DE69733322T2

DE69733322T2 - Glycosidase-enzyme

Info

Publication number: DE69733322T2
Application number: DE69733322T
Authority: DE
Inventors: J. Edward BYLINA; V. Ronald SWANSON; J. Eric MATHUR; E. David LAM
Original assignee: Diversa Corp
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-08
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2017-12-09
Also published as: IL130245A0; AU5598298A; PT1027367E; CA2274112A1; US6368844B1; EP1027367B1; ATE295850T1; US20100311845A1; US20090142326A1; US20120141453A1; EP1027367A1; ES2242986T3; US8119383B2; US20120276078A1; EP1027367A4; US9243236B2; WO1998024799A1; DE69733322D1; US20140323356A1; US20020155550A1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindungen
Diese Erfindung betrifft zwei neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die von solchen Polynucleotiden codiert werden, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung und Isolierung solcher Polynucleotide und Polypeptide. Genauer sind die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung als vermutliche Glucosidasen, α-Galactosidasen, β-Galctosidasen, β-Mannosidasen, β-Mannanasen, Endoglucanasen und Pullalanasen identifiziert worden.
2. Beschreibung des zugehörigen Gebietes
Die Glycosid-Bindung von β-Galactosiden kann von verschiedenen Enzymklassen gespalten werden: (i) Phospho-β-Galactosidasen (EC 3.2.1.85) sind für ein phosphoryliertes Substrat spezifisch, das über die vom Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System (PTS) abhängige Aufnahme erzeugt wird; (ii) typische β-Galactosidasen (EC 3.2.1.23), repräsentiert durch das LacZ-Enzym von Escherichia coli, die relativ spezifisch für β-Galactoside sind; und (iii) β-Glucosidasen (EC 3.2.1.21) wie etwa die Enzyme von Agrobacterium faecalis, Clostridium thermocellum, Pyrococcus furiosus oder Sulfolobus solfataricus (Day, A.G. und Withers, S.G., (1986) Purification and characterization of a β-glucosidase from Alcaligenes faecalis. Can. J. Biochem. Cell. Biol. 64, 914-922; Kengen, S.W.M., et al., (1993) Eur. J. Biochem., 213, 305-312; Ait, N., Cruezet, N. und Cattaneo, J. (1982) Properties of β-glucosidase purified from Clostridium thermocellum. J. Gen. Microbiol. 128, 569-577; Grogan, D.W. (1991) Evidence that β-galactosidase of Sulfolobus solfataricus is only one of several activities of a thermostable β-D-glycodiase. Appl. Environ. Microbiol. 57, 1644-1649). Mitglieder der letzten Gruppe zeigen oft eine ziemlich ausgedehnte Substratspezifität und hydrolysieren β-Glucoside ebenso wie β-Fucoside und β-Galactoside, obwohl sie in Bezug auf die β-anomere Konfiguration der glycosidischen Bindung hoch spezifisch sind.
Allgemein sind α-Galactosidasen Enzyme, die die Hydrolyse von Galactose-Gruppen auf einem Polysaccharid-Grundgerüst katalysieren oder die Abspaltung von Di- oder Oligosacchariden, die Galactose enthalten, hydrolysieren.
Allgemein sind β-Mannanasen Enzyme, die die Hydrolyse von Mannose-Gruppen intern auf einem Polysaccharid-Grundgerüst katalysieren oder die Abspaltung von Di- oder Oligosacchariden, die Mannose-Gruppen enthalten, hydrolysieren. β-Mannosidasen hydrolysieren nicht reduzierende, endständige Mannose-Reste in einem Mannose enthaltenden Polysaccharid und die Abspaltung von Di- oder Oligosacchariden, die Mannose-Gruppen enthalten.
Guarmehl ist ein verzweigtes Galactomannan-Polysaccharid, das aus einem β-1,4 verbundenen Mannose-Grundgerüst mit α-1,6 verbundenen Seitenketten besteht. Die Enzyme, die für einen Abbau von Guarmehl erforderlich sind, sind β-Mannanase, β-Mannosidase und α-Galactosidase. β-Mannanase hydrolysiert das Mannose-Grundgerüst intern, und β-Mannosidase hydrolysiert nicht reduzierende, endständige Mannose-Reste. α-Galactosidase hydrolysiert α-gebundene Galactose-Gruppen.
Galactomannan-Polysaccharide und die Enzyme, die sie abbauen, haben ein Vielzahl von Anwendungen. Guarmehl wird gewöhnlich als Verdickungsmittel in Nahrungsmitteln verwendet und bei der hydraulischen Fraktionierung zur Rückgewinnung von Öl und Gas eingesetzt. Folglich haben Galactomannasen für Abbau und Modifikation von Guarmehl industrielle Bedeutung. Darüber hinaus besteht Bedarf an hitzestabilen Galactomannasen, die unter den extremen Bedingungen aktiv sind, die mit Bohren und Bohrlochstimulierung verbunden sind.
Es gibt andere Anwendungsgebiete in verschiedenen Industriezweigen, wie etwa in der Zuckerrüben-Industrie. 20-30% des Verbrauches an Saccharose innerhalb der USA bestehen aus Saccharose aus Zuckerrüben. Roher Rübenzucker kann einen geringen Anteil an Raffinose enthalten, wenn die Zuckerrüben vor der Verarbeitung gelagert werden und die Zersetzung einzusetzen beginnt. Raffinose verhindert die Kristallisation von Saccharose und bildet sich auch aus einer versteckter Menge Saccharose. Es ist daher von Vorteil, Raffinose aus rohem Rübenzucker zu entfernen. α-Galactosidase ist auch als eine Abbauhilfe zum Aufschließen von Raffinose, Stachyose und Verbascose in solchen Nahrungsmitteln wie Bohnen und anderen Gas enthaltenden Nahrungsmitteln verwendet worden.
β-Galactosidasen, die bei hohen Temperaturen aktiv und stabil sind, scheinen die überlegenen Enzyme zur Herstellung von Lactose-freien Nahrungs-Milchprodukten zu sein (Chaplin, M.F. und Bucke, C. (1990) In: Enzyme Technology, S. 159-160, Cambridge University Press, Cambridge, UK). Auch haben mehrere Studien die Verwendbarkeit von β-Galactosidasen für die enzymatische Synthese von Oligosacchariden über Transglycosylierungsreaktionen gezeigt. (Nilsson, K.G.I. (1988) Enzymatic synthesis of oligosaccharides. Trends Biotechnol. 6, 156-264; Cote, G.L. und Tao, B.Y. (1990) Oligosaccharide synthesis by enzymatic transglycosylation. Glycoconjugate J. 7, 145-162). Trotz des kommerziellen Potentials sind bisher nur wenige β-Galactosidasen von Thermophilen charakterisiert worden. Von zwei Genen wird berichtet, dass sie β-Galactoside spaltende Enzyme des hyperthermophilen Bakteriums Thermotoga maritima sind, eines des am meisten thermophilen organotrophen Eubakteriums, das bisher beschrieben worden ist ((Huber, R., Langworthy, T.A., König, H., Thomm, M., Woese, C.R., Sleytr, U.B. und Stetter, K.O. (1986) T. maritima sp. nov. represents a new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up to 90°C, Arch. Microbiol. 144, 324-333). Die Genprodukte sind als eine β-Galactosidase und eine β-Glucosidase identifiziert worden.
Pullulanase ist als ein Verzweigungen spaltendes („debranching") Enzym für Pullulan und Stärke gut bekannt. Das Enzym hydrolysiert α-1,6-Glucosidbindungen bei diesen Polymeren. Aufschluss von Stärke zur Produktion von Süßstoffen (Glucose oder Maltose) ist eine sehr wichtige industrielle Anwendung für dieses Enzym. Der Aufschluss von Stärke läuft in zwei Schritten ab. Der erste Schritt umfasst die Verflüssigung des Substrates mit α-Amylase, und der zweite Schritt oder Saccharifizierungsschritt wird durch β-Amylase mit Zugabe von Pullulanase als ein Verzweigungen spaltendes Enzym durchgeführt, um bessere Ergebnisse zu erhalten.
Endoglucanasen können bei einer Vielzahl industrieller Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel können die Endoglucanasen der vorliegenden Erfindung die internen β-1,4-Glycosidbindungen in Cellulose hydrolysieren, was für die Umwandlung von pflanzlicher Biomasse in Treibstoffe und chemische Ausgangsstoffe verwendet werden kann. Endoglucanasen finden auch Verwendungen bei Formulierungen von Detergentien, in der Textilindustrie, in Tierfutter, bei der Abfallbehandlung und in der Fruchtsaft- und Brauindustrie zur Klärung und Extraktion von Säften.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die nachstehenden Abbildungen erläutern Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht dazu gedacht, den Rahmen der Erfindung zu begrenzen, der durch die Patentansprüche festgelegt ist.
1a-b stellen die DNA in voller Länge und die zugehörige abgeleitete Aminosäuresequenz von M11TL der vorliegenden Erfindung dar. Sequenzierung wurde für alle Sequenzen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines automatischen 378-DNA-Sequenziergeräts durchgeführt (Applied Biosystems, Inc.).
2 ist eine Darstellung der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von OC1/4V-33B/G.
3 ist eine Darstellung der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von F1-12G.
4a-b sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von 9N2-31B/G.
5a-b sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von MSB8-6G.
6 ist eine Darstellung der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von AED1112RA-18B/G.
7a-b sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von GC74-22G.
8a-b sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von VC1-7G1.
9a-c sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von 37GP1.
10a-c sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von 6GC2.
11a-d sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von 6GP2.
12a-c sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von 63GB1.
13a-b sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von OC1/4V.
14a-e sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von 6GP3.
15a-d sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von MSB8-6GP2 von Thermotoga maritima.
16a-c sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von MSB8-6GB4 von Thermotoga maritima.
17a-d sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von 37GP4 von Banki gouldi.
18a-b sind Darstellungen der DNA in voller Länge und der zugehörigen abgeleiteten Aminosäuresequenz von VC1-7EG1 von Pyrococcus furiosus.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuren (Polynucleotide) bereit gestellt, die reife Enzyme mit den zugehörigen Aminosäuresequenzen aus den 1-18 codieren (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64).
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides einschließlich der Kultivierung von Wirtszellen, die die Polynucleotide aus den 1-18 enthalten, und der Expression eines Polypeptides, das durch das Polynucleotid codiert wird, durch die Wirtszelle und der Isolierung des Polypeptides.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Enzym, ausgewählt aus der ein Enzym umfassenden Gruppe, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NR: 15-28 oder 61-64 beschrieben, aufweist, und ein Enzym, das mindestens 30 aufeinander folgende Amiosäurereste als ein Enzym aufweist, das eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NR: 15-28 oder 61-64 hat.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Glucose aus löslichen Zell-Oligosacchariden bereit, das das Inkontaktbringen einer Oligosaccharide enthaltenden Probe mit einer wirksamen Menge eines Enzyms, das aus der Gruppe der Enzyme mit der in den SEQ ID NR: 15-28, 61-63 und 64 dargestellten Aminosäuresequenz ausgewählt ist, in der Weise umfasst, dass Glucose hergestellt wird.
Die hierin beschriebenen Veröffentlichungen werden allein wegen ihrer Offenlegung vor dem Anmeldedatum der vorliegenden Patentanmeldung angeführt. Nichts hierin ist als ein Zugeständnis zu verstehen, dass es der Erfindung nicht zusteht, einer solchen Offenlegung Kraft einer früheren Erfindung voranzugehen.
Definitionen
Der hierin verwendete Begriff „Monosaccharid" bezeichnet ein einzelne Einheit eines Polyhydroxyaldehyds oder -Ketons.
Das hierin verwendete „Oligosaccharid" besteht aus kurzen Ketten aus Monosaccharid-Einheiten, die durch kovalente Bindungen miteinander verbunden sind. Die am häufigsten auftretenden unter ihnen sind die Disaccharide, die aus zwei Monosaccharid-Einheiten bestehen.
Das hierin verwendete „Polysaccharid" besteht aus langen Ketten, die viele Monosaccharid-Einheiten aufweisen.
Der Begriff „Gen" bezeichnet den DNA-Abschnitt, der an der Produktion einer Polypeptidkette beteiligt ist; er umschließt sowohl Regionen, die der codierenden Region vorausgehen und ihr folgen (Leader und Trailer), als auch intervenierende Sequenzen (Introns) zwischen einzelnen Codierungssegmenten (Exons).
Eine codierende Sequenz ist mit einer anderen codierenden Sequenz „funktionell verbunden", wenn RNA-Polymerase die beiden codierenden Sequenzen in eine einzige mRNA transkribiert, die dann in ein einziges Polpeptid translatiert wird, das Aminosäuren umfasst, die von beiden codierenden Sequenzen stammen. Die codierenden Sequenzen müssen nicht aneinander grenzen, solange die exprimierten Sequenzen schließlich in der Weise prozessiert werden, dass sie das gewünschte Protein erzeugen.
„Rekombinante" Enzyme bezeichnen Enzyme, die durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden: d.h. von Zellen produziert werden, die mit einer exogenen DNA-Konstruktion transformiert wurden, die das gewünschte Enzym codiert. „Synthetische" Enzyme sind jene, die durch chemische Synthese hergestellt wurden.
Eine DNA-„Codierungssequenz" oder eine „codierende Nucleotidsequenz" für ein bestimmtes Enzym ist eine DNA-Sequenz, die in ein Enzym transkribiert und translatiert wird, wenn sie der Kontrolle geeigneter Regulatorsequenzen unterliegt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind als ein Ergebnis ihrer enzymatischen Aktivität als Glucosidasen, α-Galactosidasen, β-Galactosidasen, β-Mannosidasen, β-Mannanasen, Endoglucanasen und Pullalanasen identifiziert worden.
Im Einklang mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden sowohl neue Enzyme als auch aktive Fragmente, Analoga und Derivate hiervon bereit gestellt.
Im Einklang mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit gestellt, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung einschließlich sowohl der mRNAs, cDNAs, genomischen DNAs, als auch der aktiven Analoga und Fragmente solcher Enzyme codieren.
Im Einklang mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide durch rekombinante Techniken bereit gestellt, das die Kultivierung rekombinanter prokaryontischer und/oder eukaryontischer Wirtszellen, die eine Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung enthalten, unter Bedingungen, die die Expression jener Enzyme fördern, und die anschließende Gewinnung jener Enzyme umfasst.
Im Einklang mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung jener Enzyme oder Polynucleotide, die solche Enzyme codieren, zur Hydrolyse von Lactose zu Galactose und Glucose zur Verwendung in der Lebensmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie, zum Beispiel um Unverträglichkeit von Lactose zu behandeln, als ein diagnostisches Reportermolekül, beim Nassmahlen von Getreide, in der Fruchtsaftindustrie, beim Backen, in der Textilindustrie und in der Detergensindustrie bereit gestellt.
Im Einklang mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung solcher Enzyme zur Hydrolysierung von Guarmehl (ein Galactomannan-Polysaccharid) bereit gestellt, um nicht reduzierende endständige Mannose-Reste zu entfernen. Weiterhin gibt es für Polysaccharide wie etwa Galactomannan und die Enzyme im Einklang mit der Erfindung, die sie abbauen, gibt es eine Reihe von Anwendungen. Guarmehl wird gewöhnlich als ein Verdickungsmittel in Nahrungsmitteln verwendet und wird ebenfalls in der hydraulischen Fraktionierung bei der Öl- und Gasgewinnung eingesetzt. Folglich sind Mannanasen von industrieller Bedeutung für Abbau und Modifikation von Guarmehl. Darüber hinaus besteht ein Bedarf an hitzebeständigen Mannasen, die unter den extremen Bedingungen aktiv sind, die mit Bohren und Bohrlochstimulierung verbunden sind.
Im Einklang mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden auch Nucleinsäure-Sonden bereit gestellt, die Nucleinsäuremoleküle mit ausreichender Länge umfassen, um spezifisch mit einer Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren.
Im Einklang mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung jener Enzyme oder Polynucleotide, die jene Enzyme codieren, für in vitro-Anwendungen in der wissenschaftlichen Forschung bereit gestellt, zum Beispiel um durch Verwendung bestimmter Regionen, d.h. konservativer Sequenzregionen, der Nucleotidsequenz Sonden zur Identifizierung ähnlicher Sequenzen zu erzeugen, die möglicherweise ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten Fachleuten auf dem Gebiet aus den hierin gegebenen Beschreibungen offensichtlich sein.
Die Polynucleotide aus dieser Erfindung wurden ursprünglich aus genomischen Genbanken gewonnen, die von den nachstehenden Organismen stammen:
M11TL ist eine neue Art von Desulfurococcus, isoliert aus dem Diamond Pool im Yellowstone-Nationalpark. Der Organismus wächst optimal bei 85-88°C, pH-Wert 7,0 in einem schwachen Salzmedium, das Hefeextrakt, Pepton und Gelatine als Substrate enthält, mit einer N₂/CO₂-Gasphase.
OC1/4V ist aus der Gattung Thermotoga. Der Organismus wurde aus dem Yellowstone National-Park isoliert. Er wächst optimal bei 75°C in einem schwachen Salzmedium mit Cellulose als einem Substrat und in N₂ in der Gasphase.
Pyrococcus furiosus VC1 und (7EG1) ist aus der Gattung Pyrococcus. VC1 wurde aus Vulcano, Italien isoliert. Er wächst optimal bei 100°C in einem starken Salzmedium (marin), das elementaren Schwefel, Hefeextrakt, Pepton und Stärke als Substrate enthält, und in N₂ in der Gasphase.
Staphylothermus marinus F1 ist aus der Gattung Staphylothermus. F1 wurde aus Vulcano, Italien isoliert. Er wächst optimal bei 85°C, pH-Wert 6,5 in einem starken Salzmedium (marin), das elementaren Schwefel und Hefeextrakt als Substrate enthält, und in N₂ in der Gasphase.
Thermococcus 9N-2 ist aus der Gattung Thermococcus. 9N-2 wurde aus einer diffusen Spaltenflüssigkeit aus dem Ostpazifischen Rücken isoliert. Er ist ein streng anaerober Organismus, der bei 87°C optimal wächst.
Thermotoga maritima MSB8 und MSB8 (Clon # 6GP2 und 6GB4) ist aus der Gattung Thermotoga und wurde aus Vulcano, Italien isoliert. MSB8 wächst optimal bei 85°C, pH-Wert 6,5 in einem starken Salzmedium (marin), das Stärke und Hefeextrakt als Substrate enthält, und in N₂ in der Gasphase.
Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA ist aus der Gattung Thermococcus. AEDII12RA wächst optimal bei 85°C, pH-Wert 9,5 in einem starken Salzmedium (marin), das Polysulfide und Hefeextrakt als Substrate enthält, und in N₂ in der Gasphase.
Thermococcus chitonophagus GC74 ist aus der Gattung Thermococcus. GC74 wächst optimal bei 85°C, pH-Wert 6,0 in einem starken Salzmedium (marin), das Chitin, Fleischextrakt, elementaren Schwefel und Hefeextrakt als Substrate enthält, und in N₂ in der Gasphase. AEPII 1a wächst optimal bei 85°C, pH-Wert 6,5 in marinem Medium unter anaeroben Bedingungen. Er hat viele Substrate. Bankia gouldi ist aus der Gattung Bankia.
Demzufolge werden die Polynucleotide und von ihnen codierten Enzyme durch den Organismus identifiziert, aus dem sie isoliert worden sind, und werden nachstehend manchmal bezeichnet als „M11TL" (1 und SEQ ID NR: 1 und 15), „OC1/4V-33B/G" (2 und SEQ ID NR: 2 und 16), „F1-12G" (3 und SEQ ID NR: 3 und 17), „9N2-31B/G" (4 und SEQ ID NR: 4 und 18), „MSB8" (5 und SEQ ID NR: 5 und 19), „AED1112RA-18B/G" (6 und SEQ ID NR: 6 und 20), „GC74-22G" (7 und SEQ ID NR: 7 und 21), „VC1-7G1" (8 und SEQ ID NR: 8 und 22), „37GP1" (9 und SEQ ID NR: 9 und 23), „6GC2" (10 und SEQ ID NR: 10 und 24), „6GP2" (11 und SEQ ID NR: 11 und 25), „AEPII 1a" (12 und SEQ ID NR: 12 und 26), „OC1/4V" (13 und SEQ ID NR: 13 und 27), und „6GP3" (14 und SEQ ID NR: 28), „MSB8-6GP2" (15 und SEQ ID NR: 57 und 61), „MSB8-6GB4" (16 und SEQ ID NR: 58 und 62), „VC1- 7EG1" (17 und SEQ ID NR: 59 und 63) und 37GP4 (18 und SEQ ID NR: 60 und 64).
Die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung zeigen auf der Ebene der Nucleotide und Proteine Identität mit bekannten Genen und Proteinen, die durch sie codiert werden, wie in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Die Polynucleotide und Enzyme der vorliegenden Erfindung weisen Homologie zueinander auf, wie in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Alle in den Tabellen 1 und 2 identifizierten Clone codieren Polypeptide, die eine α-Glycosidase- oder β-Glycosidase-Aktivität aufweisen.
Diese Erfindung liefert zusätzlich zu den isolierten Nucleinsäuremolekülen, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung codieren, auch im Wesentlichen ähnliche Sequenzen. Isolierte Nucleinsäuresequenzen sind im Wesentlichen ähnlich, wenn sie: (i) in der Lage sind, unter nachstehend beschriebenen Bedingungen mit den Polynucleotiden der SEQ ID NR: 1-14 und 57-60 zu hybridisieren; oder (ii) DNA-Sequenzen codieren, die zu den Polynucleotiden der SEQ ID NR: 1-14 und 57-60 degeneriert sind. Degenerierte DNA-Sequenzen codieren die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NR: 15-28 und 61-64, weisen aber Variationen in den Nucleotid-Codierungssequenzen auf. Der hierin verwendete Begriff im Wesentlichen ähnlich betrifft Sequenzen, die ähnliche Identität wie die Sequenzen der vorliegenden Erfindung besitzen. Die Nucleotidsequenzen, die im Wesentlichen die gleichen sind, können durch Hybridisierung oder durch Sequenzvergleich identifiziert werden. Enzymsequenzen, die substantiell die gleichen sind, können durch eine oder mehrere der nachstehenden Untersuchungen identifiziert werden: proteolytische Spaltung, Gel-Elektrophorese und/oder Mikrosequenzierung.
Ein Verfahren zur Isolierung der Nucleinsäuremoleküle, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung codieren, besteht darin, eine Genbank mit einer natürlichen oder künstlich entwortenen Sonde unter Verwendung von auf dem Gebiet anerkannten Verfahren zu durchmustern (vgl. zum Beispiel: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (Hrsg.) Green Publishing Company Assoc. und John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Fachleuten auf dem Gebiet ist offensichtlich, dass die Polynucleotide mit den SEQ ID NR: 1-14 und 57-60 oder Fragmente hiervon (mindestens 12 aufeinander folgende Nucleotide umfassend) besonders nützliche Sonden sind. Weitere besonders nützliche Sonden für diesen Zweck sind hybridisierbare Fragmente zu den Sequenzen der SEQ ID NR: 1-14 und 57-60 (d.h. mindestens 12 aufeinander folgende Nucleotide umfassend).
Unter Berücksichtigung von Nucleinsäuresequenzen, die mit spezifischen, hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, kann die Hybridisierung unter Bedingungen reduzierter Stringenz, mittlerer Stringenz oder sogar unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Als ein Beispiel für Oligonucleotid-Hybridisierung wird eine Polymer-Membran, die immobilisierte, denaturierte Nucleinsäuren enthält, zuerst über 30 Minuten bei 45°C in einer aus 0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH-Wert 7,0, 5,0 mM Na₂EDTA, 0,5% SDS, 10 × Denhardt und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure bestehenden Lösung prähybridisiert. Etwa 2 × 10⁷ CpM (spezifische Aktivität 4-9 × 10⁸ CpM/μg) einer ³²P-endmarkierten Oligonucleotid-Sonde werden dann der Lösung zugegeben. Nach Inkubation über 12-16 Stunden wird die Membran über 30 Minuten bei Zimmertemperatur in 1 × SET-Lösung (150mM NaCl, 20 mMTris-Hydrochlorid, pH-Wert 7,8, 1 mM Na₂EDTA), die 0,5% SDS enthält, gewaschen, anschließend folgt ein Waschgang von 30 Minuten in frischer 1 × SET-Lösung bei einer Temperatur von 10°C für die Oligonucleotid-Sonde. Die Membran wird dann einem autoradiografischen Film zum Nachweis von Hybridisierungssignalen ausgesetzt.
Stringente Bedingungen bedeutet, dass Hybridisierung nur eintritt, wenn mindestens 90% Identität, bevorzugt mindestens 95% Identität und am meisten bevorzugt mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen vorliegt. Darüber hinaus ist klar, dass ein Abschnitt einer aus 100 Bp bestehenden Sequenz, der eine Länge von 95 Bp hat, eine Identität von 95% mit der aus 1090 Bp bestehenden Sequenz aufweist, aus der er gewonnen wurde. Vgl. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory (1989), welches hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Ebenfalls ist klar, dass ein Fragment einer aus 100 Bp bestehenden Sequenz, die eine Länge von 95 Bp hat, eine Identität von 95% mit der aus 100 Bp bestehenden Sequenz aufweist, aus der es gewonnen wurde.
Eine erste DNA- (RNA-) Sequenz ist hierin mindestens 70% und bevorzugt mindestens 80% mit einer anderen DNA- (RNA-) Sequenz identisch, wenn mindestens 70% und bevorzugt mindestens 80% bzw. 90% Identität zwischen den Basen der ersten Sequenz und den Basen der anderen Sequenz besteht, wenn sie korrekt gegeneinander ausgerichtet werden, zum Beispiel wenn sie mit BLASTIN ausgerichtet werden.
Der hierin verwendete Ausdruck „Identiät" bezeichnet eine Polynucleotid-Sequenz, die einen bestimmten Prozentsatz an den gleichen Basen wie ein Referenz-Polynucleotid umfasst (SEQ ID NR: 1-14 und 57-60). Zum Beispiel hat ein Polynucleotid, das mindestens 90% Identität mit einem Referenz-Polynucleotid aufweist, Polynucleotid-Basen, die zu 90% mit den Basen identisch sind, aus denen das Referenz-Polynucleotid besteht, und 10% der Basen, die diese Polynucleotidsequenz umfassen, können unterschiedlich sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, die sich vom Referenz-Polynucleotid in der Weise unterscheiden, dass die Unterschiede stille Unterschiede sind, zum Beispiel verändert der Unterschied nicht die Aminosäuresequenz, die durch das Polynucleotid codiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleotid-Unterschiede, die zu Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, -Deletionen, -Fusionen und Verkürzungen in dem Polypeptid führen, das vom Referenz-Polynucleotid codiert wird. In einem bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung behalten diese Polypeptide die gleiche biologische Wirksamkeit wie das durch das Referenz-Polynucleotid codierte Polypeptid bei.
Es wird berücksichtigt, dass solche Sonden mit einem analytisch nachweisbaren Reagenz markiert werden können und bevorzugt markiert werden, um die Identifizierung der Sonde zu ermöglichen. Nützliche Reagenzien umschließen Radioaktivität, fluoreszierende Farbstoffe oder Enzyme, die in der Lage sind, die Bildung eines nachweisbaren Produktes zu katalysieren, sind aber nicht hierauf begrenzt. Die Sonden lassen sich daher verwenden, um komplementäre Kopien von DNA aus anderen Quellen zu isolieren oder um solche Quellen auf verwandte Sequenzen zu durchmustern.
Die Polynucleotide dieser Erfindung wurden aus genomischen Genbanken der in Tabelle 1 angeführten Organismen gewonnen. Zum Beispiel können Genbanken in dem Lambda ZAP II-Clonierungsvektor (Stratagene Cloning Systems) erzeugt werden. Massen-Ausschnitte können mit diesen Genbanken durchgeführt werden, um Bibliotheken im pBluescript-Phagemid zu erzeugen. Auf diese Weise werden Bibliotheken erzeugt und Ausschnitte durchgeführt, wie in den nachstehenden Protokollen/Verfahren beschrieben wird.
Die Excisionsbibliotheken werden in den E. coli -Stamm BW14893 F'kan1A eingeführt. Expressions-Clone werden dann unter Verwendung eines Hochtemperatur-Filtertests identifiziert. Expressions-Clone, die mehrere Glucanasen und mehrere andere Glycosidasen codieren, werden identifiziert und erneut gereinigt. Die Polynucleotide und durch sie codierten Enzyme der vorliegenden Erfindung weisen die vorstehend beschriebenen Aktivitäten auf.
Die Codierungssequenzen für die Enzyme der vorliegenden Erfindung wurden durch Durchmustern der genomischen DNAs identifiziert, die für jene Clone hergestellt worden waren, die Glucosidase- oder Galactosidase-Aktivität zeigten.
Ein Beispiel für eine solche Untersuchung ist ein Hochtemperatur-Filtertest, in dem Expressions-Clone durch Verwendung von Hochtemperatur-Filtertests identifiziert wurden, wobei die Pufferlösung Z (vgl. nachstehendes Rezept) verwendet wurde, die 1 mg/ml des Substrates 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-Glucopyranosid (XGLU) (Diagnostic Chemicals Limited oder Sigma) enthielt, nachdem eine Excisionsbibliothek in den E. coli -Stamm BW14893 F'kan1A eingeführt worden war. Expressions-Clone, die XGLUasen codierten, wurden identifiziert und aus M11TL, OC1/4V, Pyrococcus furiosus VC1, Staphylothermus marinus F1, Thermococcus 9N-2, Thermotoga maritima MSB8, Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA und Thermococcus chitonophagus GC74 erneut gereinigt.
Z-Pufferlösung: (Referenz bei Millery, J.H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, S. 445).

pro Liter:

Na₂HPO₄-7H₂ O 16,1 g

NaH₂PO₄-7H₂O 5,5 g

KCl 0,75 g

MgSO₄-7H₂O 0,246 g

β-Mercaptoethanol 2,7 ml

Einstellung des pH-Wertes auf 7,0
Hochtemperatur-Filtertest

(1) Der f-Faktor f'kan (vom E.coli -Stamm CSH118)(1) wurde in den pho-pnh-lac-Stamm BW 14893(2) eingeführt. BW 13893(2). Die Bibliothek aus fadenförmigen Phagen wurde auf den resultierenden Stamm BW 14893 F'kan plattiert (Miller, J.H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics; Lee, K.S., Metcalf et al., (1992) Evidence for two phosphonate degradative pathways in Enterobacter Aerogenes, J. Bakteriol. 174:2501-2510.) (2) Nach Zucht auf 100 mm-LB-Platten, die 100 μg/ml Ampicillin, 80 μg/ml Methicillin und 1 mM IPTG enthielten, wurden unter Verwendung von Millipore-HATF-Membranfiltern Kolonieabzüge durchgeführt.
(3) Die Kolonien, die auf die Filter übertragen wurden, wurden mit Chloroformdampf in 150 mm-Petrischalen aus Glas lysiert.
(4) Die Filter wurden auf 100 mm-Petrischalen aus Glas übertragen, die ein Stück mit Pufferlösung gesättigtes Whatman-3MM-Filterpapier enthielten. (a) Bei dem Test auf Galactosidase-Aktivität (XGALase) wurde das 3MM-Papier mit Z-Pufferlösung gesättigt, die 1 mg/ml XGAL (ChemBridge Corporation) enthielt. Nach Übertragung des lysierte Kolonien tragenden Filters auf die Petrischale aus Glas wurde die Schale bei 80-85°C in den Ofen gestellt. (b) Bei dem Test auf Glucosidase (XGLU) wurde das 3MM-Papier mit Z-Pufferlösung gesättigt, die 1 mg/ml XGLU enthielt. Nach Übertragung des lysierte Kolonien tragenden Filters auf die Petrischale aus Glas wurde die Schale bei 80-85°C in den Ofen gestellt.
(5) „Positive" wurden als blaue Punkte auf den Filtermembranen beobachtet. Verwendet wurde die nachstehende Filter-Rettungstechnik, um das Plasmid aus der lysierten positiven Kolonie zurückzugewinnen. Verwendet wurden Pasteurpipetten (oder Glaskapillaren), um blaue Punkte auf der Filtermembran auszustechen. Die kleinen Filterscheiben wurden in einem Eppendorf-Röhrchen platziert, die 20 μl Wasser enthielt. Das Eppendorf-Röhrchen wurde bei 75°C über 5 Minuten inkubiert, anschließend vortexgeschüttelt, um Plasmid-DNA vom Filter zu eluieren. Diese DNA wurde für Thermotoga maritima MSB8-6G, Staphylothermus marinus F1-12G, Thermococcus AED1112RA-18B/G, Thermococcus chitonophagus GC74-22G, M11TL und OC1/4V in elektrokompetente E. coli-Zellen DH10B transformiert. Elektrokompetente E. coli BW14893 F'kan1A wurden für Thermococcus 9N2-31B/G und Pyrococcus furiosus VC1-7G1 verwendet. Der Filter-Kolonieabzugtest wurde auf den Transformationsplatten wiederholt, um die „Positiven" zu identifizieren. Stelle die Transformationsplatten nach dem Filtererabzug in den 37°C-Inkubator, um die Kolonien zu regenerieren. Impfe die erneut gereinigten Positiven mit 3 ml LB-Flüssigkeit, die 100 μg/ml Ampicillin enthält und inkubiere bei 37°C über Nacht. Isoliere Plasmid-DNA aus diesen Kulturen und sequenziere die Plasmid-Insertion. In einigen Fällen, in denen die Platten, die für die anfänglichen Kolonieabzüge verwendet wurden, nicht-konfluente Kolonien enthielten, konnte eine spezifische Kolonie, die einem blauen Punkt auf dem Filter entsprach, auf einer regenerierten Platte identifiziert und direkt erneut gereinigt werden, anstatt die Filter-Rettungstechnik zu verwenden.

Ein anderes Beispiel für einen solchen Test ist eine Variation des Hochtemperatur-Filtertests, wobei die mit der Kolonie beladenen Filter durch Hitze unterschiedlicher Temperaturen abgetötet werden (zum Beispiel 105°C über 20 Minuten), um Thermostabilität zu beobachten. Das 3MM-Papier wird mit verschiedenen Pufferlösungen gesättigt (d. i. 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 mM Tris-Cl (pH-Wert 9,5)), um Enzymaktivität unter verschiedenen Pufferlösungen zu bestimmen.
Ein β-Glucosidase-Test kann ebenfalls verwendet werden, worin GlcpβNp als ein künstliches Substrat (Aryl-β-Glucosidase) verwendet wird. Der. Anstieg der Absorption bei 405 nm als ein Ergebnis der p-Nitrophenol (pNp)-Freisetzung wurde auf einem Hitachi-U1100-Spektrophotometer verfolgt, das mit einem mit Thermostat versehenen Küvettenhalter ausgerüstet war. Die Untersuchungen können bei 80°C oder 90°C in einer geschlossenen 1 ml-Quarzküvette durchgeführt werden. Ein standardisiertes Reaktionsgemisch enthält 150 mM Trinatrium-Substrat, pH-Wert 5,0 (bei 80°C) und 0,95 mM pNp-Derivat pNp = 0,561 mM^–1 cm^–1). Man lässt das Reaktionsgemisch die gewünschte Temperatur erreichen, worauf die Reaktion durch Injektion einer geeigneten Menge Enzym (1,06 ml Endvolumen) gestartet wird.
1 U β-Glucosidase-Aktivität ist definiert als diejenige Menge, die notwendig ist, um die Bildung von 1,0 μMol pNp/min zu katalysieren. D-Cellobiose kann ebenfalls als ein Substrat verwendet werden.
Ein ONPG-Test auf β-Galactosidase-Aktivität wird von Millery, J.H. (1992) A short Course in Bacterial Genetics und Mill, J.H. (1992) Experiments in Molekular Genetics beschrieben, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen werden.
Eine quantitative fluorometrische Untersuchung auf β-Galactosidase-spezifische Aktivität wird beschrieben von: Youngman, P., (1987) Plasmid Vectors for Recovering and Exploiting Tn917 Transpositions in Bacillus and other Gram-Positive Bacteria. In Plasmids: A Practical approach (Hrsg. K. Hardy) S. 79-103. IRL Press, Oxford. Eine Beschreibung des Verfahrens kann bei Millery (1992) S. 75-77 gefunden werden, dessen Inhalt durch Bezugnahme hierin in ihrer Gesamtheit eingeschlossen wird.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in der Form von DNA vorliegen, wobei DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann als Doppelstrang oder Einzelstrang vorliegen, und falls einzelsträngig, kann sie der codierende Strang oder der nicht codierende (Antisense) Strang sein. Die codierenden Sequenzen, die die reifen Enzyme codieren, können mit den Codierungssequenzen, die in den 1-8 (SEQ ID NR:1-14 und 57-60) dargestellt sind, identisch sein, oder können eine sich unterscheidende Codierungssequenz sein, welche als ein Ergebnis der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes die gleichen reifen Enzyme wie die DNA der 1-18 (SEQ ID NR: 1-14 und 57-60) codiert.
Das Polynucleotid, das die reifen Enzyme der 1-18 (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64) codiert, kann folgendes umfassen, ist aber nicht hierauf begrenzt: nur die Codierungssequenz für das reife Enzym; die Codierungssequenz für das reife Enzym und eine zusätzliche Codierungssequenz wie etwa eine Leader-Sequenz oder eine Proprotein-Sequenz; die Codierungssequenz für das reife Enzym (und optional zusätzliche Codierungssequenz) und nicht codierende Sequenz wie etwa Introns oder nicht codierende Sequenz 5'- und/oder 3' der Codierungssequenz für das reife Enzym.
Daher umfasst der Ausdruck „Polynucleotid, das eine Enzym (Protein) codiert" sowohl ein Polynucleotid, das nur die Codierungssequenz für das Enzym einschließt, als auch ein Polynucleotid, welches zusätzliche eine codierende und/oder nicht codierende Sequenz einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus Varianten der hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoga und Derivate der Enzyme codieren, die die abgeleiteten Aminosäuresequenzen aus den 1-18 (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64) aufweisen. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende allele Variante des Polynucleotids oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids sein.
Daher umschließt die vorliegende Erfindung sowohl Polynucleotide, die die gleichen reifen Enzyme wie in den 1-18 (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64) codieren, als auch Varianten solcher Polynucleotide, die ein Fragment, Derivat oder Analogon der Enzyme aus den 1-18 (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64) codieren. Solche Nucleotidvarianten umschließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten.
Wie hierin vorstehend angezeigt, können die Polynucleotide eine Codierungssequenz aufweisen, die eine natürlich vorkommende allele Variante der in den 1-18 (SEQ ID NR: 1-14 und 57-60) dargestellten Codierungssequenzen ist. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist eine allele Variante eine alternative Form einer Polynucleotid-Sequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition eines oder mehrerer Nucleotide aufweisen kann, die die Funktion des codierten Enzyms nicht wesentlich ändert.
Fragmente der Gene in voller Länge der vorliegenden Erfindung können als eine Hybridisierungssonde für eine cDNA- oder eine genomische Bibliothek verwendet werden, um die DNA in voller Länge zu isolieren und um andere DNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem Gen oder ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Sonden dieses Typs haben bevorzugt mindestens 10, bevorzugt mindestens 15 und noch mehr bevorzugt mindestens 30 Basen und können zum Beispiel mindestens 50 oder mehr Basen umfassen. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen DNA-Clon, der einem Transkript in voller Länge entspricht, und einen genomischen Clon oder Clone, die das vollständige Gen einschließlich Regulator- und Promotorregionen, Exxons und Introns umschließen, zu identifizieren. Ein Beispiel einer Durchmusterung umschließt Isolierung der codierenden Region des Gens durch Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine Oligonucleotid-Sonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide mit einer Sequenz, die komplementär zu der des Gens der vorliegenden Erfindung ist, werden verwendet, um eine Bibliothek genomischer DNA zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn mindestens 70%, bevorzugt mindestens 90% und mehr bevorzugt mindestens 95% Übereinstimmung zwischen den Sequenzen besteht. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Der hierin verwendete Ausdruck „stringente Bedingungen" bedeutet, dass Hybridisierung nur eintreten wird, wenn mindestens 95% und bevorzugt mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden in einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren, codieren Enzyme, die entweder im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität aufweisen wie das reife Enzym, das von der DNA aus den 1-18 (SEQ ID NR: 1-14 und 57-60) codiert wird.
Alternativ kann das Polynucleotid mindestens 15 Basen, bevorzugt mindestens 30 Basen und mehr bevorzugt mindestens 50 Basen haben, die mit irgendeinem Teil eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung hybridisieren und eine Identität damit, wie hierin vorstehend beschrieben, aufweisen und Aktivität beibehalten oder nicht beibehalten können. Zum Beispiel können solche Polynucleotide als Sonden für die Polynucleotide SEQ ID NR: 1-14 und 57-60 zum Beispiel für die Gewinnung des Polynucleotids oder als eine diagnostische Sonde oder als ein PCR-Primer verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist daher auf Polynucleotide gerichtet, die mindestens 70% Identität, bevorzugt mindestens 90% Identität und mehr bevorzugt mindestens 95% Identität mit einem Polynucleotid aufweisen, das sowohl die Enzyme der SEQ ID NR: 15-28 und 61-64 als auch Fragmente hiervon codiert, wobei die Fragmente mindestens 15 Basen, bevorzugt mindestens 30 Basen und am meisten bevorzugt mindestens 50 Basen besitzen, wobei die Fragmente mindestens 90% Identität, bevorzugt mindestens 95% Identität und am meisten bevorzugt mindestens 97% Identität unter stringenten Bedingungen mit irgendeinem Abschnitt eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus Enzyme, die die abgeleiteten Aminosäuresequenzen aus den 1-18 (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64) aufweisen, sowie Fragmente, Analoga und Derivate solcher Enzyme.
Die Ausdrücke „Fragment", „Derivat" und „Analogon" in Bezug auf die Enzyme aus den 1-18 (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64) bezeichnen Enzyme, die wesentlich die gleiche Funktion oder Aktivität wie diese Enzyme behalten. Daher umschließt ein Analogon ein Proprotein, das durch Abspaltung des Proprotein-Abschnittes aktiviert werden kann, ein aktives, reifes Enzym zu bilden.
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können ein rekombinantes Enzym, ein natürliches Enzym oder ein synthetisches Enzym sein, bevorzugt ein rekombinantes Enzym.
Das Fragment, Derivat oder Analogon der Enzyme aus den 1-18 (SEQ ID NR: 15-28 und 61-64) kann (i) eines sein, bei dem ein oder mehrere der Aminosäure-Reste durch einen konservierten oder nicht konservierten Aminosäure-Rest (bevorzugt einen konservierten) Aminosäure-Rest substituiert werden, und ein solcher substituierter Aminosäure-Reste kann oder kann nicht einer sein, der vom genetischen Code codiert wird, oder (ii) eines, bei dem ein oder mehrere der Aminosäure-Reste eine Substituentengruppe umfassen, oder (iii) eines, bei dem das reife Enzym mit einer anderen Verbindung verschmilzt, wie etwa einer Verbindung, die die Halbwertszeit des Enzyms verlängert (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) eines, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Enzym verbunden werden, wie etwa eine Leader- oder Sekretionssequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Enzyms verwendet wird, oder eine Proprotein-Sequenz. Solche Fragmente, Derivate und Analoga werden von Fachleuten auf dem Gebiet auf Grund der hierin beschriebenen Fakten als innerhalb des Rahmens liegend angesehen.
Die Enzyme und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in einer isolierten Form bereit gestellt und sind bevorzugt bis zur Homogenität gereinigt.
Der Ausdruck „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde (z.B. aus der natürlichen Umgebung, falls es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Enzym, das in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid oder Enzym, getrennt von einigen oder allen koexistierenden Materialien des natürlichen Systems, ist isoliert. Solche Polynucleotide können Teil eines Vektors sein, und/oder solche Polynucleotide oder Enzyme können Teil einer Zusammensetzung und dennoch isoliert sein, denn ein solcher Vektor oder solche Zusammensetzung sind nicht Teil seiner natürlichen Umgebung.
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung umschließen sowohl die Enzyme mit den SEQ ID NR: 15-28 und 61-64 (besonders die reifen Enzyme) als auch Enzyme, die mindestens 70 % Ähnlichkeit (bevorzugt mindestens 70% Identität) mit den Enzymen der SEQ ID NR: 15-28 und 61-64 aufweisen und mehr bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt mindestens 90% Identität) mit den Enzymen der SEQ ID NR: 15-28 und 61-64 und noch mehr bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit (noch mehr bevorzugt mindestens 95% Identität) mit den Enzymen der SEQ ID NR: 15-28 und 61-64 aufweisen und auch Abschnitte solcher Enzyme einschließen, wobei ein solcher Abschnitt des Enzyms allgemein mindestens 30 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren umfasst.
Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, wird „Ähnlichkeit" zwischen zwei Enzymen durch das Vergleichen der Aminosäuresequenz und seiner konservierten Aminosäure-Substituenten des einen Enzyms mit der Sequenz eines zweiten Enzyms bestimmt.
Eine Variante, d.h. ein "Fragment-", "Analogon-" oder "Derivat " Polypeptid und ein Referenz-Polpeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verzweigungen unterscheiden, die in jeglicher Kombination auftreten können.
Zu den bevorzugten Varianten gehören jene, die sich von einer Referenz durch konservative Aminosäure-Substitution unterscheiden. Solche Substitutionen sind jene, die eine gegebene Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ersetzen. Als konservative Substitutionen wird typischerweise der Ersatz, einer für einen anderen, unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile angesehen; Tausch der Hydroxylreste Ser und Thr untereinander, Austausch der sauren Reste Asp und Glu, Substitution zwischen den Amidresten Asn und Gln, Austausch der basischen Reste Lys und Arg und Ersatz unter den aromatischen Resten Phe, Tyr.
Am meisten bevorzugt sind Varianten, die die gleiche biologische Funktion und Aktivität wie das Referenz-Polypeptid, von dem sie abstammen, behalten.
Fragmente oder Abschnitte der Enzyme der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung des zugehörigen Enzyms in voller Länge durch Peptidsynthese verwendet werden; zu diesem Zweck können die Fragmente als Zwischenschritte zur Herstellung des Enzyms in voller Länge verwendet werden. Fragmente oder Abschnitte der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung in voller Länge zu synthetisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umschließen, Wirtszellen, die gentechnisch mit Vektoren der Erfindung hergestellt werden, und die Herstellung von Enzymen der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Wirtszellen werden mit den Vektoren der Erfindung, welche zum Beispiel ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können, gentechnisch hergestellt (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Der Vektor kann zum Beispiel in der Form eines Plasmids, eines viralen Partikels, eines Phagen etc. vorliegen. Die gentechnisch hergestellten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien kultiviert werden, die in geeigneter Weise zur Aktivierung von Promotoren, Selektion von Transformanten oder zur Amplifizierung der Gene der vorliegenden Erfindung modifiziert sein können. Die Kulturbedingungen wie etwa Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind jene, die zuvor für die zur Expression ausgewählten Wirtszellen verwendet wurden und werden Fachleuten auf dem Gebiet geläufig sein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Enzymen mit Hilfe von rekombinanten Techniken verwendet werden. So können zum Beispiel die Polynucleotide zur Expression eines Enzyms in jeden aus einer Reihe von Expressionsvektoren eingeschlossen werden. Solche Vektoren umschließen chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefe-Plasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abstammen, virale DNA wie etwa von Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudorabies. Es kann jedoch auch jeder andere Vektor verwendet werden, solange sie in der Wirtszelle replizierbar und lebensfähig sind.
Die geeignete DNA-Sequenz kann mit einer Reihe von Verfahren in den Vektor inseriert werden. Allgemein wird die DNA-Sequenz in eine geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle(n) durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren inseriert. Solche und andere Verfahren werden als innerhalb des Rahmens von Fachleuten auf dem Gebiet liegend angesehen.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist mit einer geeigneten Kontrollsequenzen) zur Expression (Promotor) funktionell verbunden, um mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele für solche Promotoren können genannt werden: LTR oder SV40-Promotor, der E. coli-lac-oder-trp-, der Lambda-Phagen P_L-Promotor und andere Promotoren, die dafür bekannt sind, Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder deren Viren zu kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomen-Bindungsstelle zur Initiierung der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifizierung der Expression umschließen.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren bevorzugt ein oder mehrere selektierbare Markierungsgene, um ein phänotypisches Erkennungsmerkmal zur Selektion von transformierten Wirtszellen wie etwa Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkulturen oder wie etwa Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz bei E. coli bereitzustellen.
Der Vektor, der sowohl die geeignete DNA-Sequenz, wie hierin vorstehend beschrieben, als auch eine geeignete Promotor- oder Kontrollsequenz enthält, kann verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um der Wirtszelle zu gestatten, das Protein zu exprimieren.
Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirtsorganismen können genannt werden: Bakterienzellen wie etwa E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; Pilzzellen wie etwa Hefe; Insektenzellen wie etwa Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; Tierzellen wie etwa CHO, COS oder Bowes Melanom; Adenoviren, Pflanzenzellen etc. Die Auswahl eines geeigneten Wirts kann von Fachleuten auf diesem Gebiet aus den hierin genannten Fakten bestimmt werden.
Genauer umschließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstruktionen, die eine oder mehrere der Sequenzen, wie vorstehend breit beschrieben, umfassen. Die Konstruktionen umfassen einen Vektor wie etwa einen Plasmid- oder viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in einer vorwärts gerichteten oder reversen Orientierung inseriert worden ist. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst die Konstruktion darüber hinaus Regulationssegmente einschließlich zum Beispiel eines Promotors, die funktionell mit der Sequenz verbunden sind. Eine große Anzahl von geeigneten Vektoren und Promotoren ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und kommerziell zu erwerben. Die nachstehenden Vektoren werden als Beispiele genannt: Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174, pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eukaryontisch: pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, solange sie in der Wirtszelle replizierbar und lebensfähig sind.
Promotor-Regionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markierungen ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Im Einzelnen genannte bakterielle Promotoren umschließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, Lambda P_R, P_L und trp. Eukaryontische Promotoren umschließen sehr frühen CMV, HSV-Thymidin-Kinase, frühes und spätes SV40, LTRs vom Retrovirus und Metallothionein-1 der Maus. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt im Bereich des Fachwissens auf diesem Gebiet.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstruktionen enthalten. Die Wirtszelle kann entweder eine eukaryontische Zelle wie etwa eine Säugerzelle oder eine niedere eukaryontische Zelle wie etwa eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie etwa eine Bakterienzelle sein. Einführung der Konstruktion in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfizierung, DEAE-Dextranvermittelte Transfizierung oder Elektroporation erreicht werden (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Die Konstruktionen in Wirtszellen können in einer herkömmlichen Weise zur Produktion des Genprodukts, das durch die rekombinante Sequenz codiert wird, verwendet werden. Alternativ können die Enzyme der Erfindung synthetisch durch herkömmliche Peptid-Syntheseanlagen hergestellt werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls unter Verwendung von RNAs, die von den DNA-Konstruktionen der vorliegenden Erfindung abstammen, eingesetzt werden, um solche Proteine herzustellen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirtsorganismen werden von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) beschrieben, die Offenbarung davon ist hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Transkription der DNA, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung codiert, durch höhere Eukaryonten wird durch die Insertion einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-agierende Elemente der DNA, gewöhnlich etwa zwischen 10 und 300 Bp, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele umschließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs Bp 100 bis 270, ein früher Promotor-Enhancer des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
Allgemein werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Markierungen einschließen, die die Transformation der Wirtszelle erlauben, z.B. das Gen für Ampicillin-Resistenz von E. coli und das TRP1-Gen von S. cerevisiae, und einen Promotor, der von einem hoch-exprimierten Gen stammt, um Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktursequenz zu steuern. Solche Promotoren können von Operons stammen, die glycolytische Enzyme wie etwa 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschock-Proteine und andere codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in einer geeigneten Phase mit Translationsstart- und Terminationssequenzen und bevorzugt einer Leader-Sequenz, die in der Lage ist, Sekretion von translatiertem Enzym zu steuern, zusammengebaut. Optional kann die heterologe Sequenz ein Fusionsenzym einschließlich eines N-terminalen Peptids zur Identifikation codieren, das gewünschte Eigenschaften, z.B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produktes überträgt.
Hilfreiche Expressionsvektoren zur Verwendung bei Bakterien werden konstruiert, indem eine strukturelle DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsstart- und Terminationssignalen in funktioneller Lesephase mit einem funktionalen Promotor inseriert wird. Der Vektor wird einen oder mehrere phänotypische, selektierbare Markierungen und einen Replikationsursprung umfassen, um die Erhaltung des Vektors sicher zu stellen und um Amplifizierung innerhalb der Wirtszelle zu ermöglichen, falls erwünscht. Geeignete prokaryontische Wirzsorganismen zur Transformation umschließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und zahlreiche Arten der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl die Wahl auch auf die Verwendung anderer fallen kann.
Als ein repräsentatives, aber nicht begrenzendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung bei Bakterien eine selektierbare Markierung und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden stammen, die genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten. Solche kommerziellen Vektoren umschließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-„Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach Transformierung eines geeigneten Wirtsstammes und Züchtung des Wirtsstammes bis zu einer geeigneten Zelldichte wird der selektierte Promotor durch geeignete Verfahren induziert (z.B. Temperaturwechsel oder chemische Induktion), und die Zellen werden über einen weiteren Zeitraum kultiviert.
Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Verfahren aufgebrochen, und der resultierende Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung zurückbehalten.
Mikrobenzellen, die zur Expression von Proteinen verwendet werden, können durch jedes herkömmliche Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich durch Gefrier-Tau-Zyklen, Ultraschallbehandlung, mechanischen Aufbruch oder Verwendung von Zell-lysierenden Agenzien; solche Verfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Verschiedene Kultursysteme mit Säugerzellen können ebenfalls verwendet werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele für Säuger-Expressionssysteme umschließen die COS-7-Linien von Fibroblasten aus Affennieren, beschrieben von Gluzman, Cell, 23:175 (1981), und andere Zelllinien, die zur Expression eines kompatiblen Vektors in der Lage sind, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren werden einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch alle notwendigen Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstelle, Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen, Transkription-Terminationssequenzen und 5'-flankierende, nicht transkribierte Sequenzen umfassen. DNA-Sequenzen, die von der SV40-Spleißstelle stammen und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die geforderten nicht transkribierten genetischen Elemente zu liefern.
Das Enzym kann aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren gewonnen und gereinigt werden, die Ausfällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, Säure-Extraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatit-Chromatogaphie und Lectin-Chromatographie umschließen. Schritte zu Wiederfaltung des Proteins können, falls notwendig, zur Herstellung der vollständigen Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Schließlich kann Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) für abschließende Reinigungsschritte verwendet werden.
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können ein auf natürliche Weise gereinigtes Produkt oder ein Produkt chemischer Syntheseverfahren sein oder durch rekombinante Techniken von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus (zum Beispiel durch Kulturen von bakteriellen, Hefe-, höheren Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen) produziert werden. In Abhängigkeit von dem in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendeten Wirtsorganismus können die Enzyme der Erfindung glycosyliert oder sie können nicht glycosyliert sein. Enzyme der Erfindung können auch einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest einschließen, müssen es aber nicht.
β-Galactosidase hydrolysiert Lactose zu Galactose und Glucose. Demzufolge können die Enzyme OC1/4V, 9N2-31B/G, AED1112RA-18B/G und F1-12G in der Lebensmittel verarbeitenden Industrie zur Produktion von Milch mit geringem Lactosegehalt und zur Produktion von Galactose oder Glucose aus in Molke enthaltener Lactose eingesetzt werden, die in einer großen Menge als ein Nebenprodukt bei der Herstellung von Käse anfällt. Allgemein ist es erwünscht, dass Enzyme, die in der Lebensmittelverarbeitung verwendet werden, wie etwa die vorstehend genannten β-Galactosidasen, bei erhöhten Temperaturen stabil sind, um die Bewahrung vor mikrobieller Verunreinigung zu unterstützen.
Diese Enzyme können auch in der pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden. Diese Enzyme werden verwendet, um Unverträglichkeit von Lactose zu behandeln. In diesem Fall wird ebenfalls ein thermostabiles Enzym gewünscht. Thermostabile β- Galactosidasen finden auch Verwendung in diagnostischen Verabreichungen, wo sie als Reportermoleküle eingesetzt werden.
Glucosidasen reagieren mit löslichen Cellooligosacchariden am nicht reduzierenden Ende, um Glucose als einziges Produkt zu ergeben. Glucanasen (Endo- und Exo-) wirken durch Depolymerisation von Cellulose und erzeugen weitere nicht reduzierende Enden (Endoglucanasen wirken zum Beispiel auf innere Verbindungen, wobei Cellobiose, Glucose und Cellooligosaccharide als Produkte entstehen). β-Glucosidasen werden bei Verabreichungen verwendet, bei denen Glucose das erwünschte Produkt ist. Demzufolge können M11TL, F1-12G, GC74-22G, MSB8-6G, OC1/4V, VC1-7G1, 9N2-31B/G und AED1112RA-18B/G in einer großen Vielzahl industrieller Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich beim Nassmahlen von Getreide zur Trennung von Stärke und Gluten, in der Früchte verarbeitenden Industrie zur Klärung und Maschinenpflege, beim Backen zur Reduktion von Viskosität, in der Textilindustrie zur Herstellung von Blue Jeans und in der Detergensindustrie als ein Zusatz. Für diese und andere Anwendungen sind thermostabile Enzyme wünschenswert.
Antikörper gegen die Enzyme, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Enzyme in ein Tier oder durch Verabreichung der Enzyme an ein bevorzugt nicht menschliches Tier erhalten werden. Der auf diese Weise erhaltene Antikörper wird dann selbst die Enzyme binden. Auf diese Weise kann selbst eine Sequenz, die nur ein Fragment der Enzyme codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die die ganzen ursprünglichen Enzyme binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Enzym aus den Zellen zu isolieren, die das Enzym exprimieren.
Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann jede Technik verwendet werden, die aus Kulturen fortlaufender Zelllinien produzierte Antikörper liefert. Beispiele umschließen die Hybridom-Technik (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), die Triom-Technik, die menschliche B-Zellen-Hybridom-Technik (Kozbor et al., 1983 Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77-96).
Techniken, die für die Produktion von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden (US-Patent Nr. 4,946,778) können so angepasst werden, dass Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Enzymprodukte dieser Erfindung produziert werden. Auch transgene Mäuse können verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Enzymprodukte dieser Erfindung zu exprimieren.
Antikörper, die gegen die Enzyme der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, können bei der Durchmusterung auf ähnliche Enzyme bei anderen Organismen und Proben verwendet werden. Solche Durchmusterungstechniken sind auf dem Fachgebiet bekannt und ein solcher Durchmusterungstest wird zum Beispiel in „Methods for Measuring Cellulase Activities", Methods in enzymology, Bd. 160, S. 87-116, beschrieben, welches hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen wird.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele weiter beschrieben; es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht durch solche Beispiele begrenzt ist. Alle Teile oder Mengen sind, soweit nicht anders angegeben, Gewichtsangaben.
Um das Verständnis der nachstehenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, häufig erscheinende Verfahren und/oder Ausdrücke beschrieben.
„Plasmide" werden durch ein kleines p gekennzeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Ziffern vorausgehen und/oder folgen. Die hierin verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder käuflich zu erwerben, öffentlich auf einer uneingeschränkten Basis zugänglich oder können aus verfügbaren Plasmiden im Einklang mit veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind zu jenen beschriebenen äquivalente Plasmide auf dem Fachgebiet bekannt und werden Fachleuten geläufig sein.
„Spaltung" von DNA betrifft katalytische Spaltung von DNA durch ein Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA ansetzt. Die zahlreichen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind käuflich zu erwerben, und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und andere Erfordernisse werden, wie es Fachleuten bekannt ist, verwendet. Für analytische Zwecke werden typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Für den Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmid-Konstruktion werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Pufferlösungen und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller genannt. Gewöhnlich werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C verwendet, können aber im Einklang mit den Anweisungen des Herstellers variieren. Nach der Spaltung wird das Reaktionsgemisch direkt auf einem Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Auftrennung der abgespaltenen Fragmente nach Größe wird unter Verwendung von 8 % Polyacrylamid-Gel durchgeführt, wie von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) beschrieben.
„Oligonucleotide" betrifft entweder ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotid-Stränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden daher an kein anderes Oligonucleotid ligieren, solange nicht ein Phosphat mit einem ATP-Molekül in Anwesenheit von einer Kinase zugegeben wird. Ein synthetisches Oligonucleotid wird ein Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert worden ist.
„Ligierung" betrifft den Prozess der Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäure-Fragmenten (Maniatis, T. et al, Id., S. 146). Solange nicht anders angegeben, kann Ligierung unter Verwendung bekannter Pufferlösungen und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg annähernd äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente durchgeführt werden.
Soweit nicht anders vermerkt, wurde die Transformation durchgeführt, wie in dem Verfahren von Graham, F. und Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973) beschrieben.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von Glycosidase-Enzymen
DNA, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung codiert, SEQ ID NR: 1-14 und 57-60, wurden zunächst von einem die DNA enthaltenden pBluescript-Vektor durch die PCR-Technik unter Verwendung der hierin angeführten Primer amplifizert. Die amplifizierten Sequenzen wurden dann in den entsprechenden PQE-Vektor, der unter den Primer-Sequenzen aufgelistet ist, inseriert, und das Enzym wurde nach den hierin beschriebenen Protokollen exprimiert. Die 5'- und 3'-Primer-Sequenzen für die entsprechenden Gene sind wie folgt:
Die angegebenen Restriktionsenzym-Stellen entsprechen den Restriktionsenzym-Stellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor, der für das entsprechende Gen angezeigt ist (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). Der Vektor pQE codiert Resistenz gegen Antibiotika (Amp.), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG- regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomen-Bindungsstelle (RBS), ein 6-His-Marker und Restriktionsenzym-Stellen.
Der Vektor pQE wurde mit den angegebenen Restriktionsenzymen gespalten. Die amplifizierten Sequenzen wurden in den entsprechenden Vektor pQE ligiert und im Rahmen mit der die RBS codierenden Sequenz inseriert. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um den E. coli-Stamm M15/pREP4 (Qiagen, Inc.) durch Elektroporation zu transformieren. M15/pREP4 enthält mehrfache Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch Resistenz gegenüber Kanamycin (Kan^r) überträgt. Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und gegen Ampicillin/Kanamycin resistente Kolonien wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die die gewünschten Konstruktionen enthielten, wurden über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in LB-Kulturmedien, die sowohl mit Amp (100 μg/ml) als auch Kan (25 μg/ml) versetzt waren, gezüchtet. Die O/N-Kultur wurde verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu beimpfen. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte 600 (O.D.⁶⁰⁰) von zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch Inaktivieren des lacI-Repressors, was den P/O freimacht und zu erhöhter Gen-Expression führt. Man ließ die Zellen zusätzliche 3 bis 4 Stunden wachsen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet.
Die vorstehend genannten Primer-Sequenzen können ebenfalls verwendet werden, um das Zielgen aus dem hinterlegten Material durch vorstehend beschriebene Hybridisierungstechniken zu isolieren.
Beispiel 2
Isolierung eines ausgewählten Clons aus den hinterlegten genomischen Clonen
Ein Clon wird direkt isoliert, indem das hinterlegte Material unter Verwendung der in Beispiel 1 genannten Oligonucleotid-Primer für das bestimmte Gen, das isoliert werden soll, durchmustert wird. Die spezifischen Oligonucleotide werden unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts von Applied Biosystems synthetisiert. Die Oligonucleotide werden mit ³²P-ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase markiert und nach einem Standardprotokoll (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY, 1982) gereinigt. Die hinterlegten Clone in den pBluescript-Vektoren können verwendet werden, um bakterielle Wirtszellen zu transformieren, welche dann auf 1,5%-Agarplatten bis zur Dichte von 20.000 bis 50.000 PBE/150-mm-Platte plattiert werden. Diese Platten werden unter Verwendung von Nylonmembranen nach dem Standardprotokoll für Durchmusterung (Stratagene 1993) durchmustert. Genauer wird die Nylonmembran mit denaturierter und fixierter DNA in 6 × SSC, 20 mM NaH₂PO₄, 0,4% SDS, 5 × Denhardt, 500 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachsspermien-DNA und 6 × SSC, 0,1 % SDS prähybridisiert. Nach Prähybridisierung über eine Stunde wird die Membran mit Hybridisierungspufferlösung aus 6 × SSC, 20 mM NaH₂PO₄, 0,4% SDS, 500 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachsspermien-DNA mit 1 × 10⁶ CpM/ml ³²P-Sonde über Nacht bei 42°C hybridisiert. Die Membran wird bei 45-50°C mit Waschpufferlösung aus 6 × SSC, 0,1 % SDS gewaschen, über 20-30 Minuten getrocknet und über Nacht einem Kodak-Röntgenfilm ausgesetzt. Positive Clone werden durch zweite und dritte Duchmusterungsgänge isoliert und gereinigt. Der gereinigte Clon wird sequenziert, um seine Übereinstimmung mit der Primer-Sequenz zu überprüfen.
Sobald der Clon isoliert ist, werden die beiden Oligonucleotid-Primer, die dem interessierenden Gen entsprechen, verwendet, um das Gen aus dem eingelagerten Material zu amplifizieren. Eine Polymerase-Kettenreaktion wird in 25 μl Reaktionsgemisch mit 0,5 μg der DNA des interessierenden Gens durchgeführt. Das Reaktionsgemisch besteht aus 1,5-5 mM MgCl₂, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine, je 20 μM von dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pMol von jedem Primer und 0,25 Einheiten Taq-Polymerase. 35 PCR-Zyklen (Denaturierung bei 94°C über 1 min; Anheften bei 55°C über 1 min; Verlängerung bei 72°C über 1 min) werden im automatisierten Thermocycler von Perkin-Eimer Cetus durchgeführt. Das amplifizierte Produkt wird durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert, und die DNA-Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht wird ausgeschnitten und gereinigt. Durch Subclonierung und Sequenzierung des DNA-Produktes wird das PCR-Produkt darauf überprüft, ob es sich um das interessierende Gen handelt. Die Nucleotide der Enden der neu gereinigten Gene werden sequenziert, um die Sequenzen in voller Länge zu identifizieren. Vollständige Sequenzierung der Gene in voller Länge wird dann durch Spaltung mit Exonuclease III oder Primer-Walking durchgeführt.
Beispiel 3
Durchmusterung auf Galactosidase-Aktivität
Durchmusterungsverfahren auf Protein-Aktivität der α-Galactosidase können wie folgt durchgeführt werden:
Substratplatten werden durch ein Standard-Plattierungsverfahren bereitgestellt. Verdünne XL1-Blue MRF-E. coli-Wirtszellen (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) auf O.D.₆₀₀ = 1,0 mit NZY-Kulturmedium. In 15-ml-Röhrchen beimpfe 200 μl verdünnte Wirtszellen mit Phage. Mische leicht und inkubiere die Röhrchen bei 37°C über 15 min. Gebe etwa 3,5 ml LB-Top-Agarose (0,7%), die 1 mM IPTG enthält, in jedes Röhrchen dazu und gieße über die gesamte NYZ-Plattenoberfläche. Lasse abkühlen und inkubiere bei 37°C über Nacht. Die Untersuchungsplatten werden als Substrat: p-Nitrophenyl-α-Galactosidase (Sigma) (200 mg/100 ml) (100 mM NaCl, 100 mM Kalium-Phosphat)- 1 % (Gew./Vol.) Agarose-Platten erhalten. Die Plaques werden mit Nitrocellulose überlagert und bei 4°C über 30 Minuten inkubiert, worauf die Nitrocellulose entfernt wird und über die Substratplatten gelegt wird. Die Substratplatten werden dann bei 70°C über 20 Minuten inkubiert.
Beispiel 4
Durchmusterung von Clonen auf Mannanase-Aktivität
Eine Festphasen-Durchmusterung wurde als ein erstes Durchmusterungsverfahren verwendet, um Clone auf β-Mannanase-Aktivität zu untersuchen.
Eine Kulturlösung des E.coli-Wirtsstammes Y1090 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) wurde auf O.D.₆₀₀ = 1,0 mit NZY-Kulturmedium verdünnt. Die amplifizierte Bibliothek von Thermotoga maritima-lambda-gtl1-Bibliothek wurde in SM (Phagen-Verdünnungspufferlösung) verdünnt: 5 × 10⁷ PBE/μl verdünnt 1:1000, dann 1:100 auf 5 × 10² PBE/μl. Dann wurden 8 μl Phagen-Verdünnungslösung (5 × 10² PBE/μl) auf 200 μl Wirtszellen plattiert. Sie wurden dann in 15-ml-Röhrchen bei 37°C über 15 Minuten inkubiert.
Etwa 4 ml geschmolzene, LB Top-Agarose (0,7%) wurden bei etwa 52°C in jedes Röhrchen zugegeben, und das Gemisch wurde auf die Oberfläche der LB-Agarplatten gegossen. Die Agarplatten wurden dann bei 37°C über fünf Stunden inkubiert. Die Platten wurden repliziert und mit 10 mM IPTG getränkten Duralon-UV^TM-Nylonmembranen (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) über Nacht induziert. Die Nylonmembranen und Platten wurden mit einer Nadel markiert, um ihre Orientierung zu behalten, und die Nylonmembranen wurden dann entfernt und bei 4°C gelagert.
Ein Azo-Galactomannan-Überzug, wurde auf die LB-Platten aufgebracht, die die Lambda-Plaques enthielten. Der Überzug enthält 1 % Agarose, 50 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7, 0,4% Azocarob-Galactomannan (Megazyme, Australien). Die Platten wurden bei 72°C inkubiert. Die mit Azocarob-Galactomannan behandelten Platten wurden nach 4 Stunden untersucht, dann zur Inkubation über Nacht zurückgestellt. Mutmaßliche Positive wurden durch geklärte Zonen auf den Azocarob-Galactomannan-Platten identifiziert. Zwei positive Clone wurden beobachtet.
Die vorstehend genannten Nylonmembranen, die zu den positiven Clonen passen, wurden geholt, über der Platte ausgerichtet, und die Abschnitte, die zu den Stellen der Klärungszonen für positive Clone passten, wurden ausgeschnitten. Die Phagen wurden von den ausgeschnittenen Membranabschnitten durch Einweichen der jeweiligen Abschnitte in 500 μl SM (Phagen-Verdünnungspufferlösung) und 25 μl CHCl₃ eluiert.
Beispiel 5
Durchmusterung von Clonen auf Mannosidase-Aktivität
Ein Festphasen-Durchmusterung wurde als ein erstes Durchmusterungsverfahren verwendet, um Clone auf β-Mannosidase-Aktivität zu untersuchen.
Eine Kulturlösung des E.coli-Wirtsstammes Y1090 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) wurde auf O.D.₆₀₀ = 1,0 mit NZY-Kulturmedium verdünnt. Die amplifizierte Bibliothek von AEPII 1a-lambda-gt11-Bibliothek wurde in SM (Phagen-Verdünnungspufferlösung) verdünnt: 5 × 10⁷ PBE/μl, verdünnt 1:1000, dann 1:100 auf 5 × 10² PBE/μl. Dann wurden 8 μl Phagen-Verdünnungslösung (5 × 10² PBE/μl) auf 200 μl Wirtszellen plattiert. Sie wurden dann in 15-ml-Röhrchen bei 37°C über 15 Minuten inkubiert.
Etwa 4 ml geschmolzene, LB-Top-Agarose (0,7%) wurden bei etwa 52°C in jedes Röhrchen zugegeben, und das Gemisch wurde auf die Oberfläche der LB-Agarplatten gegossen. Die Agarplatten wurden dann bei 37°C über fünf Stunden inkubiert. Die Platten wurden repliziert und mit 10 mM IPTG getränkten Duralon-UV^TM-Nylonmembranen (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) über Nacht induziert. Die Nylonmembranen und Platten wurden mit einer Nadel markiert, um ihre Orientierung zu behalten, und die Nylonmembranen wurden dann entfernt und bei 4°C gelagert.
Ein p-Nitrophenyl-β-D-manno-pyranosid-Überzug, wurde auf die LB-Platten aufgebracht, die die Lambda-Plaques enthielten. Der Überzug enthält 1 % Agarose, 50 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7, 0,4% p-Nitrophenyl-β-D-mannopyranosid (Megazyme, Australien). Die Platten wurden bei 72°C inkubiert. Die mit p-Nitrophenyl-β-D-manno-pyranosid behandelten Platten wurden nach 4 Stunden untersucht, dann zur Inkubation über Nacht zurückgestellt. Mutmaßliche Positive wurden durch geklärte Zonen auf den p-Nitrophenyl-β-D-manno-pyranosid-Platten identifiziert. Zwei positive Clone wurden beobachtet.
Die vorstehend genannten Nylonmembranen, die zu den positiven Clonen passen, wurden geholt, über der Platte ausgerichtet, und die Abschnitte, die zu den Stellen der Klärungszonen für positive Clone passten, wurden ausgeschnitten. Die Phagen wurden von den ausgeschnittenen Membranabschnitten durch Einweichen der jeweiligen Abschnitte in 500 μl SM (Phagen-Verdünnungspufferlösung) und 25 μl CHCl₃ eluiert.
Beispiel 6
Durchmusterung auf Pullulanase-Aktivität
Durchmusterungsverfahren auf Pullulanase-Proteinaktivität können wie folgt durchgeführt werden:
Substratplatten werden durch ein Standardverfahren zur Plattierung bereitgestellt. Wirtszellen werden auf O.D.₆₀₀ = 1,0 mit NZY oder geeignetem Kulturmedium verdünnt. Beimpfe in 15-ml-Röhrchen 200 μl verdünnte Wirtszellen mit Phage. Mische sanft und inkubiere die Röhrchen bei 37°C über 15 Minuten. Gebe etwa 3,5 ml LB-Top-Agarose (0,7%) in jedes Röhrchen dazu; das Gemisch wird plattiert, abgekühlt und bei 37°C über etwa 28 Stunden inkubiert. Überzüge von 4,5 ml des nachstehenden Substrates werden aufgebracht: 100 ml Gesamtvolumen

0,5 g Red Pullulan Red (Megazyme, Australien)

1,0 g Agarose

5 ml Pufferlösung (Tris-HCl, pH-Wert 7,2 bei 75°C)

2 ml 5 M NaCl

5 ml CaCl₂ (100 mM)

85 ml dH₂O
Die Platten wurden auf Raumtemperatur gekühlt und dann bei 75°C über 2 Stunden inkubiert. Bei Positiven wurde Substratabbau beobachtet.
Beispiel 7
Durchmusterung auf Endoglucanase-Aktivität
Durchmusterungsverfahren auf Endoglucanase-Proteinaktivität können wie folgt durchgeführt werden:

1. Die Gen-Bibkiothek wird auf 6 LB/GelRite/0,1% CMC/NZY-Agarplatten (4.800 Plaque-bildende Einheiten/Platte) in E. coli-Wirtszellen mit LB-Agarose als Top-Agarose plattiert. Die Platten werden bei 37°C über Nacht inkubiert.
2. Die Platten werden auf 4°C über eine Stunde gekühlt.
3. Die Platten werden mit Duralon-Membranen (Stratagene) bei Zimmertemperatur für eine Stunde überdeckt, und die Membranen werden ausgerichtet und von den Platten entfernt und bei 4°C gelagert.
4. Die Top-Agaroseschicht wird entfernt, und die Platten werden bei 37°c über ~3 Stunden inkubiert.
5. Die Plattenoberfläche wird mit NaCl gespült.
6. Die Platte wird mit 0,1 % Kongorot über 15 Minuten angefärbt.
7. Die Platte wird mit 1 M NaCl entfärbt.
8. Die auf der Platte identifizierten, mutmaßlichen Positiven werden von der Duralon-Membran isoliert (Positive werden durch Klärungszonen rund um Clone identifiziert). Der Phage wird durch Inkubieren in 500 μl SM + 25 μl CHCl₃ zur Eluierung von der Membran eluiert.
9. Insertions-DNA wird in einen geeigneten Clonierungsvektoren subcloniert, und die Subclone werden erneut auf CMCase-Aktivität unter Verwendung des nachstehenden Protokolls untersucht: i) Zentrifugiere 1 ml Über-Nacht-Minipäparation des Clons bei maximaler Geschwindigkeit über 3 Minuten. ii) Gieße den Überstand ab und verwende ihn, um „Vertiefungen" zu füllen, die in eine LB/GelRite/0,1% CMC-Platte gemacht worden waren. iii) Inkubiere bei 37°C über 2 Stunden. iv) Färbe mit 0,1 % Kongorot über 15 Minuten. v) Entfärbe mit 1 M NaCl über 15 Minuten. vi) Identifiziere Positive durch Klärungszone rund um den Clon.

Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Lichte der vorstehenden Beschreibungen möglich und daher innerhalb des Rahmens der anhängenden Patentansprüche; die Erfindung kann auf andere Weise als der im Einzelnen beschriebenen durchgeführt werden.

Claims

Polynucleotid, das ein Glycosidaseenzym codiert, das eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Sequenz die ein Polypeptid wie in SEQ ID NR: 64 gezeigt codiert; (b) einer Sequenz wie in SEQ ID NR: 60 gezeigt; (c) der Sequenz nach einem der Punkte (a) oder (b), wobei T auch U sein kann; (d) einer Sequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 90%, 95% oder 97% zu SEQ ID NR: 60 hat; und (e) einer Sequenz, die zu der Sequenz nach einem der Punkte (a) bis (d) komplementär ist.
Vektor, der das Polynuleotid nach Anspruch 1 enthält.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 2 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle eine eukaryontische oder prokaryontische Zelle ist.
Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NR: 64 gezeigt; (b) einer Aminosäuresequenz, die durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird; (c) einer Aminosäuresequenz mit einer Länge von mindestens 30 oder 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus der Sequenz wie in SEQ ID NR: 64 gezeigt oder einem Polypeptid, das durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird; (d) einer Aminosäuresequenz, die Glycosidaseaktivität und eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 90% oder 95% zu SEQ ID NR: 64 hat.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 5 oder eines Polypeptids wie durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert, umfassend: Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 3 oder 4 und Isolieren des Polypeptids, welches durch das Polynucleotid codiert wird.
Antikörper, der ein Polypeptid wie durch Anspruch 1 codiert oder das Polypeptid nach Anspruch 5 spezifisch bindet.
Verfahren zum Erzeugen von Glucose aus löslichen Cellooligosacchariden, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe, die Oligosaccharide enthält, mit einer wirksamen Menge des Polypeptids nach Anspruch 5, so dass Glucose hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Probe aus Molkereiprodukten, Fruchtsäften, Reinigungsmitteln, Textilien, Guarmehl, Tierfutter, pflanzlicher Biomasse oder Abfallprodukten besteht.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Oligosaccharid Maltose, Cellobiose, Lactose, Saccharose, Raffinose, Stachyose, Verbascose, Cellulose, Stärke, Amylose, Glycogen, Disaccharide, Polysaccharide oder Pullulan ist.
Thermostabile Glycosidase, die eine Sequenz wie in Anspruch 5 angegeben oder wie durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert hat.
Polypeptid, das Galactosidase-, Mannanase-, Mannosidase-, Pullulanase- oder Endoglucanase-Aktivität hat, und das eine Sequenz wie in Anspruch 5 angegeben oder wie durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert hat.
Verfahren zur Herstellung von Milch oder Käse mit niedrigem Lactosegehalt, umfassend die Verarbeitung von Milch oder Käse unter Verwendung eines Enzyms, das eine Sequenz wie in Anspruch 5 angegeben oder wie durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert hat.
Enzym, das eine Sequenz wie in Anspruch 5 angegeben oder wie durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert hat, zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Enzyms, das eine Sequenz wie in Anspruch 5 angegeben oder wie durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert hat, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Lactoseintoleranz.
Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen selektiv mit SEQ ID NR: 60 hybridisiert, umfassend ein Oligonucleotid mit einer Sequenz: (a) von mindestens 30 oder 50 Basen Länge; (b) von mindestens 30 oder 50 Basen Länge und einer Sequenzidentität von mindestens 90%, 95% oder 97% zu SEQ ID NR: 60; (c) von mindestens 30 oder 50 aufeinanderfolgenden Basen einer Sequenz, die ein Polypeptid wie in SEQ ID NR: 64 gezeigt codiert; (d) von mindestens 30 oder 50 aufeinanderfolgenden Basen mit einer Sequenz wie in SEQ ID NR: 60 gezeigt; (e) nach einem der Punkte (a) bis (d), wobei T auch U sein kann; (f) wie in SEQ ID NR: 43 oder 44 gezeigt; oder (g) komplementär zur Sequenz nach einem der Punkte (a) bis (f).
Arzneimittel, welches das Polypeptid nach Anspruch 5 und/oder das Polynucleotid nach Anspruch 1 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst.
Verwendung eines Enzyms nach Anspruch 14 bei der Getreidenassschrotung zur Trennung von Stärke und Gluten, in der Fruchtsaftindustrie oder Brauindustrie zur Klärung, Extraktion und/oder Einrichtungswartung, in der Zuckerrübenindustrie, beim Backen zur Reduktion der Viskosität, bei der Umwandlung von pflanzlicher Biomasse in Treibstoffe und Chemikalien, bei der Abfallbehandlung, in Tierfutter, in der Textilindustrie, bei Bohrlochstimulation und/oder als Zusatz in der Waschmittelindustrie.
Verwendung eines Enzyms nach Anspruch 14 bei der Depolymerisation von Cellulose.
Verfahren zum Hydrolysieren von Guarmehl, umfassend das Inkontaktbringen einer Zusammensetzung die Guarmehl umfasst, mit einem Enzym nach Anspruch 14, wobei das Guarmehl hydrolysiert wird.
Verfahren zum Hydrolysieren von Stärke, umfassend das Inkontaktbringen einer Zusammensetzung die Stärke umfasst, mit einem Enzym wie in Anspruch 14 angegeben.
Verfahren zur Behandlung einer Textilie, umfassend das Inkontaktbringen der Textilie mit einem Enzym wie in Anspruch 14 angegeben unter Bedingungen, unter denen das Enzym eine glycosidische Bindung hydrolysieren kann.
Verfahren zur Behandlung von Tierfutter, umfassend das Inkontaktbringen des Tierfutters mit einem Enzym nach Anspruch 14 unter Bedingungen, unter denen das Enzym eine glycosidische Bindung hydolysieren kann.
Verfahren zur Umwandlung von pflanzlicher Biomasse in Treibstoff oder eine Chemikalie, umfassend das Inkontaktbringen einer Zusammensetzung, die pflanzliche Biomasse umfasst, mit dem Enzym nach Anspruch 14, wobei die pflanzliche Biomasse in Treibstoff oder eine Chemikalie umgewandelt wird.
Verfahren zur Abfallbehandlung, umfassend das Inkontaktbringen einer Zusammensetzung die ein Abfallprodukt umfasst, mit einem Enzym wie in Anspruch 14 angegeben, wobei das Abfallprodukt behandelt wird.
Verfahren zur Behandlung eines Backproduktes, umfassend das Inkontaktbringen des Backproduktes mit einem Enzym wie in Anspruch 14 angegeben unter Bedingungen, unter denen das Enzym eine glycosidische Bindung hydrolysieren kann.
Verfahren zur Bohrlochstimulation, umfassend die Anwendung des Enzyms wie in Anspruch 14 angegeben während der Bohrarbeiten, wobei eine Stimulation der Bohrarbeiten erfolgt.