JP4380874B2 - アルカリセルラーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤用酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは植物細胞壁の主成分で、衣料、紙、建築材料等に有効利用されるバイオマスの代表的存在である。セルロースはグルコースが直鎖状にβ−１，４結合した巨大分子であるため、分解によって燃料物質やより高付加価値の代謝物質に変換が可能である。そのためセルロースを分解する酵素として、セルラーゼ及びその反応産物の有効利用に関する研究が多岐に行われている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般に、中酸性に最適反応ｐＨを有し、結晶性セルロースを良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心となっている。
【０００３】
一方、掘越（特公昭５０−２８５１５号公報、Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以来、セルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となった。その後、実際に好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（特公昭６０−２３１５８号公報、特公平６−０３０５７８号公報、米国特許第４９４５０５３号等）が衣料用洗剤へ配合されるに至った。これ以降、真菌類由来のセルラーゼ配合洗剤も上市されるようになり、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼと並ぶ洗剤用酵素としての地位を確立してきた。
【０００４】
さらに近年、遺伝子工学の発展に伴い、洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっている。アルカリセルラーゼについても既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、実生産に用いられている例もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、洗剤用酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子及びその遺伝子を用いた大量かつ単一のアルカリセルラーゼを製造する方法を確立することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、自然界からアルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリセルラーゼをコードする遺伝子をクローン化することにより、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするアルカリセルラーゼ遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、配列番号４に示す塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するアルカリセルラーゼ遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、上記のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記の形質転換体を培養することを特徴とするアルカリセルラーゼの製造法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子は、配列番号１若しくは２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする配列を有する。アルカリセルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがある）は特に制限されない。また、配列番号１又は２に示した成熟酵素のアミノ酸配列におけるアミノ末端には、１〜数個のアミノ酸が付加、欠失、置換していてもよい。
【０００９】
本発明の配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｎ１３１ａセルラーゼと表記する）のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列との相同性を比較すると、Bacillus sp. No.1139株の生産するセルラーゼ（Fukumoriら、J. Gen. Microbiol., 131, 3339-3345, 1985）との相同性は８１．９％であり、Bacillus sp. KSM-64株由来のセルラーゼ（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）との相同性は８３．６％、Bacillus sp. KSM-S237株が生産するセルラーゼ（特願平１１−０１３０４９号）との相同性は８６．７％であり、本発明の遺伝子からコードされるＮ１３１ａセルラーゼと最も高い相同性を示したが、完全に一致するものではなかった。このことは、Ｎ１３１ａセルラーゼが新規なアルカリセルラーゼであることを示唆するものであり、従って配列番号１に示したアミノ酸配列と最大８７％以上の相同性を有するセルラーゼは本発明に含まれる。
【００１０】
次に、本発明の配列番号２に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｎ１３１ｂセルラーゼと表記する）のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列との相同性を比較すると、上記のＮ１３１ａセルラーゼとの相同性は８３．６％、Bacillus sp. No.1139株の生産するセルラーゼとの相同性は８８．０％、Bacillus sp. KSM-64株由来のセルラーゼとの相同性は９０．９％であった。さらに、Bacillus sp. KSM-S237株が生産するセルラーゼとの相同性が９４．７％と本発明の遺伝子からコードされるＮ１３１ｂと最も高い相同性を示した。このことは、Ｎ１３１ｂセルラーゼが従来公知のセルラーゼとは完全に一致するものではなく、新規な酵素であることを示唆するものであり、従って配列番号２に示したアミノ酸配列と最大９５％以上の相同性を有するセルラーゼは本発明に含まれる。
尚、相同性の検索はＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＣＤバイオデータソフトウェア［ソフトウェア開発社製、ｖｅｒ．３６］を用いたマキシマムマッチング法にて行った。
【００１１】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、配列番号１若しくは２に示すアミノ酸配列又はその変異体をコードするものであればよいが、配列番号３若しくは４で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。
【００１２】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、バチルス属に属する微生物、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株等からクローン化することができる。
〔バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の菌学的性質〕
Ａ. 形態学的性質；
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．６〜０．８×２．８〜７．２μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、０．７〜１．０×１．０〜１．８μｍ、中央準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：陽性
（ｆ）抗酸性：陰性
【００１３】
Ｂ. 培養学的性質；
（ａ）一般細菌用液体培地（ｐＨ５．７、培地１）：生育せず
（ｂ）一般細菌用液体培地（ｐＨ６．８、培地１）：生育せず
（ｃ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ６．５、培地２）：生育せず
（ｄ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ８．５、培地２）：生育する
【００１４】
Ｃ. 生理学的性質；
（ａ）硝酸塩の還元（培地３）：陽性
（ｂ）脱窒反応（培地３）：陰性
（ｃ）ＶＰテスト（培地４）：陰性
（ｄ）インドールの生成（培地５）：陰性
（ｅ）硫化水素の生成（培地６）：陰性
（ｆ）デンプンの加水分解（培地７）：陽性
（ｇ）カゼインの加水分解（培地８）：陰性
（ｈ）ゼラチンの液化（培地９）：陽性
（ｉ）クエン酸の利用（培地１０）：陰性
（ｊ）カタラーゼ：陽性
（ｋ）オキシダーゼ（培地１１）：陽性
（ｌ）生育の温度範囲（培地１２）：１３−４２℃、至適範囲：２３−３８℃
（ｍ）生育のｐＨ範囲（培地１３）：ｐＨ７．６−１０．５、至適範囲：ｐＨ９−９．５
（ｎ）生育における酸素の影響（培地１４）：嫌気条件下で微弱だが生育する。
（ｏ）グルコースからのガス産生（培地１５）：陰性
（ｐ）塩化ナトリウム耐性（培地１６）：１０％塩化ナトリウム存在下で生育する。
（ｑ）馬尿酸の加水分解（培地１７）：陰性
（ｒ）４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）の加水分解（培地１８）：陰性
（ｓ）糖の利用性（培地１９）：グルコース、アラビノース、キシロース、マンニトール、ガラクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロース、フラクトース、メリビオース、リボース、サリシン、グリセロール、ソルビトール等を炭素源として生育可能である。
ラムノース、イノシトールを炭素源として利用できない。
【００１５】
培地１：ニュートリエントブロス（ディフコ）指示量、希塩酸にてｐＨを調整
培地２：ニュートリエントアガー（ディフコ）指示量、炭酸ナトリウムにてｐＨを調整
培地３：ニュートリエントブロス０．８重量％、硝酸カリウム０．１重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地４：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、グルコース０．５重量％（別滅菌）、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地５：ＳＩＭ培地（日水製薬）指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）、インドール産生試験用濾紙（日水製薬）
培地６：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地７：バクトペプトン１．５重量％、酵母エキス０．５重量％、可溶性デンプン２．０重量％、リン酸１水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地８：酵母エキス０．５重量％、グルコース２．０重量％、カゼイン０．５重量％、リン酸１水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩、０．０２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地９：ニュートリエントブロス０．８重量％、ゼラチン１．２重量％、酵母エキス０．５重量％、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地１０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩、０．０２重量％、クエン酸ナトリウム０．２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地１１：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬）
培地１２：トリプティケース ソイ ブロス（ＢＢＬ）指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地１３：トリプティケース ソイ ブロスに炭酸ナトリウムあるいは水酸化ナトリウムを別滅菌後に添加し、ｐＨを調整
培地１４：アナエロビックアガー（ディフコ）指示量、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地１５：バクトペプトン１．０重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、グルコース１．０重量％、フェノールレッド０．００２重量％、水酸化ナトリウムにてｐＨを調整
培地１６：バクトトリプトン（ディフコ）０．５重量％、酵母エキス１．５重量％、リン酸１水素カリウム０．３重量％、寒天２．０重量％、グルコース２．０重量％（別滅菌）、塩化ナトリウム０−１６重量％、炭酸ナトリウム０．５重量％（別滅菌）
培地１７：バクトトリプトン１．０重量％、肉エキス（ディフコ）０．３重量％、酵母エキス０．１重量％、グルコース０．１重量％、リン酸１水素ナトリウム０．５重量％、馬尿酸１．０重量％、炭酸ナトリウム１．０重量％（別滅菌）
培地１８：バクトトリプトース（ディフコ）２．０重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、システイン塩酸塩０．１重量％、寒天１．５重量％、ＭＵＧ１００ｐｐｍ（濾過滅菌）、炭酸ナトリウム０．３重量％（別滅菌）
培地１９：硝酸カリウム０．２重量％、リン酸１水素ナトリウム０．２重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．００５重量％、微量金属混液*０．２容量％、ビタミン混液**０．２容量％、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）０．１Ｍ、寒天０．３重量％（別滅菌）、糖類１．０重量％（濾過滅菌）
＊、＊＊；Nielsenら、Microbiology, 141, 1745-1761(1995)に準ずる。
【００１６】
以上、ＫＳＭ−Ｎ１３１株は中性培地に生育しない好アルカリ性細菌であり、且つグラム陽性、カタラーゼ陽性の有胞子桿菌であることから、好アルカリ性バチルス属細菌であると判断された。そこで本菌株の形態学、生理学的性質について、Nielsenらが新たに分類した好アルカリ性バチルス属細菌の記載（Microbiology、141、1745-1761、1995）に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス シュウドアルカロフィルスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス シュウドアルカロフィルスと完全には一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へ、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７５）として寄託した。
【００１７】
上記のＫＳＭ−Ｎ１３１株からのアルカリセルラーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行うことができる。
【００１８】
また、本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主内で複製維持が可能で、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリセルラーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175, 1995）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００１９】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないが、Bacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌；Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌；Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌が挙げられる。
【００２０】
得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリセルラーゼを採取することにより、アルカリセルラーゼを得ることができる。培養は、宿主菌又は形質転換株が資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で行なえばよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により、所望の酵素形態とすることができる。
【００２１】
【実施例】
実施例１（アルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニング）
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布した［２．０重量％カルボキシメチルセルロース（Ａ１０ＭＣ；日本製紙社製）、１．０重量％肉エキス（オキソイド社製）、１．０重量％バクトペプトン（ディフコ社製）、１．０重量％塩化ナトリウム、０．１重量％リン酸２水素カリウム、０．５重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）、０．００５重量％トリパンブルー（別滅菌）］。３０℃の培養器で３日間静置培養し、生育した菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返した。これらの菌株を、２．０重量％ポリペプトンＳ（日本製薬社製）、１．０重量％魚肉エキス（和光純薬社製）、０．１５重量％リン酸１水素カリウム、０．１重量％酵母エキス（ディフコ社製）、０．０７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．１重量％カルボキシメチルセルロース及び０．５重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る液体培地を用い、３０℃、３日間振盪培養した。アルカリセルラーゼを生産している菌株を選択し、とりわけ高アルカリ性域で強力な活性を示したセルラーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株を取得した。
【００２２】
実施例２（バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡの調製）
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養は、２．０重量％ポリペプトンＳ、０．１重量％カルボキシセルロース（Ａ１０ＭＣ）、０．１重量％酵母エキス、１重量％魚肉エキス、０．１５重量％リン酸１水素カリウム、０．０７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．５重量％グルタミン酸ナトリウム（別滅菌）及び０．５重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地を用い、３０℃、４０時間振盪（１２５ｒｐｍ）して行った。得られた培養液約３００ｍＬから遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、５℃）により菌体を回収し、この菌体から斉藤・三浦の方法によりゲノムＤＮＡを調製した。
【００２３】
実施例３（Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子断片のクローニング）
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養上清から精製したセルラーゼのアミノ末端配列を１５番目まで決定した結果、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎであった。この配列は、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｓ２３７株やバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株の生産するアルカリセルラーゼのアミノ末端配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎと極めて高い相同性を示した。そこで中間のアミノ酸配列も相同性が高い可能性があると予想し、Ｓ２３７セルラーゼのアミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を合成し、これらを用いてＮ１３１ａセルラーゼをコードする遺伝子の増幅をＰＣＲ反応により試みた。
すなわち、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１μＬ（１００ｎｇ）、プライマー１及び２各２０μＬ（１μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イオン水４０μＬを混合し、サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）にて９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし、３０サイクルの反応条件でＤＮＡの増幅を行った。得られたＰＣＲ産物（約１ｋｂ）をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により精製し、得られたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）及び３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマーバイオシステム社製）を用いて決定した。
【００２４】
実施例４（Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子のゲノムＰＣＲ法によるクローニング）実施例３で決定したＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子は不完全なものであったため、インバースＰＣＲ法により全遺伝子の取得を試みた。すなわち、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１０μＬ（８μｇ）、ＰＣＲ用緩衝液５μＬ、脱イオン水３４μＬ及びＥｃｏＲＩ１μＬ（１０単位）を混合し、３７℃、２時間３０分間制限酵素処理した。得られたゲノム分解産物を精製後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラ社製）を用いて自己閉環した（１６℃、２時間）。自己閉環したＤＮＡを精製し、インバースＰＣＲ法の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μＬ、プライマー３（配列番号７）及びプライマー４（配列番号８）各２０μＬ（１μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イオン水４０．５μＬを混合した後、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅したＤＮＡ断片（約４ｋｂ）を精製し、このうち約２ｋｂの塩基配列を決定した。この段階で完全なＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子及びその上流約５００ｂの配列は決定されたので、次に構造遺伝子下流の塩基配列決定を進め、下流約２００ｂの塩基配列を決定した。得られた塩基配列からセルラーゼ遺伝子の上流領域並びに下流領域の塩基配列を基に、プライマー５（配列番号９）及びプライマー６（配列番号１０）を合成し、バチルス エスピー Ｎ１３１株のゲノムからＰＣＲ法によりＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子を増幅した。得られた遺伝子の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した（配列番号１及び３）。
【００２５】
実施例５（形質転換枯草菌によるＮ１３１ａセルラーゼの生産）
Ｎ１３１ａセルラーゼのアミノ末端側からターミネーター下流までの遺伝子をプラスミド（ｐＨＳＰ６４）のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結し、構築した組換えプラスミドを枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換した。形質転換株を３．０重量％ポリペプトンＳ、３．０重量％マルトース、０．５重量％魚肉エキス、０．１重量％酵母エキス、０．１重量％リン酸２水素カリウム、０．０２重量％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサイクリン（７．５μｇ／ｍＬ）から成る培地（ＰＭ培地、ｐＨ６．８）にて３０℃、４８時間振盪培養を行った。遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）により得られた培養上清中のセルラーゼの活性は、約２００００Ｕ／Ｌであった。
【００２６】
実施例６（Ｎ１３１ｂセルラーゼ遺伝子のゲノムＰＣＲ法によるクローニング）Ｎ１３１ａセルラーゼのクローニングを行った際に、Ｎ１３１ａセルラーゼの配列と類似した配列がバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノム上に存在する可能性が示唆された。そこで、Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子のクローニングの際に用いた方法と同様に、Ｓ２３７セルラーゼのアミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプライマー７〜１２（配列番号１１〜１６）を合成し、ＰＣＲ法によりＮ１３１ｂセルラーゼをコードする遺伝子の増幅を行った。
すなわち、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノム溶液１μＬ（７０ｎｇ）、プライマーの組合せを各１０μＬ（０．３μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、脱イオン水６０μＬ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１μＬ（５単位）を混合し、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サイクルの反応条件でＤＮＡの増幅を行った。得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ベーリンガーマンハイム社製)を用いて精製し、３７７ＤＮＡシークンサーにより塩基配列をそれぞれ決定した。得られた遺伝子断片の塩基配列をＳ２３７セルラーゼ遺伝子と比較すると、Ｎ１３１ｂセルラーゼのアミノ末端以降をコードすると考えらるいくつかの遺伝子断片及び停止コドンとその下流域と考えられる遺伝子断片の存在が示唆された。しかし、完全な塩基配列は決定されていないこと並びに開始コドン及びその近傍の領域については遺伝子断片として取得されていなかった。
まず、アミノ末端より上流の領域をコードする遺伝子を取得するためにバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡ４μｇを各種制限酵素（Ｓａｕ３Ａ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII）により分解し、ＬＡ ＰＣＲインヴィトロクローニングキット(宝酒造)を用いてカセットと連結したものを鋳型にＰＣＲ反応［プライマー１３（配列番号１７）及びプライマー１４（配列番号１８）を使用］を行った。その結果、ＨｉｎｄIIIにより処理したサンプルについてＤＮＡの増幅が認められ、この増幅断片（約０．４ｋｂ）の塩基配列を決定した結果、Ｎ１３１ｂセルラーゼのアミノ末端より上流の領域をコードする遺伝子断片が確認された。しかし、その解析を行うと開始コドンから３４塩基下流にアンバーコドン（ＴＧＡ）が存在することが明らかになった。アンバーコドン（ＴＧＡ）に関しては、枯草菌において極くまれにトリプトファンをコードするという報告もあることから（Lovettら、J. Bacteriol.，173，1810-1812，1991）、本遺伝子においてもトリプトファンをコードする可能性が示唆された。しかし、開始コドンの上流部にはリボソーム結合部位などの翻訳開始に必要な配列が見出されず、オーカーコドン（ＴＡＡ）がいくつも存在することも明らかになった。従って、本遺伝子は細胞内で発現しない擬似遺伝子である可能性が高いと考えられた。
完全なＮ１３１ｂセルラーゼ遺伝子をコードする塩基配列を決定するためにプライマー１５（配列番号１９）及びプライマー１６（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行った。最終的に決定された塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号２及び配列番号４に示した。
【００２７】
実施例７（形質転換枯草菌によるＮ１３１ｂセルラーゼの生産）
細胞内で発現しない可能性のあるＮ１３１ｂセルラーゼを生産させる目的で、遺伝子の発現に必要な領域としてバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biochem.，56，827-877，1992）の上流発現領域を増幅した［プライマー１７（配列番号２１）及びプライマー１８（配列番号２２）を使用］。得られたＮ１３１ｂセルラーゼ遺伝子断片と上流発現領域遺伝子断片を精製し、プライマー１６（配列番号２０）及びプライマー１７（配列番号２１）を用いてリコンビナントＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行った。取得したキメラ遺伝子を精製し、制限酵素ＢｇｌIIびＨｉｎｄIIIで処理後、予め同じ制限酵素で処理しておいたプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）に連結した。得られた組換えプラスミドをプロトプラスト法により枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入し、形質転換を行った。形質転換株をＰＭ培地（テトラサイクリンは１５μｇ／ｍＬとした）中で３０℃、７２時間振盪培養した。遠心分離により得られた培養上清中のセルラーゼの活性は、約３３０００Ｕ／Ｌであった。
【００２８】
［酵素活性測定法］
０．２ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５重量％カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙社製）及び０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に、適当に希釈した０．１ｍＬの酵素液を加えて２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５重量％ジニトロサリチル酸、３０重量％ロッシェル塩、１．６重量％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え、５３５ｎｍにおける吸光度を測定して還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００２９】
参考例１（Ｎ１３１ａセルラーゼの最適反応ｐＨ）
クエン酸緩衝液（ｐＨ４−７）、リン酸緩衝液（ｐＨ６−８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８−１１）、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２−１２．５）の各緩衝液（１００ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、Ｎ１３１ａセルラーゼはｐＨ９−９．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上の活性を有していた（図１）。
【００３０】
参考例２（Ｎ１３１ｂセルラーゼの最適反応ｐＨ）
参考例１と同様にしてＮ１３１ｂセルラーゼの最適反応ｐＨを調べた結果、ｐＨ９−９．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上の活性を有していた（図２）。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いれば、衣料用洗剤、繊維処理剤等として有用なアルカリセルラーゼを単一且つ大量に生産することが可能である。
【００３２】
【配列表】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアルカリセルラーゼ（Ｎ１３１ａ）活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２】本発明のアルカリセルラーゼ（Ｎ１３１ｂ）活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤用酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは植物細胞壁の主成分で、衣料、紙、建築材料等に有効利用されるバイオマスの代表的存在である。セルロースはグルコースが直鎖状にβ−１，４結合した巨大分子であるため、分解によって燃料物質やより高付加価値の代謝物質に変換が可能である。そのためセルロースを分解する酵素として、セルラーゼ及びその反応産物の有効利用に関する研究が多岐に行われている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般に、中酸性に最適反応ｐＨを有し、結晶性セルロースを良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心となっている。
【０００３】
一方、掘越（特公昭５０−２８５１５号公報、Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以来、セルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となった。その後、実際に好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（特公昭６０−２３１５８号公報、特公平６−０３０５７８号公報、米国特許第４９４５０５３号等）が衣料用洗剤へ配合されるに至った。これ以降、真菌類由来のセルラーゼ配合洗剤も上市されるようになり、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼと並ぶ洗剤用酵素としての地位を確立してきた。
【０００４】
さらに近年、遺伝子工学の発展に伴い、洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっている。アルカリセルラーゼについても既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、実生産に用いられている例もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、洗剤用酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子及びその遺伝子を用いた大量かつ単一のアルカリセルラーゼを製造する方法を確立することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、自然界からアルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリセルラーゼをコードする遺伝子をクローン化することにより、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするアルカリセルラーゼ遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、配列番号４に示す塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するアルカリセルラーゼ遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、上記のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記の形質転換体を培養することを特徴とするアルカリセルラーゼの製造法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子は、配列番号１若しくは２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする配列を有する。アルカリセルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがある）は特に制限されない。また、配列番号１又は２に示した成熟酵素のアミノ酸配列におけるアミノ末端には、１〜数個のアミノ酸が付加、欠失、置換していてもよい。
【０００９】
本発明の配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｎ１３１ａセルラーゼと表記する）のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列との相同性を比較すると、Bacillus sp. No.1139株の生産するセルラーゼ（Fukumoriら、J. Gen. Microbiol., 131, 3339-3345, 1985）との相同性は８１．９％であり、Bacillus sp. KSM-64株由来のセルラーゼ（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）との相同性は８３．６％、Bacillus sp. KSM-S237株が生産するセルラーゼ（特願平１１−０１３０４９号）との相同性は８６．７％であり、本発明の遺伝子からコードされるＮ１３１ａセルラーゼと最も高い相同性を示したが、完全に一致するものではなかった。このことは、Ｎ１３１ａセルラーゼが新規なアルカリセルラーゼであることを示唆するものであり、従って配列番号１に示したアミノ酸配列と最大８７％以上の相同性を有するセルラーゼは本発明に含まれる。
【００１０】
次に、本発明の配列番号２に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｎ１３１ｂセルラーゼと表記する）のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列との相同性を比較すると、上記のＮ１３１ａセルラーゼとの相同性は８３．６％、Bacillus sp. No.1139株の生産するセルラーゼとの相同性は８８．０％、Bacillus sp. KSM-64株由来のセルラーゼとの相同性は９０．９％であった。さらに、Bacillus sp. KSM-S237株が生産するセルラーゼとの相同性が９４．７％と本発明の遺伝子からコードされるＮ１３１ｂと最も高い相同性を示した。このことは、Ｎ１３１ｂセルラーゼが従来公知のセルラーゼとは完全に一致するものではなく、新規な酵素であることを示唆するものであり、従って配列番号２に示したアミノ酸配列と最大９５％以上の相同性を有するセルラーゼは本発明に含まれる。
尚、相同性の検索はＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＣＤバイオデータソフトウェア［ソフトウェア開発社製、ｖｅｒ．３６］を用いたマキシマムマッチング法にて行った。
【００１１】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、配列番号１若しくは２に示すアミノ酸配列又はその変異体をコードするものであればよいが、配列番号３若しくは４で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。
【００１２】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、バチルス属に属する微生物、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株等からクローン化することができる。
〔バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の菌学的性質〕
Ａ. 形態学的性質；
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．６〜０．８×２．８〜７．２μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、０．７〜１．０×１．０〜１．８μｍ、中央準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：陽性
（ｆ）抗酸性：陰性
【００１３】
Ｂ. 培養学的性質；
（ａ）一般細菌用液体培地（ｐＨ５．７、培地１）：生育せず
（ｂ）一般細菌用液体培地（ｐＨ６．８、培地１）：生育せず
（ｃ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ６．５、培地２）：生育せず
（ｄ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ８．５、培地２）：生育する
【００１４】
Ｃ. 生理学的性質；
（ａ）硝酸塩の還元（培地３）：陽性
（ｂ）脱窒反応（培地３）：陰性
（ｃ）ＶＰテスト（培地４）：陰性
（ｄ）インドールの生成（培地５）：陰性
（ｅ）硫化水素の生成（培地６）：陰性
（ｆ）デンプンの加水分解（培地７）：陽性
（ｇ）カゼインの加水分解（培地８）：陰性
（ｈ）ゼラチンの液化（培地９）：陽性
（ｉ）クエン酸の利用（培地１０）：陰性
（ｊ）カタラーゼ：陽性
（ｋ）オキシダーゼ（培地１１）：陽性
（ｌ）生育の温度範囲（培地１２）：１３−４２℃、至適範囲：２３−３８℃
（ｍ）生育のｐＨ範囲（培地１３）：ｐＨ７．６−１０．５、至適範囲：ｐＨ９−９．５
（ｎ）生育における酸素の影響（培地１４）：嫌気条件下で微弱だが生育する。
（ｏ）グルコースからのガス産生（培地１５）：陰性
（ｐ）塩化ナトリウム耐性（培地１６）：１０％塩化ナトリウム存在下で生育する。
（ｑ）馬尿酸の加水分解（培地１７）：陰性
（ｒ）４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）の加水分解（培地１８）：陰性
（ｓ）糖の利用性（培地１９）：グルコース、アラビノース、キシロース、マンニトール、ガラクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロース、フラクトース、メリビオース、リボース、サリシン、グリセロール、ソルビトール等を炭素源として生育可能である。
ラムノース、イノシトールを炭素源として利用できない。
【００１５】
培地１：ニュートリエントブロス（ディフコ）指示量、希塩酸にてｐＨを調整
培地２：ニュートリエントアガー（ディフコ）指示量、炭酸ナトリウムにてｐＨを調整
培地３：ニュートリエントブロス０．８重量％、硝酸カリウム０．１重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地４：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、グルコース０．５重量％（別滅菌）、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地５：ＳＩＭ培地（日水製薬）指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）、インドール産生試験用濾紙（日水製薬）
培地６：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地７：バクトペプトン１．５重量％、酵母エキス０．５重量％、可溶性デンプン２．０重量％、リン酸１水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地８：酵母エキス０．５重量％、グルコース２．０重量％、カゼイン０．５重量％、リン酸１水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩、０．０２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地９：ニュートリエントブロス０．８重量％、ゼラチン１．２重量％、酵母エキス０．５重量％、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地１０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩、０．０２重量％、クエン酸ナトリウム０．２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地１１：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬）
培地１２：トリプティケース ソイ ブロス（ＢＢＬ）指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌）
培地１３：トリプティケース ソイ ブロスに炭酸ナトリウムあるいは水酸化ナトリウムを別滅菌後に添加し、ｐＨを調整
培地１４：アナエロビックアガー（ディフコ）指示量、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌）
培地１５：バクトペプトン１．０重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、グルコース１．０重量％、フェノールレッド０．００２重量％、水酸化ナトリウムにてｐＨを調整
培地１６：バクトトリプトン（ディフコ）０．５重量％、酵母エキス１．５重量％、リン酸１水素カリウム０．３重量％、寒天２．０重量％、グルコース２．０重量％（別滅菌）、塩化ナトリウム０−１６重量％、炭酸ナトリウム０．５重量％（別滅菌）
培地１７：バクトトリプトン１．０重量％、肉エキス（ディフコ）０．３重量％、酵母エキス０．１重量％、グルコース０．１重量％、リン酸１水素ナトリウム０．５重量％、馬尿酸１．０重量％、炭酸ナトリウム１．０重量％（別滅菌）
培地１８：バクトトリプトース（ディフコ）２．０重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、システイン塩酸塩０．１重量％、寒天１．５重量％、ＭＵＧ１００ｐｐｍ（濾過滅菌）、炭酸ナトリウム０．３重量％（別滅菌）
培地１９：硝酸カリウム０．２重量％、リン酸１水素ナトリウム０．２重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．００５重量％、微量金属混液*０．２容量％、ビタミン混液**０．２容量％、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）０．１Ｍ、寒天０．３重量％（別滅菌）、糖類１．０重量％（濾過滅菌）
＊、＊＊；Nielsenら、Microbiology, 141, 1745-1761(1995)に準ずる。
【００１６】
以上、ＫＳＭ−Ｎ１３１株は中性培地に生育しない好アルカリ性細菌であり、且つグラム陽性、カタラーゼ陽性の有胞子桿菌であることから、好アルカリ性バチルス属細菌であると判断された。そこで本菌株の形態学、生理学的性質について、Nielsenらが新たに分類した好アルカリ性バチルス属細菌の記載（Microbiology、141、1745-1761、1995）に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス シュウドアルカロフィルスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス シュウドアルカロフィルスと完全には一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へ、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７５）として寄託した。
【００１７】
上記のＫＳＭ−Ｎ１３１株からのアルカリセルラーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行うことができる。
【００１８】
また、本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主内で複製維持が可能で、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリセルラーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175, 1995）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００１９】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないが、Bacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌；Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌；Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌が挙げられる。
【００２０】
得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリセルラーゼを採取することにより、アルカリセルラーゼを得ることができる。培養は、宿主菌又は形質転換株が資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で行なえばよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により、所望の酵素形態とすることができる。
【００２１】
【実施例】
実施例１（アルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニング）
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布した［２．０重量％カルボキシメチルセルロース（Ａ１０ＭＣ；日本製紙社製）、１．０重量％肉エキス（オキソイド社製）、１．０重量％バクトペプトン（ディフコ社製）、１．０重量％塩化ナトリウム、０．１重量％リン酸２水素カリウム、０．５重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）、０．００５重量％トリパンブルー（別滅菌）］。３０℃の培養器で３日間静置培養し、生育した菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返した。これらの菌株を、２．０重量％ポリペプトンＳ（日本製薬社製）、１．０重量％魚肉エキス（和光純薬社製）、０．１５重量％リン酸１水素カリウム、０．１重量％酵母エキス（ディフコ社製）、０．０７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．１重量％カルボキシメチルセルロース及び０．５重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る液体培地を用い、３０℃、３日間振盪培養した。アルカリセルラーゼを生産している菌株を選択し、とりわけ高アルカリ性域で強力な活性を示したセルラーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株を取得した。
【００２２】
実施例２（バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡの調製）
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養は、２．０重量％ポリペプトンＳ、０．１重量％カルボキシセルロース（Ａ１０ＭＣ）、０．１重量％酵母エキス、１重量％魚肉エキス、０．１５重量％リン酸１水素カリウム、０．０７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．５重量％グルタミン酸ナトリウム（別滅菌）及び０．５重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地を用い、３０℃、４０時間振盪（１２５ｒｐｍ）して行った。得られた培養液約３００ｍＬから遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、５℃）により菌体を回収し、この菌体から斉藤・三浦の方法によりゲノムＤＮＡを調製した。
【００２３】
実施例３（Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子断片のクローニング）
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養上清から精製したセルラーゼのアミノ末端配列を１５番目まで決定した結果、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎであった。この配列は、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｓ２３７株やバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株の生産するアルカリセルラーゼのアミノ末端配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎと極めて高い相同性を示した。そこで中間のアミノ酸配列も相同性が高い可能性があると予想し、Ｓ２３７セルラーゼのアミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を合成し、これらを用いてＮ１３１ａセルラーゼをコードする遺伝子の増幅をＰＣＲ反応により試みた。
すなわち、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１μＬ（１００ｎｇ）、プライマー１及び２各２０μＬ（１μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イオン水４０μＬを混合し、サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）にて９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし、３０サイクルの反応条件でＤＮＡの増幅を行った。得られたＰＣＲ産物（約１ｋｂ）をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により精製し、得られたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）及び３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマーバイオシステム社製）を用いて決定した。
【００２４】
実施例４（Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子のゲノムＰＣＲ法によるクローニング）実施例３で決定したＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子は不完全なものであったため、インバースＰＣＲ法により全遺伝子の取得を試みた。すなわち、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１０μＬ（８μｇ）、ＰＣＲ用緩衝液５μＬ、脱イオン水３４μＬ及びＥｃｏＲＩ１μＬ（１０単位）を混合し、３７℃、２時間３０分間制限酵素処理した。得られたゲノム分解産物を精製後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラ社製）を用いて自己閉環した（１６℃、２時間）。自己閉環したＤＮＡを精製し、インバースＰＣＲ法の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μＬ、プライマー３（配列番号７）及びプライマー４（配列番号８）各２０μＬ（１μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イオン水４０．５μＬを混合した後、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅したＤＮＡ断片（約４ｋｂ）を精製し、このうち約２ｋｂの塩基配列を決定した。この段階で完全なＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子及びその上流約５００ｂの配列は決定されたので、次に構造遺伝子下流の塩基配列決定を進め、下流約２００ｂの塩基配列を決定した。得られた塩基配列からセルラーゼ遺伝子の上流領域並びに下流領域の塩基配列を基に、プライマー５（配列番号９）及びプライマー６（配列番号１０）を合成し、バチルス エスピー Ｎ１３１株のゲノムからＰＣＲ法によりＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子を増幅した。得られた遺伝子の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した（配列番号１及び３）。
【００２５】
実施例５（形質転換枯草菌によるＮ１３１ａセルラーゼの生産）
Ｎ１３１ａセルラーゼのアミノ末端側からターミネーター下流までの遺伝子をプラスミド（ｐＨＳＰ６４）のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結し、構築した組換えプラスミドを枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換した。形質転換株を３．０重量％ポリペプトンＳ、３．０重量％マルトース、０．５重量％魚肉エキス、０．１重量％酵母エキス、０．１重量％リン酸２水素カリウム、０．０２重量％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサイクリン（７．５μｇ／ｍＬ）から成る培地（ＰＭ培地、ｐＨ６．８）にて３０℃、４８時間振盪培養を行った。遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）により得られた培養上清中のセルラーゼの活性は、約２００００Ｕ／Ｌであった。
【００２６】
実施例６（Ｎ１３１ｂセルラーゼ遺伝子のゲノムＰＣＲ法によるクローニング）Ｎ１３１ａセルラーゼのクローニングを行った際に、Ｎ１３１ａセルラーゼの配列と類似した配列がバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノム上に存在する可能性が示唆された。そこで、Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子のクローニングの際に用いた方法と同様に、Ｓ２３７セルラーゼのアミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプライマー７〜１２（配列番号１１〜１６）を合成し、ＰＣＲ法によりＮ１３１ｂセルラーゼをコードする遺伝子の増幅を行った。
すなわち、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノム溶液１μＬ（７０ｎｇ）、プライマーの組合せを各１０μＬ（０．３μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、脱イオン水６０μＬ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１μＬ（５単位）を混合し、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サイクルの反応条件でＤＮＡの増幅を行った。得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ベーリンガーマンハイム社製)を用いて精製し、３７７ＤＮＡシークンサーにより塩基配列をそれぞれ決定した。得られた遺伝子断片の塩基配列をＳ２３７セルラーゼ遺伝子と比較すると、Ｎ１３１ｂセルラーゼのアミノ末端以降をコードすると考えらるいくつかの遺伝子断片及び停止コドンとその下流域と考えられる遺伝子断片の存在が示唆された。しかし、完全な塩基配列は決定されていないこと並びに開始コドン及びその近傍の領域については遺伝子断片として取得されていなかった。
まず、アミノ末端より上流の領域をコードする遺伝子を取得するためにバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡ４μｇを各種制限酵素（Ｓａｕ３Ａ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII）により分解し、ＬＡ ＰＣＲインヴィトロクローニングキット(宝酒造)を用いてカセットと連結したものを鋳型にＰＣＲ反応［プライマー１３（配列番号１７）及びプライマー１４（配列番号１８）を使用］を行った。その結果、ＨｉｎｄIIIにより処理したサンプルについてＤＮＡの増幅が認められ、この増幅断片（約０．４ｋｂ）の塩基配列を決定した結果、Ｎ１３１ｂセルラーゼのアミノ末端より上流の領域をコードする遺伝子断片が確認された。しかし、その解析を行うと開始コドンから３４塩基下流にアンバーコドン（ＴＧＡ）が存在することが明らかになった。アンバーコドン（ＴＧＡ）に関しては、枯草菌において極くまれにトリプトファンをコードするという報告もあることから（Lovettら、J. Bacteriol.，173，1810-1812，1991）、本遺伝子においてもトリプトファンをコードする可能性が示唆された。しかし、開始コドンの上流部にはリボソーム結合部位などの翻訳開始に必要な配列が見出されず、オーカーコドン（ＴＡＡ）がいくつも存在することも明らかになった。従って、本遺伝子は細胞内で発現しない擬似遺伝子である可能性が高いと考えられた。
完全なＮ１３１ｂセルラーゼ遺伝子をコードする塩基配列を決定するためにプライマー１５（配列番号１９）及びプライマー１６（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行った。最終的に決定された塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号２及び配列番号４に示した。
【００２７】
実施例７（形質転換枯草菌によるＮ１３１ｂセルラーゼの生産）
細胞内で発現しない可能性のあるＮ１３１ｂセルラーゼを生産させる目的で、遺伝子の発現に必要な領域としてバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biochem.，56，827-877，1992）の上流発現領域を増幅した［プライマー１７（配列番号２１）及びプライマー１８（配列番号２２）を使用］。得られたＮ１３１ｂセルラーゼ遺伝子断片と上流発現領域遺伝子断片を精製し、プライマー１６（配列番号２０）及びプライマー１７（配列番号２１）を用いてリコンビナントＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行った。取得したキメラ遺伝子を精製し、制限酵素ＢｇｌIIびＨｉｎｄIIIで処理後、予め同じ制限酵素で処理しておいたプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）に連結した。得られた組換えプラスミドをプロトプラスト法により枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入し、形質転換を行った。形質転換株をＰＭ培地（テトラサイクリンは１５μｇ／ｍＬとした）中で３０℃、７２時間振盪培養した。遠心分離により得られた培養上清中のセルラーゼの活性は、約３３０００Ｕ／Ｌであった。
【００２８】
［酵素活性測定法］
０．２ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５重量％カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙社製）及び０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に、適当に希釈した０．１ｍＬの酵素液を加えて２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５重量％ジニトロサリチル酸、３０重量％ロッシェル塩、１．６重量％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え、５３５ｎｍにおける吸光度を測定して還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００２９】
参考例１（Ｎ１３１ａセルラーゼの最適反応ｐＨ）
クエン酸緩衝液（ｐＨ４−７）、リン酸緩衝液（ｐＨ６−８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８−１１）、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２−１２．５）の各緩衝液（１００ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、Ｎ１３１ａセルラーゼはｐＨ９−９．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上の活性を有していた（図１）。
【００３０】
参考例２（Ｎ１３１ｂセルラーゼの最適反応ｐＨ）
参考例１と同様にしてＮ１３１ｂセルラーゼの最適反応ｐＨを調べた結果、ｐＨ９−９．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上の活性を有していた（図２）。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いれば、衣料用洗剤、繊維処理剤等として有用なアルカリセルラーゼを単一且つ大量に生産することが可能である。
【００３２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアルカリセルラーゼ（Ｎ１３１ａ）活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２】本発明のアルカリセルラーゼ（Ｎ１３１ｂ）活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
Claims (6)
- 配列番号２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするアルカリセルラーゼ遺伝子。
- 配列番号４に示す塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基酸配列を有するアルカリセルラーゼ遺伝子。
- 請求項１又は２記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 宿主が微生物である請求項４記載の形質転換体。
- 請求項４又は５に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアルカリセルラーゼの製造法。
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