如Jacobs等,1995所述的突变体769)的表达降低20-40倍。因此，调节物degU刺激枯草杆菌蛋白酶Carlsberg表达的结合位点位于包含nt-225–nt-182的区域内。

WO9102792公开了ATCC 53926碱性蛋白酶基因的启动子功能，用于在地衣芽孢杆菌ATCC 53926中大规模生产枯草杆菌蛋白酶Carlsberg型蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在使用复合培养基组分作为氮和碳源发酵工艺中生产。

WO9102792特定描述枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的5’区，其编码地衣芽孢杆菌ATCC 53926的aprE基因(图27)，包含功能性aprE基因启动子和包含核糖体结合位点(夏因-达尔加诺序列)的5’UTR。此外，其截短片段从AvaI限制性内切核酸酶位点开始，包含功能性aprE基因启动子和含有核糖体结合位点(夏因-达尔加诺序列)的5’UTR，如表达枯草杆菌蛋白酶Carlsberg融合蛋白所例示，所述融合蛋白由来自地衣芽孢杆菌ATCC 53926的aprE基因信号肽以及迟缓芽孢杆菌DSM5383碱性蛋白酶基因的前肽序列和成熟序列组成。

在一个优选实施方案中，所述感兴趣的基因在芽孢杆菌细胞中的表达受来自编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的天然启动子(也称为aprE启动子，其选自HMM得分高于50的启动子组)，或其活性片段或变体控制。

优选地，aprE启动子选自来自以下的aprE启动子：解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、喜盐芽孢杆菌(Bacillus haloduans)、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌。优选地，aprE启动子来自地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。最优选地，aprE启动子来自地衣芽孢杆菌。

更优选地，aprE启动子是编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的启动子，或编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的aprE启动子序列的功能片段或aprE启动子序列的功能变体，其中枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％,至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性。

优选地，aprE启动子包含sigma因子A核心启动子，优选结合基序-35和-10。

优选地，aprE启动子包含调控因子的一个或多个结合基序，所述调控因子选自degU(sacU)、ScoC(hpr)、SinR和AbrB。最优选地，aprE启动子包含调控因子degU的一个或多个结合基序。

优选地，aprE启动子包含sigma因子A核心启动子，优选结合基序-35和-10，和DegU调节物的结合区。

在一个更优选的实施方案中，所述aprE启动子选自但不限于HMM得分高于50的启动子，包含sigma因子A核心启动子，优选结合基序-35和-10，和优选地包含DegU调节物的结合区。

在一个实施方案中，本文所述和用于本发明方法的aprE启动子优选是与SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性的aprE启动子。

在一个实施方案中，本文所述和用于本发明方法的aprE启动子优选是与SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性的aprE启动子。

在一个实施方案中，本文所述和用于本发明方法的aprE启动子优选是与SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性的aprE启动子，其中aprE启动子包含sigma因子A核心启动子，优选结合基序-35和-10，和优选地包含DegU调节物的结合区。

在一个实施方案中，本文所述和用于本发明方法的aprE启动子优选是与SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性的aprE启动子，或其活性片段，且其中aprE启动子包含sigma因子A核心启动子，优选结合基序-35和-10，以及DegU调节物的结合区。

aprE启动子更优选与SEQ ID NO:12有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性。

在一个实施方案中，本文所述和用于本发明方法的aprE启动子优选是与SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性的aprE启动子，或活性片段，其中活性片段选自与SEQ ID NO:13有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性的核酸序列。

aprE启动子最优选与SEQ ID NO:13有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性。

aprE启动子最优选与SEQ ID NO:13有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％至少99.5％或甚至100％的序列相同性，且其中aprE启动子包含sigma因子A核心启动子，优选结合基序-35和-10，并且优选地包含DegU调节物的结合区。

aprE启动子优选是SEQ ID NO:8、10、12或13所示的aprE启动子序列的变体。优选地，SEQ ID NO:8、10、12或13的aprE启动子序列变体包含在一个或多个位置的取代、缺失和/或插入，且其中启动子序列变体具有启动子活性。在一个实施方案中，SEQ ID NO:8、10、12或13的aprE启动子变体包含在一个或多个位置的取代且具有启动子活性，包含多至1、多至2、多至3、多至4、多至5、多至6、多至7、多至8、多至9、多至10、多至11、多至12、多至13、多至14、多至15、多至16、多至17、多至18、多至19或多至20个取代。

在一个实施方案中，所述含感兴趣基因的核酸构建体和/或表达载体除了启动子序列外，还包含一种或多种其他控制序列。优选地，这类控制序列使得基因mRNA能够翻译。这样的控制序列对于宿主细胞而言可以是天然或异源的。这样的控制序列包括但不限于5’-UTR(也称为前导序列)、核糖体结合位点(RBS，夏因-达尔加诺序列)和3’-UTR。核酸构建体和/或表达载体优选包含5’-UTR和RBS。优选地，5’-UTR选自基因的控制序列，所述基因选自aprE、grpE、ctoG、SP82、gsiB、cryIIa和ribG基因。

想要的蛋白可分泌(进入发酵液的液体部分)或可保持在芽孢杆菌细胞内。优选地，发酵产物由芽孢杆菌细胞分泌入发酵液。感兴趣的蛋白分泌入发酵培养基允许促进感兴趣的蛋白与发酵培养基分离。为使感兴趣的蛋白分泌入发酵培养基，核酸构建体包含编码信号肽的多核苷酸，其指导感兴趣的蛋白分泌入发酵培养基。本领域已知多种信号肽。优选的信号肽选自来自枯草芽孢杆菌中AprE蛋白的信号肽或来自枯草芽孢杆菌中YvcE蛋白的信号肽。

具体而言，适合从芽孢杆菌细胞分泌淀粉酶到发酵培养基的是来自枯草芽孢杆菌中的AprE蛋白的信号肽，或来自枯草芽孢杆菌中的YvcE蛋白的信号肽。由于YvcE信号肽适合分泌各种不同淀粉酶，能使用此信号肽，优选与本文所述的发酵工艺组合，以表达各种淀粉酶和在其特性方面分析淀粉酶如淀粉分解活性或稳定性。

在一个实施方案中，包含感兴趣的基因的表达载体位于芽孢杆菌宿主细胞的染色体DNA外。在另一个实施方案中，所述表达载体以一个或多个拷贝整合入芽孢杆菌细胞的染色体DNA。表达载体可以是线性或环状。在一个实施方案中，所述表达载体是病毒载体或质粒。

为了自主复制，所表达载体还可包含复制起点，使得载体能在所讨论的宿主细胞中自主复制。细菌复制起点包括但不限于质粒pUB110、pC194、pTB19、pAMβ1和pTA1060的复制起点，允许在芽孢杆菌中复制(Janniere,L.,Bruand,C.和Ehrlich,S.D.(1990).Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors.Gene 87,53-6；Ehrlich,S.D.,Bruand,C.,Sozhamannan,S.,Dabert,P.,Gros,M.F.,Janniere,L.和Gruss,A.(1991).Plasmid replication and structural stability in Bacillussubtilis.Res.Microbiol.142,869-873)以及pE194的复制起点(Dempsey,L.A.和Dubnau,D.A.(1989).Localization of the replication origin of plasmidpE194.J.Bacteriol.171,2866-2869)。复制起点可具有突变以使其功能在宿主细胞中成为温度敏感型(参见例如Ehrlich,1978,Proceedings of the National Academy ofSciences USA75:1433-1436)。

在一个实施方案中，所述表达载体包含允许容易选择转化细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是编码产物的基因，其提供杀生物剂抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。细菌选择性标记包括但不限于来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。此外，选择可通过共转化完成，例如描述于WO91/09129，其中选择性标记在单独载体上。

感兴趣的蛋白

本发明涉及生产感兴趣的蛋白的方法，包括使用本文所述的发酵工艺。因此，本发明涉及生产感兴趣的蛋白的方法，包括本文所述发酵工艺，进一步详细地包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中培养芽孢杆菌细胞包括向发酵液加入一种或多种补料溶液，所述一种或多种补料溶液包含一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子，和

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及额外地任选存在的选自以下的一种或多种：每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼。

优选地，感兴趣的蛋白以至少3g蛋白(干物质)/kg发酵液的量，优选至少5g蛋白(干物质)/kg发酵液的量，优选至少10g蛋白(干物质)/kg发酵液的量，优选至少15g蛋白(干物质)/kg发酵液的量，优选至少20g蛋白(干物质)/kg发酵液的量表达。

在一个实施方案中，由于本发明发酵工艺适合提供高滴度的感兴趣的蛋白，本发明涉及增加感兴趣的蛋白滴度的方法，包括本文所述的发酵工艺。发酵工艺优选提供至少5g/l感兴趣的蛋白的滴度。发酵工艺更优选提供至少10g/l感兴趣的蛋白的滴度。发酵工艺甚至更优选提供至少15g/l感兴趣的蛋白的滴度。

感兴趣的蛋白优选是酶。在一个特定实施方案中，所述酶分类为氧化还原酶(EC1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC 6)(根据酶命名法的EC编号，国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会推荐(1992)(Recommendations(1992)of the Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry andMolecular Biology)，包括其1993-1999年发表的增刊)。在一个优选实施方案中，所述感兴趣的蛋白是适合用于洗涤剂的酶。

更优选地，酶是水解酶(EC 3)，优选糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)。尤其优选的酶是选自以下的酶：淀粉酶(尤其是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1))、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)、脂肪酶(EC 3.1.1.3)、植酸酶(EC3.1.3.8)、核酸酶(EC 3.1.11-EC 3.1.31)和蛋白酶(EC 3.4)；特别是选自以下的酶：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶和纤维素酶，优选淀粉酶或蛋白酶，优选蛋白酶。最优选的是丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)，优选枯草杆菌蛋白酶。

在一个特别优选的实施方案中，优选下列感兴趣的蛋白：

蛋白酶

具有蛋白裂解活性的酶称为“蛋白酶”或“肽酶”。蛋白酶是发挥“蛋白酶活性”或“蛋白裂解活性”的活性蛋白。

蛋白酶是类别EC 3.4的成员。蛋白酶包括氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC3.4.13)、二肽基肽酶和三肽基肽酶(EC 3.4.14)、肽基二肽酶(EC 3.4.15)、丝氨酸型羧肽酶(EC3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、omega肽酶(EC3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC3.4.23)、金属内肽酶(EC 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC 3.4.25)、未知催化机制的肽链内切酶(EC 3.4.99)。

市售可得蛋白酶包括但不限于Lavergy^TM Pro(BASF)、

Duralase^TM、Durazym^TM、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

和

(诺维信(Novozymes)A/S)，以下列商标销售的那些：

Prime、Purafect

Purafect

Purafect

和

(Danisco/杜邦(DuPont))、Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.)、迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶和来自花王(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

至少一种蛋白酶可选自丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶(EC3.4.21)的特征是在催化活性位点具有丝氨酸，其与底物在催化反应中形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶可选自糜蛋白酶(如EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(如EC 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(如EC 3.4.21.37或EC 3.4.21.71)、颗粒酶(如EC 3.4.21.78或EC 3.4.21.79)、激肽释放酶(如EC 3.4.21.34,EC 3.4.21.35,EC 3.4.21.118或EC 3.4.21.119)、纤溶酶(如EC 3.4.21.7)、胰蛋白酶(如EC 3.4.21.4)、凝血酶(如EC 3.4.21.5,)和枯草杆菌蛋白酶(也称为枯草杆菌肽酶(subtilopeptidase)，如EC 3.4.21.62)，后者在本文中也称为“枯草杆菌蛋白酶”。

暂时命名为枯草杆菌酶(subtilase)的丝氨酸蛋白酶亚组由Siezen等.(1991),Protein Eng.4:719-737和Siezen等.(1997),Protein Science 6:501-523提出。其通过超过170种丝氨酸蛋白酶(之前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶)氨基酸序列的同源性分析定义。枯草杆菌蛋白酶之前通常定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，且根据Siezen等，现在是枯草杆菌酶亚组。鉴定了多种枯草杆菌酶，且测定了一些枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于这些枯草杆菌酶和其氨基酸序列的更详细描述，参考Siezen等.(1997),Protein Science 6:501-523。

枯草杆菌酶可分成6个细分，即枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素(lantibiotic)肽酶家族、kexin家族和pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的一个亚组是枯草杆菌蛋白酶，其是来自S8家族的丝氨酸蛋白酶，如MEROPS数据库所定义(http://merops.sanger.ac.uk)。肽酶家族S8包含丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶和其同源物。

S8家族、A亚家族的主要成员是：

名称	MEROPS S8家族，A亚家族
		枯草杆菌蛋白酶Carlsberg	S08.001
迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素	S08.003
		嗜热蛋白酶	S08.007
枯草杆菌蛋白酶BPN’	S08.034
		枯草杆菌蛋白酶DY	S08.037
碱性肽酶	S08.038
		枯草杆菌蛋白酶ALP 1	S08.045
枯草杆菌蛋白酶sendai	S08.098
		碱性弹性蛋白酶YaB	S08.157

枯草杆菌蛋白酶型的亲代蛋白酶(EC 3.4.21.62)和其变体可以是细菌蛋白酶。所述细菌蛋白酶可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、地芽孢杆菌(Geobacillus)、乳酸芽孢杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)或链霉菌(Streptomyces)蛋白酶，或革兰氏阴性菌多肽如弯曲杆菌(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌(Flavobacterium)、梭杆菌(Fusobacterium)、螺杆菌(Helicobacter)、llyobacter、奈瑟氏菌(Neisseria)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)或脲原体(Ureaplasma)蛋白酶。此家族的综述提供于例如"Subtilases:Subtilisin-like Proteases",R.Siezen,"Subtilisin enzymes"的第75-95页，R.Bott和C.Betzel编,纽约,1996。

至少一种蛋白酶可选自以下：来自解淀粉芽孢杆菌BPN'的枯草杆菌蛋白酶(描述于Vasantha等.(1984)J.Bacteriol.卷159,第811-819页和JA Wells等.(1983)收录于Nucleic Acids Research,卷11,第7911-7925页)；来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg；公开于EL Smith等.(1968),J.Biol Chem,卷243,第2184-2191页和Jacobs等.(1985),Nucl.Acids Res,卷13,第8913-8926页)；枯草杆菌蛋白酶PB92(碱性蛋白酶PB92的初始序列描述于EP 283075A2)；枯草杆菌蛋白酶147和/或309(分别是

，如WO 89/06279所公开；来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，如WO91/02792所公开，例如来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483或迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体，如WO95/23221所述；来自嗜碱芽孢杆菌(DSM 11233)的枯草杆菌蛋白酶，如DE 10064983所公开；来自吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii，DSM 14391)的枯草杆菌蛋白酶，如WO 2003/054184所公开；来自杆菌(DSM 14390)的枯草杆菌蛋白酶，如WO 2003/056017所公开；来自杆菌(DSM 14392)的枯草杆菌蛋白酶，如WO2003/055974所公开；来自吉氏芽孢杆菌(DSM14393)的枯草杆菌蛋白酶，如WO2003/054184所公开；具有SEQ ID NO:4的枯草杆菌蛋白酶，如WO 2005/063974所述；具有SEQ ID NO:4的枯草杆菌蛋白酶，如WO 2005/103244所述；具有SEQ ID NO:7的枯草杆菌蛋白酶，如WO 2005/103244所述；和具有SEQ ID NO:2的枯草杆菌蛋白酶，如申请DE 102005028295.4所述。

至少一种枯草杆菌蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶309(其可在本文称为

)，如WO 89/06279表I的序列a)所公开，或与之至少80％相同的变体，并且具有蛋白裂解活性。

已知蛋白酶包含描述于以下的变体：WO 92/19729、WO 95/23221、WO 96/34946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/11768、WO 01/44452、WO 02/088340、WO03/006602、WO2004/03186、WO 2004/041979、WO 2007/006305、WO 2011/036263、WO 2011/036264和WO2011/072099。合适的示例特别包含衍生自EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶变体(带有在一个或多个下列位置处的氨基酸取代:3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274，其具有蛋白裂解活性)。另外，枯草杆菌蛋白酶在位置Asp32、His64和Ser221未突变。

至少一种枯草杆菌蛋白酶可具有EP 1921147所述的SEQ ID NO:22，或是其变体，与EP 1921147所述的SEQ ID NO:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同且具有蛋白裂解活性。在一个实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶与EP 1921147所述的SEQ ID NO:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同，且特征为在101位(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)、或天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)、或丙氨酸(A)、或甘氨酸(G)、或丝氨酸(S)且有蛋白裂解活性。在一个实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶与EP1921147所述的SEQ ID NO:22至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同，且特征为在101位(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选谷氨酸(E)，并且具有蛋白裂解活性。这种枯草杆菌蛋白酶变体可包含在101位的氨基酸取代，如R101E或R101D，单独或与在3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和/或274位(根据BPN’编号)的一个或多个取代组合，且具有蛋白裂解活性。在一个优选实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶与EP 1921147所述的SEQ ID NO:22相同，除了蛋白酶特征为在101位(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)。在一个实施方案中，所述蛋白酶包含一个或多个进一步的取代：(a)在3位的苏氨酸(3T)，(b)在4位的异亮氨酸(4I)，(c)在63位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63A、63T或63R)，(d)在156位的天冬氨酸或谷氨酸(156D或156E)，(e)在194位的脯氨酸(194P)，(f)在199位的甲硫氨酸(199M)，(g)在205位的异亮氨酸(205I)，(h)在217位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217D、217E或217G)，(i)根据(a)-(h)的2种或更多氨基酸的组合。

合适的枯草杆菌蛋白酶可与EP 1921147所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，且特征为包含一个氨基酸(根据(a)-(h))或者(i)所述组合以及氨基酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G或101S(根据BPN’编号)，并且具有蛋白裂解活性。

在一个实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶与EP 1921147所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，且特征为包含突变(根据BPN’编号)R101E或S3T+V4I+V205I或S3T+V4I+R101E+V205I或S3T+V4I+V199M+V205I+L217D，并且具有蛋白裂解活性。如果需要这些蛋白酶分泌入发酵培养基，优选使用来自枯草芽孢杆菌的AprE蛋白的信号肽。

在另一个实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶包含与EP 1921147所述的SEQ ID NO:22至少80％相同的氨基酸序列且进一步特征为包含S3T+V4I+S9R+A15T+V68A+D99S+R101S+A103S+I104V+N218D(根据BPN’编号)，并且具有蛋白裂解活性。

枯草杆菌蛋白酶可具有与EP 1921147所述的SEQ ID NO:22至少80％相同的氨基酸序列且进一步特征为包含R101E和一个或多个选自以下的取代：S156D、L262E、Q137H、S3T、R45E,D,Q、P55N、T58W,Y,L、Q59D,M,N,T、G61D,R、S87E、G97S、A98D,E,R、S106A,W、N117E、H120V,D,K,N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A,G、Y171L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T、D及L262N、Q、D(如WO 2016/096711所述和根据BPN’编号)，并且具有蛋白裂解活性。

本发明所述蛋白酶具有蛋白裂解活性。用于测定蛋白裂解活性的方法可通过文献熟知(参见例如Gupta等.(2002),Appl.Microbiol.Biotechnol.60:381-395)。蛋白裂解活性可用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA,短AAPF；参见例如DelMar等.(1979),Analytical Biochem 99,316-320)作为底物测定。pNA通过蛋白水解从底物分子中切割，引起黄色游离pNA释放，这能通过检测OD405定量。

淀粉酶

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)可在多糖中实施(1->4)-α-D-糖苷键的内水解，所述多糖含有3个或更多(1->4)-α连接-D-葡萄糖单元。淀粉酶以随机方式作用于淀粉、糖原和相关多糖及寡糖；还原基团以α构型释放。其他淀粉酶示例包括：β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(E.C.3.2.1.98)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(E.C.3.2.1.133)。

许多淀粉酶描述于专利和公开的专利申请，包括但不限于：WO 2002/068589、WO2002/068597、WO 2003/083054、WO 2004/091544和WO 2008/080093。

已知淀粉酶衍生自地衣芽孢杆菌，具有WO 95/10603所述的SEQ ID NO:2。合适的变体与WO 95/10603所述的SEQ ID NO:2至少90％相同，和/或包括在下列位置的一个或多个取代：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444，其具有淀粉分解活性。这类变体描述于WO94/02597、WO 94/018314、WO 97/043424和WO 99/019467的SEQ ID NO:4。

已知淀粉酶衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌，具有WO 02/10355所述的SEQ ID NO:6，或与之至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。SEQ ID NO:6的合适变体包括与之至少90％相同的那些，和/或还包含在181和/或182位的缺失和/或在193位的取代。

已知淀粉酶衍生自杆菌物种707，具有WO 99/19467所公开的SEQ ID NO:6，或与之至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。

已知淀粉酶来自盐敏芽孢杆菌，具有WO 96/2387所述的SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:7，也描述为SP-722，或与所述序列之一至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。

已知淀粉酶衍生自芽孢杆菌物种DSM 12649，具有WO 00/22103所公开的SEQ IDNO:4，或与之至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。

已知淀粉酶来自芽孢杆菌菌株TS-23，具有WO 2009/061380所公开SEQ ID NO:2，或与之至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。

已知淀粉酶来自噬细胞菌属物种(Cytophaga sp.)，具有WO 2013/184577所公开的SEQ ID NO:1，或与之至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。

已知淀粉酶来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)DSM 90，具有WO 2010/104675所公开的SEQ ID NO:1，或与之至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。

已知具有WO 00/60060所述的SEQ ID NO:2的氨基酸1-485的淀粉酶，或包含与SEQID NO:2的氨基酸1-485至少96％相同的氨基酸序列的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。

已知具有WO 2006/002643所述的SEQ ID NO:12的淀粉酶，或与之至少80％相同且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括相较于SEQ ID NO:12有至少80％相同性和/或在位置Y295F和M202LITV包含取代并且具有淀粉分解活性的那些。

已知具有WO 2011/098531所述的SEQ ID NO:6的淀粉酶，或与之至少80％相同且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括相较于SEQ ID NO:6有至少80％相同性和/或在选自以下的一个或多个位置处包含取代且具有淀粉分解活性的那些：193[G、A、S、T或M]，195[F、W、Y、L、I或V]，197[F、W、Y、L、I或V]，198[Q或N]，200[F、W、Y、L、I或V]，203[F、W、Y、L、I或V]，206[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D或E]，210[F、W、Y、L、I或V]，212[F、W、Y、L、I或V]，213[G、A、S、T或M]和243[F、W、Y、L、I或V]。

已知具有WO 2013/001078所述SEQ ID NO:1的淀粉酶，或与之至少85％相同且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括相较于SEQ ID NO:1有至少85％相同性和/或在对应位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476和G477的2个或更多(数个)位置处包含改变且具有淀粉分解活性的那些。

已知具有WO 2013/001087所述的SEQ ID NO:2的淀粉酶，或与之至少85％相同且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括相较于SEQ ID NO:2有至少85％相同性和/或在位置181+182或182+183或183+184处包含缺失的那些，其具有淀粉分解活性。合适的淀粉酶包括相较SEQ ID NO:2有至少85％相同性和/或在位置181+182或182+183或183+184处包含缺失的那些，其在对应W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476和G477的任意位置处包含1个或2个或更多修饰且具有淀粉分解活性。

淀粉酶还包括来自上述淀粉酶的杂合α-淀粉酶，例如描述于WO 2006/066594。

市售可得淀粉酶包括：

Duramyl^TM,Termamyl^TM,Fungamyl^TM,Stainzyme^TM,Stainzyme Plus^TM,Natalase^TM,Liquozyme X和BAN^TM(来自诺维信(Novozymes)A/S),和Rapidase^TM,Purastar^TM,PoweraseTM,Effectenz^TM(M100，来自杜邦(DuPont)),Preferenz^TM(S1000,S110和F1000；来自杜邦),PrimaGreen^TM(ALL；杜邦),Optisize^TM(杜邦)。

脂肪酶

“脂肪酶”、“解脂酶”、“脂质酯酶”都指EC 3.1.1类的酶(“羧酸酯水解酶”)。脂肪酶(E.C.3.1.1.3,三酰基甘油脂酶)可将甘油三酯水解成更亲水的甘油单酯和甘油二酯、游离脂肪酸和甘油。脂肪酶通常还包括对不同于甘油三酯的底物有活性或切割特定脂肪酸的酶，如磷脂酶A(E.C.3.1.1.4)、半乳糖脂酶(E.C.3.1.1.26)、角质酶(EC 3.1.1.74)，和具有甾醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)的酶。

专利和公开的专利申请描述了许多脂肪酶，包括但不限于：WO2000032758、WO2003/089620、WO2005/032496、WO2005/086900、WO200600976、WO2006/031699、WO2008/036863、WO2011/046812和WO2014059360。

脂肪酶用于洗涤剂和清洁产品以去除油脂、脂肪、油和奶渍。市售可得脂肪酶包括但不限于：Lipolase^TM、Lipex^TM、Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信A/S)、Lumafast(最初来自杰能科(Genencor))和Lipomax(吉斯特布罗卡德斯有限公司(Gist-Brocades)/现在的DSM)。

用于测定解脂活性的方法通过文献熟知(参见例如Gupta等.(2003),Biotechnol.Appl.Biochem.37,第63-71页)。例如，脂肪酶活性可通过底物棕榈酸对硝基苯酯(pNP-棕榈酸酯，C:16)的酯键水解来测量，释放黄色的pNP且能在405nm检测。

纤维素酶

“纤维素酶(cellulase、cellulase enzyme)”或“纤维素分解酶”是参与纤维素水解的酶。已知3个主要纤维素酶种类，即内切-ss-1,4-葡聚糖酶(内切-1,4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶,E.C.3.2.1.4；水解纤维素中的β-1,4-糖苷键)、纤维二糖水解酶(1,4-P-D-葡聚糖纤维二糖水解酶,EC 3.2.1.91)和ss-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。

专利和公开的专利申请描述了纤维素酶，包括但不限于：WO1997/025417、WO1998/024799、WO2003/068910、WO2005/003319和WO2009020459。

市售可得纤维素酶包括Celluzyme^TM、Endolase^TM、Carezyme^TM、Cellusoft^TM、Renozyme^TM、Celluclean^TM(来自诺维信A/S)、Ecostone^TM、Biotouch^TM、Econase^TM、Ecopulp^TM(来自AB Enzymes Finland)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM、杰能科洗涤剂纤维素酶L、IndiAge^TM Neutra(来自杰能科国际公司(Genencor International Inc.)/杜邦)、Revitalenz^TM(2000，来自杜邦)、Primafast^TM(杜邦)和KAC-500^TM(来自花王株式会社(KaoCorporation))。

本发明所述膜纤维素酶具有“纤维素分解活性”或“纤维素酶活性”。本领域技术人员已知测量纤维素分解活性的试验。例如，纤维素分解活性可通过以下情况测定：纤维素酶使羧甲基纤维素水解成还原碳水化合物，其还原能力经铁氰化物反应方式比色测定，根据Hoffman,W.S.,J.Biol.Chem.120,51(1937)所述。

甘露聚糖酶

甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)可水解甘露糖中的内部β-1,4键。聚合物。“甘露聚糖酶”可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。已知甘露聚糖酶衍生自野生型芽孢杆菌或腐质霉(Humicola)，尤其是黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉(H.insolens)。合适的甘露聚糖酶描述于WO99/064619。

市售可得甘露聚糖酶包括：

(诺维信AIS)。

果胶裂解酶

果胶裂解酶(E.C.4.2.2.2)消除性剪切(1->4)-α-D-聚半乳糖醛酸以产生寡糖，在其非还原末端有4-脱氧-α-D-半乳糖-4-enuronosyl基团。

专利和公开的专利申请描述了果胶裂解酶，包括但不限于：WO2004/090099。已知果胶裂解酶衍生自芽孢杆菌，尤其是地衣芽孢杆菌或黏琼脂芽孢杆菌或任意这些的变体，例如描述于US 6,124,127,WO 99/027083,WO 99/027084,WO 2002/006442,WO2002/092741,WO 2003/095638。

市售可得果胶裂解酶包括：Xpect^TM、Pectawash^TM和Pectaway^TM(诺维信A/S)；PrimaGreen^TM、EcoScour(杜邦)。

核酸酶

核酸酶(EC 3.1.21.1)也称为脱氧核糖核酸酶I，或DNase对5'-磷酸二核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸末端产物进行内切核苷酸剪切。

专利和公开的专利申请描述了核酸酶，包括但不限于：US3451935、GB1300596、DE10304331、WO2015155350、WO2015155351、WO2015166075、WO2015181287和WO2015181286。

本发明的一个优选实施方案是在化学确定的发酵培养基中培养地衣芽孢杆菌细胞的发酵工艺，包括步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

(b)用地衣芽孢杆菌细胞接种步骤(a)的发酵培养基，所述细胞包含在不依赖于诱导物的启动子，优选aprE启动子序列控制下的编码碱性蛋白酶或淀粉酶的基因，

(c)在有助于地衣芽孢杆菌细胞生长和碱性蛋白酶或淀粉酶表达的条件下，在发酵培养基中培养地衣芽孢杆菌细胞，

其中培养地衣芽孢杆菌细胞包括向发酵培养基加入一种或多种补料溶液，所述溶液包含葡萄糖和一种或多种微量元素离子，且优选包含镁离子，和

其中在发酵工艺中加入的葡萄糖总量高于每升初始发酵培养基200g葡萄糖；和

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol、每升初始培养基至少30μmol和每升初始培养基至少40μmol；和

其中，优选地，发酵工艺的pH保持高于7.0，优选pH 7.2-pH 8.0，优选通过向发酵液加入铵离子保持，且其中，优选地，发酵在需氧条件下进行，持续至少24小时，优选至少40小时。

下游加工

可以进行或可以不进行进一步从发酵液纯化感兴趣的蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含感兴趣的蛋白的发酵液，其通过本文所述发酵工艺获得。

在另一个实施方案中，可以从发酵液进一步纯化所述感兴趣的蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明涉及生产感兴趣的蛋白的方法，包括本文所述的发酵工艺，进一步详细地包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中培养芽孢杆菌细胞包括向所述发酵培养基加入一种或多种补料溶液，所述一种或多种补料溶液包含一种或多种化学确定的碳源和一种或多种微量元素离子，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及额外任选存在的选自以下的一种或多种：每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼；和

(d)从发酵液纯化感兴趣的蛋白。

(a)提供化学确定的发酵培养基，

(d)从发酵液纯化感兴趣的蛋白；

其中所述感兴趣的蛋白是丝氨酸蛋白酶。

想要的蛋白可分泌(入发酵液的液体部分)或可不从宿主中分泌(并因而包含于发酵液的细胞)。据此，想要的蛋白可从发酵液的液体部分或细胞裂解物回收。想要的蛋白的回收可通过本领域技术人员已知的方法实现。从发酵液回收蛋白的合适方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。如果感兴趣的蛋白在发酵液中沉淀或结晶或者至少部分结合发酵液的颗粒物，可能需要额外处理步骤以从生物质释放感兴趣的蛋白或使感兴趣的蛋白晶体和沉淀溶解。US6316240B1、WO2008110498A1和WO2018185048A1描述了从发酵液中回收在发酵期间沉淀和/或结晶的感兴趣的蛋白的方法。WO2017097869A1也描述了从发酵液中纯化感兴趣的蛋白的方法。在想要的蛋白包含于发酵液的细胞的情况中，可能需要从细胞释放感兴趣的蛋白。从细胞释放能用例如但不限于细胞裂解(用技术人员熟知的细胞技术)实现，例如溶菌酶处理、超声处理、弗氏压碎器处理或其组合。

感兴趣的蛋白可通过本领域已知方法从发酵液纯化。例如，感兴趣的蛋白可通过常规程序从发酵液分离，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。分离的多肽还可通过本领域已知的多种程序进一步纯化，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳过程(例如制备式等电聚焦(IEF))、差别性溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取(参见例如Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH出版社(VCH Publishers),纽约,1989)。纯化的多肽可随之通过本领域已知程序浓缩，包括但不限于超滤和蒸发，尤其是薄膜蒸发。

在另一个实施方案中，不从发酵液纯化所述感兴趣的蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明涉及生产感兴趣的蛋白的方法，包括本文所述的发酵工艺，进一步详细地包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌，以及额外任选存在的选自以下的一种或多种：每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼。

从发酵液中纯化感兴趣的蛋白通常与残留在纯化蛋白溶液中的来自发酵的剩余组分相关。这些剩余组分有时难以去除或能用复杂纯化过程去除。这些污染可以是芽孢杆菌细胞或其部分和/或芽孢杆菌细胞代谢产物，但通常也是培养基成分。后者对于复合发酵培养基特别有问题，因为这些培养基类型包含各种各样的未确定的化合物，其通常干扰感兴趣的蛋白的活性，如抑制酶活性。使用化学确定的培养基用于工业蛋白生产可以克服此缺点，帮助蛋白纯化和产生不含干扰性复合培养基成分的纯化的蛋白组合物。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含感兴趣的蛋白的组合物，其通过包括使用本文所述的发酵工艺的方法生产。这样的组合物可区别于用本领域现有的采用复合培养基的发酵方法获得的组合物，因为使用复合培养基引起的残留组分数量有限或甚至没有。优选地，包含感兴趣的蛋白的组合物不包含使用复合培养基成分而产生的组分，其通过本发明的发酵工艺获得。

因此，在另一个实施方案中，本发明涉及包含感兴趣的蛋白的组合物，其通过包括使用本文所述的发酵工艺的方法获得，进一步详细地包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

(d)从发酵液纯化感兴趣的蛋白并因而形成包含感兴趣的蛋白的组合物。

在一个实施方案中，不从发酵液纯化所述感兴趣的蛋白。在此实施方案中，本发明涉及包含感兴趣的蛋白的组合物，其通过包括本文所述的发酵工艺的方法获得，进一步详细地包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

纯化的蛋白溶液可进一步加工形成“蛋白制剂”。“蛋白制剂”指含有少量成分的非复合制剂，其中所述成分用于稳定蛋白制剂所包含的蛋白的目的和/或稳定蛋白制剂本身。术语“蛋白稳定性”涉及存储或操作期间随着时间保持蛋白活性。术语“蛋白制剂稳定性”涉及在存储或操作期间维持蛋白制剂的物理性质以及在存储或操作期间避免微生物污染。

“蛋白制剂”是组合物，意味着配制入复合制剂内，其本身可以确定用于最终用途。本发明所述的“蛋白制剂”不是含有数种成分的复合制剂，其中所述成分配制入复合制剂内以在最终应用中各自单独实施特定作用。复合制剂可不限于洗涤剂制剂，其中单独洗涤剂制剂组分配制的量对洗涤剂制剂的洗涤效果有效。

蛋白制剂可以是固体或液体。蛋白制剂能用本领域已知技术获得。例如但不限于，固体酶制剂能通过挤压或造粒获得。本领域已知合适的挤压和造粒技术并描述于例如WO9419444A1和WO9743482A1。酶制剂背景下的“液体”与20℃和101.3kPa下的物理性质相关。液体蛋白制剂可包括的酶量范围为按重量计0.1％-40％或按重量计0.5％-30％或按重量计1％-25％或3％-10％，都相对于酶制剂的总重量。

液体蛋白制剂可包含超过一种类型的蛋白。本发明的水性蛋白制剂可包含按重量计大于约50％、按重量计大于约60％、按重量计大于约70％或按重量计大于约80％的量的水，都相对于蛋白制剂总重量。

本发明的蛋白制剂可包含剩余组分如源自发酵培养基的盐、源自生产宿主细胞的细胞碎片、发酵期间由生产宿主细胞产生的代谢物。

在一个实施方案中，所述剩余组分可以按重量计少于30％、按重量计少于20％、按重量计少于10％或按重量计少于5％的量包含于液体酶制剂，都相对于水性蛋白制剂的总重量。在一个实施方案中，所述蛋白制剂尤其是液体蛋白制剂除了一种或多种蛋白外，还包含一种或多种选自以下的额外的化合物：溶剂、盐、pH调节剂、防腐剂、稳定剂、酶抑制剂、螯合剂和增稠剂。液体蛋白制剂中的防腐剂可以是山梨醇、苯甲酸盐、proxel或其任何组合。液体蛋白制剂中的稳定剂可以是MPG、甘油、乙酸盐或其任何组合。液体蛋白制剂中的螯合剂可以是柠檬酸盐。酶抑制剂尤其是用于蛋白酶的，可以是硼酸、硼酸衍生物，特别是苯基硼酸衍生物如4FPBA或肽醛。通过本发明方法生产的蛋白可用于食品，例如蛋白可以是用于烘焙的添加剂。蛋白能用于饲料，例如蛋白是动物饲料添加剂。蛋白能用于淀粉加工工业，例如淀粉酶用于淀粉转化成乙醇或糖(高果糖玉米糖浆)和其他副产物如油、干酒糟等。蛋白可用于纸浆和纸张加工，例如蛋白能用于提高纸强度。在一个实施方案中，所述通过本发明方法生产的蛋白用于洗涤剂制剂或清洗制剂。“洗涤剂制剂”或“清洗制剂”指指定用于清洗被弄脏的材料的组合物。清洗包括洗涤和硬表面清洗。本发明所述的被弄脏的材料包括纺织品和/或硬表面。

在下列实施例中阐明进一步本发明，所述实施例不意在以任何方式限制本发明的范围。

实施例

下列实施例仅用于阐明本发明。本领域技术人员清楚了解的许多可能变化也在本发明范围内。

除非另有说明，下列实验通过应用用于基因工程和通过培养微生物来发酵生产化合物的标准设备、方法、化学物和生化制品来进行。还参见Sambrook等.(MolecularCloning:A Laboratory Manual).第2版,冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory),纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress),,1989)和Chmiel等.(Bioprocesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik,古斯塔夫·菲舍尔出版社(Gustav Fischer Verlag),斯图加特,1991)。

实施例1

芽孢杆菌菌株

地衣芽孢杆菌ATCC53926细胞包含编码碱性蛋白酶的基因，如WO9102792所述。

碱性蛋白酶表达在来自地衣芽孢杆菌ATCC 53926的aprE启动子控制下，如WO9102792所述。表达的碱性蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶(BLAP)，如WO9102792所详细说明，包含突变R99E。

发酵条件

地衣芽孢杆菌细胞接种于化学确定的发酵培养基，其包含表1和表2所列的组分。

表1：初始发酵培养基的组成。

表2：包含40g/L柠檬酸的微量元素溶液的微量元素组成。

含有葡萄糖和镁离子的溶液用作补料溶液。通过补料溶液加入的镁离子的量导致每升初始发酵培养基共0.4g镁离子。

对照发酵在相同条件下进行，但在第一次实验中以初始培养基提供的微量元素离子的量的90％现在加入补料溶液，且仅10％以初始培养基提供。2次实验中，根据工业相关的发酵工艺的要求，加入的化学确定的碳源总量保持高于每升初始培养基200g。通过向发酵液加入铵离子，发酵工艺的pH保持高于7。发酵在需氧条件下完成，持续超过48小时。

蛋白酶滴度的测量

在多个时间点测定发酵工艺生产的蛋白酶滴度。蛋白水解活性用Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA,短AAPF；参见例如DelMar等.(1979),AnalyticalBiochem 99,316-320)作为底物测定。pNA通过在30℃,pH 8.6TRIS缓冲液中蛋白水解剪切而从底物分子切割，引起黄色的游离pNA释放，其通过检测OD405定量。

结果

图1显示蛋白酶滴度随着时间的发展。从图1可得出，某一发酵时间后，当微量元素离子用补料溶液加入时，蛋白酶滴度以更高的斜率增加。图2显示发酵工艺结束时的蛋白酶滴度。从图2可得出，发现微量元素离子在补料中的发酵工艺所生产的蛋白酶所实现的滴度比对照高超过70％。因此，以补料溶液向发酵工艺而不是初始培养基加入至少部分微量元素离子，增加了芽孢杆菌细胞所生产的感兴趣的蛋白的量。

实施例2

芽孢杆菌启动子的提取和比对

实施用tblastn 2.5.0+(Camacho C.,Coulouris G.,Avagyan V.,Ma N.,Papadopoulos J.,Bealer K.,&Madden T.L.(2008)"BLAST+:架构与应用(BLAST+:architecture and applications)."BMC Bioinformatics 10:421)的翻译blast搜索，采用来自地衣芽孢杆菌的aprE蛋白质序列(SEQ ID NO.2)作为针对Genbank和Genbank WGS(全基因组鸟枪法)数据库的查询，选项为：-evalue 1e-20,-db_gencode 11,-max_target_seqs 60000。重新取回全GenBank记录用于最小蛋白相同性高于40％的BLAST命中。

使用来自blast搜索结果的BLAST命中位置信息，提取编码aprE的基因的上游序列，经受下列条件：

a.上游提取尺寸是200个核苷酸。如果上游基因/CDS注释比200个核苷酸近，则提取较短片段。如果片段长度小于50个核苷酸，不提取这个片段。

b.提取的上游序列通过BLAST命中bitscore分组，通过相同bitscore以降序排列分选。为避免偏倚，来自同一bitscore组的相同上游序列进行重复数据删除。

c.对于各by-bitscore上游序列组，进行积累多重比对(并分开保存)，使用mafft7.307版(Katoh,Standley.“MAFFT multiple sequence alignment software version 7:improvements in performance and usability”,Molecular Biology and Evolution30:772-780,2013)，采用keeplength选项。产生的多重核苷酸比对可视化为序列logos并检测以鉴定上游调控序列保守最明显的bitscore阈值：保守片段仍具有高信息量，而非保守片段具有低信息量。

d.基于鉴定的阈值，bitscore高于阈值的所有上游序列(SEQ ID No.19-166)用mafft进行多重比对。

隐马尔可夫模型(HMM)创建

使用上面创建的多重比对文件，用HMMER 3.1b1建立hmm(Wheeler,Travis J和Sean R Eddy.(2013)“nhmmer:用概况HMM的DNA同源性搜索(nhmmer:DNA homology searchwith profile HMMs).”Bioinformatics(英格兰牛津)卷29,19(2013):2487-9)，这是通过运行命令：hmmbuild-n PaprE PaprE.hmm{aligned.mfa}进行的。此hmm随后用:hmmpressPaprE.hmm压缩，产生能在任意序列上运行的模型。

序列提取

为提取匹配模型的序列，HMMER软件能用命令:nhmmscan PaprE.hmm{sequence}运行，其中{sequence}代表含有任何DNA序列的fasta格式文件。这会输出匹配模型的序列列表(通过匹配开始和结束给出)，以及e值和分数。hmm的校正表明，高于50的截取值(cutoff)的任何分数指示匹配。使用此截取值从超过8000个非芽孢杆菌基因组的数据库中提取匹配序列，确认错误发现率为零。

Claims

1.一种在化学确定的发酵培养基中培养芽孢杆菌细胞的发酵工艺，所述工艺包括以下步骤：

(a)提供化学确定的发酵培养基，

其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含所述一种或多种微量元素离子的一种或多种补料溶液向发酵培养基加入所述一种或多种微量元素离子，所加入的量选自每升初始培养基至少50μmol铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌。

2.如权利要求1所述的发酵工艺，其中所述芽孢杆菌细胞在摄取或代谢诱导物分子的能力方面未进行遗传修饰，优选地，其中所述芽孢杆菌细胞不是manP和/或manA缺陷型。

3.如权利要求1或2所述的发酵工艺，其中感兴趣的基因的表达在选自以下的启动子序列控制下：veg启动子、lepA启动子、serA启动子、ymdA启动子、fba启动子、aprE启动子、amyQ启动子、amyL启动子、噬菌体SPO1启动子、cryIIIA启动子，其组合和其活性片段或变体，优选在aprE启动子序列控制下。

4.如权利要求3所述的发酵工艺，其中所述aprE启动子序列具有高于50的HMM得分。

5.如权利要求3或4中任一项所述的发酵工艺，其中所述aprE启动子选自来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、喜盐芽孢杆菌(Bacillus haloduans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的aprE启动子。

6.如权利要求3-5中任一项所述的发酵工艺，其中所述aprE启动子序列是编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的启动子，或编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的aprE启动子序列的功能片段或编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的aprE启动子序列的功能变体，其中枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％,至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或甚至100％的序列相同性。

7.如权利要求3-6中任一项所述的发酵工艺，其中所述aprE启动子序列包含sigma因子A核心启动子，优选结合基序-35和-10。

8.如权利要求3-7中任一项所述的发酵工艺，其中所述aprE启动子序列包含调控因子的一个或多个结合基序，所述调控因子选自degU(sacU)、ScoC(hpr)、SinR和AbrB，优选degU。

9.如权利要求3-8中任一项所述的发酵工艺，其中所述aprE启动子序列与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或甚至100％的序列相同性。

10.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基的微量元素离子是每升初始培养基至少50μmol/铁、每升初始培养基至少40μmol铜、每升初始培养基至少30μmol锰和每升初始培养基至少40μmol锌。

11.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含微量元素离子的一种或多种补料溶液加入发酵培养基的微量元素离子进一步包含选自每升初始培养基至少1μmol钴、每升初始培养基至少2μmol镍和每升初始培养基至少0.3μmol钼的一种或多种微量元素离子。

12.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述微量元素离子通过一种或多种盐或者微量元素氢氧化物，或者一种或多种微量元素盐与一种或多种微量元素氢氧化物的组合提供，优选地，所述一种或多种盐是选自氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐中的一种或多种。

13.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中在芽孢杆菌细胞培养期间通过包含镁离子的一种或多种补料溶液将每升初始培养基至少0.1克镁离子加入发酵培养基。

14.如权利要求13所述的发酵工艺，其中所述镁离子通过一种或多种镁盐或氢氧化镁，或一种或多种镁盐与氢氧化镁的组合提供，优选地，所述一种或多种镁盐是选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁和磷酸镁中的一种或多种。

15.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述化学确定的碳源包含葡萄糖，优选地，其中主要量的化学确定的碳源以葡萄糖提供；优选地，其中在所述发酵工艺中没有加入次级碳源。

16.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中在芽孢杆菌细胞培养期间将一种或多种化学确定的营养源通过一种或多种包含这些营养源的补料溶液加入发酵培养基，所述营养源选自化学确定的氮源、化学确定的硫源和化学确定的钾源。

17.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述芽孢杆菌细胞培养期间将发酵液pH调至或高于pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.2、pH 7.4或pH 7.6。

18.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述发酵工艺提供感兴趣的蛋白的至少5g/l的滴度。

19.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述感兴趣的蛋白是酶，优选地，其中所述感兴趣的蛋白选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶和纤维素酶，优选蛋白酶。

20.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中发酵产物被所述芽孢杆菌细胞分泌入发酵液。

21.如前述权利要求中任一项所述的发酵工艺，其中所述芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞或迟缓芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌细胞。

22.一种生产感兴趣的蛋白的方法，包括权利要求1-21中任一项所述的发酵工艺，且任选地，纯化感兴趣的蛋白。

23.一种包含感兴趣的蛋白的发酵液，通过权利要求1-21中任一项所述的发酵工艺获得。

24.一种组合物，包含通过权利要求22所述的方法生产的感兴趣的蛋白。

25.一种使感兴趣的蛋白滴度增加到高于5g/L的方法，包括权利要求1-22中任一项所述的发酵工艺。