JP2003250571A - ペクチン酸リアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】高アルカリ性領域で充分作用するＡ−タイプの
プロトペクチナーゼ活性を有し、工業用酵素として有用
なペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子及びその遺伝
子を用いて酵素を単一且つ大量に製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 パチルス菌由来のタンパク質、又はタン
パク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から
なり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク
質；及びこれをコードするペクチン酸リアーゼ遺伝子。 【効果】 ペクチン酸リアーゼ遺伝子を用いれば、衣料
用洗剤酵素、繊維精練用酵素として有用なペクチン酸リ
アーゼを単一且つ大量に生産することが可能。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、繊維処理剤、食品
加工剤、洗浄剤として有用なペクチン酸リアーゼをコー
ドする遺伝子並びにその製造法に関する。

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ペクチ
ンは植物細胞壁の構成糖あるいは細胞間の中葉の主成分
として存在している。従って、果実の破砕物や搾汁中の
ペクチン質を分解し清澄化するのにペクチン分解酵素が
用いられている。さらに果汁等の搾汁率の向上、柑橘ジ
ュースパルプからの可溶性固形分の回収、野菜単細胞食
品の製造、みかん内果皮の剥皮、コーヒー豆の外皮を除
去した後に残るペクチンを主成分とする粘質物の除去等
にもペクチン分解酵素が広く用いられている。

【０００２】ペクチン分解酵素には大きく分けて、
（１）ペクチンのメチルエステルを加水分解するペクチ
ンメチルエステラーゼ、（２）ペクチン酸およびペクチ
ンのα−１，４結合を加水分解するエンド型、エキソ型
ポリガラクツロナーゼ、（３）ペクチン酸、ペクチンに
対しβー脱離反応で、α−１，４結合を切断し、非還元
末端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成する酵素であるエン
ド型、エキソ型ペクチン酸リアーゼ、エンド型、エキソ
型ペクチンリアーゼ、（４）オリゴガラクツロン酸を主
な基質とするオリゴガラクツロナーゼ、の４種類が存在
し（バイオサイエンスとインダストリー, 50, 315-321,
1992）、更にこの他に、不溶性のプロトペクチンに対
し分解作用を示すプロトペクチナーゼが見出されている
（Agric．Biol．Chem．42，2427−2429，1978）。

【０００３】このプロトペクチナーゼは、さらにＡ−タ
イプとＢ−タイプに分類されるが、Ａ−タイプはポリガ
ラクツロナーゼ或いはペクチン酸リアーゼ活性を有する
酵素であり、Ｂ−タイプはセルロース（ヘミセルロー
ス）とペクチン質を結び付けている介在多糖配列中のア
ラビナンのα−１，５結合性ガラクタンのα−１，４結
合を加水分解する酵素である（繊維工学、45、19-32、1
992）。

【０００４】これらのペクチン質分解酵素の中で、一般
的にアルカリ性側に最適反応ｐＨを有するペクチン酸リ
アーゼの工業的な利用は繊維産業や洗剤工業において有
効であると考えられる。例えば、植物性繊維の精練にお
いてはアルカリ性領域で処理することで精練度合を高め
ることが可能であり、一般の衣料用洗剤や漂白剤も高ア
ルカリ性（ｐＨ１０−１１）にすることによってその洗
浄力を高めることができる。事実、麻繊維の精練におい
てペクチン酸リアーゼあるいはその生産菌が古くより用
いられてきた。また、最近ではプロトペクチナーゼ(ペ
クチン酸リアーゼが主成分)を用いた木綿繊維の精練も
実用化の段階にあるという（染色工業、43、162-173、1
995）。更に植物性繊維上のプロトペクチンに付着した
汚れを除去するには、Ａ−タイプのプロトペクチナーゼ
に分類されるペクチン酸リアーゼが有効であると考えら
れる。このような観点から、ペクチン酸リアーゼの衣料
用洗剤への応用に関し特開平１０−３３７１８１号、特
開平１１−３１８４４３号、特開平１１−３１８４５７
号、ＷＯ９８／０６８０５、ＷＯ９８／０６８０８等が
開示されている。さらにコンタクトレンズ用洗浄剤（特
開昭６２−９１３号）、イオン交換膜洗浄剤（特開平１
−３０４００７号）等にペクチナーゼを使用するという
ことも開示されている。

【０００５】従って、アルカリ性領域で良好に作用する
プロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼを
大量に生産することが望まれていた。

【０００６】本発明の目的は、高アルカリ性領域で充分
作用するＡ−タイプのプロトペクチナーゼ活性を有し、
工業用酵素として有用なペクチン酸リアーゼをコードす
る遺伝子及びその遺伝子を用いて当該酵素を単一且つ大
量に製造する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アルカリ
領域で充分に作用するペクチン酸リアーゼを探索すべく
日本国内の土壌よりスクリーニングを行ったところ、当
該目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さらに当
該微生物からペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子を
クローン化し、これを用いることにより工業用酵素とし
て有用なペクチン酸リアーゼを工業的に製造できること
を見出した。

【０００８】すなわち本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）のタンパク質； （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
パク質、及び当該タンパク質をコードするペクチン酸リ
アーゼ遺伝子を提供するものである。

【０００９】また、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）
のＤＮＡからなるペクチン酸リアーゼ遺伝子； （ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、（ｂ）
（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、且つペクチン酸リアーゼ活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を提供する
ものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のタンパク質は、（ａ）配
列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
パク質であり、本発明の遺伝子は、（ａ）配列番号１の
アミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）の
アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且
つペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコード
するものである。ここで（ａ）のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列
と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ま
しくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
されたアミノ酸配列であって、依然としてペクチン酸リ
アーゼ活性を有する配列であり、付加には、アミノ末端
又はカルボキシ末端への１〜数個のアミノ酸の付加も含
まれる。

【００１１】本発明の配列番号１に示すペクチン酸リア
ーゼのアミノ酸配列と従来公知のペクチン酸リアーゼの
アミノ酸配列とその相同性を比較するとBacillus sp. K
SM-P15株の生産するペクチン酸リアーゼ（Pel-15： Eu
r. J. Biochem., 267, 2268-2275, 2000）との相同性
は、５７．９％であり、次いでFusarium solani f. sp.
pisi株の生産するペクチン酸リアーゼ（Pel-A：J. Bact
eriol. 174, 6343-6349,1992）との相同性は、３１．３
％であった。その他の公知のペクチン酸リアーゼとは３
０％以下の相同性を示すにすぎなかった。また、Bacill
us subtilis 168株の全ゲノム配列（Nature, 390, 249-
256, 1997）の中で未知な機能タンパク質として公開さ
れているyypA遺伝子によりコードされるタンパク質の一
部と７２．１％の相同性が認められた。しかし、従来公
知のBacillus subtilisのペクチン酸リアーゼ（BsPel:
FEBS Lett., 335, 319-326, 1993）とは１６．５％の相
同性を示すにすぎなかった。このことは、本発明ペクチ
ン酸リアーゼ遺伝子によりコードされるペクチン酸リア
ーゼは新規な酵素であることを示唆するものであり、従
って配列番号１に示したアミノ酸配列と最大５８％以上
の相同性を有するペクチン酸リアーゼをコードする遺伝
子は本発明に含まれる。尚、相同性の検索はＧＥＮＥＮ
ＴＹＸ−ＣＤバイオデータソフトウェア［ソフトウェア
開発（株）製、ｖｅｒ．３６］を用いたマキシマムマッ
チング法にて行った。

【００１２】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子は、上
記の通り、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタン
パク質または当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列か
らなるタンパク質をコードするものであればよいが、
（ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、又は
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、且つペクチン酸リア
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからな
るペクチン酸リアーゼ遺伝子が好ましい。ここでストリ
ンジェントな条件とは、例えば６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ
の組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘ
デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含
む溶液中においてプローブとともに６５℃、１２〜１８
時間恒温する条件が挙げられる。

【００１３】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子は、例
えば下記の菌学的性質を有するバチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−Ｐ２８５０株等からクローン化することができ
る。

【００１４】Ａ 形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．５〜１．０×
１．２〜２．７μｍ） （ｂ）多形性：無し （ｃ）運動性：有り （ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、
０．６〜１．３×０．９〜２．０μｍ、中央、膨潤無し （ｅ）グラム染色：陽性

【００１５】Ｂ 生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元：陰性 （ｂ）ＶＰテスト：陽性 （ｃ）硫化水素の生成：陰性 （ｄ）インドール産生：陰性 （ｅ）ゼラチンの分解：陽性 （ｆ）クエン酸の利用：陰性 （ｇ）カタラーゼ：陽性 （ｈ）オキシダーゼ：陽性 （ｉ）グルコースからのガス産生：陰性 （ｊ）β―ガラクトシダーゼ：陽性 （ｋ）アルギニンジヒドロラーゼ：陽性 （ｌ）リジンデカルボキシダーゼ：陰性 （ｍ）オルニチンデカルボキシダーゼ：陰性 （ｎ）ウレアーゼ：陰性 （ｏ）トリプトファンデアミナーゼ：陰性 （ｐ）糖からの酸生成：グリセロール、Ｌ−アラビノー
ス、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコ
ース、フラクトース、マンノース、ソルボース、ラムノ
ース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、α
―メチルーＤ−グルコシド、アミダリン、アルブチン、
エスクリン、セロビオース、マルトース、シュークロー
ス、トレハロース、キシリトール、デンプン、グリコー
ゲン等を炭素源として利用し酸を産生する。

【００１６】以上、生理学的性質に関してはアピ２０、
アピ５０ＣＨＢ（ビオメリュー社）を用いて試験を行っ
た結果である。

【００１７】ＫＳＭ−Ｐ２８５０株は、グラム陽性、カ
タラーゼ陽性の有胞子桿菌であることからバチルス属細
菌であると判断され、また生理学的試験の陽性率の結果
からバチルス リケニフォルミスに近縁な菌種であると
考えられた。さらに「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ」（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ社、１９８
４年）の記載に準じ検討したところ、その性質は既知の
バチルス リケニフォルミスとは完全には一致せず、他
のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバ
チルス属細菌として本菌株を独立行政法人産業技術総合
研究所 特許微生物寄託センターへバチルス エスピー
ＫＳＭ−Ｐ２８５０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６７）
として寄託した。

【００１８】上記のＫＳＭ−Ｐ２８５０株からのペクチ
ン酸リアーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知
の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う
ことができる。

【００１９】また、本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子
を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複
製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることが
でき、該遺伝子を安定に保持できるベクターにペクチン
酸リアーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとし
ては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２
２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）等が挙げら
れ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ
６４（Biosci. Biotechnol. Biocem., 59, 2172-2175,
1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

【００２０】かくして得られた組換えベクターを用いて
宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテ
ントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行う
ことができる。宿主菌としては特に制限されないがBaci
llus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli
（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線
菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カ
ビ）等の真菌が挙げられる。

【００２１】得られた形質転換体は、資化しうる炭素
源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適
当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液
から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、
凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得
ることができる。

【００２２】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を説明する。 〔酵素活性測定法〕試験管に０．２ ｍＬの０．５ Ｍ
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、
０．１ ｍＬの４ ｍＭ 塩化カルシウム溶液、０．２ｍ
Ｌの１％（ｗ／ｖ） ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣ
Ｎ社製：Ｌｏｔ １４４８２、水酸化ナトリウム溶液に
てｐＨ６．８に調整したもの）及び１．４ ｍＬの脱イ
オン水を加え、３０℃で５分間恒温した後、０．１ｍＬ
の適当に希釈した酵素液（希釈は１ ｍＭ塩化カルシウ
ムを含む５０ ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５に
より行った）を添加し反応を開始した。３０℃で１０分
間恒温した後、２ ｍＬの５０ ｍＭ 塩酸を加え反応を
停止した。生成した不飽和ポリガラクツロニド量は２３
５ｎｍにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロニ
ドの分子吸光係数４６００（J. Food. Sci., 31， 838-
845, 1996）を用いて求めた。なお、盲検としては酵素
液を加えずに処理した反応液に２ｍＬの５０ｍＭ 塩酸
を加え、その後に０．１ｍＬの酵素液を添加したものを
用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下にお
いて１分間に１μｍｏｌの不飽和ジガラクツロニド相当
の不飽和ポリガラクツロニドを生成する量とした。

【００２３】実施例１ ペクチン酸リアーゼ生産菌のス
クリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは当研
究室保存菌株を下記の組成を有する寒天平板培地に塗布
し、３０℃で３−５日間培養を行った。菌が生育した
後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液（セチルトリメチルア
ンモニウムブロマイド）を流し込み１０分間静置した。
コロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペクチ
ン酸リアーゼ生産菌として保存し、粗酵素を調製し種々
の評価に供した。その結果、アルカリペクチン酸リアー
ゼ生産菌としてバチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ２８５０
株を得た。

【００２４】

【表１】

【００２５】実施例２ ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養 上述のスクリーニングにより得られたバチルス スピー
シーズ ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養は、坂口フラスコ
に５０ ｍＬの液体培地を加えて３０℃、２日間振盪す
ることにより行った。培地組成は、１．５％（ｗ／ｖ）
ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキ
ス、０．１％リン酸水素２カリウム、０．０２％硫酸マ
グネシウム、０．５％ペクチン、５０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．６：濾過滅菌）とした。

【００２６】実施例３ ＫＳＭ−Ｐ２８５０株産生ペク
チン酸リアーゼの精製 ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養液を遠心分離（１０，００
０×ｇ、２０分、４℃）し、その上澄液（９００ｍＬ）
に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるように徐々に添
加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（１０，０
００×ｇ、１５分、４℃）を行い沈殿物を回収した。こ
れを少量の基本緩衝液（１ｍＭ塩化カルシウムを含む５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液：ｐＨ ７．５）に溶解し、
同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内
液をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＤＥＡ
Ｅ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）カラム（２．６×１
６ｃｍ）へ添着した。基本緩衝液にて洗浄溶出される画
分に活性が認められ、これを集めた。次にこの非吸着画
分をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＣＭ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）カラム（２．５×２２ｃ
ｍ）へ添着した。基本緩衝液にて洗浄溶出を行った後、
０から０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む基本緩衝液を用
いた濃度勾配溶出法により、吸着タンパク質を溶出させ
た。ペクチン酸リアーゼ活性は０．１２Ｍ付近の塩化ナ
トリウム濃度で溶出された。この画分を限外濾過により
濃縮し、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む基本緩衝液にて
平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００（ファルマ
シア社）ゲル濾過カラム（１．６×６０ｃｍ）に供し
た。ペクチン酸リアーゼ活性を示す画分は２つのピーク
として溶出され、それぞれの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行った結果、分子量の異なる２種類の均一なペクチン酸
リアーゼを得た。

【００２７】実施例４ ペクチン酸リアーゼの特性 実施例３で得られた２種類のペクチン酸リアーゼの分子
量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約３４ｋＤａ及び約２８ｋ
Ｄａと推定された。そこで分子量２８ｋＤａのペクチン
酸リアーゼのアミノ末端配列をアミノ酸シークエンサー
（476A型；アプライド バイオシステム社）にて１４番
目まで決定した結果、Ala-Glu-Val-Val-(His/Ala)-(Pro
/Met/Val)-Thr-Ile-Val-Val-(Thr/Gly)-(Glu/Gly)-Gly-
Glnであった。

【００２８】またペクチン酸リアーゼ活性に及ぼすｐＨ
の影響を調べたところ図１に示すように最適反応ｐＨは
１０付近（ＣＡＰＳ緩衝液）と高いアルカリ性領域にあ
った。尚、使用した緩衝液は５０ｍＭトリスー塩酸緩衝
液（ｐＨ８．９−９．３）、５０ｍＭグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．９−１１．２）及び５０ｍ
ＭＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．０−１２．０）であっ
た。

【００２９】次にプロトぺクチナーゼ活性を以下の方法
にて測定した。すなわち基質として３０ｃｍしつけ糸
（金鈴印シロモ４０／３甘ヨリ）１本（約２５ｍｇ）を
５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０．５）、０．４ｍＭ塩化カルシウムを含む反応液に酵
素液を添加し（全量２ｍＬ）、３０℃、１時間反応を行
い上清液中に遊離したペクチンをオルシノール塩酸法に
より測定する方法を用いた。上記反応条件下において、
本酵素はペクチン酸リアーゼ活性１Ｕあたりガラクツロ
ン酸換算で約１３０μｇのペクチンを遊離するプロトペ
クチナーゼ活性を有することが明らかになった。

【００３０】実施例５ バチルス エスピー ＫＳＭ−
Ｐ２８５０株のゲノムＤＮＡの調製 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ２８５０株の培養は、
１％トリプトン（ディフコ）、０．５％(w/v)酵母エキ
ス（ディフコ）、０．５％塩化ナトリウム、０．２％リ
ン酸１水素カリウム、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．６：濾過滅菌）から成る培地を用い、３０℃、２
４時間振盪して行った。得られた培養液から遠心分離
（１２０００×ｇ、１５分、５℃）により菌体を回収
し、この菌体から斉藤・三浦の方法によりゲノムＤＮＡ
を調製した。

【００３１】実施例６ ペクチン酸リアーゼ遺伝子のク
ローニング ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニングは、ＬＡ Ｐ
ＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ
（タカラ社）を用いて行った。まず、実施例５で調製し
たＫＳＭ−Ｐ２８５０株のゲノムＤＮＡをＨｉｎｄII
I、あるいはＥｃｏＲＩによる部分分解を行い、ＧＦＸ
ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ(ファルマシア社)により精
製した。ＨｉｎｄIII分解フラグメントにＬＡ ＰＣＲ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ中のＨｉｎ
ｄIIIカセット、ライゲーション溶液を加え１６℃で３
０分間反応を行い、ＤＮＡを精製した。ライゲーション
精製溶液に脱イオン水を加え、９４℃で１０分間処理し
た後、１回目のＰＣＲをペクチン酸リアーゼのアミノ末
端配列よりデザインしたプライマーＡ（配列番号３）と
ｋｉｔ中のカセットプライマーＣ１、ＬＡ Ｔａｑ ポ
リメラーゼを用いて行った。反応条件は、９５℃、１５
秒間、５５℃、３０秒間、７２℃、１２０秒間を３３サ
イクルとした。得られたＰＣＲ反応液を脱イオン水１０
０倍に希釈し、この一部を用いて２回目のＰＣＲを行っ
た。使用したプライマーはペクチン酸リアーゼのアミノ
末端配列よりデザインしたプライマーＢ（配列番号４）
とｋｉｔ中のカセットプライマーＣ２とした。ここで得
られたペクチン酸リアーゼ遺伝子断片（約１．０ｋｂ）
を精製し、その塩基配列をＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ ｋｉｔ（アプライド バイオシステム社）及び３７
７ＤＮＡシークエンサー（アプライド バイオシステム
社）を用いて決定した。次に同様な方法によってＫＳＭ
−Ｐ２５８０株ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解フラグメ
ントをＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｋｉｔ中のＥｃｏＲＩカセットにライゲーションし
た溶液を鋳型に先に得られた塩基配列の情報を基に合成
したプライマーＣ（配列番号５）とカセットプライマー
Ｃ１による１回目のＰＣＲ，さらに１回目のＰＣＲによ
る増幅断片を鋳型とし、プライマーＤ（配列番号６）と
カセットプライマーＣ２を用いて２回目のＰＣＲを行い
約２．５ｋｂの遺伝子断片を得た。この遺伝子断片の塩
基配列を決定し、ＰＣＲにより得られた遺伝子断片をつ
なぎ合わせることにより本発明のペクチン酸リアーゼを
コードする遺伝子の全塩基配列を決定した。

【００３２】実施例７ ペクチン酸リアーゼ遺伝子のゲ
ノムＰＣＲによる取得 バチルス エスピー Ｐ−２８５０株ゲノム溶液１．５
μＬ(６５０ｎｇ)、ＰＣＲ用緩衝液５μＬ、脱イオン水
３７μＬ、プライマーＣ（配列番号５）及びプライマー
Ｅ（配列番号７）各１μＬ（１５ｐｍｏｌ）、２．５ｍ
ＭｄＮＴＰミックス４μＬ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５単位)を混合した
後、９５℃、５分間の熱変性後、９５℃で１５秒間、６
０℃、３０秒間、７２℃、１２０秒間を１サイクルとし
３０サイクルのＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片
（約１．８ｋｂ）をＸｂａＩにより処理した後、精製し
た。得られた遺伝子断片をプラスミドｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ（ヤクルト本社）のＸｂａＩ／ＳｍａＩ部位に連結し
組換えプラスミドを構築した。

【００３３】実施例８ 組換え枯草菌によるペクチン酸
リアーゼの生産 実施例７で調製した組換えプラスミドを用いて枯草菌Ｉ
ＳＷ１２１４株を形質転換した。形質転換株を３．０％
ポリペプトンＳ、３．０％マルトース、０．５％魚肉エ
キス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸２水素カリ
ウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサ
イクリン（７．５μｇ／ｍＬ）から成る培地（ＰＭ培
地、ｐＨ６．８）にて３０℃、３日間振盪培養を行っ
た、遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）により
得られた培養上清中のセルラーゼの活性は、約１０００
Ｕ／Ｌであった。さらに培養上清から実施例３と同様に
精製したペクチン酸リアーゼ活性画分は分子量約２８ｋ
Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）であり、最適反応ｐＨは１０
付近（ＣＡＰＳ緩衝液）であった。

【００３４】

【発明の効果】本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子を用
いれば、衣料用洗剤酵素、繊維精練用酵素として有用な
ペクチン酸リアーゼを単一且つ大量に生産することが可
能である。

【００３５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Pectic acid lyase <130> P00891403 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Bacillus sp. KSM-P2850 <400> 1 Met Lys Arg Leu Ala Gly Thr Val Ile Leu Ser Gly Leu Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Phe Gly Gln Ala Leu Pro Glu Lys Ala Leu Ala Ala Glu Val Val 20 25 30 His Lys Thr Ile Val Val Glu Lys Gly Gln Thr Tyr Asp Gly Lys Gly 35 40 45 Lys Arg Leu Ile Ala Gly Pro Glu Leu Gly Asp Gly Ser Gln Arg Glu 50 55 60 Asp Gln Lys Pro Ile Phe Lys Val Glu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80 Val Val Leu Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly Val His Thr Tyr Gly Asn 85 90 95 Ala Ser Ile Asn Asn Val Val Trp Glu Asp Val Gly Glu Asp Ala Leu 100 105 110 Thr Val Lys Ser Glu Gly Ser Val Thr Ile Asn Gly Gly Ser Ala Arg 115 120 125 Leu Ala Ala Asp Lys Ile Phe Gln Ile Asn Lys Ala Ser Thr Phe Thr 130 135 140 Val Lys Asn Phe Thr Ala Asp Gln Gly Gly Lys Phe Ile Arg Gln Leu 145 150 155 160 Gly Gly Ser Thr Phe Lys Ala Val Val Asn Ile Asp Asn Cys Thr Ile 165 170 175 Thr Asn Met Lys Glu Ala Ile Phe Arg Thr Asp Ser Ser Thr Ser Ser 180 185 190 Val Thr Met Ile Asn Thr Arg Tyr Ser Lys Val Gly Gln Lys Trp Ile 195 200 205 Gly Val Lys His Val Thr Glu Arg Asn Asn His Glu Phe 210 215 220 <210> 2 <211> 666 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-P2850 <400> 2 atg aag aga tta gca ggt acg gtt att ttg tca ggt ttg ctc gta tgc 48 Met Lys Arg Leu Ala Gly Thr Val Ile Leu Ser Gly Leu Leu Val Cys -28 -25 -20 -15 ggg ttt gga cag gct ctg cct gaa aaa gct ttg gcc gcc gag gtc gtt 96 Gly Phe Gly Gln Ala Leu Pro Glu Lys Ala Leu Ala Ala Glu Val Val -10 -5 1 cac aaa acg atc gta gtc gag aaa ggc caa acg tat gac gga aaa ggc 144 His Lys Thr Ile Val Val Glu Lys Gly Gln Thr Tyr Asp Gly Lys Gly 5 10 15 20 aag cgg ctg att gca ggt ccg gag ctc ggg gac ggc agc caa cgc gag 192 Lys Arg Leu Ile Ala Gly Pro Glu Leu Gly Asp Gly Ser Gln Arg Glu 25 30 35 gat caa aaa ccg att ttc aaa gtg gag gat ggt gca acg ctc aaa aat 240 Asp Gln Lys Pro Ile Phe Lys Val Glu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asn 40 45 50 gtc gtg ctt ggc gct cct gct gct gat ggt gtt cac aca tat gga aac 288 Val Val Leu Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly Val His Thr Tyr Gly Asn 55 60 65 gct tcc ata aac aac gtt gtt tgg gaa gat gtc ggc gaa gat gcc ttg 336 Ala Ser Ile Asn Asn Val Val Trp Glu Asp Val Gly Glu Asp Ala Leu 70 75 80 act gtc aaa agc gaa gga agt gtc acg ata aac gga gga tcg gcc cgg 384 Thr Val Lys Ser Glu Gly Ser Val Thr Ile Asn Gly Gly Ser Ala Arg 85 90 95 100 ctt gcc gcg gac aaa atc ttt cag att aat aaa gcg agc aca ttt acc 432 Leu Ala Ala Asp Lys Ile Phe Gln Ile Asn Lys Ala Ser Thr Phe Thr 105 110 115 gtg aaa aat ttt act gcc gat caa gga ggc aaa ttc att cgc cag ctc 480 Val Lys Asn Phe Thr Ala Asp Gln Gly Gly Lys Phe Ile Arg Gln Leu 120 125 130 gga ggc tcg aca ttt aaa gcc gtg gtc aat att gat aac tgt acg att 528 Gly Gly Ser Thr Phe Lys Ala Val Val Asn Ile Asp Asn Cys Thr Ile 135 140 145 aca aac atg aaa gag gcg atc ttc cga acc gac agc agt aca agt tcc 576 Thr Asn Met Lys Glu Ala Ile Phe Arg Thr Asp Ser Ser Thr Ser Ser 150 155 160 gtt aca atg ata aat aca aga tac tca aaa gtc ggt cag aaa tgg atc 624 Val Thr Met Ile Asn Thr Arg Tyr Ser Lys Val Gly Gln Lys Trp Ile 165 170 175 180 ggt gtg aag cat gtt acg gaa aga aac aat cat gaa ttt taa 666 Gly Val Lys His Val Thr Glu Arg Asn Asn His Glu Phe 185 190 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gargtngtnc aytgyacnat hgtngt 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gtngarggng gncaracnta ygaygg 26 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 tatacgccgt ttcttggaat g 21 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ttgaaaatcg ggttttgatc ctcgcgttg 29 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gttctagaag cccttattaa attaagcgct ttacc 35

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のペクチン酸リアーゼ活性に及ぼすｐＨ
の影響を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 CA04 DA05 DA11 EA04 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 FF11 FF12 LL05 4B065 AA01X AA15Y AA57X AB01 BA01 CA19 CA27 CA41 CA57 CA60

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質； （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
   のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
   列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
   パク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードするペクチン酸リアーゼ遺伝子； （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個
   のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
   列からなり、且つペクチン酸リアーゼ活性を有するタン
   パク質。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
   るペクチン酸リアーゼ遺伝子； （ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、（ｂ）
   （ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズし、且つペクチン酸リアーゼ活
   性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含有する
   組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 宿主が微生物である請求項５記載の形質
   転換体。
7. 【請求項７】 請求項５又は６記載の形質転換体を培養
   し、培養物からペクチン酸リアーゼを採取するペクチン
   酸リアーゼの製造法。