JP2003180364A - ペクチン酸リアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 （ａ）特定なアミノ酸配列からなるタン
パク質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性
を有するタンパク質；及びこれをコードするペクチン酸
リアーゼ遺伝子。 【効果】 ペクチン酸リアーゼは、衣料用洗剤酵素、繊
維精練用酵素等として有用であり、本発明遺伝子を用い
れば、当該酵素を単一且つ大量に生産することが可能で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、繊維処理剤、食品
加工剤、洗浄剤として有用なペクチン酸リアーゼ、該タ
ンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換
えベクター、該ベクターを含む形質転換体及び該形質転
換体を用いたペクチン酸リアーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ペクチ
ン分解酵素は、植物細胞壁の構成糖或いは細胞間の中葉
の主成分としてのペクチンを分解する作用を有し、食品
加工剤、植物性繊維の精練に古くより用いられてきた。
また、ペクチン分解酵素は洗剤工業への応用も考えられ
ており、例えば、特公平６−３９５９６号、ＷＯ９５／
２５７９０、ＷＯ９８／０６８０５、ＥＰ０８７０８３
４等が開示されている。更にコンタクトレンズ用洗浄剤
（特開昭６２−９１３号）、イオン交換膜洗浄剤（特開
平１−３０４００７号）等にペクチナーゼを使用するこ
とも報告されている。

【０００３】ペクチン分解酵素には、大きく分けて
（１）ペクチンのメチルエステルを加水分解するペクチ
ンメチルエステラーゼ、（２）ペクチン酸及びペクチン
のα−１，４結合を加水分解するエンド型、エキソ型ポ
リガラクツロナーゼ、（３）ペクチン酸、ペクチンに対
しβー脱離反応で、α−１，４結合を切断し、非還元末
端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成する酵素であるエンド
型、エキソ型ペクチン酸リアーゼ、エンド型、エキソ型
ペクチンリアーゼ、（４）オリゴガラクツロン酸を主な
基質とするオリゴガラクツロナーゼ（バイオサイエンス
とインダストリー、50, 315-321, 1992）、の４種類が
存在し、更にこの他に、不溶性のプロトペクチンに対し
分解作用を示すプロトペクチナーゼが見出されている
（Agric. Biol.Chem., 42, 2427-2429, 1978）。

【０００４】このプロトペクチナーゼは、Ａ−タイプと
Ｂ−タイプに分類されるが、Ａ−タイプはポリガラクツ
ロナーゼ又はペクチン酸リアーゼ活性を有する酵素であ
り、Ｂ−タイプはセルロース（ヘミセルロース）とペク
チン質を結び付けている介在多糖配列中のアラビナンの
α−１，５結合性ガラクタンのα−１，４結合を加水分
解する酵素である（繊維工学, 45, 19-32, 1992）。

【０００５】これらペクチン質分解酵素の中で、一般的
にアルカリ性側に最適反応ｐＨを有するペクチン酸リア
ーゼの工業的な利用は、繊維産業や洗剤工業において有
効であると考えられる。例えば、植物性繊維の精練にお
いてはアルカリ性領域で処理することで精練度合を高め
ることが可能であり、一般の衣料用洗剤や漂白剤も高ア
ルカリ性（ｐＨ１０−１１）にすることによってその洗
浄力を高めることができる。また、更にＡ−タイプのプ
ロトペクチナーゼ活性を有するものであれば植物性繊維
上のプロトペクチンに付着した汚れを除去することがで
きる。しかしながら、斯かる特性を充分に満足する酵素
は、未だ得られていないのが現状である。

【０００６】本発明は、高アルカリ性領域で充分作用
し、且つＡ−タイプのプロトペクチナーゼ活性を有し、
工業用酵素として有用なペクチン酸リアーゼ、該タンパ
ク質をコードする遺伝子及び該遺伝子を用いて単一の酵
素を製造する方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、日本国内
の土壌よりスクリーニングを行ったところ、高アルカリ
性領域で充分作用し且つＡ−タイプのプロトペクチナー
ゼ活性を有するペクチン酸リアーゼを生産する微生物を
見出すと共に、当該微生物からペクチン酸リアーゼをコ
ードする遺伝子をクローン化し、これを用いることによ
り工業用酵素として有用なペクチン酸リアーゼを遺伝子
工業的に製造できることを見出した。

【０００８】すなわち本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）のタンパク質； （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
パク質、及び当該タンパク質をコードするペクチン酸リ
アーゼ遺伝子を提供するものである。

【０００９】また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の
ＤＮＡからなるペクチン酸リアーゼ遺伝子； （ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、（ｂ）
（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、且つペクチン酸リアーゼ活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を提供する
ものである。

【００１０】更に本発明は、上記ペクチン酸リアーゼ遺
伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含
む形質転換体及び該形質転換体を培養し、培養物からペ
クチン酸リアーゼを採取するペクチン酸リアーゼの製造
法を提供するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のタンパク質は、（ａ）配
列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
パク質であり、本発明の遺伝子は、（ａ）配列番号１の
アミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）の
アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且
つペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコード
するものである。ここで、（ａ）のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列
と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ま
しくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列であって、依然としてペクチン酸リ
アーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端へ
の１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。なお、当該等
価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的
突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製すること
ができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用し
た変異導入用キット（Mutan-super Express Km Kit（タ
カラ社製））等を用いて変異を導入すればよい。

【００１２】本発明の配列番号１に示すペクチン酸リア
ーゼのアミノ酸配列と従来公知のペクチン酸リアーゼの
アミノ酸配列とその相同性を比較するとBacillus sp. K
SM-P103株の生産するペクチン酸リアーゼ（Pel-103： B
iosci. Biotechnol. Biochem., 63, 998-1005, 1999）
との相同性は、７２．６％であり、Bacillus sp. KSM-P
7株の生産するペクチン酸リアーゼ（Pel-7： Biochim.
Biophys. Acta, 1427,145-154, 1999）との相同性は、
７１．９％と中程度以上の値を示した。その他の公知の
ペクチン酸リアーゼとは３０％以下の相同性を示すにす
ぎなかった。このことは、本発明ペクチン酸リアーゼ遺
伝子によりコードされるペクチン酸リアーゼは新規な酵
素であることを示すものであり、従って配列番号１のア
ミノ酸配列と最大７３％以上の相同性を有するペクチン
酸リアーゼをコードする遺伝子は本発明に包含される。
尚、相同性の検索はＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＣＤバイオデー
タソフトウェア［ソフトウェア開発（株）製、ｖｅｒ．
３６］を用いたマキシマムマッチング法にて行った。

【００１３】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子は、上
記のとおり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタ
ンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列か
らなるタンパク質をコードするものであればよいが、
（ａ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、又は
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、且つペクチン酸リア
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有
するペクチン酸リアーゼ遺伝子であるものが好ましい。
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば６×ＳＳ
Ｃ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、
０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、
０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍ
Ｌ ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中においてプローブと
共に６５℃で１２〜１８時間恒温する条件が挙げられ
る。

【００１４】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子は、例
えば下記の菌学的性質を有するバチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−Ｐ２８５０株等からクローン化することができ
る。ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の菌学的性質を以下に示す。

【００１５】Ａ．形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．５〜１．０×
１．２〜２．７μｍ） （ｂ）多形性：無し （ｃ）運動性：有り （ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、
０．６〜１．３×０．９〜２．０μｍ、中央、膨潤無し （ｅ）グラム染色：陽性

【００１６】Ｂ．生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元：陰性 （ｂ）ＶＰテスト：陽性 （ｃ）硫化水素の生成：陰性 （ｄ）インドール産生：陰性 （ｅ）ゼラチンの分解：陽性 （ｆ）クエン酸の利用：陰性 （ｇ）カタラーゼ：陽性 （ｈ）オキシダーゼ：陽性 （ｉ）グルコースからのガス産生：陰性 （ｊ）β―ガラクトシダーゼ：陽性 （ｋ）アルギニンジヒドロラーゼ：陽性 （ｌ）リジンデカルボキシダーゼ：陰性 （ｍ）オルニチンデカルボキシダーゼ：陰性 （ｎ）ウレアーゼ：陰性 （ｏ）トリプトファンデアミナーゼ：陰性 （ｐ）糖からの酸生成：グリセロール、Ｌ−アラビノー
ス、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコ
ース、フラクトース、マンノース、ソルボース、ラムノ
ース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、α
―メチルーＤ−グルコシド、アミダリン、アルブチン、
エスクリン、セロビオース、マルトース、シュークロー
ス、トレハロース、キシリトール、デンプン、グリコー
ゲン等を炭素源として利用し酸を産生する。 尚、上記の生理学的性質に関しては、アピ２０、アピ５
０ＣＨＢ（ビオメリュー社）を用いて試験を行った結果
である。

【００１７】ＫＳＭ−Ｐ２８５０株は、グラム陽性、カ
タラーゼ陽性の有胞子桿菌であることからバチルス属細
菌であると判断され、また生理学的試験の陽性率の結果
からバチルス リケニフォルミスに近縁な菌種であると
考えられた。更に「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」
（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ社、１９８４
年）の記載に準じ検討したところ、その性質は既知のバ
チルス リケニフォルミスとは完全には一致せず、他の
バチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチ
ルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へ
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ２８５０株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１８５６７）として寄託した。

【００１８】上記のＫＳＭ−Ｐ２８５０株からのペクチ
ン酸リアーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知
の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う
ことができる。

【００１９】また、本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子
を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複
製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることが
でき、該遺伝子を安定に保持できるベクターにペクチン
酸リアーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとし
ては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２
２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）等が挙げら
れ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ
６４（Biosci. Biotechnol. Biocem., 59, 2172-2175,
1995）或いはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

【００２０】かくして得られた組換えベクターを用いて
宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピ
テントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行
うことができる。宿主菌としては特に制限されないがBa
cillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia co
li（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線
菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カ
ビ）等の真菌が挙げられる。

【００２１】得られた形質転換体は、資化しうる炭素
源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適
当な条件下で培養すればよく、得られた培養液から、一
般的な方法によって酵素の採取、精製を行うことにより
本発明の酵素液を得ることができる。すなわち、培養物
から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた
培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮すればよ
い。得られた酵素液は、更に凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶
化により必要な酵素形態とすることができる。

【００２２】かくして得られた本発明のペクチン酸リア
ーゼは、後記実施例４に示すように、最適反応ｐＨが１
１付近と非常に高いアルカリ性領域にあり、且つペクチ
ン酸リアーゼ活性１Ｕあたりガラクツロン酸換算で約９
１５μｇのペクチンを遊離するプロトペクチナーゼ活性
を有する。

【００２３】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を説明する。

【００２４】〔酵素活性測定法〕試験管に０．２ ｍＬ
の０．５ Ｍ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０．５）、０．１ ｍＬの４ ｍＭ 塩化カルシウム溶
液、０．２ｍＬの１％（ｗ／ｖ） ポリガラクツロン酸
水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ １４４８２、水酸化ナト
リウム溶液にてｐＨ６．８に調整したもの）及び１．４
ｍＬの脱イオン水を加え、３０oＣで５分間恒温した
後、０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液（希釈は１ ｍ
Ｍ塩化カルシウムを含む５０ ｍＭトリス−塩酸緩衝
液，ｐＨ７．５により行った）を添加し反応を開始し
た。３０oＣで１０分間恒温した後、２ ｍＬの５０ ｍ
Ｍ 塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガ
ラクツロニド量は２３５ｎｍにおける吸光度を測定し、
不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（J. F
ood. Sci., 31， 838-845, 1996）を用いて求めた。な
お、盲検としては酵素液を加えずに処理した反応液に２
ｍＬの５０ｍＭ 塩酸を加え、その後に０．１ｍＬの酵
素液を添加したものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）
は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌの不飽
和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツロニドを
生成する量とした。

【００２５】実施例１ ペクチン酸リアーゼ生産菌のス
クリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、或いは当研究
室保存菌株を下記表１に示す組成を有する寒天平板培地
に塗布し、３０℃で３−５日間培養を行った。菌が生育
した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液（セチルトリメチ
ルアンモニウムブロマイド）を流し込み１０分間靜置し
た。コロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペ
クチン酸リアーゼ生産菌として保存し、粗酵素を調製し
種々の評価に供した。その結果、アルカリペクチン酸リ
アーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ２８
５０株を得た。

【００２６】

【表１】

【００２７】実施例２ ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養 上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピ
ー ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養は、坂口フラスコに５
０ ｍＬの液体培地を加えて３０℃、２日間振盪するこ
とにより行った。培地組成は、１．５％（ｗ／ｖ）ポリ
ペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、
０．１％リン酸水素２カリウム、０．０２％硫酸マグネ
シウム、０．５％ペクチン、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．６：濾過滅菌）とした。

【００２８】実施例３ ＫＳＭ−Ｐ２８５０株産生ペク
チン酸リアーゼの精製 ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養液を遠心分離（１０，００
０×ｇ、２０分、４℃）し、その上澄液（９００ｍＬ）
に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるように徐々に添
加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（１０，０
００×ｇ、１５分、４℃）を行い沈殿物を回収した。こ
れを少量の基本緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウムを含む５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液：ｐＨ ７．５）に溶解し、
同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内
液をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＤＥＡ
Ｅ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）カラム（２．６×１
６ｃｍ）へ添着した。基本緩衝液にて洗浄溶出される画
分に活性が認められ、これを集めた。次にこの非吸着画
分をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＣＭ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）カラム（２．５×２２ｃ
ｍ）へ添着した。基本緩衝液にて洗浄溶出を行った後、
０から０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む基本緩衝液を用
いた濃度勾配溶出法により、吸着タンパク質を溶出させ
た。ペクチン酸リアーゼ活性は０．１２Ｍ付近の塩化ナ
トリウム濃度で溶出された。この画分を限外濾過により
濃縮し、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む基本緩衝液にて
平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００（ファルマ
シア社）ゲル濾過カラム（１．６×６０ｃｍ）に供し
た。ペクチン酸リアーゼ活性を示す画分は２つのピーク
として溶出され、それぞれの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行った結果、均一なペクチン酸リアーゼとして得られ
た。

【００２９】実施例４ ペクチン酸リアーゼの特性 実施例３で得られた１つのペクチン酸リアーゼの分子量
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３４ｋＤａと推定された。
またアミノ末端配列をアミノ酸シークエンサー（476A
型；アプライド バイオシステム社）にて１９番目まで
決定した結果、Ala-Asp-Phe-Ser-Leu-Lys-Gly-Phe-Ala-
Ala-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Gly-Gluであった。

【００３０】またペクチン酸リアーゼ活性に及ぼすｐＨ
の影響を調べたところ図１に示すように最適反応ｐＨは
１１付近（グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）と非常
に高いアルカリ性領域にあった。尚、使用した緩衝液は
５０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．１−９．３）、
５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
９−１１．２）及び５０ｍＭＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１
０．０−１２．０）であった。

【００３１】次にプロトぺクチナーゼ活性を以下の方法
にて測定した。すなわち基質として３０ｃｍしつけ糸
（金鈴印シロモ４０／３甘ヨリ）１本（約２５ｍｇ）を
５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０．５）、０．４ｍＭ塩化カルシウムを含む反応液に酵
素液を添加し（全量２ｍＬ）、３０℃、１時間反応を行
い上清液中に遊離したペクチンをオルシノール塩酸法に
より測定する方法を用いた。上記反応条件下において、
本酵素はペクチン酸リアーゼ活性１Ｕあたりガラクツロ
ン酸換算で約９１５μｇのペクチンを遊離するプロトペ
クチナーゼ活性を有することが明らかになった。

【００３２】実施例５ バチルス エスピー ＫＳＭ−
Ｐ２８５０株のゲノムＤＮＡの調製 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養は、
１％トリプトン（ディフコ）、０．５％（ｗ／ｖ）酵母
エキス（ディフコ）、０．５％塩化ナトリウム、０．１
％リン酸１水素カリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．６：濾過滅菌）から成る培地を用い、３０
℃、２４時間振盪して行った。得られた培養液から遠心
分離（１２０００×ｇ、１５分、５℃）により菌体を回
収し、この菌体から斉藤・三浦の方法によりゲノムＤＮ
Ａを調製した。

【００３３】実施例６ ペクチン酸リアーゼ遺伝子のク
ローニング ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニングは、ＬＡ Ｐ
ＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ
（タカラ社）を用いて行った。まず、実施例４で調製し
たＫＳＭ−Ｐ２８５０株のゲノムＤＮＡをＨｉｎｄII
I、或いはＰｓｔＩにより部分分解し、ＧＦＸ ＰＣＲ
ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｋｉｔ(ファルマシア社)により精製した。
ＨｉｎｄIII分解フラグメントにＬＡ ＰＣＲ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ中のＨｉｎｄIII
カセット、ライゲーション溶液を加え１６℃で３０分間
反応を行い、ＤＮＡを精製した。ライゲーション精製溶
液に脱イオン水を加え、９４℃で１０分間処理した後、
１回目のＰＣＲをペクチン酸リアーゼのアミノ末端配列
よりデザインしたプライマーＡ（配列番号３）とｋｉｔ
中のカセットプライマーＣ１、ＬＡ Ｔａｑ ポリメラ
ーゼを用いて行った。反応条件は、９５℃、１５秒間、
５５℃、３０秒間、７２℃、１２０秒間を３３サイクル
とした。得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、この一部を
用いて２回目のＰＣＲを行った。使用したプライマーは
ペクチン酸リアーゼのアミノ末端配列よりデザインした
プライマーＢ（配列番号４）とｋｉｔ中のカセットプラ
イマーＣ２とした。ここで得られたペクチン酸リアーゼ
遺伝子断片（約０．８ｋｂ）を精製し、その塩基配列を
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（アプライド
バイオシステム社）及び３７７ＤＮＡシークエンサー
（アプライド バイオシステム社）を用いて決定した。
次に同様な方法によってＫＳＭ−Ｐ２５８０株ゲノムＤ
ＮＡのＰｓｔＩ分解フラグメントをＬＡ ＰＣＲ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ中のＰｓｔＩカ
セットにライゲーションした溶液を鋳型にプライマーＣ
（配列番号５）とカセットプライマーＣ１による１回目
のＰＣＲ、更に１回目のＰＣＲ増幅断片を鋳型とし、プ
ライマーＤ（配列番号６）とカセットプライマーＣ２を
用いて２回目のＰＣＲを行い約１ｋｂの遺伝子断片を得
た。以上の遺伝子断片の塩基配列を決定し得られた情報
を基に新たなプライマーＥ、Ｆ（配列番号７、８）を用
いてＨｉｎｄIIIカセットにライゲーションされたＫＳ
Ｍ−Ｐ２５８０株ゲノムＤＮＡのＨｉｎｄIII分解フラ
グメントを鋳型にＰＣＲにより約０．７ｋｂの遺伝子断
片を取得し塩基配列を決定した。以上の一連のＰＣＲに
より得られた遺伝子断片をつなぎ合わせることにより本
発明のペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子の全塩基
配列を決定した。

【００３４】実施例７ ペクチン酸リアーゼ遺伝子のゲ
ノムＰＣＲによる取得 バチルス エスピー Ｐ−２８５０株ゲノム溶液１．５
μＬ(６５０ｎｇ)、ＰＣＲ用緩衝液５μＬ、脱イオン水
３７μＬ、プライマーＧ（配列番号９）及びプライマー
Ｈ（配列番号１０）各１μＬ（１５ｐｍｏｌ）、２．５
ｍＭｄＮＴＰミックス４μＬ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５単位)を混合した
後、９５℃、５分間の熱変性後、９５℃で１５秒間、６
０℃、３０秒間、７２℃、１２０秒間を１サイクルとし
３０サイクルのＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片
（約１．８ｋｂ）を精製し、ＸｂａＩ処理を行った。得
られた遺伝子断片をプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤ
クルト本社）のＸｂａＩ／ＳｍａＩ部位に連結し組換え
プラスミドを構築した。

【００３５】実施例８ 組換え枯草菌によるペクチン酸
リアーゼの生産 実施例７で調製した組換えプラスミドを用いて枯草菌Ｉ
ＳＷ１２１４株を形質転換した。形質転換株を３．０％
ポリペプトンＳ、３．０％マルトース、０．５％魚肉エ
キス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸２水素カリ
ウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサ
イクリン（７．５μｇ／ｍＬ）から成る培地（ＰＭ培
地、ｐＨ６．８）にて３０℃、３日間振盪培養を行っ
た、遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）により
得られた培養上清中のセルラーゼの活性は、約６８００
Ｕ／Ｌであった。更に培養上清から実施例２と同様に精
製したペクチン酸リアーゼ活性画分は分子量約３４ｋＤ
ａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）であり、最適反応ｐＨは１１付
近（グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液）であった。

【００３６】

【発明の効果】本発明のペクチン酸リアーゼは、衣料用
洗剤酵素、繊維精練用酵素等として有用であり、本発明
遺伝子を用いれば、当該酵素を単一且つ大量に生産する
ことが可能である。

【００３７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Pectic acid lyase <130> P05521312 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Bacillus sp. KSM-P2850 <400> 1 Met Lys Lys Leu Ile Ser Ile Ile Phe Ile Phe Val Leu Gly Val Val 1 5 10 15 Gly Ser Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Glu Ala Ala Ser Ala Leu Asn 20 25 30 Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala 35 40 45 Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr 50 55 60 Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala 65 70 75 80 Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr Ser Asn 85 90 95 Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser Ile 100 105 110 Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile 115 120 125 Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His Glu Val 130 135 140 Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn 145 150 155 160 Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys 165 170 175 Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile 180 185 190 Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met 195 200 205 Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His 210 215 220 Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly 225 230 235 240 Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp Ser Gly 245 250 255 Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe 260 265 270 Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly 275 280 285 Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met 290 295 300 Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu 305 310 315 320 Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala Gly Val 325 330 335 Gly Lys Ile Asn Pro 340 <210> 2 <211> 1026 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-P2850 <400> 2 atg aag aaa tta atc agc atc atc ttt atc ttt gta tta ggg gtt gtc 48 Met Lys Lys Leu Ile Ser Ile Ile Phe Ile Phe Val Leu Gly Val Val -39 -35 -30 -25 ggg tca ttg aca gcg gcg gtt tcg gca gaa gca gct tct gcc tta aac 96 Gly Ser Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Glu Ala Ala Ser Ala Leu Asn -20 -15 -10 tcg ggc aaa gta aat ccg ctt gcc gac ttc agc tta aaa ggc ttt gcc 144 Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala -5 1 5 gca cta aac ggc gga aca acg ggc gga gaa ggc ggt cag acg gta acc 192 Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr 10 15 20 25 gta aca acg gga gat cag ctg att gcg gca tta aaa aat aag aat gca 240 Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala 30 35 40 aat acg cct tta aaa att tat gtc aac ggc acc att aca aca tca aat 288 Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr Ser Asn 45 50 55 aca tcc gca tca aag att gac gtc aaa gac gtg tca aac gta tcg att 336 Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser Ile 60 65 70 gtc gga tca ggg acc aaa ggg gaa ctc aaa ggg atc ggc atc aaa ata 384 Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile 75 80 85 tgg cgg gcc aac aac atc atc atc cgc aac ttg aaa att cac gag gtc 432 Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His Glu Val 90 95 100 105 gcc tca ggc gat aaa gac gcg atc ggc att gaa ggc cct tct aaa aac 480 Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn 110 115 120 att tgg gtt gat cat aat gag ctt tac cac agc ctg aac gtt gac aaa 528 Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys 125 130 135 gat tac tat gac gga tta ttt gac gtc aaa aga gat gcg gaa tat att 576 Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile 140 145 150 aca ttc tct tgg aac tat gtg cac gat gga tgg aaa tca atg ctg atg 624 Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met 155 160 165 ggt tca tcg gac agc gat aat tac aac agg acg att aca ttc cat cat 672 Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His 170 175 180 185 aac tgg ttt gag aat ctg aat tcg cgt gtg ccg tca ttc cgt ttc gga 720 Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly 190 195 200 gaa ggc cat att tac aac aac tat ttc aat aaa atc atc gac agc gga 768 Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp Ser Gly 205 210 215 att aat tcg agg atg ggc gcg cgc atc aga att gag aac aac ctc ttt 816 Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe 220 225 230 gaa aac gcc aaa gat ccg att gtc tct tgg tac agc agt tca ccg ggc 864 Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly 235 240 245 tat tgg cat gta tcc aac aac aaa ttt gta aac tct agg ggc agt atg 912 Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met 250 255 260 265 ccg act acc tct act aca acc tat aat ccg cca tac agc tac tca ctc 960 Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu 270 275 280 gac aat gtc gac aat gta aaa tca atc gtc aag caa aat gcc gga gtc 1008 Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala Gly Val 285 290 295 ggc aaa atc aat cca taa 1026 Gly Lys Ile Asn Pro 300 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 aarggnttyg cngcnytnaa yggngg 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tnaayggngg nacnacnggn ggnga 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 acgttgacaa gattactatg ac 22 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 attgtctctt ggtacagcag ttcaccg 27 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 attcagattc tcaaaccagt tatg 24 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 atttgatgtt gtaatggtgc cgttgac 27 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 tcatatatgc gagcttgctg aatg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 tgactgagca agcggttcaa agcg 24

【図面の簡単な説明】

【図１】ペクチン酸リアーゼ活性に及ぼすｐＨの影響を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:07 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA07 CA04 DA07 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD02 LL02 LL04 4B065 AA15Y AA19X AB01 AC14 CA27 CA41 CA57

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質； （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
   のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
   列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
   パク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードするペクチン酸リアーゼ遺伝子； （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
   のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
   列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
   パク質。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
   るペクチン酸リアーゼ遺伝子； （ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、（ｂ）
   （ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズし、且つペクチン酸リアーゼ活
   性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含有する
   組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 宿主が微生物である請求項５記載の形質
   転換体。
7. 【請求項７】 請求項５又は６記載の形質転換体を培養
   し、培養物からペクチン酸リアーゼを採取するペクチン
   酸リアーゼの製造法。