ES2242986T3 - Enzimas glicosidasa. - Google Patents

Enzimas glicosidasa.

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ES2242986T3 ES97952351T ES97952351T ES2242986T3 ES 2242986 T3 ES2242986 T3 ES 2242986T3 ES 97952351 T ES97952351 T ES 97952351T ES 97952351 T ES97952351 T ES 97952351T ES 2242986 T3 ES2242986 T3 ES 2242986T3
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Edward J. Bylina
Ronald V. Swanson
Eric J. Mathur
David E. Lam
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Abstract

Un polinucleótido que codifica un enzima glicosidasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en: (a) una secuencia que codifica un polipéptido como se publica en ID DE SEC NO:64 (b) una secuencia como la publicada en ID DE SEC NO:60; (c) la secuencia de (a) o (b), en donde T también puede ser U; (d) una secuencia que tiene al menos 90%, 95% o 97% de la identidad de secuencia de ID DE SEC NO:60; y (e) una secuencia complementaria a la secuencia de (a) a (d).

Description

Enzimas glicosidasa.
Antecedentes de la invención 1. Campo de las invenciones
Esta invención se refiere a nuevos polinucleótidos identificados, polipéptidos codificados por estos polinucleótidos, el uso de estos polinucleótidos y polipéptidos, así como la producción y aislamiento de estos polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención ha estado supuestamente identificada como glucosidasas, \alpha-galactosidasas, \beta-galactosidasas, \beta-manosidasas, \beta-mananasas, endoglucanasas, y pulalanasas.
2. Descripción de la materia en cuestión
El enlace glicosídico de \beta-galactósidos puede romperse por diferentes clases de enzimas: (i) fosfo-\beta-galactosidasas (EC 3.2.1.85) son específicas para un sustrato fosforilado generado mediante el sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasa (PTS) dependiente de captación; (ii) \beta-galactosidasas típicas (EC 3.2.1.23), representadas por el enzima LacZ de Escherichia coli, que son relativamente específicas para \beta-galactósidos; y (iii) \beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) tales como los enzimas de Agrobacterium faecalis, Clostridium thermocellum, Pyrococcus furiosus o Sulfolobus solfataricus (Day, A.G. and Withers, S.G., (1986) Purificación y caracterización de una \beta-glucosidasa a partir de Alcaligenes faecalis. Can. J. Biochem. Cell. Biol. 64, 914-922; Kengen, S.W.M:, et al. (1993) Eur. J. Biochem., 213, 305-312; Ait, N., Cruezet, N. and Cattaneo, J. (1982) Propiedades de \beta-glucosidasa purificada a partir de Clostridium thermocellum. J. Gen. Microbiol.128, 569-577; Grogan, D.W. (1991). Evidencia que la \beta-galactosidasa de Sulfolobus solfataricus es solo una de las numerosas actividades de una \beta-D-glicosidasa termoestable. Appl. Environ. Microbiol. 57,1644-1649). Miembros del último grupo, a pesar de la alta especificidad con respecto a la configuración \beta-anomérica del enlace glicosídico, a menudo presenta una especificidad de sustrato relajado e hidroliza \beta-glucósidos así como \beta-fucósidos y \beta-galactósidos.
Generalmente, \alpha-galactosidasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de grupos galactosa sobre la cadena principal de un polisacárido o hidrolizan la ruptura de di- o oligosacáridos que comprenden galactosa.
Generalmente, \beta-mananasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de grupos manosa internamente sobre la cadena principal de un polisacárido o hidrolizan la ruptura de di- o oligosacáridos que comprenden grupos manosa. \beta-manosidasas hidrolizan residuos terminales de manosa no-reductores o una manosa que contenga polisacáridos y la ruptura de di- o oligosacáridos que comprendan grupos manosa.
Goma guar es un polisacárido galactomanano ramificado compuesto de la cadena principal de manosas unidas por \beta-1,4 con cadenas laterales de galactosa unidas por enlaces \beta-l,6. Los enzimas requeridos para la degradación de guar son \beta-mananasa, \beta-manosidasa y \beta-galactosidasa. \beta-mananasa hidroliza la cadena principal de manosa internamente y \beta-manosidasa hidroliza residuos terminales no reductores de manosa. \alpha-galactosidasa hidroliza grupos galactosa \alpha-unidos.
Polisacáridos de Galactomanano y los enzimas que los degradan tienen una variedad de aplicaciones. Guar se usa comúnmente como un agente espesante en alimentos y se utiliza en fracturación hidráulica en reposición de aceite y gas. Consecuentemente, galactomananasas son relevantes industrialmente para la degradación y modificación de guar. Además, existe una necesidad de que las galactomanasas termoestables sean activas en condiciones extremas asociadas al ensayo y la buena estimulación.
Existen otras aplicaciones para estos enzimas en varias industrias, tales como en la industria del azúcar de remolacha. El 20-30% del consumo doméstico en EE.UU. de sacarosa es la sacarosa del azúcar de remolacha. El azúcar de remolacha natural puede contener una pequeña cantidad de rafinosa cuando el azúcar de remolacha se almacena antes de procesarse y se empieza a descomponer. La rafinosa inhibe la cristalización de la sacarosa y también constituye una cantidad de sacarosa oculta. Así, tiene mérito eliminar la rafinosa del azúcar de remolacha natural. También se ha usado \alpha-Galactosidasa como una ayuda digestiva para descomponer la rafinosa, estaquiosa, y verbascosa en alimentos como judías y otros alimentos gaseosos.
\beta-galactosidasas que son activas y estables a altas temperaturas aparecen para ser enzimas superiores para la producción de productos lácticos dietéticos libres de lactosa (Chaplin, M.F. and Bucke, C. (1990) En: Enzyme Technology, pp. 159-160, Cambridge University Press, Cambridge, UK). También, muchos estudios han demostrado la aplicabilidad de \beta-galactosidasas en la síntesis enzimática de oligosacáridos mediante reacciones de transglicosilación (Nilsson, K.O.I. (1988) Enzymatic synthesis of oligosaccharides. Trends Biotechnol 6,156-264; Cote, G.L. and Tao, B.Y. (1990) Oligosaccharide synthesis by enzymatic transglycosylation. Glycoconjugate J. 7,145-162). A pesar del potencial comercial, solo algunas \beta-galactosidasas de termófilos han sido caracterizadas hasta ahora. Dos genes descritos son enzimas que cortan \beta-galactósidos de la bacteria hipertermofílica Thermotoga maritima, una de las eubacterias organotróficas más termofílicas descritas hasta al momento (Huber, R., Langworthy, T.A., König, H., Thomm, M., Woese, C.R., Sleytr, U.B. y Stetter, K.O. (1986) T. martima sp. nov. representa un nuevo género de la única eubacteria extremadamente termofílica que crece a 90ºC, Arch. Microbiol. 144, 324-333) una de las eubacterias organotróficas más termofílicas descritas hasta el momento. Los productos génicos han sido identificados como una \beta-galactosidasa y una \beta-glucosidasa.
Pululanasa es bien conocida como un enzima desramificado de pululano y almidón. El enzima hidroliza enlaces \alpha-1,6-glucosídicos en estos polímeros. La degradación del almidón para la producción o edulcorantes (glucosa o maltosa) es una aplicación industrial de este enzima muy importante. La degradación del almidón se desarrolla en dos etapas. La primera etapa implica la licuefacción del sustrato con \alpha-amilasa, y la segunda etapa, o etapa de sacarificación, se desempeña por la \beta-amilasa con pulalanasa añadida como un enzima desramificador, para obtener mejores rendimientos.
Endoglucanasas pueden ser usadas en varias aplicaciones industriales. Por el momento, las endoglucanasas de la presente invención pueden hidrolizar los enlaces internos \beta-1,4-glicosídicos de la celulosa, que puede ser usada para la conversión de la biomasa vegetal en combustibles y productos químicos. Las endoglucanasas también tienen aplicaciones en formulaciones de detergentes, la industria textil, en alimentación animal, en el tratamiento de deshechos, y en los zumos de frutas e industria de elaboración para la clarificación y extracción de jugos.
Breve descripción de las figuras
Las siguientes figuras son ilustrativas de realizaciones de la invención y no tienen la intención de limitar el alcance de la invención a lo abarcado en las reivindicaciones.
Figuras 1 a-b son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de M11TL de la presente invención. La secuenciación se desempeñó usando un secuenciador de DNA automático 378 para todas las secuencias de la presente invención (Applied Biosystems, Inc.).
Figura 2 es una ilustración del DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de OC 1/4V-33B/G.
Figura 3 es una ilustración del DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de Fl-12G.
Figuras 4a-b son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de 9N2-31B/G.
Figuras 5a-b son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de MSB8-6G.
Figura 6 es el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de AEDII12RA-18B/G.
Figuras 7a-b son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de GC74-22G.
Figuras 8a b son el DNA completo, y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de VC1-7G1.
Figuras 9a-c son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de 37GP1.
Figuras l0 a-c son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de 6GC2.
Figuras 11 a-d son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de 6GP2.
Figuras 12 a-c son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de 63GBl.
Figuras 13 a-b son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de OC1/4V.
Figuras 14 a-e son el DNA completo y secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de 6GP3.
Figuras l5 a-d son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de Thermotoga maritima MSB8-6GP2.
Figuras 16 a-c son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de Thermotoga maritima MSB8-6GB4.
Figuras 17 a-d son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de Banki gouldi 37GP4.
Figuras l8 a-b son el DNA completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de Pyrococcus furiosus VC1-7EG1.
\newpage
Resumen de la invención
En una realización preferida de la presente invención, hay ácidos nucleicos aislados suministrados (polinucleótidos) que codifican enzimas maduros que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de las Figuras 1-18 (ID de SEC NOS: 15-28 y 61-64).
En otra realización, la invención proporciona un método para producir un polipéptido que incluya células huésped cultivadas que contengan el polinucleótido de Figuras 1-18 y que expresen desde la célula huésped un polipéptido codificado por el polinucleótido y que aíslen en polipéptido.
En otra realización, la invención proporciona un enzima seleccionado del grupo consistente en un enzima que tiene una secuencia de aminoácidos publicada en ID de SEC NOS: 15-28 o 61-64 y un enzima que tenga al menos 30 residuos aminoacídicos consecutivos como un enzima que tiene una secuencia de aminoácidos publicada en ID de SEC NOS: 15-28 o 61-64.
Aún en otra realización, la invención proporciona un método para generar glucosa a partir de oligosacáridos celulares solubles que incluye el contacto de una muestra que contiene oligosacáridos con una cantidad efectiva de un enzima seleccionado del grupo de enzimas que tienen la secuencia de aminoácidos publicada en ID de SEC NOS: 15-28, 61-63 y 64 de manera que se produce glucosa.
Las publicaciones discutidas aquí solamente se proporcionan para su divulgación antes de la fecha de catalogación de la presente aplicación. Nada de lo aquí descrito debe ser interpretado como una admisión que la invención no tiene título para antedatar tal divulgación por virtud de invenciones anteriores.
Definiciones
"Monosacárido", como se usa aquí, se refiere a una unidad de aldehído o cetona simples polihidroxilados.
"Oligosacárido", como se usa aquí, consiste en cadenas cortas de unidades de monosacáridos unidas juntas por enlaces covalentes. De éstos, los más abundantes son los disacáridos, que tienen dos unidades de monosacáridos.
"Polisacáridos", como se usa aquí, consiste en cadenas largas que tienen muchas unidades de monosacáridos.
El término "gen" significa el segmento de DNA implicado en la producción de una cadena de polipéptido; incluye regiones precedentes y siguientes a la región codificante (líder y trailer) así como la intervención de secuencias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
Una secuencia codificante está "operativamente unida a" otra secuencia codificante cuando la RNA polimerasa transcribe las dos secuencias codificantes en un mRNA simple, que entonces se traduce en un polipéptido simple que tiene aminoácidos derivados de ambas secuencias codificantes. Las secuencias codificantes no necesitan ser contiguas entre ellas siempre que las secuencias expresadas a la postre se procedan para producir la proteína deseada.
Enzimas "recombinantes" se refieren a enzimas producidos por técnicas de DNA recombinante; es decir, producidos a partir de células transformadas por un constructo de DNA exógeno codificando el enzima deseado. Enzimas "sintéticos" son aquellos preparados por síntesis química.
Una "secuencia codificante de" DNA o una "secuencia de nucleótidos codificando" un enzima particular, es una secuencia de DNA que se transcribe y se traduce en un enzima cuando tiene lugar bajo el control de secuencias regulatorias apropiadas.
Descripción detallada de la invención
Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención han sido identificados como glucosidasas, \alpha-galactosidasas, \beta-galactosidasas, \beta-manosidasas, \beta-mananasas, endoglucanasas, y pulalanasas como un resultado de su actividad enzimática.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan nuevos enzimas, así como fragmentos activos, análogos y derivados de los mismos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican los enzimas de la presente invención incluyendo mRNAs, cDNAs, DNAs genómicos así como análogos activos y fragmentos de tales enzimas.
De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporciona un proceso para producir tales polipéptidos por técnicas recombinanates que comprenden el cultivo de células huésped recombinantes procariotas y/o eucariotas, conteniendo una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención, bajo condiciones promotoras de la expresión de dichos enzimas y subsiguiente reactivación de dichos enzimas.
De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales enzimas, o polinucleótidos codificando dichos enzimas para hidrolizar lactosa a galactosa y glucosa para el uso en los alimentos procesados en la industria, la industria farmacéutica, para tratar la intolerancia a la lactosa, como una molécula marcadora para el diagnóstico, en la molienda húmeda de maíz, en la industria de los zumos de fruta, en pastelería, en la industria textil y en la industria del detergente.
De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales enzimas para hidrolizar goma de guar (un polisacárido galactomanano) para eliminar los residuos de manosa terminales no reductores. Más polisacáridos tales como galactomanano y los enzimas de acuerdo con la invención que los degradan tienen una variedad de aplicaciones. La goma guar se usa comúnmente como un agente espesante en alimentación y también se utiliza en la fracturación hidráulica en la reposición de aceite y gas. Consecuentemente, las mananasas son industrialmente relevantes para la degradación y modificación de las gomas guar. Además, existe una necesidad de que las galactomanasas termoestables sean activas en condiciones extremas asociadas al ensayo y la buena estimulación.
De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporcionan sondas de ácidos nucleicos que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud para hibridar específicamente a una secuencia de ácido nucleico de la presente invención.
De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales enzimas, o polinucleótidos codificando tales enzimas, para propósitos in vitro relacionados con la investigación científica, por ejemplo, para generar sondas para identificar secuencias similares que podrían codificar enzimas similares de otros organismos usando ciertas regiones, es decir, regiones de secuencia conservadas, de la secuencia de nucleótidos.
Éstos y otros aspectos de la presente invención deberían ser aparentes para los expertos en el campo a partir de las instrucciones.
Los polinucleótidos de esta invención se recuperaron originariamente de bibliotecas genómicas de genes derivados de los siguientes organismos:
M11TL es una nueva especie de Desulfurococcus aislado de Diamond Pool en Yellowstone National Park. El organismo crece óptimamente a 85-88ºC, pH 7,0 en un medio salino bajo conteniendo extracto de levadura, peptona, y gelatina como sustratos con una fase gaseosa de N_{2}/CO_{2}.
OC1/4V es del género Thermotoga. El organismo se aisló de Yellowstone National Park. Crece óptimamente a 75ºC en un medio salino bajo con celulosa como un sustrato y N_{2} en fase gaseosa.
Pyrococcus furiosus VC1 y (7EG1) es del género Pyrococcus. VC1 se aisló de Vulcano, Italia. Crece óptimamente a 100ºC en un medio salino alto (marino) conteniendo azufre elemental, extracto de levadura, peptona y almidón como sustratos y N_{2} en fase gaseosa.
Staphylothermus marinus F1 es del género Staphylothermus F1 aislado de Vulcano, Italia. Crece óptimamente a 85ºC, pH 6,5 en medio salino alto (marino) conteniendo azufre elemental y extracto de levadura como sustratos y N_{2} en fase gaseosa.
Thermococcus 9N-2 es del género Thermococcus 9N-2 fue aislado del fluido de descarga difuso en la cresta del Pacífico Este. Es un anaerobio estricto que crece óptimamente a 87ºC.
Thermotoga maritima MSB8 y MSB8 (Clon # 6GP2 y 6GB4) es del género Thermotogo, y se aisló de Vulcano, Italia. MSBB crece óptimamente a 85ºC, pH 6,5 en un medio salino alto (marino) conteniendo almidón y extracto de levadura como sustratos y N_{2} en fase gaseosa.
Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA es del género Thermococcus. AEDIII2RA crece óptimamente a 85ºC, pH 9,5 en un medio salino alto (marino) conteniendo polisulfuros y extracto de levadura como sustratos y N_{2} en fase gaseosa.
Thermococcus chitonophagus GC74 es del género Thermococcus. GC74 crece óptimamente a 85ºC, pH 6,0 en un medio salino alto (marino) conteniendo quitina, extracto de carne, azufre elemental y extracto de levadura como sustratos y N_{2} fase gaseosa. AEPII 1a crece óptimamente a 85ºC a pH 6,5 en medio marino bajo condiciones anaerobias. Tiene muchos sustratos. Bankia gouldi es del género Bankia.
Consecuentemente, los polinucleótidos y enzimas codificados por esa razón son identificados por el organismo del cual son aislados, y son a veces referidos aquí como "M11TL" (Figura 1 y ID de SEC NOS: 1 y 15), "OCl/4V-33B/G" (Figura 2 y ID de SEC NOS: 2 y 16), "Fl-12G" (Figura 3 y ID de SEC NOS: 3 y 17), "9N2-31B/G" (Figura 4 y ID de SEC NOS: 4 y 18), "MSB8" (Figura 5 y ID de SEC NOS: 5 y 19), "AEDII12RA-l8B/G" (Figura 6 y ID de SEC NOS: 6 y 20), "GC74-22G" (Figura 7 y ID de SEC NOS: 7 y 21), "VC1-7G1" (Figura 8 y ID de SEC NOS: 8 y 22), "37GP1" (Figura 9 y ID de SEC NOS: 9 y 23), "6GC2" (Figura 10 y ID de SEC NOS: 10 y 24), "6GP2" (Figura 11 y ID de SEC NOS: 11 y 25), "AEPII la" (Figura 12 y ID de SEC NOS: 12 y 26), "OC1/4V" (Figura 13 y ID de SEC NOS: 13 y 27), y "6GP3" (Figura 14 y ID de SEC NOS: 28), "MSB8-6GP2" (Figura 15 y ID de SEC NOS: 57 y 61), "MSB8-6GB4"(Figura 16 y ID de SEC NOS: 58 y 62),"VC1-7EG1"(Figura 17 y ID de SEC NOS: 59 y 63), y 37GP4 (Figura 18 y ID de SEC NOS:60 y 64).
Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención muestran identidad a nivel de nucleótidos y de proteína para genes y proteínas conocidos codificadas por lo tanto como se muestra en la Tabla 1.
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TABLA 1
1 
\newpage
2
Los polinucleótidos y enzimas de la presente invención muestran homología entre ellos como se muestra en la Tabla 2.
TABLA 2
3
4
Todos los clones identificados en las Tablas 1 y 2 codifican polipéptidos que tienen actividad \alpha-glicosidasa o \beta-glicosidasa.
Esta invención, además de las moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican los enzimas de la presente invención, también proporciona sustancialmente secuencias similares. Secuencias de ácido nucleico aisladas son sustancialmente similares si: (i) son capaces de hibridar bajo condiciones descritas después aquí, a los polinucleótidos de ID de SEC NOS: 1-14 y 57-60; (ii) o codifican secuencias de DNA que son degeneradas a los polinucleótidos de ID de SEC NOS: 1-14 y 57-60. Secuencias de DNA degeneradas codifican las secuencias de aminoácidos de ID de SEC NOS: 15-28 y 61-64, pero tienen variaciones en las secuencias codificantes de nucleótido. Como se usa aquí, sustancialmente similar se refiere a las secuencias que tienen identidad similar a las secuencias de la invención del momento. Las secuencias de nucleótido que son sustancialmente las mismas pueden ser identificadas por hibridación o por comparación de secuencias. Secuencias enzimáticas que son sustancialmente las mismas pueden ser identificadas una por una de lo siguiente: digestión proteolítica, electroforesis en gel y/o microsecuenciación.
Una manera de aislar las moléculas de ácido nucleico que codifican los enzimas de la presente invención es sondear una biblioteca de genes con una sonda diseñada natural o artificialmente usando procedimientos reconocidos en el campo (ver, por ejemplo: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (EDS.) Green Publishing Company Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Se aprecia por un entendido en el campo que los polinucleótidos de ID de SEC NOS: 1-14 y 57-60 o fragmentos de los mismos (comprendiendo al menos 12 nucleótidos contiguos), son particularmente sondas útiles. Otras sondas particularmente útiles para este propósito son fragmentos hibridables a la secuencia de ID de SEC NOS: 1-14 y 57-60 (es decir, comprendiendo al menos 12 nucleótidos contiguos).
Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos que hibridan a secuencias de ácidos nucleicos reveladas aquí, la hibridación se puede llevar a cabo bajo condiciones de astringencia reducida, medio astringente o incluso condiciones astringentes. Como ejemplo de hibridación de oligonucleótidos, una membrana de polímeros que contiene ácidos nucleicos inmovilizados desnaturalizados es primero prehibridada durante 30 minutos a 45ºC en una solución que consiste en NaCl 0,9 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,0, Na_{2}EDTA 5,0 mM, SDS 0,5%, 10X solución de Denhardt 10X, y 0,5 mg/ml de ácido poliriboadenílico. Aproximadamente 2 X 10^{7} cpm (actividad específica 4-9 X 10^{8} cpm/ug) de oligonucleótido marcado con una sonda ^{32}P terminal se añaden entonces a la solución. Después de 12-16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente en SET 1X (150 mM NaCl, hidrocloruro Tris 20 mM, pH 7,8, 1 mM Na_{2}EDTA) conteniendo 0,5% SDS, seguido por un lavado de 30 minutos en SET 1X fresco a Tf l0ºC para la sonda oligonucleotídica. La membrana entonces se expone a una cinta autoradiográfica para la detección de señales de hibridación.
Condiciones astringentes significan que la hibridación solo tendrá lugar si hay al menos un 90% de identidad, preferiblemente al menos 95% de identidad y más preferiblemente al menos 97% de identidad entre las secuencias. Además, se entiende que una sección de secuencia de 100 pbs que es de 95 pbs en longitud tiene un 95% de identidad con la secuencia de 1090 pbs a partir de la cual se obtiene. Véase J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) que se incorpora por este medio por referencia en su integridad. También, se entiende que un fragmento de una secuencia de 100 pbs que es de 95 pbs en longitud tiene un 95% de identidad con la secuencia de 100 pbs a partir de la cual se obtiene.
Como se usa hasta aquí, una primera secuencia de DNA (RNA) es al menos un 70% y preferiblemente al menos un 80% idéntica a otra secuencia de DNA (RNA) si hay al menos un 70% y preferiblemente al menos un 80% o 90% de identidad, respectivamente, entre las bases de la primera secuencia y las bases de la otra secuencia, cuando están correctamente alineadas con cada una; por ejemplo cuando están alineadas por BLASTN.
"Identidad" como el término que se usas aquí, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende un porcentaje de las mismas bases como un polinucleótido referente (ID de SEC NOS:1-14 y 57-60). Por ejemplo, un polinucleótido que es al menos un 90% idéntico a un polinucleótido referente, tiene bases polinucleotídicas que son idénticas en un 90% de las bases que constituyen el polinucleótido referente y puede tener diferentes bases en un 10% de las bases que comprende esta secuencia polinucleotídica.
La presente invención se refiere a polinucleótidos que difieren del polinucleótido referente tal que los cambios son cambios silentes, por ejemplo el cambio no hace alterar la secuencia aminoacídica codificada por el polinucleótido. La presente invención también se refiere a cambios nucleotídicos que resultan en sustituciones ácidas, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones en el polipéptido codificado por el polinucleótido referente. En un aspecto preferido de la invención estos polipéptidos retienen la misma acción biológica como el polipéptido codificado por el polineucleótido referente.
También se aprecia que tales sondas pueden ser y son preferiblemente marcadas con un reactivo analíticamente detectable para facilitar la identificación de la sonda. Reactivos útiles incluyen pero no se limitan a radioactividad, colorantes fluorescentes o enzimas capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Las sondas son así útiles para aislar copias complementarias de DNA de otros orígenes o para cribar tales orígenes para secuencias relacionadas.
Los polinucleótidos de esta invención se recubrieron de bibliotecas genómicas de genes a partir de los organismos nombrados en la Tabla 1. Por ejemplo, bibliotecas de genes pueden ser generadas en el vector de clonación de Lambda ZAP II (Stratagene Cloning Systems). La escisión de la masa puede ser ejecutada en estas bibliotecas para generar bibliotecas en el fagómido pBluescript. Las bibliotecas son así generadas y la escisión ejecutada de acuerdo con los protocolos/métodos hasta aquí descritos.
Las bibliotecas de escisión son introducidas en la cadena BW14893 F'kanlA de E. coli. Los clones de expresión son identificados usando un ensayo de filtrado a alta temperatura. Los clones de expresión que codifican muchas glucanasas otras muchas glicosidasas se identifican y repurifican. Los polinucleótidos, y enzimas codificados de esta manera, de la presente invención, proporcionan las actividades como se ha descrito antes.
Las secuencias codificantes para los enzimas de la presente invención se identificaron por cribado de DNAs genómicos preparados por los clones que tienen actividad glucosidasa o galactosidasa.
Un ejemplo de un ensayo de estos es un ensayo de filtración a alta temperatura en donde los clones de expresión se identificaron por el uso de ensayos de filtración a alta temperatura usando un tampón Z (véase la receta abajo) conteniendo 1 mg/ml del sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucopiranósido (XGLU) (Diagnostic Chemicals Limited or Sigma) después de introducir una biblioteca de escisión en la cepa de E.coli BW14893 F'kan1A. Los clones de expresión que codifican XGLUasas se identificaron y repurificaron a partir de M11TL, OC1/4V, Pyrococcus furiosos VC1, Staphylothemus marinus F1, Thermococcus 9N-2, Thermotoga maritima MSB8, Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA, y Thermococcus chitonophagus GC74.
Tampón-z: (referencia en Miller, J.H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, p. 445.)
por litro
Na_{2}HPO4-7H_{2}O 16,1 g
NaH_{2}PO_{4}-7H_{2}O 5,5 g
KCl 0,75 g
MgSO_{4}-7H_{2}O 0,246 g
\beta-mercaptoetanol 2,7 mL
Ajustar pH a 7,0
Ensayo de filtrado a alta temperatura
(1) El factor f de f'kan (de la cepa CSH118 de E.coli)(1) se introdujo en la cepa pho-pnh-lac BW14893(2). BW13893(2). La biblioteca de fago filamentoso se reemplazó en la cepa resultante, BW14893 F'kan. (Miller, J.H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics; Lee, K.S., Metcalf, et al., (1992) Evidence for two phosphonate degradative pathways in Enterobacter Aerogenes, J. Bacteriol.,174:2501-251 a.
(2) Después del crecimiento en placas LB de 100 mm conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina, 80 \mug/ml de neticilina y IPTG 1mM, la transferencia de colonias se llevó a cabo usando filtros de membrana Millipore HATF.
(3) Las colonias transferidas a los filtros fueron lisadas con vapor de cloroformo en placas de Petri de vidrio de 150 mm.
(4) Los filtros se transfirieron a placas de Petri de vidrio de 100 mm conteniendo una pieza de filtro de papel Whatman 3MM saturado con tampón.
(a) cuando se prueba por la actividad galactosidasa (XGALasa), el papel 3MM se saturó con tampón Z conteniendo 1 mg/ml de XGAL (ChemBridge Corporation). Tras transferir el filtro portador de las colonias lisadas a la placa de petri de vidrio, se puso la placa en un horno a 80-85ºC.
(b) cuando se prueba por glucosidasa (XGLUasa), el papel 3MM se saturó con tampón Z conteniendo 1 mg/ml de XGLU. Tras transferir el filtro portador de las colonias lisadas a la placa de petri de vidrio, se puso la placa en un horno a 80-85ºC.
(5). Se observaron "positivos" como puntos azules en los filtros de membrana. Se utilizó la siguiente técnica de rescate de filtro para recuperar el plásmido de las colonias positivas lisadas. Se utilizó una pipeta pasteur (o tubo de vidrio capilar) para extraer los puntos azules del filtro de membrana. Se colocó el pequeño disco de filtro en un tubo Eppendorf conteniendo 20 \mul de agua. Se incubó el tubo de Eppendorf a 75ºC durante 5 minutos seguido por un pulso al vórtex para eluir el DNA del plásmido del filtro. Este DNA se transformó en células de E. coli electrocompetentes DH10B para Thermatoga maritima MSB8-6G, Staphylothermus marinus F1-12G, Thermococcus AEDII 12RA-18B/G, Thermococcus chitonophagus GC74-22G, M11Tl y OC1/4V. E. coli electrocompetentes BW14893 F'kan1A se utilizaron para Thermococcus 9N2-31B/G, y Pyrococcus furiosus VC1-7G1. Se repitió el ensayo de transferencia de colonias en filtro en las placas de transformación para identificar los "positivos". Se devolvieron las placas de transformación al incubador de 37ºC tras transferir a los filtros las colonias regeneradas. Se inoculó 3 ml de LB líquido conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina con positivos repurificados e incubar a 37ºC toda la noche. Se aisló el DNA del plásmido de estos cultivos y se secuenció el inserto del plásmido. En algunos casos cuando las placas usadas para las transferencias de colonias iniciales contenían colonias no confluentes, una colonia específica correspondinente a un punto azul en el filtro pudo identificarse en una placa regenerada y repurificarse directamente, en lugar de utilizar la técnica de rescate en filtro.
Otro ejemplo de tal ensayo es una variación del ensayo de filtración a alta temperatura en donde los filtros cargados de colonias son matadas por calor a diferentes temperaturas (por ejemplo, 105ºC durante 20 minutos) para monitorizar termoestabilidad. El papel 3MM se saturó con diferentes tampones (i.e., 100 mM NaCl, 5 mM MgCl_{2}, 100 mM Tris-Cl (pH 9,5)) para determinar la actividad enzimática bajo diferentes condiciones de tamponaje.
Un ensayo \beta-glucosidasa también puede emplearse, en donde G1cp\betaNp se utiliza como un sustrato artificial (aryl-\beta-glucosidasa). El aumento en la absorbancia a 405 nm como resultado de la liberación de p-nitrofenol (pNp) fue seguido en un espectrofotómetro Hitachi U-1100 equipado con un sostenedor de cubetas con termostato. Los ensayos deben realizarse a 80ºC o 90ºC en cubetas de cuarzo de 1-ml cerradas. Una mezcla de reacción estándar contiene sustrato trisodio 150 mM, pH 5,0 (a 80ºC), y 0,95 mM pNp derivado pNp = 0,561 mM^{-1} cm^{-1}). La mezcla de reacción se dejó alcanzar la temperatura deseada, tras lo cual la reacción comenzó mediante la inyección de una cantidad apropiada de enzima (1,06 ml volumen final).
1 U de actividad \beta-glucosidasa se define como la cantidad necesaria para catalizar la formación de 1,0 \mumol pNp/min. D-celobiosa puede también utilizarse como sustrato.
Un ensayo cuantitativo ONPG para la actividad \beta-galactosidasa se describe por Miller, J.H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics y Mill, J.H. (1992) Experiments in Molecular Genetics, los contenidos de los cuales se incorporan aquí por referencia a su totalidad.
Un ensayo fluorométrico cuantitativo para la actividad \beta-galactosidasa específica se describe por Youngman P., (1987) Plasmid Vectors for Recovering and Exploiting Tn917 Transpositions in Bacillus and other Gram-Positive Bacteria. In Plasmids: A Practical approach (ed. K. Hardy) pp 79-103. IRL Press, Oxford. Una descripción del procedimiento puede encontrarse en Miller (1992) p. 75-77, los contenidos de los cuales se incorporan aquí por referencia a su totalidad.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de DNA que incluye cDNA, DNA genómico, y DNA sintético. El DNA puede ser de doble cadena o de cadena sencilla, y si la cadena es sencilla puede ser la cadena codificante o la no codificante (antisentido). Las secuencias codificantes que codifican los enzimas maduros pueden ser idénticas a las secuencias codificantes mostradas en las Figuras 1-8 (ID DE SEC NO: 1-14 y 57-60) o puede ser una secuencia codificante diferente que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica los mismos enzimas maduros que el DNA de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: 144 y 57-60).
El polinucleótido que codifica para el enzima maduro de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64) puede incluir, pero no se limita a : solo la secuencia codificante para el enzima maduro; la secuencia codificante para el enzima maduro y la secuencia codificante adicional como la secuencia líder o una secuencia de proproteína; la secuencia codificante para el enzima maduro (y opcionalmente secuencia codificante adicional) y una secuencia no codificante, tales como intrones o secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia codificante para el enzima
maduro.
Así, el término "polinucleótido que codifica un enzima (proteína)" abarca un polinucleótido que incluye sólo una secuencia codificante para la enzima así como un polinucleótido que incluye una secuencia codificante adicional y/o secuencia no codificante.
La presente invención además se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos aquí que codifican para fragmentos, análogos y derivados de los enzimas que poseen una secuencia de aminoácidos deducida de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: I5-28 y 6164). La variante de los polinucleótidos puede ser una variante alélica natural del polinucleótido o una variante no natural del polinucleótido.
Así, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican los mismos enzimas maduros que las que se muestran en las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64) así como las variantes de tales polinucleótidos que codifican para un fragmento, derivado o análogo de las enzimas de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64). Tales variantes de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de substitución y variantes de adición o inserción.
Tal como se ha indicado hasta aquí, los polinucleótidos pueden tener una secuencia codificante que es una variante alélica natural de las secuencias codificantes mostradas en las Figuras 1-18 (ID DE SEC NOS: 1-14 y 57-60). Tal como se conoce en el campo, una variante alélica es una forma alterna de una secuencia de polinucleótido que puede poseer una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no alteran sustancialmente la función del enzima codificado.
Fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención pueden utilizarse como sonda de hibridación para un cDNA o una biblioteca genómica para aislar el DNA de longitud completa y para aislar a otros DNAs que poseen una gran similitud de secuencia al gen o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo preferiblemente poseen al menos 10, preferiblemente al menos 15, y aún más preferiblemente al menos 30 bases y puede contener, por ejemplo, al menos 50 o más bases. La sonda puede utilizarse también para identificar un clon de DNA correspondiente a un transcrito de longitud completa y un clon genómico o clones que contienen el gen completo incluyendo regiones reguladoras y regiones promotoras, exones, e intrones. Un ejemplo de cribado comprende aislar la región codificante del gen usando la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos marcados que poseen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se usan para cribar una biblioteca de DNA genómico para determinar qué miembros de la biblioteca hibridan con la sonda.
La presente invención se refiere además a polinucleótidos que hibridan a las secuencias anteriormente descritas si existe al menos un 70%, preferiblemente al menos un 94%, y más preferiblemente al menos un 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención particularmente se refiere a polinucleótidos que hibridan bajo condiciones astringentes a los polinucleótidos anteriormente descritos. Tal como se usa aquí, el término "condiciones astringentes" indica que la hibridación sucederá solo si existe al menos un 95% y preferiblemente al menos un 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que hibridan a los polinucleótidos anteriormente descritos en una realización preferida codifica enzimas que cualquiera tiene sustancialmente la misma función biológica o actividad que el enzima maduro codificado por el DNA de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NOS:1-14 y 57-60).
Alternativamente, el polinucleótido puede tener al menos 15 bases, preferiblemente al menos 30 bases, y más preferiblemente al menos 50 bases que hibridan a cualquier parte de un polinucleótido de la presente invención y que es idéntica a ésta, tal como se ha descrito hasta aquí, y que puede o no puede tener actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden emplearse como sondas para los polinucleótidos de ID DE SEC NO: 1-14 y 57-60, por ejemplo, para recuperación del polinucleótido o como sonda de diagnóstico o como cebador de PCR.
Así, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que poseen al menos un 70% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad y más preferiblemente al menos a 95% de identidad a un polinucleótido que codifica los enzimas de ID DE SEC NO :15-28 y 61-64 así como fragmentos de los mismos, cuyos fragmentos poseen al menos 15 bases, preferiblemente al menos 30 bases y más preferiblemente al menos 50 bases, cuyos fragmentos son al menos un 90% idénticos, preferiblemente al menos un 95% idénticos y más preferiblemente al menos un 97% idénticos bajo condiciones astringentes a cualquier porción de un polinucleótido de la presente invención.
La presente invención además se refiere a enzimas que poseen las secuencias de aminoácidos deducidas de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64) así como fragmentos, análogos y derivados de tales enzimas.
Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a los enzimas de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64) indica enzimas que tienen esencialmente la misma función biológica o actividad de tales enzimas. Así, un análogo incluye una pro-proteína que puede ser activada por escisión de la porción de pro-proteína para producir un enzima maduro activo.
Los enzimas de la presente invención pueden ser un enzima recombinante, un enzima natural o un enzima sintético, preferiblemente un enzima recombinante.
El fragmento, derivado o análogo de las enzimas de las Figuras 1-18 (ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64) puede ser (i) uno en que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético, o (ii) uno en que uno o más de los residuos de aminoácido incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en que el enzima maduro está fusionado con otro compuesto, como un compuesto para aumentar la vida media del enzima (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en que los aminoácidos adicionales están fusionados a, el enzima maduro, como una secuencia líder o de secreción o una secuencia que se emplea para purificación del enzima maduro o una secuencia de pro-proteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se estiman que están dentro del alcance de aquellos entendidos en el campo por las instrucciones descritas aquí.
Los enzimas y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente están purificadas hasta homogeneizar.
El término "aislado" indica que el material se retira de su ambiente original (p.ej., el ambiente original si aparece de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido natural o enzima presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o enzima, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos pueden ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o enzimas pueden ser parte de una composición, y aún puede ser aislado en que tal vector o composición no es parte de su ambiente natural.
Los enzimas de la presente invención incluye los enzimas de ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64 (en particular el enzima maduro) así como los enzimas que tienen al menos un 70% de similitud (preferiblemente al menos 70% de identidad) a las enzimas de ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64 y más preferiblemente al menos 90% de similitud (más preferiblemente al menos 90% de identidad) a los enzimas de ID DE SEC NO: 15-28 y 61-64 y aún más preferiblemente al menos 95% de similitud (aún más preferiblemente al menos 95% de identidad) a los enzimas de la ID DE SEC NO: l5-28 y 61-64 y además incluye porciones de tales enzimas con tal porción del enzima generalmente conteniendo al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.
Tal como se conoce en el campo "similitud" entre dos enzimas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos conservados de aminoácidos de un enzima con la secuencia de un segundo enzima.
Una variante, es decir, un "fragmento", polipéptido "análogo" o "derivado", y polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones, que pueden presentarse en cualquier combinación.
Entre las variantes preferidas están aquellas que varían por referencia mediante sustituciones conservativas de aminoácidos. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido determinado en un polipéptido por otro polipéptido de características similares. Normalmente se observan como sustituciones conservativas los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; intercambio de los residuos hidroxilo Ser y Thr, cambio de los residuos acídicos Asp y Glu, sustitución entre los residuos amida Asn y Gln, cambio de los residuos básicos Lys y Arg y sustituciones entre los residuos aromáticos Phe, Tyr.
Más altamente preferidos son las variantes que tienen la misma función biológica y actividad como el polipéptido de referencia del que varía.
Fragmentos o porciones de los enzimas de la presente invención pueden emplearse para producir el correspondiente enzima de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, los fragmentos pueden emplearse como intermediarios para producir los enzimas de longitud completa. Fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.
La presente invención también se refiere a vectores que incluye polinucleótidos de la presente invención, células huésped que están genéticamente diseñadas con vectores de la invención y la producción de enzimas de la invención mediante técnicas recombinantes.
Las células huésped están genéticamente diseñadas (transducidas o transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo, en forma de plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped diseñadas pueden cultivarse en medios de cultivo convencionales modificados de forma apropiada para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, pH y similares, son las que se han utilizado previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y será evidente para un experto en el campo.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser empleados para producir enzimas mediante técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en cualquier tipo de vectores de expresión para expresar un enzima. Tales vectores incluyen secuencias cromosomales, no cromosomales y DNA sintético, pej, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; DNA fágico; baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y DNA fágico, DNA viral como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, y pseudorabia. No obstante, puede ser usado cualquier otro vector siempre y cuando sea replicable y viable en el huésped.
La secuencia de DNA apropiada puede insertarse en el vector mediante varios procedimientos. En general, la secuencia de DNA se inserta en un lugar de restricción endonucleasa apropiado mediante procedimientos descritos en el campo. Tales procedimientos y otros se estima que estén dentro del alcance de aquellos entendidos en el campo.
La secuencia de DNA en el vector de expresión está operativamente unida a una secuencia de control de expresión apropiada (promotor) para dirigir la síntesis de mRNA. Como ejemplos representativos de tales promotores, deben mencionarse: el promotor LTR o SV40, el lac o trp de E.coli, el promotor PL del fago lambda y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosoma para el inicio de traducción y un terminador de transcripción. El vector puede también incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.
Además, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para el cultivo de células eucariotas, o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.
El vector que contiene la secuencia de DNA apropiada tal como se ha descrito aquí, así como un promotor apropiado o secuencia control, puede ser empleado para transformar un huésped apropiado para permitir al huésped expresar la proteína.
Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E.coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; células fúngicas, levaduras; células de insecto como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células de plantas, etc. La selección de un huésped apropiado se considera que está dentro del alcance de aquellos expertos en la materia a partir de las presentes instrucciones.
Más particularmente, la presente invención también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más secuencias como se han descrito ampliamente antes. Los constructos comprenden un vector, tales como un plásmido o vector viral, en el que una secuencia de la invención ha sido insertada, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, el constructo además comprende secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operativamente unido a la secuencia. Gran número de vectores adecuados y promotores son conocidos para aquellos expertos en la materia, y están comercialmente disponibles. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; Bacterianos: pQE70, pQE6o, pQE-9 (Qiagen), pDl0, psiX174, pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eucariotas: pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). No obstante, cualquier otro plásmido o vector puede ser usado siempre que sea replicable y viable en el huésped.
Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloramfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos particulares incluye lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Promotores eucariotas incluye CMV inmediatamente temprano, HSV timidina quinasa, SV40temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneina-L de ratón. La selección del vector apropiado y promotor es bien conocido dentro del nivel básico de conocimiento de la materia.
En otra realización, la presente invención se refiere a células huésped que contienen las constructos anteriormente descritas. Las células huésped pueden ser de células eucariotas superiores, como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección de fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Los constructos en células huésped pueden utilizarse de una forma convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los enzimas de la invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales.
Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacteria, u otras células bajo el control de los promotores apropiados. Los sistemas de traducción libres de células pueden también emplearse para producir tales proteínas usando RNAs derivados de las construcciones de DNA de la presente invención. Los vectores de expresión y clonaje apropiados para usar con huéspedes procariotas y eucariotas se describen por Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), el descubrimiento del cual se incorpora aquí por referencia.
La transcripción del DNA que codifica las enzimas de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa insertando una secuencia potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos de DNA que actúan en cis, normalmente alrededor de 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ejemplos incluyen el potenciador SV40 en la parte final del origen de replicación pb 100 a 270, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la parte final del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.
Generalmente, la expresión de vectores recombinantes incluirá orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, pej, el gen de la resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado a una transcripción directa de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden derivar de operones que codifican enzimas glicolíticastales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con las secuencias de inicio de traducción y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la enzima traducida. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una enzima de fusión incluyendo un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas, pej., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano se construyen mediante inserción de una secuencia de DNA estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de inicio de traducción y terminación adecuados en fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si se desea, proporcionar amplificación en el huésped. Huéspedes procariotas adecuados para la transformación incluye E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque se pueden emplear otros por cuestiones de elección.
Como ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación conocido pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA). Estas secciones "backbone" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar.
A continuación de la transformación de una cepa huésped adecuada y crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce de manera apropiada (p.ej., cambios de temperatura o inducción química) y las células se cultivan por un periodo adicional.
Las células son generalmente obtenidas por centrifugación, rotas por métodos físicos o químicos, y el extracto crudo resultante es retenido para más purificación.
Las células de microbios empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelar-descongelar, sonicación, disrupción mecánica, o uso de agentes de lisado de células, tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.
Pueden ser empleados varios sistemas de cultivo celulares de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Ejemplos de sistema de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y cebador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores del corte y empalme, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias no transcritas en el extremo 5'. Secuencias de DNA derivadas del empalme de SV4O, y se pueden usar sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos requeridos no transcritos.
El enzima puede ser recuperado y purificado a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina pueden ser usados. Pasos de plegamiento proteico, como necesidad, al completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede ser empleada cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para los pasos de purificación final.
Los enzimas de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producido por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico (por ejemplo, por cultivos de células de bacterias, levadura, plantas superiores, insectos y mamíferos). Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el enzima de la presente invención puede ser glicosilado o puede ser no-glicosilado. Enzimas de la invención pueden incluir o no un residuo inicial aminoacídico de metionina.
La \beta-galactosidasa hidroliza lactosa a galactosa y glucosa. Consecuentemente, los enzimas GC1/4V, 9N2-31B/G, AEDIII2RA-18B/G y F1-12G pueden ser empleados en la industria de proceso alimentario para la producción de leche con bajo contenido de lactosa y para la producción de galactosa o glucosa a partir de lactosa contenida en suero obtenida en una gran cantidad como un subproducto en la producción de queso. Generalmente, se desea que los enzimas usados en el proceso alimentario, tal como las \beta-galactosidasas citadas anteriormente, sean estables a elevadas temperaturas para ayudar a prevenir la contaminación microbiológica.
Estos enzimas también pueden ser empleados en la industria farmacéutica. Los enzimas son usados para tratar la intolerancia a la lactosa. En este caso, también se desea un enzima termoestable, las \beta-galactosidasas termoestables también tienen usos en aplicaciones diagnósticas, donde pueden ser empleadas como moléculas marcadoras.
Las glucosidasas actúan sobre celooligosacáridos solubles del extremo no reductor para dar glucosa como el producto único, las Glucanasas (endo- y exo-) actúan en la despolimerización de celulosa, generando más extremos no reductores (endoglucanasas, por ejemplo, actúan sobre conexiones internas produciendo celobiosa, glucosa y celooligosacáridos como productos). Las \beta-glucosidasas se usan en aplicaciones donde la glucosa es el producto que se desea. Consecuentemente, M11TL, Fl-12G, GC74-22G, MSB8-6G, OCI/4V, VC1-7G1, 9N2-31B/G y AEDII12RA18B/G pueden ser empleados en una amplia variedad de aplicaciones industriales, incluyendo la granulación húmeda para la separación de almidón y gluten, en la industria de la fruta para la clarificación y mantenimiento de equipo, en repostería para la reducción de viscosidad, en la industria textil para el proceso de pantalones vaqueros azules, y en la industria del detergente como aditivo. Para estas y otras aplicaciones, se desean enzimas termoestables.
Los anticuerpos generados contra los enzimas correspondientes a una secuencia de la presente invención pueden ser obtenidos por inyección directa de los enzimas en un animal o por administración de los enzimas en un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo obtenido se unirá a los enzimas por sí mismo. De esta manera, incluso una secuencia que codifica solamente un fragmento de los enzimas puede ser usada para generar anticuerpos que se unen a los enzimas completamente nativos. Tales anticuerpos pueden entonces ser usados para aislar el enzima a partir de células que expresan el enzima.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Ejemplos incluyen la técnica hibridoma (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica trioma, la técnica hibridoma de células B humanas (Kozbor et al.,1983, Immunology Today 4:72), y la técnica hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colea et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77.96).
Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (Patente Estadounidense 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena simple para los productos de enzimas inmunogénicos de esta invención. También, ratones transgénicos pueden ser usados para expresar anticuerpos humanizados para productos de enzimas inmunogénicos de esta invención.
Los anticuerpos generados contra el enzima de la presente invención pueden ser usados en el cribado para enzimas similares de otro organismo y otras muestras. Tales técnicas de cribado son bien conocidas en el campo, por ejemplo, un ensayo de cribado está descrito en "Methods for Measuring Cellulase Activities",. Methods in enzymology, Vol 160, pp. 87-116, el cual está incorporado en la presente por referencia en su totalidad.
La presente invención además será descrita en referencia a los siguientes ejemplos, sin embargo, hay que entender que la presente invención no está limitada a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique lo contrario, son por peso.
Con la finalidad de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos serán descritos ciertos métodos o términos que se den con frecuencia.
"Plásmidos" son designados por una p minúscula precedida y/o seguida por mayúsculas y/o números. Los plásmidos de inicio aquí son comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base sin restricción, o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, plásmidos equivalentes a éstos descritos son conocidos en el campo y serán evidentes para el experto.
"Digestión" de DNA se refiere a la rotura catalítica del DNA con un enzima de restricción que actúa solamente sobre ciertas secuencias en el DNA. Varios enzimas de restricción usados aquí están comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos que fueron usados serían conocidos por cualquier experto. Para fines analíticos, generalmente se usa 1 \mug de plásmido o fragmento de DNA con alrededor de 2-5 unidades de enzima en alrededor de 20 \mul de solución tampón. Con la finalidad de aislar fragmentos de DNA para la construcción del plásmido, generalmente 5 a 50 \mug de DNA son digeridos con 20 a 254 unidades de enzima en un gran volumen. Cantidades apropiadas de tampones y sustrato para enzimas de restricción particulares son especificadas por el fabricante. Los tiempos de incubación que normalmente se utilizan alrededor de 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Después de la digestión se realiza directamente una electroforesis de la reacción sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La separación por tamaños de los fragmentos cortados se lleva a cabo usando gel de poliacrilamida al 8 por ciento, descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).
"Oligonucleótidos" se refiere a cualquier hebra simple de polideoxinucleótido o dos hebras complementarias de polideoxinucleótido que pueden ser químicamente sintetizados. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y así no se unirán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se unirá a un fragmento que no ha sido defosforilado.
"Ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos dobles hebras de fragmentos de ácido nucleico (Maniatis, T., et al., Id., p. 146). A menos que se indique lo contrario, la ligación puede darse usando tampones conocidos y condiciones con 10 unidades de T4 DNA ligasa ("ligasa") por 0,5 \mug de aproximadamente cantidades equimolares de los fragmentos de DNA para ser ligados.
A menos que se indique lo contrario, la transformación se llevó a cabo como se describe en el método de Graham, P. y Van dar Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).
Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de enzimas glucosidasa
El DNA que codifica los enzimas de la presente invención, ID DE SEC NO: 1-14 y 57-60 fueron inicialmente amplificadas a partir de un vector pBluescript que contiene el DNA por la técnica PCR usando los cebadores anotados aquí. Las secuencias amplificadas fueron entonces insertadas en el respectivo vector PQE debajo de las secuencias del cebador, y el enzima fue expresado de acuerdo con los protocolos publicados aquí. Las secuencias 5' y 3' del cebador para los respectivos genes son como sigue:
100
Vector: pQE12; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y BlgII 3'.
101
Vector: pQE12; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y Bgl II 3'.
102
Vector: pQE30; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y KpnI 3'
103
Vector: pQEl2; y contiene los siguientes sitios del enzima de retricción EcoRI 5'y Bgl II 3'.
104
Vector: pQE12; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y BamHI 3'.
105
Vector: pQE7a, y contiene los sitios del enzima de restricción SphI 5' y Hind III 3'.
106
Vector: pQEl2; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y KpnI 3'.
107
Vector: pQE12; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y KpnI 3',
108
Vector: pQE52; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción BamHI 5' y Hind III 3'.
109
Vector: pQET; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y HindIII 3'
110
Vector: pQEt; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción HindIII 5' y EcoRI 3'
111
Vector: pQEt; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción Hind III 5' y EcoRI 3'.
112
Vector: pQEt; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción BamHI5' y EcoRI 3'.
113
Vector: pQEt; y contiene los siguientes sitios del enzima de restricción EcoRI 5' y Hind III 3'.
Los sitios del enzima de restricción indicados corresponden a los sitios del enzima de restricción sobre el vector de expresión bacteriano indicado para el gen respectivo (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). El vector pQE codifica la resistencia del antibiótico (Amp^{r}), un origen bacteriano de la replicación (ori), un operador promotor regulable de IPTG (O/P), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios del enzima de restricción.
El vector pQE fue digerido con los enzimas de restricción indicados. Las secuencias amplificadas fueron ligadas en el vector respectivo pQE e insertadas en el marco con la secuencia que codifica para los RBS. La mezcla de ligación fue entonces usada para transformar la cepa de E. coli M15/pREP4 (Qiagen, Inc.) por electroporación. M15/pREP4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Los transformantes fueron identificados por su capacidad de crecer en placas de LB y se seleccionaron colonias reistentes a ampicilina/kanamicina. Se aisló el DNA del plásmido y se confirmó por análisis de restricción. Los clones que contienen los constructos deseados crecieron durante la noche (O/N) en medio de cultivo LB líquido suplementado con Amp: (100 u/ml) y Kan (25 ug/ml). El cultivo O/N fue usado para inocular un gran cultivo en una relación de 1:l00 a 1:250. Las células crecieron a una densidad óptica de 600 (D.O.^{600}) entre 0,4 y 0,6. Entonces se añadió IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto-piranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce la inactivación del represor lacI, clarificando la P/0 dando lugar a un aumento de la expresión del gen. Las células crecieron de 3 a 4 horas más. Las células luego fueron obtenidas por centrifugación.
Las secuencias de cebador determinadas antes pueden ser empleadas para aislar el gen Diana a partir del material depositado mediante las técnicas de hibridación descritas anteriormente.
Ejemplo 2 Aislamiento de un clon seleccionado de clones genómicos depositados
Un clon se aísla directamente por cribado del material depositado usando los cebadores del oligonucleótido publicados en el Ejemplo 1 para el gen particular que se desea aislar. Los oligonucleótidos específicos se sintetizan usando un sintetizador de DNA Applied Biosystems. Los oligonucleótidos se marcan con ^{32}P-ATP usando la polinucleótido quinasa T4 y se purifican de acuerdo con un protocolo estándar (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY,1982). Los clones depositados en los vectores pBluescript pueden ser empleados para transformar huéspedes bacterianos que entonces se depositan en placas de agar 1,5% a una densidad de 20.000-50.000 ufp/l50 mm. Estas placas son cribadas usando membranas de Nylon de acuerdo con el protocolo estándar de cribado (Stratagene,1993). Específicamente, la membrana de Nylon con DNA desnaturalizado y fijado se prehibrida SSC 6 x, NaH_{2}PO_{4} 20 mM, SDS 0,4%, solución de Denhardt 5 x, 500 \mug/ml de desnaturalizado, DNA de esperma de salmón sonicado; y SSC 6 x, SDS 0,1%. Después de una hora de prehibridación, la membrana se hibrida con el tampón de hibridación SSC 6x, NaH_{2}PO_{4} 20 mM, SDS 0,4%, 500 ug/ml de desnaturalizado, DNA de esperma de salmón sonicado con la sonda ^{32}P 1x10^{6} cpm/ml durante toda la noche a 42ºC. La membrana se lava a 45-50ºC con un tampón de lavado SSC 6 x, con SDS 0,1% durante 20-30 minutos se seca y se expone a un filme de rayos X kodak durante toda la noche. Se aíslan clones positivos y se purifican por cribado secundario y terciario. El clon purificado es secuenciado para verificar su identidad a la secuencia del cebador.
Una vez el clon está aislado, los dos cebadores oligonucleótidos correspondientes al gen de interés son usados para amplificar el gen a partir de material depositado. Una reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo en 25 \mul de mezcla de reacción con 0,5 ug del DNA del gen de interés. La mezcla de reacción es MgCl_{2}1,5-5 mM, gelatina 0,01% (p/v), 20 pM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmol de cada cebador y 0,25 Unidad de Taq polimerasa. Treinta y cinco ciclos de PCR (desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto; hibridación a 55ºC durante 1 minuto; la elongación a 72ºC durante 1 minuto) se lleva a cabo con el ciclador termal automatizado de Perkin-Elmer Cetus. El producto amplificado se analiza por electroforesis en gel de agarosa, y la banda de DNA con el peso molecular esperado se extrae y se purifica. El producto de PCR se asegura que sea el gen de interés subclonando y secuenciando el producto de DNA. La terminación de los nuevos genes purificados son secuencias de nucleótidos para identificar secuencias completas. La secuenciación completa de genes de longitud completa se lleva a cabo por la digestión con Exonucleasa III o el recorrido del cebador.
Ejemplo 3 Cribado de la actividad Galactosidasa
Los procedimientos de cribado para la actividad de la proteína \alpha-galactosidasa puede ser ensayada como sigue:
Las placas de sustrato fueron proporcionadas por un procedimiento estándar de colocación en placas. Diluir XL1-Blue MRF de huésped de E coli de (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) a O.D._{600}=1.0 con medio NZY, en tubos de 15 ml, inocular 200 \mul de células huésped diluidas con fago. Mezclar delicadamente e incubar los tubos a 37ºC durante 15 min. Añadir aproximadamente 13 ml de LB top agarosa (0,7%) conteniendo IPTG 1mM en cada tubo y verter en toda la superficie de la placa NYZ. Dejar enfriar e incubar a 37ºC durante toda la noche. Las placas de ensayo se obtienen como sustrato de p-Nitrofenil-galactosidasa (Sigma) (200 mg/l00 ml) (NaCl 100 mM, fosfato de potasio 100 mM) agarosa 1% (p/v). Las placas se recubrieron con nitrocelulosa y se incubaron a 4ºC durante 30 minutos con lo que la nitrocelulosa se desprende y se añade en las placas sustrato. Las placas sustrato entonces se incuban a 70ºC durante 20 minutos.
Ejemplo 4 Cribado de clones para la actividad Mananasa
Se utilizó un ensayo de cribado de la fase sólida como un método de cribado primario para probar clones para la actividad \beta-mananasa.
Una solución de cultivo de la hebra del huésped Y1090 de E coli (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se diluyó hasta O.D._{600}=1.0 con medio NZY. La biblioteca amplificada de Thermotoga maritima lambda gtl1 se diluyó en SM (tampón de dilución del fago):
5 x 10^{7} upf/\mul diluidas 1:1000 luego 1:100 hasta 5 x 10^{2} ufp/\mul. Entonces 8 \mul de dilución de fago (5 x 10^{2} ufp/\mul) se colocaron en 200 \mul de células huésped. Se incubaron en tubos de 15 ml a 37ºC durante 15 minutos.
Aproximadamente 4 ml de LB top agarosa (0,7%) fundida a aproximadamente 52ºC se añadió a cada tubo y la mezcla se vertió en la superficie de las placas de LB agar. Las placas de agar se incubaron a 37ºC durante cinco horas. Las placas se replicaron y se indujeron con membranas de Nylon Duralon-UV^{TM} mojadas con IPTG 10 mM (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) durante toda la noche. Las membranas de nylon y las placas se marcaron con una aguja para mantener su orientación y las membranas de nylon entonces se quitaron y se almacenaron a 4ºC.
Una cubierta de Azo-galactomanano se aplicó a las placas LB conteniendo las placas lambda. La cubierta contiene agarosa 1%, tampón de fosfato de potasio pH 7 50 mM, Azocarob-galactomanano 0,4%. (Megazyme, Australia). Las placas se incubaron a 72ºC. Las placas tratadas de Azocarob-galactomanano se observaron después de 4 horas y se volvieron a incubar durante toda la noche. Se identificaron positivas putativas por aclaramiento de zonas en las placas de Azocarob-galactomanano. Se observaron dos clones positivos.
Fueron recuperadas las membranas de nylon referidas más arriba, que corresponden a los clones positivos, orientadas sobre la placa y se cortaron las porciones que relacionan los sitios de aclaración para clones positivos. El fago se eluyó a partir de las porciones cortadas de la membrana por remojo de las porciones individuales en 500 \mul de SM (tampón de dilución del fago) y 25 \mul de CHCl_{3}.
Ejemplo 5 Cribado de clones para la actividad Manosidasa
Un ensayo de cribado de la fase sólida del fago se utilizó como método de cribado primario para probar los clones para la actividad \beta-manosidasa.
Una solución de cultivo de la hebra del huésped Y1090 de E coli (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se diluyó hasta O.D.600=1.0 con medio NZY. La biblioteca amplificada de AEPII lambda gtl1 se diluyó en SM (tampón de dilución del fago): 5 x 10^{7} ufp/\mul diluidas 1:1000 luego 1:100 hasta 5 x 10^{2} ufp/\mul. Entonces 8 \mul de dilución de fago (5 x 102 ufp/\mul) se colocaron en 200 \mul de células huésped. Se incubaron en tubos de 15 ml a 37ºC durante 15 minutos.
Aproximadamente 4 ml de LB top agarosa (0.7%) fundida a aproximadamente 52ºC se añadió a cada tubo y la mezcla se vertió en la superficie de las placas de LB agar. Las placas de agar se incubaron a 37ºC durante cinco horas. Las placas se replicaron y se indujeron con membranas de Nylon Duralon-UV^{TM} mojadas con IPTG 10 mM (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) durante toda la noche. Las membranas de nylon y las placas se marcaron con una aguja para mantener su orientación y las membranas de nylon entonces se quitaron y se almacenaron a 4ºC.
Una cubierta de p-nitrofenil-\beta-D-manno-piranósido se aplicó a las placas LB conteniendo las placas lambda. La cubierta contiene agarosa 1%, tampón de fosfato de potasio pH 7 50 mM, p-nitrofenil-\beta-D-mano-piranósido 0,4%. (Megazyme, Australia). Las placas se incubaron a 72ºC. Las placas tratadas de p-nitrofenil-\beta-D-mano-piranósido se observaron después de 4 horas y se volvieron a incubar durante toda la noche. Se identificaron positivas putativas por aclaramiento de zonas en las placas de p-nitrofenil-\beta-D-mano-piranósido. Se observaron dos clones positivos.
Fueron recuperadas las membranas de nylon referidas más arriba, que corresponden a los clones positivos, orientadas sobre la placa y se cortaron las porciones que relacionan los sitios de aclaración para clones positivos. El fago se eluyó a partir de las porciones cortadas de la membrana por remojo de las porciones individuales en 500 \mul de SM (tampón de dilución del fago) y 25 \mul de CHCl_{3}.
Ejemplo 6 Cribado para la actividad Pullulanasa
Los procedimientos de cribado para la actividad de la proteína pulalanasa pueden ser ensayados como sigue:
Se proporcionaron placas de sustrato por un procedimiento estándar de plaqueo. Se diluyen células huésped hasta O.D._{600}=1,0 con NZY o un medio apropiado. En tubos de 15 ml, inocula 200 \mul de células huésped diluidas con fago. Mezclar delicadamente e incubar los tubos a 37ºC durante 15 min. Añadir aproximadamente 3,5 ml de LB top agarosa (0,7%) a cada tubo y poner la mezcla en placas, dejar enfriar, e incubar a 37ºC durante alrededor de 28 horas. Las cubiertas de 4,5 mls del siguiente sustrato se vierten:
100 ml volumen total
O,5 g Rojo pululano (Megazyme, Australia)
1,0 g Agarosa
5 ml Tampón (Tris-HCL pH 7,2 @ 75ºC)
2 ml NaCl 5M
5 ml CaCl_{2} (100 mM)
85 ml dH_{2}O
Las placas se enfrían a temperatura ambiente, y entonces se incuban a 75ºC durante 2 horas. Se observan positivas mostrando la degradación del sustrato.
Ejemplo 7 Cribado de la actividad de la Endoglucanasa
Procedimientos de cribado para la actividad de la proteína endoglucanasa pueden ser ensayados como sigue:
1. La biblioteca de genes se pone en 6 placas de agar LB/GelRite/O,1% CMC/NZY (\sim 4,800 unidades formadoras de placas) en huésped de E.coli con LB agarosa como top agarosa. Las placas se incuban a 37ºC durante toda la noche.
2. Las placas se enfrían a 4ºC durante una hora.
3. Las placas se cubren con membranas Duralon (Stratagene) a temperatura ambiente durante una hora y las membranas se orientan y se sacan de las placas y se almacenan a 4ºC.
4. La capa de top agarosa se elimina y las placas se incuban a 37ºC durante \sim 3 horas.
5. La superficie de la placa se aclara con NaCl.
6. La placa se tiñe con Rojo Congo 0,1% durante 15 minutos.
7. La placa se destiñe con NaCl 1M.
8. Las positivas putativas identificadas en la placa se aíslan de la membrana Duralon (las positivas son identificadas por aclaración de las zonas de alrededor de los clones). El fago se eluye de la membrana por incubación en 500 \mul SM + 25 \mul CHCl_{3} para eluir.
9. El inserto de DNA es subclonado en cualquier vector de clonación adecuado y los subclones son ensayados para la actividad CMCasa usando el siguiente protocolo:
i) centrifugar durante 3 minutos 1 ml de miniprep (cultivado toda la noche) del clon a máxima velocidad.
ii) Decantar el sobrenadante y usarlo para llenar los "pozos" que se han hecho en una placa LB/GelRite/0,l% CMC.
iii) Incubar a 37ºC durante 2 horas.
iv) Teñir con Rojo Congo 0,1% durante 15 minutos.
v) Desteñir con NaCl 1 M durante 15 minutos.
vi) Identificar las positivas por aclaramiento de la zona de alrededor del clon.
Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a luz de las instrucciones de arriba, consecuentemente, en el propósito de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ser practicada de otra manera como se describe particularmente.

Claims (27)

1. Un polinucleótido que codifica un enzima glicosidasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en:
(a) una secuencia que codifica un polipéptido como se publica en ID DE SEC NO:64
(b) una secuencia como la publicada en ID DE SEC NO:60;
(c) la secuencia de (a) o (b), en donde T también puede ser U;
(d) una secuencia que tiene al menos 90%, 95% o 97% de la identidad de secuencia de ID DE SEC NO:60; y
(e) una secuencia complementaria a la secuencia de (a) a (d).
2. Un vector que contiene el polinucleótido de la reivindicación 1.
3. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 2.
4. La célula huésped de la reivindicación 3, en donde la célula huésped es una célula eucariota o procariota.
5. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo consistente en:
(a) una secuencia de aminoácidos como se publica en ID DE SEC NO: 64;
(b) una secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido de la reivindicación 1;
(c) una secuencia de aminoácidos al menos de 30 o 50 aminoácidos consecutivos en longitud de la secuencia como se publica en ID DE SEC NO:64 o un polipéptido codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1;
(d) una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad glucosidasa y que tiene al menos 70%, 90% o 95% de identidad de la secuencia de ID DE SEC NO:64.
6. Un proceso para producir el polipéptido de la reivindicación 5 o un polipéptido como el codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1 que comprende: cultivar la célula huésped de la reivindicación 3 o 4 y aislar el polipéptido codificado por dicho polinucleótido.
7. Un anticuerpo específicamente unido a un polipéptido como el codificado por la reivindicación 1 o al polipéptido de la reivindicación 5.
8. Un método para generar glucosa a partir de celooligosacáridos solubles que comprenden el contacto de muestras de oligosacáridos en contacto con una cantidad efectiva del polipéptido de la reivindicación 5 para que se produzca glucosa.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la muestra es un producto lácteo, zumos de fruta, detergentes, textiles, goma guar, alimentación animal, biomasa vegetal o productos de deshecho.
10. El método de la reivindicación 8 o 9, en donde el oligosacárido es maltosa, celobiosa, lactosa, sacarosa, rafinosa, estaquiosa, verbascosa, celulosa, almidón, amilosa, glucógeno, disacáridos, polisacáridos o pululanos.
11. Una glicosidasa termoestable que tiene una secuencia como se publica en la reivindicación 5 o es codificada por el polinucleótido de la reivindicación 1.
12. Un polipéptido que tiene una actividad galactosidasa, una actividad mananasa, una actividad manosidasa, una actividad pululanasa o una actividad endogluconasa, que tiene una secuencia como se publica en la reivindicación 5 o es codificada por el polinucleótido de la reivindicación 1.
13. Un método para hacer una leche o queso bajos en lactosa que comprenda el procesamiento de la leche o queso usando un enzima que tiene una secuencia como se publica en la reivindicación 5 o es codificada por el polinucleótido de la reivindicación 1.
14. Un enzima que tiene una secuencia como se publica en la reivindicación 5 o es codificada por el polinucleótido de la reivindicación 1 para el uso como un medicamento.
15. El uso de un enzima que tiene una secuencia como se publica en la reivindicación 5 o es codificada por el polinucléotido de la reivindicación 1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de intolerancia a la lactosa.
16. Un polinucleótido que selectivamente hibrida a ID DE SEC NO: 60 bajo condiciones astringentes que comprenden un oligonucléotido que tiene una secuencia:
(a) al menos de 30 o 50 bases en longitud;
(b) al menos de 30 o 50 bases en longitud y al menos 90%, 95% o 97% de la identidad de la secuencia ID DE SEC NO:60;
(c) al menos 30 o 50 bases consecutivas de una secuencia que codifica un polipéptido como se publica en ID DE SEC NO:64;
(d) al menos 30 o 50 bases consecutivas de una secuencia como se publica en ID DE SEC NO:60;
(e) de (a)hasta (d), en donde T también puede ser U;
(f) como se publica en ID DE SEC NO:43 o 44; o
(g) complementariamente a la secuencia de (a) hasta (f).
17. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la reivindicación 5 y/o el polinucleótido de la reivindicación 1 y opcionalmente un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
18. El uso de un enzima como se publica en la reivindicación 14 en la molienda húmeda de maíz para la separación de almidón y gluten, en la industria del zumo de fruta o industria de confección para clarificación, extracción y/o mantenimiento del equipo, en la industria del azúcar de remolacha, en pastelería para la reducción de la viscosidad, en convertir biomasa vegetal en combustibles y productos químicos, en tratamiento de residuos, en la alimentación animal, en la industria textil, en el ensayo y la buena estimulación y/o en la industria del detergente como un aditivo.
19. El uso de un enzima como se publica en la reivindicación 14 en la despolimerización de celulosa.
20. Un método para hidrolizar una goma guar que comprende el contacto de una composición que comprende una goma guar con un enzima que se publica en la reivindicación 14, así hidrolizando la goma guar.
21. Un método para hidrolizar almidón que comprende el contacto de una composición que comprende un almidón con un enzima como se publica en la reivindicación 14.
22. Un método para tratar un tejido que comprende el contacto del tejido con un enzima como se publica en la reivindicación 14 bajo condiciones en donde el enzima puede hidrolizar un enlace glicosídico.
23. Un método para tratar un alimento animal que comprende el contacto del alimento animal con un enzima como se publica en la reivindicación 14 bajo condiciones en donde el enzima puede hidrolizar un enlace glicosídico.
24. Un método para la conversión de la biomasa vegetal en combustible o un producto químico que comprende el contacto de una composición que comprende una biomasa vegetal con el enzima de la reivindicación 14, así convirtiendo la biomasa vegetal en un combustible o un producto químico.
25. Un método para el tratamiento de residuos que comprende el contacto de una composición que comprende un producto de deshecho con un enzima como se publica en la reivindicación 14, así tratando el producto de deshecho.
26. Un método para tratar un producto horneado que comprende el contacto del producto horneado con un enzima como se publica en la reivindicación 14 bajo condiciones en donde el enzima pueda hidrolizar un enlace glucosídico.
27. Un método para la estimulación de pozos que comprende la administración del enzima como se publica en la reivindicación 14 durante la operación de pozos, así estimulando la operación de pozos.
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