JP2001231569A - アルカリセルラーゼ遺伝子 - Google Patents
アルカリセルラーゼ遺伝子Info
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- JP2001231569A JP2001231569A JP2000047237A JP2000047237A JP2001231569A JP 2001231569 A JP2001231569 A JP 2001231569A JP 2000047237 A JP2000047237 A JP 2000047237A JP 2000047237 A JP2000047237 A JP 2000047237A JP 2001231569 A JP2001231569 A JP 2001231569A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 特定の配列を有する２種類のアミノ酸配
列のいずれか、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
をコードするアルカリセルラーゼ遺伝子、組換えベクタ
ー及び形質転換体。 【効果】 この遺伝子を用いて衣料用洗剤、繊維処理剤
等として有用なアルカリセルラーゼを単一且つ大量に生
産することが可能である。
列のいずれか、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
をコードするアルカリセルラーゼ遺伝子、組換えベクタ
ー及び形質転換体。 【効果】 この遺伝子を用いて衣料用洗剤、繊維処理剤
等として有用なアルカリセルラーゼを単一且つ大量に生
産することが可能である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、洗剤用酵素として
有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子に関す
る。
有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】セルロースは植物細胞壁の主成分で、衣
料、紙、建築材料等に有効利用されるバイオマスの代表
的存在である。セルロースはグルコースが直鎖状にβ−
１，４結合した巨大分子であるため、分解によって燃料
物質やより高付加価値の代謝物質に変換が可能である。
そのためセルロースを分解する酵素として、セルラーゼ
及びその反応産物の有効利用に関する研究が多岐に行わ
れている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般
に、中酸性に最適反応ｐＨを有し、結晶性セルロースを
良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心
となっている。
料、紙、建築材料等に有効利用されるバイオマスの代表
的存在である。セルロースはグルコースが直鎖状にβ−
１，４結合した巨大分子であるため、分解によって燃料
物質やより高付加価値の代謝物質に変換が可能である。
そのためセルロースを分解する酵素として、セルラーゼ
及びその反応産物の有効利用に関する研究が多岐に行わ
れている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般
に、中酸性に最適反応ｐＨを有し、結晶性セルロースを
良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心
となっている。
【０００３】一方、掘越（特公昭５０−２８５１５号公
報、Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganism
s, Springer, Berlin, 1982）によって好アルカリ性バ
チルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以
来、セルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となっ
た。その後、実際に好アルカリ性バチルス属細菌の生産
するアルカリセルラーゼ（特公昭６０−２３１５８号公
報、特公平６−０３０５７８号公報、米国特許第４９４
５０５３号等）が衣料用洗剤へ配合されるに至った。こ
れ以降、真菌類由来のセルラーゼ配合洗剤も上市される
ようになり、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼと並
ぶ洗剤用酵素としての地位を確立してきた。
報、Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganism
s, Springer, Berlin, 1982）によって好アルカリ性バ
チルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以
来、セルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となっ
た。その後、実際に好アルカリ性バチルス属細菌の生産
するアルカリセルラーゼ（特公昭６０−２３１５８号公
報、特公平６−０３０５７８号公報、米国特許第４９４
５０５３号等）が衣料用洗剤へ配合されるに至った。こ
れ以降、真菌類由来のセルラーゼ配合洗剤も上市される
ようになり、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼと並
ぶ洗剤用酵素としての地位を確立してきた。
【０００４】さらに近年、遺伝子工学の発展に伴い、洗
剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるよ
うになっている。アルカリセルラーゼについても既に数
多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定が
なされ、実生産に用いられている例もある。
剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるよ
うになっている。アルカリセルラーゼについても既に数
多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定が
なされ、実生産に用いられている例もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、洗剤
用酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺
伝子及びその遺伝子を用いた大量かつ単一のアルカリセ
ルラーゼを製造する方法を確立することにある。
用酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺
伝子及びその遺伝子を用いた大量かつ単一のアルカリセ
ルラーゼを製造する方法を確立することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、自然界か
らアルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニングを行った
ところ、目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さ
らに当該微生物からアルカリセルラーゼをコードする遺
伝子をクローン化することにより、本発明を完成した。
らアルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニングを行った
ところ、目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さ
らに当該微生物からアルカリセルラーゼをコードする遺
伝子をクローン化することにより、本発明を完成した。
【０００７】本発明は、配列番号１若しくは２に示すア
ミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
コードするアルカリセルラーゼ遺伝子を提供するもので
ある。また、本発明は、配列番号３若しくは４に示す塩
基配列、又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠
失、置換若しくは付加された塩基配列を有するアルカリ
セルラーゼ遺伝子を提供するものである。また、本発明
は、上記のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベク
ター、及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供す
るものである。また、本発明は、上記の形質転換体を培
養することを特徴とするアルカリセルラーゼの製造法を
提供するものである。
ミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
コードするアルカリセルラーゼ遺伝子を提供するもので
ある。また、本発明は、配列番号３若しくは４に示す塩
基配列、又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠
失、置換若しくは付加された塩基配列を有するアルカリ
セルラーゼ遺伝子を提供するものである。また、本発明
は、上記のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベク
ター、及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供す
るものである。また、本発明は、上記の形質転換体を培
養することを特徴とするアルカリセルラーゼの製造法を
提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の遺伝子は、配列番号１若
しくは２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列をコードする配列を有する。アルカリセ
ルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中のアミ
ノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがあ
る）は特に制限されない。また、配列番号１又は２に示
した成熟酵素のアミノ酸配列におけるアミノ末端には、
１〜数個のアミノ酸が付加、欠失、置換していてもよ
い。
しくは２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列をコードする配列を有する。アルカリセ
ルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中のアミ
ノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがあ
る）は特に制限されない。また、配列番号１又は２に示
した成熟酵素のアミノ酸配列におけるアミノ末端には、
１〜数個のアミノ酸が付加、欠失、置換していてもよ
い。
【０００９】本発明の配列番号１に示すアルカリセルラ
ーゼ（以下、Ｎ１３１ａセルラーゼと表記する）のアミ
ノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列との相
同性を比較すると、Bacillus sp. No.1139株の生産する
セルラーゼ（Fukumoriら、J.Gen. Microbiol., 131, 33
39-3345, 1985）との相同性は８１．９％であり、Bacil
lus sp. KSM-64株由来のセルラーゼ（Sumitomoら、Bios
ci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）との
相同性は８３．６％、Bacillus sp. KSM-S237株が生産
するセルラーゼ（特願平１１−０１３０４９号）との相
同性は８６．７％であり、本発明の遺伝子からコードさ
れるＮ１３１ａセルラーゼと最も高い相同性を示した
が、完全に一致するものではなかった。このことは、Ｎ
１３１ａセルラーゼが新規なアルカリセルラーゼである
ことを示唆するものであり、従って配列番号１に示した
アミノ酸配列と最大８７％以上の相同性を有するセルラ
ーゼは本発明に含まれる。
ーゼ（以下、Ｎ１３１ａセルラーゼと表記する）のアミ
ノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列との相
同性を比較すると、Bacillus sp. No.1139株の生産する
セルラーゼ（Fukumoriら、J.Gen. Microbiol., 131, 33
39-3345, 1985）との相同性は８１．９％であり、Bacil
lus sp. KSM-64株由来のセルラーゼ（Sumitomoら、Bios
ci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）との
相同性は８３．６％、Bacillus sp. KSM-S237株が生産
するセルラーゼ（特願平１１−０１３０４９号）との相
同性は８６．７％であり、本発明の遺伝子からコードさ
れるＮ１３１ａセルラーゼと最も高い相同性を示した
が、完全に一致するものではなかった。このことは、Ｎ
１３１ａセルラーゼが新規なアルカリセルラーゼである
ことを示唆するものであり、従って配列番号１に示した
アミノ酸配列と最大８７％以上の相同性を有するセルラ
ーゼは本発明に含まれる。
【００１０】次に、本発明の配列番号２に示すアルカリ
セルラーゼ（以下、Ｎ１３１ｂセルラーゼと表記する）
のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列
との相同性を比較すると、上記のＮ１３１ａセルラーゼ
との相同性は８３．６％、Bacillus sp. No.1139株の生
産するセルラーゼとの相同性は８８．０％、Bacilluss
p. KSM-64株由来のセルラーゼとの相同性は９０．９％
であった。さらに、Bacillus sp. KSM-S237株が生産す
るセルラーゼとの相同性が９４．７％と本発明の遺伝子
からコードされるＮ１３１ｂと最も高い相同性を示し
た。このことは、Ｎ１３１ｂセルラーゼが従来公知のセ
ルラーゼとは完全に一致するものではなく、新規な酵素
であることを示唆するものであり、従って配列番号２に
示したアミノ酸配列と最大９５％以上の相同性を有する
セルラーゼは本発明に含まれる。尚、相同性の検索はＧ
ＥＮＥＮＴＹＸ−ＣＤバイオデータソフトウェア［ソフ
トウェア開発社製、ｖｅｒ．３６］を用いたマキシマム
マッチング法にて行った。
セルラーゼ（以下、Ｎ１３１ｂセルラーゼと表記する）
のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列
との相同性を比較すると、上記のＮ１３１ａセルラーゼ
との相同性は８３．６％、Bacillus sp. No.1139株の生
産するセルラーゼとの相同性は８８．０％、Bacilluss
p. KSM-64株由来のセルラーゼとの相同性は９０．９％
であった。さらに、Bacillus sp. KSM-S237株が生産す
るセルラーゼとの相同性が９４．７％と本発明の遺伝子
からコードされるＮ１３１ｂと最も高い相同性を示し
た。このことは、Ｎ１３１ｂセルラーゼが従来公知のセ
ルラーゼとは完全に一致するものではなく、新規な酵素
であることを示唆するものであり、従って配列番号２に
示したアミノ酸配列と最大９５％以上の相同性を有する
セルラーゼは本発明に含まれる。尚、相同性の検索はＧ
ＥＮＥＮＴＹＸ−ＣＤバイオデータソフトウェア［ソフ
トウェア開発社製、ｖｅｒ．３６］を用いたマキシマム
マッチング法にて行った。
【００１１】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、配
列番号１若しくは２に示すアミノ酸配列又はその変異体
をコードするものであればよいが、配列番号３若しくは
４で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは数
個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有
するものが好ましい。
列番号１若しくは２に示すアミノ酸配列又はその変異体
をコードするものであればよいが、配列番号３若しくは
４で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは数
個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有
するものが好ましい。
【００１２】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、バ
チルス属に属する微生物、例えば下記の菌学的性質を有
するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株等からク
ローン化することができる。 〔バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の菌学的性
質〕 Ａ. 形態学的性質； （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．６〜０．８×
２．８〜７．２μｍ） （ｂ）多形性：無し （ｃ）運動性：有り （ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、
０．７〜１．０×１．０〜１．８μｍ、中央準端、膨潤
有り （ｅ）グラム染色：陽性 （ｆ）抗酸性：陰性
チルス属に属する微生物、例えば下記の菌学的性質を有
するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株等からク
ローン化することができる。 〔バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の菌学的性
質〕 Ａ. 形態学的性質； （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．６〜０．８×
２．８〜７．２μｍ） （ｂ）多形性：無し （ｃ）運動性：有り （ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、
０．７〜１．０×１．０〜１．８μｍ、中央準端、膨潤
有り （ｅ）グラム染色：陽性 （ｆ）抗酸性：陰性
【００１３】Ｂ. 培養学的性質； （ａ）一般細菌用液体培地（ｐＨ５．７、培地１）：生
育せず （ｂ）一般細菌用液体培地（ｐＨ６．８、培地１）：生
育せず （ｃ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ６．５、培地２）：生
育せず （ｄ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ８．５、培地２）：生
育する
育せず （ｂ）一般細菌用液体培地（ｐＨ６．８、培地１）：生
育せず （ｃ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ６．５、培地２）：生
育せず （ｄ）一般細菌用寒天培地（ｐＨ８．５、培地２）：生
育する
【００１４】Ｃ. 生理学的性質； （ａ）硝酸塩の還元（培地３）：陽性 （ｂ）脱窒反応（培地３）：陰性 （ｃ）ＶＰテスト（培地４）：陰性 （ｄ）インドールの生成（培地５）：陰性 （ｅ）硫化水素の生成（培地６）：陰性 （ｆ）デンプンの加水分解（培地７）：陽性 （ｇ）カゼインの加水分解（培地８）：陰性 （ｈ）ゼラチンの液化（培地９）：陽性 （ｉ）クエン酸の利用（培地１０）：陰性 （ｊ）カタラーゼ：陽性 （ｋ）オキシダーゼ（培地１１）：陽性 （ｌ）生育の温度範囲（培地１２）：１３−４２℃、至
適範囲：２３−３８℃ （ｍ）生育のｐＨ範囲（培地１３）：ｐＨ７．６−１
０．５、至適範囲：ｐＨ９−９．５ （ｎ）生育における酸素の影響（培地１４）：嫌気条件
下で微弱だが生育する。 （ｏ）グルコースからのガス産生（培地１５）：陰性 （ｐ）塩化ナトリウム耐性（培地１６）：１０％塩化ナ
トリウム存在下で生育する。 （ｑ）馬尿酸の加水分解（培地１７）：陰性 （ｒ）４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロ
ニド（ＭＵＧ）の加水分解（培地１８）：陰性 （ｓ）糖の利用性（培地１９）：グルコース、アラビノ
ース、キシロース、マンニトール、ガラクトース、シュ
ークロース、マンノース、マルトース、ラクトース、ト
レハロース、フラクトース、メリビオース、リボース、
サリシン、グリセロール、ソルビトール等を炭素源とし
て生育可能である。ラムノース、イノシトールを炭素源
として利用できない。
適範囲：２３−３８℃ （ｍ）生育のｐＨ範囲（培地１３）：ｐＨ７．６−１
０．５、至適範囲：ｐＨ９−９．５ （ｎ）生育における酸素の影響（培地１４）：嫌気条件
下で微弱だが生育する。 （ｏ）グルコースからのガス産生（培地１５）：陰性 （ｐ）塩化ナトリウム耐性（培地１６）：１０％塩化ナ
トリウム存在下で生育する。 （ｑ）馬尿酸の加水分解（培地１７）：陰性 （ｒ）４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロ
ニド（ＭＵＧ）の加水分解（培地１８）：陰性 （ｓ）糖の利用性（培地１９）：グルコース、アラビノ
ース、キシロース、マンニトール、ガラクトース、シュ
ークロース、マンノース、マルトース、ラクトース、ト
レハロース、フラクトース、メリビオース、リボース、
サリシン、グリセロール、ソルビトール等を炭素源とし
て生育可能である。ラムノース、イノシトールを炭素源
として利用できない。
【００１５】培地１：ニュートリエントブロス（ディフ
コ）指示量、希塩酸にてｐＨを調整 培地２：ニュートリエントアガー（ディフコ）指示量、
炭酸ナトリウムにてｐＨを調整 培地３：ニュートリエントブロス０．８重量％、硝酸カ
リウム０．１重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別
滅菌） 培地４：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、塩
化ナトリウム０．５重量％、グルコース０．５重量％
（別滅菌）、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌） 培地５：ＳＩＭ培地（日水製薬）指示量、炭酸ナトリウ
ム０．１重量％（別滅菌）、インドール産生試験用濾紙
（日水製薬） 培地６：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）指示量、炭酸ナト
リウム０．１重量％（別滅菌） 培地７：バクトペプトン１．５重量％、酵母エキス０．
５重量％、可溶性デンプン２．０重量％、リン酸１水素
カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０
２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．２重
量％（別滅菌） 培地８：酵母エキス０．５重量％、グルコース２．０重
量％、カゼイン０．５重量％、リン酸１水素カリウム
０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩、０．０２重量
％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％
（別滅菌） 培地９：ニュートリエントブロス０．８重量％、ゼラチ
ン１．２重量％、酵母エキス０．５重量％、炭酸ナトリ
ウム０．２重量％（別滅菌） 培地１０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、リ
ン酸２水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７
水塩、０．０２重量％、クエン酸ナトリウム０．２重量
％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％
（別滅菌） 培地１１：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製
薬） 培地１２：トリプティケース ソイ ブロス（ＢＢＬ）
指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌） 培地１３：トリプティケース ソイ ブロスに炭酸ナト
リウムあるいは水酸化ナトリウムを別滅菌後に添加し、
ｐＨを調整 培地１４：アナエロビックアガー（ディフコ）指示量、
炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌） 培地１５：バクトペプトン１．０重量％、塩化ナトリウ
ム０．５重量％、グルコース１．０重量％、フェノール
レッド０．００２重量％、水酸化ナトリウムにてｐＨを
調整 培地１６：バクトトリプトン（ディフコ）０．５重量
％、酵母エキス１．５重量％、リン酸１水素カリウム
０．３重量％、寒天２．０重量％、グルコース２．０重
量％（別滅菌）、塩化ナトリウム０−１６重量％、炭酸
ナトリウム０．５重量％（別滅菌） 培地１７：バクトトリプトン１．０重量％、肉エキス
（ディフコ）０．３重量％、酵母エキス０．１重量％、
グルコース０．１重量％、リン酸１水素ナトリウム０．
５重量％、馬尿酸１．０重量％、炭酸ナトリウム１．０
重量％（別滅菌） 培地１８：バクトトリプトース（ディフコ）２．０重量
％、塩化ナトリウム０．５重量％、システイン塩酸塩
０．１重量％、寒天１．５重量％、ＭＵＧ１００ｐｐｍ
（濾過滅菌）、炭酸ナトリウム０．３重量％（別滅菌） 培地１９：硝酸カリウム０．２重量％、リン酸１水素ナ
トリウム０．２重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、
硫酸マグネシウム７水塩０．００５重量％、微量金属混
液*０．２容量％、ビタミン混液**０．２容量％、炭酸
緩衝液（ｐＨ１０）０．１Ｍ、寒天０．３重量％（別滅
菌）、糖類１．０重量％（濾過滅菌） ＊、＊＊；Nielsenら、Microbiology, 141, 1745-1761
(1995)に準ずる。
コ）指示量、希塩酸にてｐＨを調整 培地２：ニュートリエントアガー（ディフコ）指示量、
炭酸ナトリウムにてｐＨを調整 培地３：ニュートリエントブロス０．８重量％、硝酸カ
リウム０．１重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％（別
滅菌） 培地４：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、塩
化ナトリウム０．５重量％、グルコース０．５重量％
（別滅菌）、炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌） 培地５：ＳＩＭ培地（日水製薬）指示量、炭酸ナトリウ
ム０．１重量％（別滅菌）、インドール産生試験用濾紙
（日水製薬） 培地６：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）指示量、炭酸ナト
リウム０．１重量％（別滅菌） 培地７：バクトペプトン１．５重量％、酵母エキス０．
５重量％、可溶性デンプン２．０重量％、リン酸１水素
カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０
２重量％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．２重
量％（別滅菌） 培地８：酵母エキス０．５重量％、グルコース２．０重
量％、カゼイン０．５重量％、リン酸１水素カリウム
０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩、０．０２重量
％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％
（別滅菌） 培地９：ニュートリエントブロス０．８重量％、ゼラチ
ン１．２重量％、酵母エキス０．５重量％、炭酸ナトリ
ウム０．２重量％（別滅菌） 培地１０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、リ
ン酸２水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７
水塩、０．０２重量％、クエン酸ナトリウム０．２重量
％、寒天１．５重量％、炭酸ナトリウム０．１重量％
（別滅菌） 培地１１：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製
薬） 培地１２：トリプティケース ソイ ブロス（ＢＢＬ）
指示量、炭酸ナトリウム０．１重量％（別滅菌） 培地１３：トリプティケース ソイ ブロスに炭酸ナト
リウムあるいは水酸化ナトリウムを別滅菌後に添加し、
ｐＨを調整 培地１４：アナエロビックアガー（ディフコ）指示量、
炭酸ナトリウム０．２重量％（別滅菌） 培地１５：バクトペプトン１．０重量％、塩化ナトリウ
ム０．５重量％、グルコース１．０重量％、フェノール
レッド０．００２重量％、水酸化ナトリウムにてｐＨを
調整 培地１６：バクトトリプトン（ディフコ）０．５重量
％、酵母エキス１．５重量％、リン酸１水素カリウム
０．３重量％、寒天２．０重量％、グルコース２．０重
量％（別滅菌）、塩化ナトリウム０−１６重量％、炭酸
ナトリウム０．５重量％（別滅菌） 培地１７：バクトトリプトン１．０重量％、肉エキス
（ディフコ）０．３重量％、酵母エキス０．１重量％、
グルコース０．１重量％、リン酸１水素ナトリウム０．
５重量％、馬尿酸１．０重量％、炭酸ナトリウム１．０
重量％（別滅菌） 培地１８：バクトトリプトース（ディフコ）２．０重量
％、塩化ナトリウム０．５重量％、システイン塩酸塩
０．１重量％、寒天１．５重量％、ＭＵＧ１００ｐｐｍ
（濾過滅菌）、炭酸ナトリウム０．３重量％（別滅菌） 培地１９：硝酸カリウム０．２重量％、リン酸１水素ナ
トリウム０．２重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、
硫酸マグネシウム７水塩０．００５重量％、微量金属混
液*０．２容量％、ビタミン混液**０．２容量％、炭酸
緩衝液（ｐＨ１０）０．１Ｍ、寒天０．３重量％（別滅
菌）、糖類１．０重量％（濾過滅菌） ＊、＊＊；Nielsenら、Microbiology, 141, 1745-1761
(1995)に準ずる。
【００１６】以上、ＫＳＭ−Ｎ１３１株は中性培地に生
育しない好アルカリ性細菌であり、且つグラム陽性、カ
タラーゼ陽性の有胞子桿菌であることから、好アルカリ
性バチルス属細菌であると判断された。そこで本菌株の
形態学、生理学的性質について、Nielsenらが新たに分
類した好アルカリ性バチルス属細菌の記載（Microbiolo
gy、141、1745-1761、1995）に準じ比較検討した結果、
本菌株はバチルス シュウドアルカロフィルスに近縁な
菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバ
チルス シュウドアルカロフィルスと完全には一致せ
ず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新
規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学
研究所へ、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株
（ＦＥＲＭＰ−１７４７５）として寄託した。
育しない好アルカリ性細菌であり、且つグラム陽性、カ
タラーゼ陽性の有胞子桿菌であることから、好アルカリ
性バチルス属細菌であると判断された。そこで本菌株の
形態学、生理学的性質について、Nielsenらが新たに分
類した好アルカリ性バチルス属細菌の記載（Microbiolo
gy、141、1745-1761、1995）に準じ比較検討した結果、
本菌株はバチルス シュウドアルカロフィルスに近縁な
菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバ
チルス シュウドアルカロフィルスと完全には一致せ
ず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新
規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学
研究所へ、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株
（ＦＥＲＭＰ−１７４７５）として寄託した。
【００１７】上記のＫＳＭ−Ｎ１３１株からのアルカリ
セルラーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知の
手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行うこ
とができる。
セルラーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知の
手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行うこ
とができる。
【００１８】また、本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子
を含む組換えベクターを作製するには、宿主内で複製維
持が可能で、該酵素を安定に発現させることができ、該
遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリセルラー
ゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸
菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場
合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosc
i. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175, 1995）、ｐ
ＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
を含む組換えベクターを作製するには、宿主内で複製維
持が可能で、該酵素を安定に発現させることができ、該
遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリセルラー
ゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸
菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場
合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosc
i. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175, 1995）、ｐ
ＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００１９】かくして得られた組換えベクターを用いて
宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピ
テントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行
うことができる。宿主菌としては特に制限されないが、
Bacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌；Escherichia
coli（大腸菌）等のグラム陰性菌；Streptomyces属（放
線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カ
ビ）等の真菌が挙げられる。
宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピ
テントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行
うことができる。宿主菌としては特に制限されないが、
Bacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌；Escherichia
coli（大腸菌）等のグラム陰性菌；Streptomyces属（放
線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カ
ビ）等の真菌が挙げられる。
【００２０】得られた形質転換体を培養し、当該培養液
からアルカリセルラーゼを採取することにより、アルカ
リセルラーゼを得ることができる。培養は、宿主菌又は
形質転換株が資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタ
ミン等を含む培地を用いて適当な条件下で行なえばよ
い。かくして得られた培養液から、一般的な方法によっ
て酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶
化等により、所望の酵素形態とすることができる。
からアルカリセルラーゼを採取することにより、アルカ
リセルラーゼを得ることができる。培養は、宿主菌又は
形質転換株が資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタ
ミン等を含む培地を用いて適当な条件下で行なえばよ
い。かくして得られた培養液から、一般的な方法によっ
て酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶
化等により、所望の酵素形態とすることができる。
【００２１】
【実施例】実施例１（アルカリセルラーゼ生産菌のスク
リーニング） 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０
分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布
した［２．０重量％カルボキシメチルセルロース（Ａ１
０ＭＣ；日本製紙社製）、１．０重量％肉エキス（オキ
ソイド社製）、１．０重量％バクトペプトン（ディフコ
社製）、１．０重量％塩化ナトリウム、０．１重量％リ
ン酸２水素カリウム、０．５重量％炭酸ナトリウム（別
滅菌）、０．００５重量％トリパンブルー（別滅
菌）］。３０℃の培養器で３日間静置培養し、生育した
菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶
解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニ
ー化を繰り返した。これらの菌株を、２．０重量％ポリ
ペプトンＳ（日本製薬社製）、１．０重量％魚肉エキス
（和光純薬社製）、０．１５重量％リン酸１水素カリウ
ム、０．１重量％酵母エキス（ディフコ社製）、０．０
７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．１重量％カルボ
キシメチルセルロース及び０．５重量％炭酸ナトリウム
（別滅菌）から成る液体培地を用い、３０℃、３日間振
盪培養した。アルカリセルラーゼを生産している菌株を
選択し、とりわけ高アルカリ性域で強力な活性を示した
セルラーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−
Ｎ１３１株を取得した。
リーニング） 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０
分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布
した［２．０重量％カルボキシメチルセルロース（Ａ１
０ＭＣ；日本製紙社製）、１．０重量％肉エキス（オキ
ソイド社製）、１．０重量％バクトペプトン（ディフコ
社製）、１．０重量％塩化ナトリウム、０．１重量％リ
ン酸２水素カリウム、０．５重量％炭酸ナトリウム（別
滅菌）、０．００５重量％トリパンブルー（別滅
菌）］。３０℃の培養器で３日間静置培養し、生育した
菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶
解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニ
ー化を繰り返した。これらの菌株を、２．０重量％ポリ
ペプトンＳ（日本製薬社製）、１．０重量％魚肉エキス
（和光純薬社製）、０．１５重量％リン酸１水素カリウ
ム、０．１重量％酵母エキス（ディフコ社製）、０．０
７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．１重量％カルボ
キシメチルセルロース及び０．５重量％炭酸ナトリウム
（別滅菌）から成る液体培地を用い、３０℃、３日間振
盪培養した。アルカリセルラーゼを生産している菌株を
選択し、とりわけ高アルカリ性域で強力な活性を示した
セルラーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−
Ｎ１３１株を取得した。
【００２２】実施例２（バチルス エスピー ＫＳＭ−
Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡの調製） バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養は、
２．０重量％ポリペプトンＳ、０．１重量％カルボキシ
セルロース（Ａ１０ＭＣ）、０．１重量％酵母エキス、
１重量％魚肉エキス、０．１５重量％リン酸１水素カリ
ウム、０．０７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．５
重量％グルタミン酸ナトリウム（別滅菌）及び０．５重
量％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地を用い、３
０℃、４０時間振盪（１２５ｒｐｍ）して行った。得ら
れた培養液約３００ｍＬから遠心分離（１２０００×
ｇ、１５分、５℃）により菌体を回収し、この菌体から
斉藤・三浦の方法によりゲノムＤＮＡを調製した。
Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡの調製） バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養は、
２．０重量％ポリペプトンＳ、０．１重量％カルボキシ
セルロース（Ａ１０ＭＣ）、０．１重量％酵母エキス、
１重量％魚肉エキス、０．１５重量％リン酸１水素カリ
ウム、０．０７重量％硫酸マグネシウム７水塩、０．５
重量％グルタミン酸ナトリウム（別滅菌）及び０．５重
量％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地を用い、３
０℃、４０時間振盪（１２５ｒｐｍ）して行った。得ら
れた培養液約３００ｍＬから遠心分離（１２０００×
ｇ、１５分、５℃）により菌体を回収し、この菌体から
斉藤・三浦の方法によりゲノムＤＮＡを調製した。
【００２３】実施例３（Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子断
片のクローニング） バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養上清か
ら精製したセルラーゼのアミノ末端配列を１５番目まで
決定した結果、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎであった。この配列
は、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｓ２３７株やバチル
ス エスピー ＫＳＭ−６４株の生産するアルカリセル
ラーゼのアミノ末端配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ｈｉｓ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎと極めて
高い相同性を示した。そこで中間のアミノ酸配列も相同
性が高い可能性があると予想し、Ｓ２３７セルラーゼの
アミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプライマー１
（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を合成
し、これらを用いてＮ１３１ａセルラーゼをコードする
遺伝子の増幅をＰＣＲ反応により試みた。すなわち、バ
チルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１μ
Ｌ（１００ｎｇ）、プライマー１及び２各２０μＬ（１
μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰ
ミックス８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ
（タカラ社製）０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イオ
ン水４０μＬを混合し、サーマルサイクラー４８０（パ
ーキンエルマー社製）にて９４℃、２分間の熱変性後、
９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１
サイクルとし、３０サイクルの反応条件でＤＮＡの増幅
を行った。得られたＰＣＲ産物（約１ｋｂ）をＧＦＸ
ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により
精製し、得られたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム
社製）及び３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキンエル
マーバイオシステム社製）を用いて決定した。
片のクローニング） バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株の培養上清か
ら精製したセルラーゼのアミノ末端配列を１５番目まで
決定した結果、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎであった。この配列
は、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｓ２３７株やバチル
ス エスピー ＫＳＭ−６４株の生産するアルカリセル
ラーゼのアミノ末端配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ｈｉｓ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎと極めて
高い相同性を示した。そこで中間のアミノ酸配列も相同
性が高い可能性があると予想し、Ｓ２３７セルラーゼの
アミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプライマー１
（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を合成
し、これらを用いてＮ１３１ａセルラーゼをコードする
遺伝子の増幅をＰＣＲ反応により試みた。すなわち、バ
チルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１μ
Ｌ（１００ｎｇ）、プライマー１及び２各２０μＬ（１
μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰ
ミックス８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ
（タカラ社製）０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イオ
ン水４０μＬを混合し、サーマルサイクラー４８０（パ
ーキンエルマー社製）にて９４℃、２分間の熱変性後、
９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１
サイクルとし、３０サイクルの反応条件でＤＮＡの増幅
を行った。得られたＰＣＲ産物（約１ｋｂ）をＧＦＸ
ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により
精製し、得られたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム
社製）及び３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキンエル
マーバイオシステム社製）を用いて決定した。
【００２４】実施例４（Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝子の
ゲノムＰＣＲ法によるクローニング） 実施例３で決定したＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子は不完
全なものであったため、インバースＰＣＲ法により全遺
伝子の取得を試みた。すなわち、バチルス エスピー
ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１０μＬ（８μｇ）、Ｐ
ＣＲ用緩衝液５μＬ、脱イオン水３４μＬ及びＥｃｏＲ
Ｉ１μＬ（１０単位）を混合し、３７℃、２時間３０分
間制限酵素処理した。得られたゲノム分解産物を精製
後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラ社
製）を用いて自己閉環した（１６℃、２時間）。自己閉
環したＤＮＡを精製し、インバースＰＣＲ法の鋳型とし
て用いた。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μＬ、プライ
マー３（配列番号７）及びプライマー４（配列番号８）
各２０μＬ（１μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．
５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イ
オン水４０．５μＬを混合した後、９４℃、２分間の熱
変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３
分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した
ＤＮＡ断片（約４ｋｂ）を精製し、このうち約２ｋｂの
塩基配列を決定した。この段階で完全なＮ１３１ａセル
ラーゼ遺伝子及びその上流約５００ｂの配列は決定され
たので、次に構造遺伝子下流の塩基配列決定を進め、下
流約２００ｂの塩基配列を決定した。得られた塩基配列
からセルラーゼ遺伝子の上流領域並びに下流領域の塩基
配列を基に、プライマー５（配列番号９）及びプライマ
ー６（配列番号１０）を合成し、バチルス エスピー
Ｎ１３１株のゲノムからＰＣＲ法によりＮ１３１ａセル
ラーゼ遺伝子を増幅した。得られた遺伝子の塩基配列を
決定し、アミノ酸配列を推定した（配列番号１及び
３）。
ゲノムＰＣＲ法によるクローニング） 実施例３で決定したＮ１３１ａセルラーゼ遺伝子は不完
全なものであったため、インバースＰＣＲ法により全遺
伝子の取得を試みた。すなわち、バチルス エスピー
ＫＳＭ−Ｎ１３１株ゲノム溶液１０μＬ（８μｇ）、Ｐ
ＣＲ用緩衝液５μＬ、脱イオン水３４μＬ及びＥｃｏＲ
Ｉ１μＬ（１０単位）を混合し、３７℃、２時間３０分
間制限酵素処理した。得られたゲノム分解産物を精製
後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラ社
製）を用いて自己閉環した（１６℃、２時間）。自己閉
環したＤＮＡを精製し、インバースＰＣＲ法の鋳型とし
て用いた。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μＬ、プライ
マー３（配列番号７）及びプライマー４（配列番号８）
各２０μＬ（１μＭ）、ＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、２．
５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ０．５μＬ（２．５単位）、及び脱イ
オン水４０．５μＬを混合した後、９４℃、２分間の熱
変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３
分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した
ＤＮＡ断片（約４ｋｂ）を精製し、このうち約２ｋｂの
塩基配列を決定した。この段階で完全なＮ１３１ａセル
ラーゼ遺伝子及びその上流約５００ｂの配列は決定され
たので、次に構造遺伝子下流の塩基配列決定を進め、下
流約２００ｂの塩基配列を決定した。得られた塩基配列
からセルラーゼ遺伝子の上流領域並びに下流領域の塩基
配列を基に、プライマー５（配列番号９）及びプライマ
ー６（配列番号１０）を合成し、バチルス エスピー
Ｎ１３１株のゲノムからＰＣＲ法によりＮ１３１ａセル
ラーゼ遺伝子を増幅した。得られた遺伝子の塩基配列を
決定し、アミノ酸配列を推定した（配列番号１及び
３）。
【００２５】実施例５（形質転換枯草菌によるＮ１３１
ａセルラーゼの生産） Ｎ１３１ａセルラーゼのアミノ末端側からターミネータ
ー下流までの遺伝子をプラスミド（ｐＨＳＰ６４）のＳ
ａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結し、構築した組換えプラ
スミドを枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換し
た。形質転換株を３．０重量％ポリペプトンＳ、３．０
重量％マルトース、０．５重量％魚肉エキス、０．１重
量％酵母エキス、０．１重量％リン酸２水素カリウム、
０．０２重量％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサイ
クリン（７．５μｇ／ｍＬ）から成る培地（ＰＭ培地、
ｐＨ６．８）にて３０℃、４８時間振盪培養を行った。
遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）により得ら
れた培養上清中のセルラーゼの活性は、約２００００Ｕ
／Ｌであった。
ａセルラーゼの生産） Ｎ１３１ａセルラーゼのアミノ末端側からターミネータ
ー下流までの遺伝子をプラスミド（ｐＨＳＰ６４）のＳ
ａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結し、構築した組換えプラ
スミドを枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換し
た。形質転換株を３．０重量％ポリペプトンＳ、３．０
重量％マルトース、０．５重量％魚肉エキス、０．１重
量％酵母エキス、０．１重量％リン酸２水素カリウム、
０．０２重量％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサイ
クリン（７．５μｇ／ｍＬ）から成る培地（ＰＭ培地、
ｐＨ６．８）にて３０℃、４８時間振盪培養を行った。
遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）により得ら
れた培養上清中のセルラーゼの活性は、約２００００Ｕ
／Ｌであった。
【００２６】実施例６（Ｎ１３１ｂセルラーゼ遺伝子の
ゲノムＰＣＲ法によるクローニング） Ｎ１３１ａセルラーゼのクローニングを行った際に、Ｎ
１３１ａセルラーゼの配列と類似した配列がバチルス
エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノム上に存在する可
能性が示唆された。そこで、Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝
子のクローニングの際に用いた方法と同様に、Ｓ２３７
セルラーゼのアミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプ
ライマー７〜１２（配列番号１１〜１６）を合成し、Ｐ
ＣＲ法によりＮ１３１ｂセルラーゼをコードする遺伝子
の増幅を行った。すなわち、バチルス エスピー ＫＳ
Ｍ−Ｎ１３１株のゲノム溶液１μＬ（７０ｎｇ）、プラ
イマーの組合せを各１０μＬ（０．３μＭ）、ＰＣＲ用
緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、
脱イオン水６０μＬ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム社製）１μＬ（５単位）を混合
し、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５
℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サ
イクルの反応条件でＤＮＡの増幅を行った。得られたＰ
ＣＲ産物をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ベーリンガー
マンハイム社製)を用いて精製し、３７７ＤＮＡシーク
ンサーにより塩基配列をそれぞれ決定した。得られた遺
伝子断片の塩基配列をＳ２３７セルラーゼ遺伝子と比較
すると、Ｎ１３１ｂセルラーゼのアミノ末端以降をコー
ドすると考えらるいくつかの遺伝子断片及び停止コドン
とその下流域と考えられる遺伝子断片の存在が示唆され
た。しかし、完全な塩基配列は決定されていないこと並
びに開始コドン及びその近傍の領域については遺伝子断
片として取得されていなかった。まず、アミノ末端より
上流の領域をコードする遺伝子を取得するためにバチル
ス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡ４μ
ｇを各種制限酵素（Ｓａｕ３Ａ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
III）により分解し、ＬＡ ＰＣＲインヴィトロクロー
ニングキット(宝酒造)を用いてカセットと連結したもの
を鋳型にＰＣＲ反応［プライマー１３（配列番号１７）
及びプライマー１４（配列番号１８）を使用］を行っ
た。その結果、ＨｉｎｄIIIにより処理したサンプルに
ついてＤＮＡの増幅が認められ、この増幅断片（約０．
４ｋｂ）の塩基配列を決定した結果、Ｎ１３１ｂセルラ
ーゼのアミノ末端より上流の領域をコードする遺伝子断
片が確認された。しかし、その解析を行うと開始コドン
から３４塩基下流にアンバーコドン（ＴＧＡ）が存在す
ることが明らかになった。アンバーコドン（ＴＧＡ）に
関しては、枯草菌において極くまれにトリプトファンを
コードするという報告もあることから（Lovettら、J. B
acteriol.，173，1810-1812，1991）、本遺伝子におい
てもトリプトファンをコードする可能性が示唆された。
しかし、開始コドンの上流部にはリボソーム結合部位な
どの翻訳開始に必要な配列が見出されず、オーカーコド
ン（ＴＡＡ）がいくつも存在することも明らかになっ
た。従って、本遺伝子は細胞内で発現しない擬似遺伝子
である可能性が高いと考えられた。完全なＮ１３１ｂセ
ルラーゼ遺伝子をコードする塩基配列を決定するために
プライマー１５（配列番号１９）及びプライマー１６
（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行った。最終的
に決定された塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配
列番号２及び配列番号４に示した。
ゲノムＰＣＲ法によるクローニング） Ｎ１３１ａセルラーゼのクローニングを行った際に、Ｎ
１３１ａセルラーゼの配列と類似した配列がバチルス
エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノム上に存在する可
能性が示唆された。そこで、Ｎ１３１ａセルラーゼ遺伝
子のクローニングの際に用いた方法と同様に、Ｓ２３７
セルラーゼのアミノ末端及び中間アミノ酸配列を基にプ
ライマー７〜１２（配列番号１１〜１６）を合成し、Ｐ
ＣＲ法によりＮ１３１ｂセルラーゼをコードする遺伝子
の増幅を行った。すなわち、バチルス エスピー ＫＳ
Ｍ−Ｎ１３１株のゲノム溶液１μＬ（７０ｎｇ）、プラ
イマーの組合せを各１０μＬ（０．３μＭ）、ＰＣＲ用
緩衝液１０μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰミックス８μＬ、
脱イオン水６０μＬ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム社製）１μＬ（５単位）を混合
し、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５
℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サ
イクルの反応条件でＤＮＡの増幅を行った。得られたＰ
ＣＲ産物をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ベーリンガー
マンハイム社製)を用いて精製し、３７７ＤＮＡシーク
ンサーにより塩基配列をそれぞれ決定した。得られた遺
伝子断片の塩基配列をＳ２３７セルラーゼ遺伝子と比較
すると、Ｎ１３１ｂセルラーゼのアミノ末端以降をコー
ドすると考えらるいくつかの遺伝子断片及び停止コドン
とその下流域と考えられる遺伝子断片の存在が示唆され
た。しかし、完全な塩基配列は決定されていないこと並
びに開始コドン及びその近傍の領域については遺伝子断
片として取得されていなかった。まず、アミノ末端より
上流の領域をコードする遺伝子を取得するためにバチル
ス エスピー ＫＳＭ−Ｎ１３１株のゲノムＤＮＡ４μ
ｇを各種制限酵素（Ｓａｕ３Ａ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
III）により分解し、ＬＡ ＰＣＲインヴィトロクロー
ニングキット(宝酒造)を用いてカセットと連結したもの
を鋳型にＰＣＲ反応［プライマー１３（配列番号１７）
及びプライマー１４（配列番号１８）を使用］を行っ
た。その結果、ＨｉｎｄIIIにより処理したサンプルに
ついてＤＮＡの増幅が認められ、この増幅断片（約０．
４ｋｂ）の塩基配列を決定した結果、Ｎ１３１ｂセルラ
ーゼのアミノ末端より上流の領域をコードする遺伝子断
片が確認された。しかし、その解析を行うと開始コドン
から３４塩基下流にアンバーコドン（ＴＧＡ）が存在す
ることが明らかになった。アンバーコドン（ＴＧＡ）に
関しては、枯草菌において極くまれにトリプトファンを
コードするという報告もあることから（Lovettら、J. B
acteriol.，173，1810-1812，1991）、本遺伝子におい
てもトリプトファンをコードする可能性が示唆された。
しかし、開始コドンの上流部にはリボソーム結合部位な
どの翻訳開始に必要な配列が見出されず、オーカーコド
ン（ＴＡＡ）がいくつも存在することも明らかになっ
た。従って、本遺伝子は細胞内で発現しない擬似遺伝子
である可能性が高いと考えられた。完全なＮ１３１ｂセ
ルラーゼ遺伝子をコードする塩基配列を決定するために
プライマー１５（配列番号１９）及びプライマー１６
（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行った。最終的
に決定された塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配
列番号２及び配列番号４に示した。
【００２７】実施例７（形質転換枯草菌によるＮ１３１
ｂセルラーゼの生産） 細胞内で発現しない可能性のあるＮ１３１ｂセルラーゼ
を生産させる目的で、遺伝子の発現に必要な領域として
バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセ
ルラーゼ遺伝子（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Bi
ochem.，56，827-877，1992）の上流発現領域を増幅し
た［プライマー１７（配列番号２１）及びプライマー１
８（配列番号２２）を使用］。得られたＮ１３１ｂセル
ラーゼ遺伝子断片と上流発現領域遺伝子断片を精製し、
プライマー１６（配列番号２０）及びプライマー１７
（配列番号２１）を用いてリコンビナントＰＣＲ法によ
りＤＮＡの増幅を行った。取得したキメラ遺伝子を精製
し、制限酵素ＢｇｌIIびＨｉｎｄIIIで処理後、予め同
じ制限酵素で処理しておいたプラスミドｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫ（ヤクルト本社製）に連結した。得られた組換えプ
ラスミドをプロトプラスト法により枯草菌ＩＳＷ１２１
４株に導入し、形質転換を行った。形質転換株をＰＭ培
地（テトラサイクリンは１５μｇ／ｍＬとした）中で３
０℃、７２時間振盪培養した。遠心分離により得られた
培養上清中のセルラーゼの活性は、約３３０００Ｕ／Ｌ
であった。
ｂセルラーゼの生産） 細胞内で発現しない可能性のあるＮ１３１ｂセルラーゼ
を生産させる目的で、遺伝子の発現に必要な領域として
バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセ
ルラーゼ遺伝子（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Bi
ochem.，56，827-877，1992）の上流発現領域を増幅し
た［プライマー１７（配列番号２１）及びプライマー１
８（配列番号２２）を使用］。得られたＮ１３１ｂセル
ラーゼ遺伝子断片と上流発現領域遺伝子断片を精製し、
プライマー１６（配列番号２０）及びプライマー１７
（配列番号２１）を用いてリコンビナントＰＣＲ法によ
りＤＮＡの増幅を行った。取得したキメラ遺伝子を精製
し、制限酵素ＢｇｌIIびＨｉｎｄIIIで処理後、予め同
じ制限酵素で処理しておいたプラスミドｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫ（ヤクルト本社製）に連結した。得られた組換えプ
ラスミドをプロトプラスト法により枯草菌ＩＳＷ１２１
４株に導入し、形質転換を行った。形質転換株をＰＭ培
地（テトラサイクリンは１５μｇ／ｍＬとした）中で３
０℃、７２時間振盪培養した。遠心分離により得られた
培養上清中のセルラーゼの活性は、約３３０００Ｕ／Ｌ
であった。
【００２８】［酵素活性測定法］０．２ｍＬの０．５Ｍ
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、
０．４ｍＬの２．５重量％カルボキシメチルセルロース
（Ａ０１ＭＣ；日本製紙社製）及び０．３ｍＬの脱イオ
ン水から成る反応液に、適当に希釈した０．１ｍＬの酵
素液を加えて２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロ
サリチル酸試薬（０．５重量％ジニトロサリチル酸、３
０重量％ロッシェル塩、１．６重量％水酸化ナトリウム
水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行っ
た。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え、５３
５ｎｍにおける吸光度を測定して還元糖の生成量を求め
た。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に
ジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、
同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）
は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグル
コース相当の還元糖を生成する量とした。
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、
０．４ｍＬの２．５重量％カルボキシメチルセルロース
（Ａ０１ＭＣ；日本製紙社製）及び０．３ｍＬの脱イオ
ン水から成る反応液に、適当に希釈した０．１ｍＬの酵
素液を加えて２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロ
サリチル酸試薬（０．５重量％ジニトロサリチル酸、３
０重量％ロッシェル塩、１．６重量％水酸化ナトリウム
水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行っ
た。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え、５３
５ｎｍにおける吸光度を測定して還元糖の生成量を求め
た。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に
ジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、
同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）
は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグル
コース相当の還元糖を生成する量とした。
【００２９】参考例１（Ｎ１３１ａセルラーゼの最適反
応ｐＨ） クエン酸緩衝液（ｐＨ４−７）、リン酸緩衝液（ｐＨ６
−８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、グリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８−１１）、リン酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２−１２．５）の各緩
衝液（１００ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結
果、Ｎ１３１ａセルラーゼはｐＨ９−９．５のグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示し
た。また、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上
の活性を有していた（図１）。
応ｐＨ） クエン酸緩衝液（ｐＨ４−７）、リン酸緩衝液（ｐＨ６
−８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、グリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８−１１）、リン酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２−１２．５）の各緩
衝液（１００ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結
果、Ｎ１３１ａセルラーゼはｐＨ９−９．５のグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示し
た。また、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上
の活性を有していた（図１）。
【００３０】参考例２（Ｎ１３１ｂセルラーゼの最適反
応ｐＨ） 参考例１と同様にしてＮ１３１ｂセルラーゼの最適反応
ｐＨを調べた結果、ｐＨ９−９．５のグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。ま
た、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上の活性
を有していた（図２）。
応ｐＨ） 参考例１と同様にしてＮ１３１ｂセルラーゼの最適反応
ｐＨを調べた結果、ｐＨ９−９．５のグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。ま
た、ｐＨ７から１１の間で最大活性の５０％以上の活性
を有していた（図２）。
【００３１】
【発明の効果】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用
いれば、衣料用洗剤、繊維処理剤等として有用なアルカ
リセルラーゼを単一且つ大量に生産することが可能であ
る。
いれば、衣料用洗剤、繊維処理剤等として有用なアルカ
リセルラーゼを単一且つ大量に生産することが可能であ
る。
【００３２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Gene for Alkaline Cellulase <130> P00741202 <160> 22 <210> 1 <211> 859 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ile 5 10 15 Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly 20 25 30 Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Asp His Leu Leu Gly Asn Glu Asn Val 35 40 45 Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Lys Glu Val Asp Gly 50 55 60 Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly 65 70 75 80 Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn 85 90 95 Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu 100 105 110 Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile 115 120 125 Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met 130 135 140 Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp 145 150 155 160 Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu 165 170 175 Tyr Pro Asn Asn Arg His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp 195 200 205 Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp 210 215 220 Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp 225 230 235 240 Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asn Asp His His 245 250 255 Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Ser Gly Ser His Ala Ala Ser Thr 260 265 270 Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met 275 280 285 Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr 290 295 300 Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp 305 310 315 320 Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp 325 330 335 Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr 340 345 350 Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro 355 360 365 Asp Gln Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val 370 375 380 Arg Ala Arg Ile Lys Gly Ala Lys Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Arg 385 390 395 400 Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe 405 410 415 Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Ala Ile Glu Val Glu Asn 420 425 430 Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ile Ser Gly Leu Asn Val Ser Asn Asp Leu 435 440 445 Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Val Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp 450 455 460 Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Ser Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Gly 465 470 475 480 Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser 485 490 495 Thr Lys His Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ser Val Lys Val Thr Glu 500 505 510 Ala Asp Phe Val Lys Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Leu Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Gly Asp Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Gly Phe Asp Asp 530 535 540 Glu Asn Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Ala 545 550 555 560 Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Thr Gly Lys Ile Val 565 570 575 Glu Ile Pro Val Val His Ser Pro Lys Gly Asp Ala Ala Leu Pro Ser 580 585 590 Asn Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser 595 600 605 Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Gln Ala 610 615 620 Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp 625 630 635 640 Ala Ser Ala Pro Arg Leu Asp Phe His Lys Asp Asn Leu Val Arg Gly 645 650 655 Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Ile Asp Pro Ala Arg Ala 660 665 670 Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Ala Asn 675 680 685 Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Phe Thr Ile Asn Phe Glu Glu 690 695 700 Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys 705 710 715 720 Ile Asn Val Arg Asp Ile Ala Asn Ile Gln Asp Asp Thr Val Leu Arg 725 730 735 Asn Met Ile Leu Ile Phe Ala Asp Val Gln Ser Asp Phe Ala Gly Arg 740 745 750 Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Ala Ser Ala Thr Glu Pro Val 755 760 765 Glu Pro Val Glu Pro Val Asp Pro Ala Pro Val Glu Pro Glu Pro Val 770 775 780 Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Ala Lys 785 790 795 800 Glu Glu Arg Glu Ala Ala Lys Ala Glu Arg Glu Ala Ala Arg Glu Ala 805 810 815 Ala Lys Glu Glu Arg Glu Glu Ala Arg Glu Ala Ala Lys Glu Glu Arg 820 825 830 Glu Ala Ala Lys Ala Glu Arg Glu Ala Ala Arg Glu Ala Ala Lys Ala 835 840 845 Glu Arg Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys Lys Lys 850 855
【００３３】 <210> 2 <211> 813 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Met Leu Leu His Gln Leu Leu Ile Phe Glu Gly(Trp)Ser Gln Lys Val 5 10 15 Leu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu 20 25 30 Gly Asn Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu 35 40 45 Gln Glu Val Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys 50 55 60 Ile Gln Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu 65 70 75 80 Ile Leu Asn Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser 85 90 95 Asn Met Ile Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly His Ala Thr 100 105 110 Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala 115 120 125 Ile Glu Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro 130 135 140 Gly Asp Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg 145 150 155 160 Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu 165 170 175 Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn 180 185 190 Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val 195 200 205 Gln Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val 210 215 220 Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro 225 230 235 240 Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser 245 250 255 His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu 260 265 270 Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val 275 280 285 Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly 290 295 300 Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu 305 310 315 320 Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val 325 330 335 Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser 340 345 350 Leu Asp Pro Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu 355 360 365 Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro 370 375 380 Ile Asp Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly 385 390 395 400 Thr Lys Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu 405 410 415 Ile Ala Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp 420 425 430 Val Ser Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu 435 440 445 Ser Ala Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys 450 455 460 Leu Thr Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala 465 470 475 480 Ala Ile Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala 485 490 495 Val Arg Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr 500 505 510 Lys Ala Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Ser Leu Glu Ala 515 520 525 Ile Ala Met His Ala Glu Asn Tyr Thr Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe 530 535 540 Val Gly Thr Glu Gly Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Thr Ile Lys Val 545 550 555 560 Ile Gly Pro Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu 565 570 575 Ala Val Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp 580 585 590 Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala 595 600 605 Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys 610 615 620 Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser 625 630 635 640 Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu 645 650 655 Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe 660 665 670 Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr 675 680 685 Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr 690 695 700 His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp 705 710 715 720 Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser 725 730 735 Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala 740 745 750 Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu 755 760 765 Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala 770 775 780 Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys 785 790 795 800 Glu Glu Lys Lys Ala Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys 805 810
【００３４】 <210> 3 <211> 3299 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 3 attaaaacga ggtctgagtt tttttaatca gacgatagca tgaaacgcaa ctgaatacaa 60 aaagtatgag gaatttgaac tacagaagat ctctttttat aattattaat acccggaacg 120 aaaatactat ttcgaaagcg gtttacacaa aaaaccttat gttatggcgt ttttagataa 180 ttggaagaaa aaaacaactc tagtaatcta aattgaacat gctataatga gtttgttagc 240 agcaatatcg gtgttattta cttactaata atgtaagcgt ttaacctaag agtagacgct 300 tatatccgaa ggaggtagat tgagtcaagt aggaataatg atgatgcagt gtacgagctt 360 taaagaatca ggagagcact tcgggttact cccgtatttt tttggaatgt tttcgaaagc 420 actttcggta ttttagttat ttgactcaat taagancgat aattaggagg taat atg 477 Met atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc act ctt att tta 525 Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ile Leu 5 10 15 gtt tta ctt cta tct tta ttt cca aca gct ctt gca gca gaa gga aat 573 Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly Asn 20 25 30 acg cgc gaa gac aat ttt gat cat tta tta ggt aat gaa aat gtt aaa 621 Thr Arg Glu Asp Asn Phe Asp His Leu Leu Gly Asn Glu Asn Val Lys 35 40 45 cgc cct tca gag gcc ggt gcg tta caa cta aaa gaa gtt gat gga caa 669 Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Lys Glu Val Asp Gly Gln 50 55 60 65 atg aca ttg gta gat caa cat gga gaa aag att caa tta cgc ggg atg 717 Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly Met 70 75 80 agt act cat gga tta caa tgg ttt cct gag atc tta aat gat aac gca 765 Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn Ala 85 90 95 tac aaa gct ctt tct aac gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt gct 813 Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu Ala 100 105 110 atg tat gta ggt gaa aat ggg tac gct acc aat cct gag tta atc aaa 861 Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile Lys 115 120 125 caa aga gtg att gat gga att gag tta gcg att gaa aat gac atg tat 909 Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met Tyr 130 135 140 145 gtt att gtt gac tgg cat gtt cat gcg cca ggt gat cct agg gat cct 957 Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp Pro 150 155 160 gtt tat gca ggt gct gaa gat ttc ttt aga gat att gca gca ttg tat 1005 Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu Tyr 165 170 175 cct aat aat cga cac att att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt 1053 Pro Asn Asn Arg His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser 180 185 190 aat aat aat ggt gga gca ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa 1101 Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys 195 200 205 gcg gta aaa gaa tat gct gat cca att gta gaa atg tta cgc gat agt 1149 Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp Ser 210 215 220 225 ggg aac gca gat gac aac atc atc att gtg ggt agt cca aac tgg agt 1197 Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser 230 235 240 cag cgt ccg gac tta gca gct gat aat cca att aat gat cac cat acg 1245 Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asn Asp His His Thr 245 250 255 atg tat act gtt cac ttc tac tct ggt tca cat gct gct tca act gag 1293 Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Ser Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu 260 265 270 agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt 1341 Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser 275 280 285 aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gcg gta ttt gcg aca gag 1389 Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu 290 295 300 305 tgg gga aca agt caa gca aat gga gat ggt ggt cct tat ttt gat gaa 1437 Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu 310 315 320 gcg gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att agt tgg gct 1485 Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala 325 330 335 aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gtg tct ggt gca ttt aca cca 1533 Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro 340 345 350 ttt gaa tta gga aaa tca aat gca aca agt ctt gac cca ggt cca gac 1581 Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro Asp 355 360 365 cag gta tgg gca cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa tat gta cgt 1629 Gln Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg 370 375 380 385 gct cgt att aaa ggt gcg aaa tat gag ccg att gac cgt act aga tat 1677 Ala Arg Ile Lys Gly Ala Lys Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Arg Tyr 390 395 400 aca aaa gtt cta tgg gat ttt aat gat gga acc aag caa ggg ttt gga 1725 Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe Gly 405 410 415 gtg aac tca gat tct ccg aat aaa gag gct att gag gtt gag aat gaa 1773 Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Ala Ile Glu Val Glu Asn Glu 420 425 430 aat ggc act ttg aga atc tca ggt tta aat gta agt aat gat ctt tct 1821 Asn Gly Thr Leu Arg Ile Ser Gly Leu Asn Val Ser Asn Asp Leu Ser 435 440 445 gat ggc aac ttc tgg gct aat gtt cgt ctt tct gcc aat ggt tgg ggg 1869 Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Val Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp Gly 450 455 460 465 aag agt gtc gat att tta agt gct gaa aaa cta act atg gat ggt att 1917 Lys Ser Val Asp Ile Leu Ser Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Gly Ile 470 475 480 gtg gat gaa cca acg aca gta gcg att gct gca att cca caa agc aca 1965 Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Thr 485 490 495 aag cat ggt tgg gca aat cca gaa cgt tcg gta aaa gtg aca gaa gct 2013 Lys His Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ser Val Lys Val Thr Glu Ala 500 505 510 gac ttt gtt aag caa gat gac ggg aaa tat aaa gcc ctt tta acg att 2061 Asp Phe Val Lys Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Leu Leu Thr Ile 515 520 525 aca ggg gat gat gct ccg aat cta aag aac att ggt ttt gat gat gaa 2109 Thr Gly Asp Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Gly Phe Asp Asp Glu 530 535 540 545 aat aac aac atg aac aac att att ctt ttc gta ggt act gaa gca gct 2157 Asn Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Ala Ala 550 555 560 gac gtg att tat ctg gat aac att aaa gta act ggt aaa att gtt gaa 2205 Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Thr Gly Lys Ile Val Glu 565 570 575 att cca gta gtt cac tct cca aaa ggc gat gct gct ctt cct tct aat 2253 Ile Pro Val Val His Ser Pro Lys Gly Asp Ala Ala Leu Pro Ser Asn 580 585 590 ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct gga 2301 Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly 595 600 605 gtc aaa acg gcc tta aca att gaa gaa gca aac ggg tcg caa gct tta 2349 Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Gln Ala Leu 610 615 620 625 tca tgg gaa ttt ggg tat cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg gct 2397 Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala 630 635 640 tct gct cca cgt tta gat ttc cac aaa gat aac cta gtt cgt ggt gaa 2445 Ser Ala Pro Arg Leu Asp Phe His Lys Asp Asn Leu Val Arg Gly Glu 645 650 655 aat gat tat gta gcg ttt gac ttc tac att gat cca gct cgt gca act 2493 Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Ile Asp Pro Ala Arg Ala Thr 660 665 670 gag gga gcg atg aat att aac tta gta ttc cag cca cct gct aat gga 2541 Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Ala Asn Gly 675 680 685 tac tgg gtc caa gcg cca aaa aca ttt aca att aac ttt gaa gag ctt 2589 Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Phe Thr Ile Asn Phe Glu Glu Leu 690 695 700 705 gaa gaa gca aat caa gta aat ggg tta tac cat tat gaa gtg aaa att 2637 Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile 710 715 720 aac gta aga gac att gcc aac att caa gat gat acg gtc cta cgt aat 2685 Asn Val Arg Asp Ile Ala Asn Ile Gln Asp Asp Thr Val Leu Arg Asn 725 730 735 atg ata ctc att ttt gca gat gta caa agt gat ttt gcg gga aga gta 2733 Met Ile Leu Ile Phe Ala Asp Val Gln Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val 740 745 750 ttt gtg gat aac gtt cgt ttt gag gct tca gct aca gag ccg gtt gag 2781 Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Ala Ser Ala Thr Glu Pro Val Glu 755 760 765 cca gtt gag cca gtt gac cca gca ccg gtt gag cct gag ccg gta gat 2829 Pro Val Glu Pro Val Asp Pro Ala Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp 770 775 780 785 cct ggt gaa gaa act cct cct gta gat gag aag gaa gcg gcg aaa gaa 2877 Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Ala Lys Glu 790 795 800 gaa aga gaa gct gca aaa gct gaa aga gaa gca gct aga gaa gca gcc 2925 Glu Arg Glu Ala Ala Lys Ala Glu Arg Glu Ala Ala Arg Glu Ala Ala 805 810 815 aaa gag gaa aga gaa gaa gca aga gag gct gca aaa gaa gaa aga gaa 2973 Lys Glu Glu Arg Glu Glu Ala Arg Glu Ala Ala Lys Glu Glu Arg Glu 820 825 830 gca gca aag gct gaa aga gaa gcg gct aga gaa gca gct aaa gct gaa 3021 Ala Ala Lys Ala Glu Arg Glu Ala Ala Arg Glu Ala Ala Lys Ala Glu 835 840 845 aga gaa gca aag aaa gaa gca aag aaa aaa taa gagaatcttg taagaactca 3074 Arg Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys Lys Lys Stop 850 855 860 ttggcttagg ctaatgagtt cttacttttt aatcgagaca aatgaataat tatagcgtga 3134 actataaaga aataagatat atttacgata atagtaatgt atactaagtt tctgattgga 3194 actctacgac gaagatgtta gtagtttaag aggaggacgt gtaatgacaa ctgagatact 3254 taatagaaga aagacagatc aagaaatact gcaagctttg gtaga 3299
【００３５】 <210> 4 <211> 2783 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 4 ctcactatag ggagaagctt gttatcacca gatgtagctt taacttcgaa gaatccatca 60 cctaattcaa ggatagaaac gtcaaacgta ccaccgccaa ggtcataaac aaggatagtt 120 tggtcttctt ctttttcaag accgtaagct aaagccgcag ctgttggctc gttaacaata 180 cgctcaactt caagaccagc aattttacca gcatctttcg tcgcttggcg ttgtgagtca 240 ttaaagtaag ctggaactgt aataactgct tttgttacct tttcacctaa gt atg ctt 298 Met Leu ctg cat cag ctt tta att ttt gaa gga tga tcg cag aaa gtt ctt gca 346 Leu His Gln Leu Leu Ile Phe Glu Gly(Trp)Ser Gln Lys Val Leu Ala 5 10 15 gca gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat 394 Ala Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn 20 25 30 gac aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa 442 Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu 35 40 45 50 gtc gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa 490 Val Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln 55 60 65 tta cgt gga atg agt aca cac gga tta cag tgg ttt cct gag atc ttg 538 Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu 70 75 80 aat gat aac gca tac aaa gct ctt tct aac gat tgg gat tcc aat atg 586 Asn Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met 85 90 95 att cgt ctt gct atg tat gta ggt gaa aat ggg cac gct aca aac cct 634 Ile Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly His Ala Thr Asn Pro 100 105 110 gag tta atc aaa caa aga gtg att gat gga att gag tta gcg att gaa 682 Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu 115 120 125 130 aat gac atg tat gtt att gtt gac tgg cat gtt cat gcg cca ggt gat 730 Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp 135 140 145 cct aga gat cct gtt tat gca ggt gct aaa gat ttc ttt aga gaa att 778 Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile 150 155 160 gca gct tta tac cct aat aat cca cac att att tat gag tta gcg aat 826 Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn 165 170 175 gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca ggg att ccg aat aac gaa 874 Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu 180 185 190 gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct gat cca att gta caa atg 922 Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Gln Met 195 200 205 210 tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac att atc att gtt ggt agt 970 Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser 215 220 225 cca aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat 1018 Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp 230 235 240 gat cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct 1066 Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala 245 250 255 gct tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga 1114 Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly 260 265 270 aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta 1162 Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val 275 280 285 290 ttt gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct 1210 Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro 295 300 305 tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac 1258 Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn 310 315 320 att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt 1306 Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly 325 330 335 gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac 1354 Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp 340 345 350 cca ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga 1402 Pro Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly 355 360 365 370 gaa tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac 1450 Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp 375 380 385 cgt aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag 1498 Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys 390 395 400 caa gga ttt gga gtg aat tcg gat tct cca aat aaa gaa ctt att gca 1546 Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala 405 410 415 gtt gat aat gaa aac aac act ttg aaa gtt tcg gga tta gat gta agt 1594 Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser 420 425 430 aac gat gtt tca gat ggc aac ttc tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc 1642 Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala 435 440 445 450 aac ggt tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gag aag ctt aca 1690 Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr 455 460 465 atg gat gtt att gtt gat gaa cca acg acg gta gct att gcg gcg att 1738 Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile 470 475 480 cca caa agt agt aaa agt gga tgg gca aat cca gag cgt gct gtt cga 1786 Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg 485 490 495 gtg aac gcg gaa gat ttt gtc cag caa acg gac ggt aag tat aaa gct 1834 Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala 500 505 510 gga tta aca att aca gga gaa gat gct cca tcg tta gaa gct att gcg 1882 Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala 515 520 525 530 atg cac gct gaa aat tac act atc aac aac atc att ctt ttt gta gga 1930 Met His Ala Glu Asn Tyr Thr Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly 535 540 545 act gaa ggt gct gat gtt atc tat tta gat acc att aaa gta att gga 1978 Thr Glu Gly Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Thr Ile Lys Val Ile Gly 550 555 560 cca gaa gtt gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt 2026 Pro Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val 565 570 575 ctt cct tct gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct 2074 Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala 580 585 590 gga gag tct ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt 2122 Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly 595 600 605 610 tct aac gcg tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt 2170 Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser 615 620 625 gat aac tgg gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg 2218 Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu 630 635 640 gtt cgc ggt gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca 2266 Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro 645 650 655 gtt cgt gca aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca 2314 Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro 660 665 670 cct act aac ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac 2362 Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn 675 680 685 690 ttt gat gaa tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat 2410 Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr 695 700 705 gaa gtg aaa att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg 2458 Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr 710 715 720 tta cta cgt aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt 2506 Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe 725 730 735 gca ggg aga gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act 2554 Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr 740 745 750 act gag ccg gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg 2602 Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro 755 760 765 770 cct gtc gat gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa 2650 Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys 775 780 785 gaa gag aaa gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa 2698 Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu 790 795 800 aag aaa gca atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctatta aactagttat 2751 Lys Lys Ala Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys 805 810 agggttatct aaaggctgat gcagatctta cg 2783
【００３６】 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 5 attagtcgac tcgaaggaaa cactcgtg 28
【００３７】 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 6 gcacgtacat attatccaga aagac 25
【００３８】 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on N131a cellulase <400> 7 gatctcagga aaccactgta atc 23
【００３９】 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on N131a cellulase <400> 8 acaacattag ctgggctaac tggtc 25
【００４０】 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on N131a cellulase <400> 9 agataaactc agaccttgtt gg 22
【００４１】 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on N131a cellulase <400> 10 taaactacta acatcttcgt cgtag 25
【００４２】 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 11 gaaggaaaca ctcgtgaaga c 21
【００４３】 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 12 agtccggacg ctgactccag 20
【００４４】 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 13 aatgctcgtc tttctgccaa cggttgg 27
【００４５】 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 14 aacagaatga tgttgttcat attg 24
【００４６】 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 15 ggtttatatc actatgaagt g 21
【００４７】 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S237 cellulase <400> 16 aaattacttc atcattctat cac 23
【００４８】 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S131b cellulase <400> 17 atccgtgtgt actcattcca 20
【００４９】 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S131b cellulase <400> 18 tctcgataat aatccctagc gccg 20
【００５０】 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S131b cellulase and KSM-64 cellulase <400> 19 agcacaagcc gaaggaaaca ctcgtgaaga caattttaaa 40
【００５１】 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S131b cellulase <400> 20 aagatctgca tcagccttta gataac 26
【００５２】 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on KSM-64 cellulase <400> 21 ttccagatct acttaccat t ttagagtcaa aag 33
【００５３】 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed DNA based on S131b cellulase and KSM-64 cellulase <400> 22 ggcttgtgct ggtcgaccca actgc 25
【図１】本発明のアルカリセルラーゼ（Ｎ１３１ａ）活
性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２】本発明のアルカリセルラーゼ（Ｎ１３１ｂ）活
性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/42 5/00 Ａ (72)発明者 瀧澤 修一 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 久保田 浩美 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 川合 修次 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 BA11 CA04 CA09 DA07 EA04 GA11 GA19 GA27 HA01 HA19 4B050 CC03 DD02 LL04 4B065 AA15X AA15Y AB01 BA02 BA22 CA31 CA57
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１若しくは２に示すアミノ酸配
列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードす
るアルカリセルラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号３若しくは４に示す塩基配列、
又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若
しくは付加された塩基酸配列を有するアルカリセルラー
ゼ遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子を含む組換
えベクター。 - 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
質転換体。 - 【請求項５】 宿主が微生物である請求項４記載の形質
転換体。 - 【請求項６】 請求項４又は５に記載の形質転換体を培
養することを特徴とするアルカリセルラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
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