MXPA00012491A - Enzimas desramificantes del almidon. - Google Patents

Abstract

La invencion concierne a una variante disenada geneticamente de una enzima desramificante de almidon genitora, por ejemplo una pululanasa o una amilasa, la variante enzimatica que tiene una termoestabilidad mejorada a un pH en el rango de 4-o en comparacion con la enzima genitora y/o una actividad incrementada hacia amilopectina y/o glicogeno en comparacion con la enzima genitora, al metodo para producir tales variantes de enzima desramificante de almidon-con termoestabilidad mejorada y o especificidad de substrato alterada, y a un metodo para convertir almidon a uno o mas azucares utilizando al menos una variante enzimatica tal.

Description

ENZIMAS DESRAMIFICANTES DEL ALMIDÓN Campo de la invención La presente invención concierne a las nuevas enzimas desramificantes del almidón, en particular pululanasas e isoamilasas, indicadas para uso en un proceso de conversión de almidón que comprende una etapa de licuefacción y una etapa de sacarificación, así como también a la producción de tales enzimas y al uso de tales enzimas en un proceso de conversión de almidón.

Antecedentes de la invención Almidones tales como almidones de maíz, papa, trigo, manioca y arroz se utilizan como materiales iniciales en la producción comercial en gran escala de azúcares, tales como jarabe rico en fructuosa, jarabe rico en maltosa, maltodextrinas, amilosa, oligosacáridos G4-G6, y otros productos de carbohidratos tales como sustitutos de grasa.

Degradación de almidón El almidón usualmente consiste de aproximadamente 80 % de amilopectina y 20 % de amilosa. La amilopectina es un REF.125793 polisacárido ramificado en las cual los residuos de las cadenas lineales a-1,4 D-glucosa se juntan por los enlaces a-1,6 glucosídicos. La amilopectina se degrada parcialmente por una a-amilasa, la cual hidroliza los enlaces 1,4-a-glucosídicos para producir oligosacáridos lineales ó ramificados. La degradación prolongada de la amilopectina por a-amilasa dá como resultado la formación de las denominadas dextrinas de límite a que no son susceptibles de hidrólisis adicional por la a-amilasa. Los oligosacáridos ramificados pueden ser hidrolizados en oligosacáridos lineales por una enzima desramificante. Los oligosacáridos ramificados remanentes pueden despolimerizarse a D-glucosa por glucoamilasa, la cual hidroliza oligosacáridos lineales en D-glucosa.

La amilosa es un polisacárido lineal construida de unidades D-glucopiranosa enlazadas juntas por uniones a-1, glucosidicos. La amilosa es degradada en los oligosacáridos lineales más cortos por a-amilasa los oligosacáridos lineales que son polimerizados en D-glucosa por la glucoamilasa.

En el caso de convertir almidón en un azúcar, el almidón se despolimeriza. El proceso de despolimerización consiste de una etapa de pretratamientto y dos ó tres etapas de proceso consecutivas, es decir un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y, dependiendo del producto final deseado, opcionalmente un proceso de isomerización.

Pre-tratamiento de almidón nativo El almidón nativo consiste de granulos microscópicos que son insolubles en agua a la temperatura ambiente. Cuando un sólido de almidón acuoso se calienta, los granulos se hinchan y eventualmente revientan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante el proceso de "gelatinización" hay un incremento dramático en la viscosidad. Como el nivel de sólidos es 30-40 % en un proceso industrial típico, el almidón se ha diluido ó "licuado" de modo que pueda ser manejado. Esta reducción en viscosidad es hoy en día, principalmente obtenida por degradación enzimática.

Licuefacción Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en ramas más pequeñas y unidades lineales (maltodextrinas) por una a-amilasa (por ejemplo Termamyl™, disponible de Novo Nordisk A/S, Dinamarca) . El proceso de licuefacción se lleva a cano típicamente por aproximadamente 1-2 horas a aproximadamente 105-110 °C por aproximadamente 5 a 10 minutos seguido por aproximadamente 1-2 horas de aproximadamente 95 °C. El pH, generalmente se encuentra entre aproximadamente 5.5 y 6.2. a fin de asegurar una estabilidad enzimática óptima en estas condiciones, se añade calcio, por ejemplo, 1 mM de calcio (40 ppm de iones calcio libre) . Después de este tratamiento el almidón líquido tendrá un "equivalente dextrosa" (DE) de 10-15.

Sacarificación Después del proceso de licuefacción las maltodextrinas se convierten en dextrosa por adición de una glucoamilasa (por ejemplo AMG™, disponible de Novo Nordisk A/S) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (ver por ejemplo la Patente USA No. 4,335,208) ó una pululanasa (por ejemplo Promozyme™, disponible de Novo Nordisk A/S) (ver la Patente USA No. 4,560,651). Antes de esta etapa el pH se reduce a un valor inferior a 4.5, por ejemplo aproximadamente 3.8, manteniendo la temperatura alta (encima de 95 °C) por un período de por ejemplo, aproximadamente 30 minutos, para inactivar la a-amilasa de licuefacción para reducir la formación de oligosacáridos cortos llamados "precursores de panosa" los cuales no pueden ser hidrolizados apropiadamente por la enzima desramificante .

La temperatura se baja luego a 60 °C, se añaden glucoamilasa y la enzima desramificante, y se procede al proceso de sacarificación por aproximadamente 24-72 horas.

Normalmente, cuando se desnaturaliza la a-amilasa después de la etapa de licuefacción, una pequeña cantidad del producto comprende precursores de panosa los cuales no pueden degradarse por las pululanasas ó AMG. Si está presente durante la sacarificación, la amilasa activa desde la etapa de licuefacción, (por ejemplo, sin desnaturalización) , este nivel puede ser tan alto como 1-2 % ó igualmente mayor, lo cual es tanto más indeseable cuanto más bajos significativamente sean , los resultados de sacarificación. Por esta razón, se prefiere también que la a-amilasa sea una que sea capaz de degradar las moléculas de almidón en oligosacáridos largos, ramificados (tales como, el Fungamyl™- similares a las a-amilasas) preferentemente a los oligosacáridos ramificados más cortos .

Isomerización Cuando el azúcar, producto final, deseado es por ejemplo, jarabe de fructuosa concentrada, el jarabe de dextrosa puede convertirse en fructuosa por isomerización enzimática. Después del proceso de sacarificación el pH se incrementa hasta un valor en el rango de 6-8, preferiblemente aproximadamente 7.5, y el calcio se elimina por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte luego en jarabe de fructuosa concentrada que utiliza, por ejemplo, una glucosa isomerasa inmovilizada (tal como Sweetzy e™, disponible de Novo Nordisk A/S) .

Enzimas desramificantes Las enzimas desramificantes que pueden atacar a las amilopectinas se dividen en dos clases: isoamilasas (E.C. 3.2.1.68) y pululanasas (E.C. 3.2.1.41), respectivamente.La isoamilasa hidroliza a las uniones de la rama a-1, 6-D-glucosídica en amilopectina y dextrina de límite-ß y puede distinguirse de las pululanasas por la incapacidad de la isoamilasa para atacar al pululan, y por su acción limitada sobre las dextrinas de límite-a.

Cuando una a-amilasa "similar a Termanyl™" estabilizada acida se usa para el propósito de mantener la actividad amilasa durante el proceso completo de sacarificación (sin inactivación) , la especificidad de la degradación debería tomarse en consideración. En lo que a esto concierne, se desea mantener la actividad a-amilasa a lo largo de todo el proceso de sacarificación, puesto que permite una reducción en la adición de la a iloglucidasa, la cual es económicamente benéfica y reduce la isomaltosa, producto de condensación, AMG™, que incrementa, por consiguiente, el producto DE (equivalente a dextrosa) .

De la discusión anterior parece que el proceso de conversión de almidón conocido se efectúa en una serie de etapas, debido a los diferentes requerimientos de las varias enzimas en términos de por ejemplo, temperatura y pH. Sería deseable, sin embargo, poder diseñar una ó más de 'estas enzimas de modo que el proceso total pudiera efectuarse de una manera más económica y eficiente. Una posibilidad a este respecto es diseñar de otra manera las enzimas desramificantes termolábiles así como convertirlas estables a temperaturas superiores. La presente invención conciernen a tales enzimas desramificantes termoestables, el uso de las cuales proporciona un número de ventajas importantes que serán discutidas en detalle posteriormente.

También concierne a enzimas desramificantes de almidón son una especificidad de substrato alterado.

Breve descripción de la invención Un objeto de la presente invención es, por consiguiente, proporcionar enzimas desramificantes termoestables, por ejemplo pululanasas e isoamilasas, las cuales son adecuadas para uso a altas- temperaturas en un proceso de conversión de almidón, en particular que utiliza técnicas de ingeniería genética a fin de identificar u sintetizar variantes de enzimas adecuadas. Otro objeto de la invención es proporcionar nuevas enzimas desramificantes de almidón con una especificidad de substrato alterada.

En su aspecto más amplio, la presente invención puede por consiguiente caracterizarse como que concierne a nuevas enzimas desramificantes de almidón con propiedades mejoradas en términos de por ejemplo, termoestabilidad ó especificidad de substrato, así como también métodos para producir tales enzimas y el uso de tales enzimas en un proceso de conversión de almidón.

En un aspecto particular, la invención concierne a una variante de ingeniería genética de una enzima desramificante de almidón genitora, la variante de la enzima que tenga una termoestabilidad mejorada en un rango de pH de 4-6 comparado con la enzima genitora.

Otro aspecto de la invención concierne a variantes diseñadas genéticamente de una enzima desramificante de almidón genitora, la variante de la enzima que tenga una actividad incrementada hacia las amilopectinas y/ó glicógenos en comparación con la enzima genitora.

Un aspecto adicional de la invención concierne a un método para producir una variante de la enzima desramificante de almidón con termoestabilidad incrementada, el método que comprende las etapas de: - identificar uno ó más residuos de aminoácidos y/ó regiones de aminoácidos asociadas con termoestabilidad en una primera enzima desramificante de almidón genitora, identificar uno ó más residuos de aminoácidos homólogos y/ó regiones de aminoácidos en una segunda enzima deramificante de almidón genitora por medio de la alineación de las secuencias de aminoácidos de las primera y segunda enzimas desrarmificantes de almidón genitoras, t - mutar uno ó más de los residuos de aminoácidos homólogos y/ó regiones de aminoácidos en la segunda enzima desramificante de almidón genitora para producir una variante de enzima con termoestabilidad incrementada.

Un aspecto aún adicional de la invención concierne a un método para producir una variante de enzima desramifícante de almidón con especificidad de substrato alterada, el método que comprende las etapas de: - identificar uno ó más residuos de aminoácidos en al menos un bucle de aminoácidos asociado con especificidad hacia un substrato deseado en una primera enzima desramificante de almidón genitora, - identificar uno ó más residuos de aminoácidos en al menos un bucle que corresponde a una segunda enzima desramificante de almidón genitora por medio de la alineación de las secuencias de aminoácidos de las primera y segunda enzimas desramificantes de almidón genitoras, y - mutar uno ó más de los residuos de aminoácidos homólogos en al menos un bucle de la segunda enzima desramificante de almidón genitora para producir una variante de enzima con especificidad de substrato alterada.

El término "bucle" significa, al menos en el contexto de la presente invención, la parte de la secuencia que sigue la parte de la cadena beta/ laminar de la secuencia en cuestión. Dicha "cadena beta/laminar" puede identificarse por alineación de secuencias múltiple de secuencias de la presente invención y las secuencias con una estructura tri-dimensional conocida. Tales alineaciones pueden hacerse utilizando programas de alineación estándares, disponibles de por ejemplo, el paquete UWGCG (Manual del Programa para el Paquete Wisconsin, versión 8,Agosto de 1994, Group Computer Genetics, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) .

Estructuras enzimáticas tri-dimensionales conocidas están disponibles de Brookhaven Databank. Ejemplos de tales son la estructura tridimensional de la a-amilasa de Aspergillus oryzae TAKA (S ift y colaboradores, 1991), el aminoácido de Aspergillus níger (Brady y colaboradores, 1991), la estructura de la a-amilasa pancreática de cerdo (Qian y colaboradores, 1993), y la a-amilasa de cebada (Kadziola y colaboradores, 1994), Journal of Molecular Biology 239: 104-121; A. Kadziola, Tesis, Departamento de Química, U. De Copenhague, Dinamarca) .

La invención concierne además a un método para convertir almidón a uno ó más azúcares, el método que comprende desramificar el almidón utilizando al menos una variante de enzima como la descrita en la presente.

Descripción detallada de la invención En el presente contexto, el término "termoestable" se refiere en general al hecho de que las variantes de enzimas desramificantes conforme a la invención tienen una termoestabilidad mejorada comparada con la enzima genitora apropiada. El grado de mejora en termoestabilidad puede variar de cuerdo a factores tales como la termoestabilidad de la enzima genitora y el uso que se pretende de la variante de la enzima, por ejemplo, ya sea si se pretende usarla primariamente para licuefacción ó para sacarificación ó para ambas. Será obvio de la dicusión anterior que para sacarificación, la variante de la enzima deberá mantener un grado substancial de actividad enzimática durante la etapa de sacarificación a una temperatura de al menos aproximadamente 63 °C, preferiblemente al menos aproximadamente 70 °C, mientras que una variante de la enzima diseñada para uso en la etapa de licuefacción debería ser capaz de conservar un grado substancial de actividad enzimática a una temperatura de al menos 95 °C.

La ter oestabilidad mejorada de las variantes enzimáticas de acuerdo a la invención pueden en particular definirse de acuerdo a uno ó más de los siguientes criterios .

En una modalidad, la variante enzimática de la invención tiene una termoestabilidad mejorada como la definida por calorimetría de exploración diferencial (DSC) utilizando el método descrito a continuación.

En otra modalidad, la variante enzimática de la invención tiene una termoestabilidad mejorada como se define por un incremento en el tiempo medio T1/2) de al menos aproximadamemente 5 %, preferiblemente al menos de 10 %, más preferiblemente 15 % , más preferiblemente al menos aproximadamente 25 %, más preferiblemente al menos de aproximadamente 50 %, tal como al menos 100 %, en "ensayo de ?2 para licuefacción" descrito en la presente, utilizando un pH de 5.0 y una temperatura de 95 °C. Las variantes enzimáticas conforme a esta definición son adecuadas para usar en la etapa de licuefacción del proceso de conversión del almidón.

Alternativa ó adicionalmente, una variante enzimática adecuada para usar en licuefacción puede definirse como que tiene una termoestabilidad mejorada como se definió por un incremento de actividad enzimática residual de al menos aproximadamente 10 % , más preferiblemente de al menos 15 %, más preferiblemente al menos aproximadamente 25 2 , más preferiblemente al menos aproximadamente 50 %, en el "ensayo para actividad residual después de licuefacción" descrito en la presente, utilizando un pH de 5.0 y una temperatura de 95 °C.

En una modalidad adicional, la variante enzimática de la invención tiene una termoestabilidad mejorada como se definió por un incremento en el tiempo medio (Ti,-) de al menos 5 % , preferiblemente de al menos aproximadamente 10 %, más preferiblemente de al menos 15 % , más preferiblemente de al menos aproximadamente 25 %, más preferiblemente de al menos aproximadamente 50 , tal como al menos 100 %, en el "ensayo de T1 2 para sacarificación" descrito en la presente, utilizando pH de 4.5 y una temperatura de 70 °C, Tales variantes son adecuadas para usar en la etapa de sacarificación del proceso de conversión de almidón.

Alternativa ó adicionalmente, una variante enzimática adecuada para sacarificación puede definirse como que tiene una termoestabilidad mejorada como se definió por un incremento de la actividad enzimática residual de al menos aproximadamente 5 %, preferiblemente de al menos aproximadamente 10 , más preferiblemente de al menos 25 % , más preferiblemente de al menos 50 %, en el "ensayo para actividad residual después de sacarificación" descrito en la presente, que utiliza un pH de 4.5 y una temperatura de 63 °C. Preferiblemente, esta termoestabilidad mejorada se observa también cuando se corre el ensayo a una temperatura de 70 °C.

El término "activa substancialmente" como se usa en la presente para una variante enzimática dada y un grupo de condiciones dadas de temperatura, pH y tiempo significa que la actividad enzimática relativa de la variante enzimática es al menos de aproximadamente 25 %, preferiblemente a.l menos aproximadamente 50 % , en particular de aproximadamente 60 % , especialmente al menos 70% tal a io al iteres aprKmBdarepte 9C%, 933%, p ejeiplo al itßzce ípax±iBckrtarrtB de 9 Q tparca±) srn la acüv rfed relati a de la erredira cimitarra trajo el gtu o ce carrrüciarrfis dadas mencionadas en conexión con la termoestabilidad mej orada exacta anterior .

Una variante enzimática "derivada de" una enzima dada (una "enzima genitora") significa que la secuencia de aminoácidos de la enzima genitora ha sido modificada, por ejemplo por substitución, eliminación, inserción y/ó transferencia de bucle como se describe a continuación, para dar como resultado la variante enzimática. En el caso de una enzima genitsra producida por un organismo tal como un microorganismo, en donde una variante enzimática de acuerdo a la invención se deriva de la enzima genitora, la variante enzimática puede producirse por transformación apropiada de la misma ó un microorganismo similar u otro organismo usado para producir la enzima genitora.

Una ventaja de las enzimas desramificantes termoestables de la invención es que hacen lo posible por efectuar la licuefacción y desramificar simultáneamente antes de la etapa de sacarificación. Esto no ha sido posible anteriormente, puesto que las pululanasas e isoamilasas conocidas con actividad específica aceptable son termolábiles y son inactivadas a temperaturas aproximadamente de 60 °C. (se conocen algunas pululanasas termoestables de Pyrococcus , pero éstas tienen una actividad específica extremadamente baja a temperaturas más altas y son por consiguiente inadecuadas para los propósitos de la presente invención) . Para desramificar, utilizando las enzimas desramificantes termoestables de la invención, durante la licuefacción junto con la acción de una a-amilasa, la formación de precursores de panosa se reduce, reduciendo con esto el contenido de panosa en el producto final e incrementando el rendimiento total de sacarificación. Es también posible de esta manera extender el tiempo del proceso de licuefacción sin riesgo de formación de gran cantidad de precursores de panosa. Para prolongar ia etapa de licuefacción, el rendimiento de DE se aumenta de 10-15 hasta por ejemplo 15-20, reduciendo la necesidad de glucoamilasa. Este requerimiento de reducción de glucoamilasa es a su vez ventajosa cuando la formación de isomaltosa indeseable se reduce, por lo que dá como resultado un aumento en el rendimiento de glucosa. Además, -L. -ucoaiüilasa reducida fac -uita ademas que j.a etapa de sacarificación sea llevada a cabo a una concentración de substrato elevada (DS, substancias secas, concentración más altas) que lo normal aprox. 30-35 i usado de acuerdo a lo anterior en la metaria. Esto permite costos de evaporación reducidos al final del proceso, por ejemplo, en un proceso de jarabe de maíz rico en fructuosa, y el tiempo de de reacción de la sacarificación puede también reducirse, con lo que la capacidad de producción se incrementa. Una ventaja adicional es que la a-amilasa usada en el proceso de licuefacción no necesita ser inactivada/ desnaturalizada en este caso.

Además, es posible usar las enzimas desramificantes termoestables conforme a la invención durante la sacarificación, lo cual es ventajoso por varias razones. En el proceso de sacarificación de almidón convencional, la temperatura del p-.or-eso no es más de 60 °C debido al hecho de que ni la enzima de sacarificación pululanasa ni AMG™ son suficientemente termoestables para permitir usar una temperatura superior. Esto es una desventaja, sin embargo, como sería muy deseable correr el proceso a una temperatura de aproximadamente encima de 60 °C, en particular encima de 63 °C, por ejemplo aproximadamente 70 °C, para reducir el crecimiento bacteriano durante la etapa relativamente larga de sacarificación. Además, una temperatura de proceso superior norma!. mente dá una actividad superior por mg de enzima (actividad específica superior) , con lo que se hace posible reducir ia c entidad en peso de la enzima usada y/ó obtener una actividad enzimática total más alta. Una temperatura más al,a puede también dar como resultado una alto contenido de materia seca después de sacarificación, lo cual puede ser r.enéfico en términos de reducir el costo de la evaporació-i.

Aunque una isoamilasa termoestable debe considerarse como que es más benéfica que una pululanasa cuando se usa en el proceso de licuefacción, puesto que las isoamilasas están ' caracterizadas por su especificidad hacia amilopectinas y actividad sobre dextrinas de peso molecular más alto, una alternativa preferida es alterar la especi icidad de una puiulanasa tanto como para ser más "similar a isoamilasa" en el sentido de tener actividad mejorada nacía dextpnas de cadena rami-icada mas -arga. Entre las varias pululanasas hay diferencias substanciales a este respecto, igualmente entre las pululanasas del mismo origen de Bacill us .

Métodos para determinarla estabilidad y actividad -dad La termoestabilidad de las pululanasas e isoamilasas puede detectarse por medida de la actividad residual por incubación de la enzima bajo condiciones de fatiga acelerada, ias cuales comprenden: pH 4.5 en 50 mM de un regulador de acetato de sodio sin una matriz de dextrina estabilizante (tal como la de aproximadamente 35 % de materia seca que está normalmente presente durante la sacarificación) . La estabilidad puede determinarse a isotermas de por ejemplo 63 °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C y 95 °C, midiendo la actividad residual de las muestras tomadas de un baño de agua a intervalos regulares (por ejemplo 5 ó 10 min) durante un período de tiempo de una hora. Para determinar la estabilidad para ei propósito de licuefacción, se utilizan un pH de 5.0, una temperatura de 95 °C y un tiempo de ensayo total de 30 minutos ("ensayo para actividad residual después de licuefacción") . Para determinar la estabilidad para el propósito de sacarificación, se utiliza un pH de 4.5, una temperatura de 63 °C ó 70 °C y un tiempo de ensayo total de 30 minutos ("ensayo para actividad residual después de sacarificación") .

Alternativamente, la termoestabilidad puede expresarse como "tiempo medio" (T:,_), el cual se define como el tiempo, bajo un grupo de condiciones dadas, a las cuales la actividad de la enzima que se está ensayando se reduce a 50 . de la actividad inicial al principio del ensayo. En este caso, el "ensayo de T:,_ para licuefacción" utiliza un pH de 5.0 y una temperatura de 95 °C, mientras que el "ensayo de t:,_ para sacarificación" utiliza un pH de 4.5 y una temperatura de 70 °C. El ensayo se efectúa diferentemente a co o se describió anteriormente para los ensayos respectivos para actividad residual.

Actividad: Método de Somogyi-Nelson para determinación de azúcares reductores La actividad de ambas, puiulanasas e isoamilasas, puede medirse utilizando el método de Somogyi-Nelson para la determinación de azúcares reductores (J. Biol. Chem. 153, 375 (194) ) . Este método se basa en ei principio de que el azúcar reduce los iones cúpricos a óxido cuproso, el cual reacciona con un reactivo molibdato arseniato para pf-r1oducir un color azul que se mide espectrofotométricamente. La solución a ser medida debe contener 50-600 mg de glucosa por litro. El procedimiento para el método de Somoglyi-Nelson es como sigue: Valor muestra : Pipetear 1 ml de solución de azúcar en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de reactivo de cobre. Tapar el tubo de ensayo con una perla de vidrio. Colocar el tubo de ensayo en un baño de agua hirviente por 20 minutos. Enfriar el tubo de ensayo. Añadir 1 ml de reactivo para desarrollo del color de Nelson. Agita el tubo de ensayo son invertirlo. Añadir 10 ml de agua desionizada. Invertir el tubo de ensayo y agitar vigorosamente.

Medir la absorbancia a 520 nm, invertir el tubo de ensayo una vez inmediatamente antes de la transferencia del líquido a la celdilla.

Valor del blanco: el mismo procedimiento que para el valor muestral, pero con agua en vez de la solución de azúcar.

Valor estándar: El mismo procedimiento que para el valor muestral.

Cálculos En ia región 0-2 la absorbancia es proporcional a la rantidad de azúcar. 100 (muestra - blanco) [estándar - blanco) (muestra - blanco) . de glucosa 100 X (estándar - blanco) Reactivos : 1. Reactivo de cobre de Somogyi Se disuelve 35.1 g de Na-HP04.2H;0 y 40.0 g de tartrato sodio y potasio en desionizada. Se añaden 100 ml de hidróxido de sodio ÍN y 80 ml de sulfato cúprico al 10 =. Se disuelven 180 g de sulfato de sodio anhidro en la mezcla, y el volumen se lleva a 1 litro con agua desionizada.

... Reactivo para desarroxxo de± coxor de Ne±son Se disuelven 50 g de molibdato de amonio en 900 ml de agua desionizada. Luego se añaden 42 ml de ácido sulfúrico concentrado, seguido por 6 g de biarseniato disódico heptahidratado disuelto en 50 mi de agua desionizada, y el volumen se lleva a un litro con agua desionizada. La solución se deja en reposo por 24-48 horas a 37 °C antes de usarla y se almacena en ia obscuridad en un frasco obscuro con un tapón de vidrio. 3. Estándar Se disuelve 100 mg de glucosa (anhidra) en 1 litro de agua desionizada.

Especificidad de substrato Se describen métodos para la determinación y caracterización del perfil de acción y especificidad de las pululanasas e isoamilasas para varios substratos (por ejemplo amilopectira, glicógeno y pululan) en Kainuma y colaboradores en Carbohydrate Research, 61 (1978) 345-357. Utilizando estos . étodos, puede determinarse la actividad relativa de una isoamilasa ó una puiulanasa, y puede evaluarse la actividad relativa de una variante enzimática conforme a la invención comparada a ia actividad relativa de la enzima genitora, por ejemplo para determinar si una variante de pululanasa tiene el aumento de especificidad deseada hacia sacáridos de alto peso molecular tal como amixopectina en corrrparación con xa enzima genitora.

Conversión de r-imidón - Como se indicó anteriormente, en una modalidad de la invención, el pro..-eso de conversión de almidón comprende ia desramifice cien utilizando una enzima desramificante termoestable de la invención durante la etapa de licuefacción juií o con una a-amilasa. La etapa de licuefacción es ".-Típicamente llevada a cabo a un pH entre 4.5 y 6.5, por ejemplo desde 5.0 hasta 6 2, a una temperatura en el rango de 95-110 °C por un período de 1 a 3 horas, preferiblemente aproximadamente 1.5 - 2 horas. Se prefiere, sin embargo, que el pH sea tan bajo como sea posible, por ejemplo de 4.5 a 5.0, mientras que las enzimas usadas para la licuefacción tienen una estabilidad suficiente al pH en cuestión. Si la "-amilasa es dependiente de calcio, se puede añadir calcio en una cantidad de 30 a 50 ppm, tales como alrededor de 40 ppm (ó 0.75 a 1.25 mmM, tal como alrededor de 1 mM) en la etapa de licuefacción para estabilizar la enzima. Como se explicó anteriormente, la a-amilasa no necesita ser inactivada después de la etapa de licuefacción para la formación de panosa reducida en este caso.

Ejemplos de a-amilasas específicas que pueden usarse en la etapa de licuefacción incluyen a-amilasas de Bacill us licheniformi s, tales como los productos Termamyl®, Spezyme® AA, Spezy e® Delta AA, axamyl® y Kleistase®, comercialmente disponibles, y las mutantes de a-amilasa descritas en WO 96/23874 (Novo Nordisk) y PCT/DK97/00197 (Novo Nordisk) .

Las isoamilasas que pueden usarse como enzimas genitoras conforme a la invención incluyen, pero no se limitan a, la isoamilasa termoestable derivada la acrhaebacterium Sulfolobus acidocaldari us termofílica (Maruta, K. y colaboradores, (1996) , Biochimica et Biophysica Acta 1291, p. 177-181), la isoamilasa de Rhodother us marlnus (por ejemplo la isoamilasa de la SEC ID NO 3) y la isoamilasa de Pseudomonas, por ejemplo Pseudomonas amyl oderamosa (por ejemplo Pseudomonas amyl odera osa isoamylase descrita en la base de datos EMBL con número de acceso J03871 ó GeneBank con número de acceso Ejemplos de pululanasas que pueden usarse como una enzima genitora incluyen, pero no se limitan a, una pululanasa termoestable de por ejemplo Pyrococcus ó una pululanasa diseñada de proteína desde por ejemplo una cepa de Bacill us tal como Bacill us acidopull ulyti cus (por ejemplo Promozyme™ ó la SEC ID NO 1) ó Bacill us deramificans (por ejemplo la SEC ID NO 2; ó la pullulanasa de Bacillus deramificans con No. de acceso GeneBank Q68699) .

Mientras los métodos para sacarificación, anteriores en la materia emplean una temperatura de no más de aproximadamente 60 °C, la presen-te invención proporciona enzimas desramificantes termoestables que pueden permanecer activas a temperaturas más latas, por ejemplo al menos aproximadamente 63 °C y preferiblemente al menos aproximadamente 70 °C para eliminar las posibilidades de crecimiento microbiano. Ejemplos de glicoamilasas adecuadas para sacarificación incluyen glucoamilasas de Aspergillus niger, tales como AMG™. El proceso de sacarificación típicamente procede en aproximadamente 24-72 horas a un pH de aproximadamente 4.0-4.5, preferiblemente aproximadamente 4.0.

Cuando el azúcar final, producto es por ejemplo jarabe rico en fructuosa de aproximadamente 50 % de jarabe de fructuosa, la D-glucosa formada es isomerizada por una isomerasa a un pH de alrededor de 6-8, preferiblemente aproximadamente 7.5. Un ejemplo de una isomerasa adecuada es una glucosa isomerasa tal como la glucosa isomerasa derivada de Streptomyces urinus . La isomerasa puede ser una glucosa isomerasa inmovilizada, tal como Sweetzy e®. es normalmente eliminado si se añade antes de la licuefacción.

Tecnología de pululanasas e isoamilasas Las pululanasas e isoamilasas son miembros de 1 a familia de 13 amilasas (Henrissat, B. Y colaboradores, Biochem J. 293:781-788, 1993). Este sugiere que tienen la misma estructura total en la parte central de la molécula que consiste de una región A, B y C. Las regiones B varían muy dramáticamente en talla y estructura, mientras que las otras dos regiones se cree que generalmente poseen un alto grado de homología. La región A se compone generalmente de una estructura alfa-8/beta-8 (una beta-cilindrica) y 8 bucles entre las cadenas beta y las hélices alfa (sin embargo, una helicoidal puede en ciertos casos estar ausente) . Las secuencias vienen desde la parte de la cadena beta del punto cilíndrico-beta hacia ia región enlazante del substrato. Estas regiones son de particular interés para la especificidad de la enzima (Svensson, B. Y colaboradores, Biochemical Society Transactions, Vol. 20; Me Gregor, J. Prot. Chem. 7: 399, 1988). Sin embargo, para utilización de la información acerca de secuencias específicas y así como también estrategias generales para analizar secuencias de pululanasas e isoamilasas, ia presente invención proporciona los instrumentos necesarios para facilitar al ingeniero de estas enzimas producir variantes con termoestabilidad y/ó especificidad mejoradas.

Listado de Secuencias El de secuencias se me c presente.

SEC ID NO: 1: pululanasa de Bacill us acidopull ulyticus SEC ID NO: 2: pululanasa de Bacill us deramificans SEC ID NO: 3 + SEC iD NO 12: isoamilasa de Rhodothermus marinus ?EC ID NO: 4: isoamilasa de Pseudomonas amyloderamosa JD270 (Chen, JK y colaboradores (1990) Bioche ica et Biophysica Acta 1087, páginas 307-315) (base de datos SEC ID NO: 5: pululanasa de Klebsiella pneumoniae (Kornacker y colaboradores, Mol. Microbiol. 4: 73-85 (1990) SEC ID NO: 6: pululanasas de Klebsiella aerogenes (Katsuragi y colaboradores, J. Bacteriol. 169:2301-2306 (1987) ) SEC ID NO: 7: isoamilasa de Pseudomonas sp. SMP1 (Tognoni, A. y colaboradores, Patente USA No. 5,457,037) SEC ID NO: 8: isoamilasa de Favobacterlu odoratu (JP 96239-81, Susumu Hizukuri y colaboradores) SEC ID NO: 9: isoamilasa de Sulfolobus acidocaldarl us, ATCC 33909 (BiocLi ica et Biophysica Acta 1291 (1996) 177-181,Kazuhiko Marut i y colaboradores9 ?EC ID NO: 10: isoamiiasa de Sulfolobus solfa taricus (No. de Acceso de GeneBank : Y08256) .

SEC ID NO: 11: isoamilasa de maíz, Zea mays (Acceso SEC gen pulB de Bacillus acldopull ulyticus (SEC ±o. U L' er r-Hvi ra - S Z)?L-?-.1. . i it3.SQS La Fig. 1 ac"unta muestra la secuencia de aminoácidos de cuatro pului-ir.asas diferentes así como también una alineación de asras secuencias. Con base en la información proporcionada per esta alineación, es posible efectuar substituciones por homología a fin de obtener las características deseadas de termoestabilidad y/ó especificidad de substrato alterada mejoradas.

Las cuatro secuencias son las SEC ID NOS: 5, 6, 1 y 2.

Estructura de isoamiiasas La Fig. ¿. adjun a muestra .a secuencia de amino cidos de siete isoamilasas diferentes así como también una alineación de estas secuencias. Con base en la información proporcionada por esta alineación, es posible efectuar substituciones por homología por homología a fin de obtener las características deseadas de termoestabilidad y/ó especificidad de substrato alterada mejoradas.

Las siete secuencias son las SEC ID NOS: 4, 7, 8, 9, xu, J y xx.

La estructura de rayos-X de la isoamilasa de Pseudomona amy lo der amos a se ha publicado recientemente en la_ base de datos de Brookhaven con el No. 1BF2. La estructura confirma la vista completa del método de alineación de la secuencia, pero también expone ciertas diferencias en la alineación sugerida. El número de bucles corregido deducido de la estructura 3D de ia isoami Pseudomonas amyl oderamosa (1BF2) se exponen a continuación: Bucle Sugerido Deducido de la estructura 1. 210-230 2. 250-292 251-295 319-376 319-330 401-436 401-436 461-479 461-468 482-485 482-503 530-539 533-580 605-636 606-636 Alineación de pululanasas e isoamilasas La figura 3 adjunta expone una "alineación clave" de pululanasas e isoamilasas seleccionadas (las de las SEC ID NOS: 1, 2, 3 y 4), en otras palabras una mejor adaptación de alineación de residuos de aminoácidos homólogos en las secuencias respectivas. Los paréntesis (" ") indican posiciones de cadenas beta supuestas. Cada grupo de paréntesis es seguido por un número de bucles, que indicarla posición en la secuencia de los bucles. La información sobre de Los bucles individuales se encuentra en la Tabla 1 posterior.

Puede determinarse los residuos desde la nueva secuencia homologa hasta los residuos en las secuencias de la alineación clave, por comparación de las secuencias en su mayoría homologa de la "alineación clave" de dos ó más enzimas desramificantes de almidón apropiadas, y alineación de estas dos secuencias. La homología puede encontrarse por ejemplo por utilización del programa GAP del paquete UWGCG (Manual del programa para el Paquete Wisconsin, versión 8, Agosto de 1994, Genetics computer Group, 575 Science Drive, madison, Wisconsin, USA 53711) . La nueva secuencia puede entonces colocarse en ia ineación clave por utilización de un programa de edición de textos u otro programa de cómputo adecuado .

La tabla 1 posterior proporciona información sobre la localización de regiones de interés seleccionadas en los varios bucles de las pululanasas e isoamilasas seleccionadas, estas regiones de los bucles son de interés con respecto a la modificación para producir variantes énzimáticas conforme a la invención. El bucle 3 que sigue constituye la región B (MacGregor, 19S8), mientras los otros bucles pertenecen a la región A.

Tabla 1 Cuando se enlista más de una región para una enzima y bucle dado en la Tabla 1, la región enlistada primero (por ejemplo a) es en cada caso la longitud esperada del bucle en cuestión. La próxima región (por ejemplo b) es la región preferida para modificación y la última región (por ejemplo c) es más preferida.

Para efectuar modificaciones, por ejemplo, substituciones, eliminaciones, inserciones y/ó transferencia de bucles, en uno ó más de estos bucles las proteínas ^diseñadas que tienen las propiedades deseadas en términos de termoestabilidad y/ó especificidad de substrato alterada mejoradas pueden producirse. Una variante enzimática conforme a la invención puede comprender cualquier combinación apropiada de una ó más substituciones, eliminaciones, inserciones y/ó transferencias de bucles para obtener las características deseadas de termoestabilidad y/ó actividad alterada mejoradas .

La región en bucle de la SEC ID NO: 1, ver 369-397 (región denominada a) , puede conforme a la invención ser reemplazada apropiadamente con la región correspondiente colocada espacialmente de la SEC ID NO: 4, por ejemplo 176-195 (ver la denominada a) . Adicionalmente, la región 371-385 del bucle 1 (SEC ID NO: 1) (ver la denominada b) puede correspondientemente ser reemplazada con la región 179-193 del bucle 1 (SEC ID NO: 4) (ver la denominada b.).

En el presente contexto, una nomenclatura simplificada se usa para indicar substituciones de aminoácidos en una posición dada. Por ejemplo "G810" se refiere a la substitución de u-i ^esiduo de glicina en posición 81 con un residuo de prol..na, y "F489G,A" se refiere a la substitución de un residuo de fenilalanina en posición 489 ya sea con glicina ó alanina.

Tecnología para termoestabilidad mejorada Cuando la tecrología para termoestabilidad mejorada, una u otra ó ambas de ias primera y segunda enzimas genitoras pueden ser una isoamilasa ó una pululanasa. Para obtener termsestat "lidad mejorada de isoamilasas y pululanasas, nes enf acarnos especialmente sobre la región B, la cual se ha demostrado que es importante para estabilidad, utilizando información de homología de secuencias como acicionalmente se describe a continuación.

TermoestabiIxdad- homología de secuencia Se usaron varias aproximaciones diferentes con ei propósito de obtener termoestabilidad incrementada, que incluyen substituciones proiina, substituciones Gly a Ala y substituciones Asn y Gln. Detalles y ejemplos adicionales de estas aproximaciones de proporcionan a continuación.

Substituciones prolina Substituciones proiina, por ejemplo reemplazar uno ó más residuos de aminoácidos diferentes de prolina con un residuo de prolina, se sugiere como un intento para obtener termoestabilidad sobre las bases de alineación de secuencias de isoamilasas y pululanasas. Ejemplos de posibles substituciones de prolina se proporcionan en lo siguiente.

Isoamilasas : En la isoamilasa de P. amiloderamosa (SEC ID NO: 4): Las posiciones para ias substituciones prolina incluyen G81P, G99P, T18P, T199P, Q202P, T221, Q226P, A238P, T278P, R286P, A294P, G467P, G64P, V67P, E69P, A549P, G713P, G713P y D736P, y preferiblemente S356P, T376P, T278P, N348P y S454P.

En la isoamilasa de R. marinus (SEC ID NO: 3) : Posiciones para la substitución prolina incluyen G154P, N305P 'y N669P, y preferiblemente R588P y K480P.

Pululanasas : En la pululanasa de B. Acidopullulyticus (SEC ID NO: 1) : Las posiciones preferidas incluyen A210P, V215P, L249P, K383P, S509P, T811P y G823P.

En la pululanasa de B. deramificans (SEC ID NO: 2) : Las posiciones preferidas incluyen G306P, V311P, L345P, D605P, T907P y A919P.

Substi tuciones Gly a Ala : por ejemplo: En ia isoamilasa de P. amyl oderamosa (SEC ID NO: 4) : G181A Substituciones- Asn (N) y Gln (Q) : Los nuevos residuos se seleccionan de todos los 20 posibles residuos de aminoácido-s, pero preferiblemente residuos en una posición de homólogos como se ve de la alineación de la secuencia, Leu, lie, Phe, Ala, Thr, Ser, y Tyr que son preferidos . De especial . nf perres siguientes : Bucle 1: N379, N384 Bucle 2: N426, Q432, N434, N437, N444, N446 Bucle 3: N486, N490, Q502, N512, N515, N521 Bucle 4 : Bucle 5: Q596 Bucle 6: N61 , N621, Q628 Bucle 7: N679, N681, Q684 UCxe b: IX I M Z. , N/31, ? y>? c i r T ? MO . • Bucle 2: N522, N533, N590 Bucle 3: N585, N608, N611, N617 Bucle : — Bucle 5: Q691, Q698 Bucle 6: N712, N717 Bucle 7: N764, N775 Bucle 8: N815, N817, N820 SEC ID NO: UC±C -L - Bucle 2: N227, N232 Bucle 3: N286, N305, N314, N315, N327, N333 Bucle 4: — Bucle 5: Q405 Bucle 6: — Bucle 7: N482, N485, N489, N496, .N500, Q513 Bucle 8: N54, N548, N549, Q553, N555, N560, Q562 SEC ID NO: 4 Bucle 1: Q218, Q225- Bucle 2: Q254, Q257, N258, N261, N266, N270, Q271, N272, N280 Bucle 3: N322, N348, N358, Q359, N364, N370, N372, N375. Bucle 4: N408, N412, N421, N424, N428 Bucle 5: N468, Q471, Q477 Bucle 6: -- Bucle 7: N547, N550, N551, 553, N567, Q572 Bucle 8: Q615, N617, N618, N619, N622 Las modificaciones en los bucles 2 y 3 son de particular interés con respecto al mejoramiento de la termoestabilidad. El bucle 2 es de interés debido a sus interacciones con otra región en la parte N-terminal de la secuencia. El bucle 3 es de interés debido a posible asociación con un sitio enlazante de calcio localizado entre la región A y la región B.

Tecnología para especificidad de substrato alterada Cuando la tecnología para especificidad de substrato alterada, una u otra 6 ambas de las primera y segunda enzimas genitoras pueden ser una isoamilasa ó una pulular-asa, aunque esto os de particular interés para propósitos de la presente invención obtener especificidad mejorada de pululanasas hacia el material almidonada ramificado de peso molecular más alto tal como glicógeno y amilopectina, en otras palabras una transferencia de especifidad "amilasa-similar" a una pululasa, por ejemplo por medio de modificaciones en los bucles 1-8, prexepbxemente los bucles 1, 2, 4 y 5.

Para la transferencia de actividad isoamilasa-similar a pululanasas una transferencia de bucle de una isoamilasa a una pululanasa es de particular interés, por ejemplo por inserción del bucle 5 desde una isoamilasa en el sitio del bucle 5 de una pululanasa, ó por inserción del bucle 1 desde una isoamilasa en el sitio del bucle 1 de una pululanasa con la numeración indicada en la Tabla 1.

Actividad, homología de secuencias y cadenas beta, hélice-alfa y bucles completos, en la información secuencia! La actividad, una u otra actividad específica ó especificidad, pueden ..ser transferidas a pululanasas, utilizando la infirmación secuencial desde por ejemplo la isoamilasa de P. an, 2 l oder amos a (SEC ID NO: 4) (actividad de isomailasa alta) . También actividad, una u otra actividad espec •i.r-Fi.ca o especiriciaaa, pueden ser transteriaas a isoamilasas, utilizando la información secuencial desde por ejemplo pululanasas de B. acidopull ulyticus (SEC ID NO: 1). Los bucles se analizan por residuos específicos presentes específicamente en el comienzo de la secuencia bucle, desde el final de la cacena-beta en isoamilasas (ó cadena-beta sugerida en pui xarasas) .

Los cambios sugeridos ejemplificados posteriormente se aplican a todas la pululanasas en las posiciones homologas correspondientes a !as de las dos pululanasas discutidas: Aportación ce pululanasas con actividad similar a isoamiiasa : Esto puede obtenerse por substituciones en regiones bucles siguiendo las cadenas-beta en pululanasa de B. acidopull ulyticus (SEC ID NO: 1) y B. deramificans (S?C Para transferencia de la actividad alta de la amilasa de P. amyl oderamosa hacia materiales feculosos ramificados de peso molecular más alto a isoamilasas de R. marinus u otras isoamilasas, ó a pululanasas, una alineación de secuencias se efectúa como se describió anteriormente. Por evaluación de la homología de las secuencias y tomando en consideración la "estructura" de las enzimas como se describió anteriormente, se pueden deducir estrategias para La transferencia de actividad más alta desde P. amy lo der amos a se efectúa preferentemente sin pérdida de termoestabilidad de la isoamilasa de R. marinus en alg n grado substancial. Aunque puede generalmente ser difícil alterar la actividad del substrato sin alterar la termoestabilidad, se contempla que la presente invención mantendrá la obtención de una actividad más alta mientras al mismo tiempo mantener substancialmente la termoestabilidad alta en la isoamilasa de R. marinus así como también en las pululanasas más termoestables . Esto se hace posible alineando las isoamilasas y pululanasas a ser mutadas con la "alineación clave" y seleccionando las enzimas genitoras a ser mutadas así como también residuos y regiones de aminoácidos específicos para ser mutados utilizando información obtenida desde tales alineaciones de secuencias de aminoácidos.

La lista siguiente proporciona ejemplos de posibles 1Uilutaciones, basado en estos principios, que pueden efectuarse para obtener actividad más alta de R. marinus (SEC ID NO: 3) hacia los materiales feculosos de peso molecular alto.

Mutaciones para elevar la actividad de la SEC ID NO: 3: Bucle 1: K183E, L184Q, H185D, P186T, E187S, V1S8I, E190A, P191Q, preferido; 1184Q, P186T, E187S, P191Q Bucle 2: H222Q, A223E, K224T, V225Q, H226N, R228A, H229N,L230D, inserto dVPN entre 231 y 232, E232S, R233D, G23 A, L235N, R236Q, N242M, P243T, L244E, C245N, A248S, E250D, P251R preferido; K224T, V225Q, R228A, P251R Bucle 3: G289A, V293T, L294W, inserción de TSSDPTT entre 294 y 295, G295A, P296T, T297I, L298Y, F300W, I303L, R306A, A307T, K310?, A311L, D311L, D312T, P313S, N314G, eliminar P316, R317 , F318Y, L319F, V320Y, Y322N, T325I, N327A, T328N, L329F, D330N, V331T, G332T, P334T Preferido; P296T, R306A, P313S, eliminar P316, V331T, P334T Bucle 4: A404S, A405V, A407g Bucle 5: D3397A, V398I, P400G, G401N, G402S, V405L, H407G, W410Q, Q411G Bucle 6: R418L, Y419F, A422S, V423L, R425Q, F426A, W 27Q pr i p "7 - 4 ^QM. v "12Y.. L474V. 75Y Bucle 8 p i i-y j vW I I , S543L, Q5446L, H447q Mutagénesis en sitio dirigido Una vez que se ha aislado una isoamilasa ó pululasa que codifican a una secuencia de DNA, y se han identificado los sitios deseables para mutación, las mutaciones se introducen utilizando sligonuclótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos a Ios-lados de los sitios de mutación deseados. En un método específico, un gap de un solo filamento de DNA, la enzima que codifica a la secuencia, se crea en un vector que transporta el gen enzimático. Entonces, el nucleótido sintético, porta la mutación deseada, es fortalecida en una porción homologa del DNA de un solo filamento. El gap remanente es entonces insertado con la DNA polimerasa I (fragmento de Klenow) y la construcción se liga utilizando T4 igasa. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga y colaboradores, (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. La patente USA 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican a mutaciones múltiples por ejecución de alteraciones menores del cartucho. Sin embargo, una variedad igualmente grande de mutaciones pueden ser introducidas al mismo tiempo por el método de Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos de varias longitudes, pueden introducirse.

Otro método para introducir mutaciones en enzimas que codifican secuencias de DNA se describe en Nelson y Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, 147-151. Involucra la generación en tres etapas de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida por utilización de una cadena de DNA sintetizada químicamente como uno de los iniciadores en las reacciones de PCR. Desde el fragmento generado por PCR, un fragmento de DNA que lleva ia mutación puede aislarse por fragmentación con endonucleasas de restricción y reinsertarse en un plásmido de expresión.

Mutaqénesis aleatoria La mutagénesis casual o aleatoria se efectúa adecuadamente ya sea como mutagénesis casual localizada ó en región específica en al menos tres partes de gen que se traslada a la secuencia de aminoácidos expuesta en cuestión, ó sin el gen entero.

La mutagénesis casual de una secuencia de DNA que codifica a una enzima genitora puede ser convenientemente e - Ií- yc_ C-« ,- u. . a._3 ,C-4ta-_y p sr.n-la materia.

En relación a lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención concierne a un método para generar una variante de una enzima genitora, en la que la variante exhibe estabilidad térmica mejorada en relación a la genitora, el métoco que comprende : (a) someter a una secuencia de DNA que codifica a la enzima genitora a mutagénesis casual, (b) expresar a la secuencia de DNA mutada obtenida en la etapa (a) en una célula huesped, y (c) '3 r* ce ?s,l1u,-,i1as huespedes que expresan una variante enzimética que tiene una propiedad alterada (por ejemplo, estabilidad térmica) en relación a la enzima genitora .

La etapa (a) del método anterior de la invención es pref riblemente ei?ccuado utilizando iniciadores alterados.

Por ejempüo,- la mutagénesis casual puede efectuarse por utilización de un agente mutante químico ó físico, por uso de un oligonucleótido adecuado, ó por someter ia secuencia de DNA a PCR mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis casual puede efectuarse por uso de alguna' combinación de estos agentes mutantes. El agenta mutante puede, por ejemplo, ser uno de ios que inducen transiciones, transversiones, inversiones, mezclado, eliminaciones, y/ó inserciones.

Ejemplos de agentes mutantes químicos ó adecuados para el presente propósito incluye irradiación con rayos ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N' -nitro-nitrosoguanidina (MNNG) , O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etilmetano (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando tales agentes se utilizan, la mutagénesis se efectúa típicamente por incubación de la secuencia de DNA que codifica a la enzima a la enzima genitora a ser mutada en presencia del agente mutante seleccionado en condiciones adecuadas para que tenga lugar la mutagénesis, y seleccionar para el DNA mutado las propiedades deseadas.

Cuando la mutagénesis se efectúa por el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado ó aciculado con los tres nucleótidos no-genitores durante la síntesis del oligonucleótido en la posición en la que se han cambiado. El dopado ó acicalamiento puede darse de manera que se evitan los codones para aminoácidos indeseables. El oligonucleótido dopado ó acicula incorporarse en el DNA que codifica a ia enzima glucoamilasa por cualquier técnica publicada, utilizando por ejemplo, PCR, LCR ó cualquier DNA polimerasa y ligasa que se juzgue apropiada.

Preferentemente el dopado se lleva a cabo utilizando reración casual constante", en ia ., _ ? e-, i porcentaje de tipo-silvestre y mutación en cada posición es predefinida. Además, el dopado puede estar dirigido hacia una preferencia por la introducción de ciertos nucleótidos, y con esto una preferencia por la introducción de uno ó más residuos de aminoácidos específicos. El dopado puede hacerse, por ejemplo e modo que se permita la introducción de 90 de tipo salvaje y 10 ~ de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la selección de un esquema de dopado se basa en genética así como también inconvenientes estructurales de la proteína. El esquema de dopage puede hacerse por utilización del programa DOPE que, inter alia, asegura que la introducción de codones de detención se evite (Jensen, LJ, andersen, KV, Svendsen, A, y Kretzschmar, T. (1998) Nucleic • Acids Research 26: 697-702) .

Cuando se utiliza la mutagénesis generada por PCR, ya sea un gen no tratado ó tratado químicamente que codifica a una glucoamilasa genitora sometida a PCR bajo condiciones que aumentan la ¿esincorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leug y colaboradores, Technique, Vol. 1, 1989, pags. 11-15) .

Una cepa imitadora de E. coll (Fowler y colaboradores, Moiec. Gen. Genet, 133, 1974, pags 179-191), S. cerevisiae ó cualquier otro organismo microbiano puede usarse para la mutagénesis casual del DNA que codifica a la enzima por por ejemplo, transformación de un plásmido que contenga la enzima genitora en la cepa imitadora, desarrollar la cepa mutadora con el plásmido y aislar el plásmido mutado de la cepa mutadora. El plásmido mutado puede ser posteriormente transxormado en organismo de expresión.

La secuencia de DNA a ser mutada puede estar convenientemente presente en un acervo genómico ó de cDNA preparado desde un organismo que expresa a la enzima genitora. Alternativamente, la secuencia de DNA puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido ó un bacteriófago, el cual como tal puede incubarse con ó de otra manera expuesto al agente mutante. El DNA a ser mutado puede también estar presente en una célula huésped ya sea por que está integrado al genoma de dicha célula ó porque está presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el DNA para ser mutado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de DNA para ser sometida a mutagénesis casual es preferiblemente una secuencia de cDNA ó de DNA genómico.

En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de DNA mutada antes de efectuar la etapa de expresión b) ó la etapa "de cribado c) . Tal amplificación puede efectuarse de acuerdo a métodos conocidos en la materia, el método preferido actualmente es el de la amplificación generada por PCR que utiliza oligonucleótidos iniciadores con base en la secuencia de aminoácidos ó de DNA de la enzima genitora.

Posteriormente a la incubación con ó expuesta ai agente mutante, el DNA mutado se expresa por cultivo en células huéspedes adecuadas que transportan la secuencia de DNA en condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido tranformada con ia secuencia de DNA mutada, opcionalmente presente en un vector, ó uno que llevó la secuencia de DNA que codifica a la enzima genitora durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes adecuadas son las siguientes: bacterias gram positivas tales como Bacill us subtilis, Bacillus licheniformis, bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophil ue, Bacillus alkaliphilus, Bacillusamyloliquefaciens, Bacill us coagulans , Bacillus circulans, Bacill us lautus, Bacillus megateri um, Bacillus thuringiensis , Streptomyces lividans ó Streptomyces murinus; y bacterias gram negativas tales como E. Coli.

La secuencia de DNA mutada puede adicionalmente comprender una secuencia de DNA que codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia de DNA mutada.

Mutagénesis casual localizada La mutagénesis casual puede estar ventajosamente localizada en una parte de la enzima genitora en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima se han identificado como que son de particular importancia para una propiedad dada de la enzima, y cuando son modificadas se espera que den como resultado una variante que tenga propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima genitora se ha elucidado y relacionado con la función de ia enzima.

La mutagénesis casual, localizada, ó en región específica se efectúa convenientemente por uso de técnicas de mutagénesis generada por PCR como se describió anteriormente ó alguna otra técnica adecuada conocida en la materia. Alternativamente, la secuencia de DNA que codifica a la parte de la recuencia de DNA a ser modificada puede aislarse, por ejemplo, por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis por uso de alguno de los métodos de mutagénesis discutidos anteriormente.

Homología con otras enzimas genitoras En una modalidad, ia presente invención también concierne a variantes de polipéptidos genitores aislados que tienen una sec?.-r.-ncia de aminoácidos que tiene un grado de identidad ccn cualquiera de las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4 de al menos aproximadamente 60 z , preferiblemente al menos 70 % , preferiblemente al menos aproximadamente 80 l , preferiblemente al menos aproximadamente 92 , preferiblemente al menos 93 %, más preferiblemente aJ menos aproximadamente 95 % , igualmente más preferiblemente al menos 97 i , y más preferiblemente al menos aproximadamente 99 %, y que tienen actividad pululanasa ó isoamilasa (en lo sucesivo "polipéptidos homólogos") . En una modalidad preferida, los polipéptidos genitores homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por cinco aminoácidos, preferiblemente por cuatro aminoácidos, más preferiblemente por tres aminoácidos, igualmente más preferiblemente por dos aminoácidos, y más preferiblemente por un aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4.

La homología de la secuencia de aminoácidos puede determinarse como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia de la segunda. "Homología" (identidad) puede ser determinada por uso de algún algoritmo convencional, preferiblemente por uso dei programa gap del paquete GCG versión 8 (Agosto de 1994) utilizando valores falsos para gap en desventaja, por ejemplo, una creación de gap en desventaja de 3.0 y extensión de gap en desventaja de 0.1 (Genetic Computer Group 81991) Manual del Programa para el paquete GCG, versión 8, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) .

Preferiblemente, los polipéptidos genitores comprenden las secuencias de aminoácidos de alguna de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4; ó variantes alélicas de los mismos; ó un fragmento de éstos que tengan actividad pululanasa ó isoamilasa.

Los fragmentos de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 son polipéptidos que tengan uno ó más aminoácidos eliminados de terminus amino y/ó carboxilo de estas secuencias de aminoácidos.

Las variantes alélicas denotan cualquiera de dos ó más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo cromosoma locus. Lae variaciones alélicas aumentan naturalmente en el transcurso de la mutación, y puede dar como resultado polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser imperceptibles (ningún cambio en el poiipéptido codificado) ó puede codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido que codifica para una variante aléiica de un gen.

En otra modalidad, los polipéptidos genitores aislados que tienen actividad pululanasa ó isoamilasa son codificados por secuencias de ácidos nucleicos que hibridizan en condiciones de muy baja severidad, más preferiblemente condiciones de baja severidad más preferiblemente condiciones de media severidad, más referiblemente condiciones de alta severidad, más preferiblemente condiciones de alta severidad, y más preferiblemente condiciones de muy alta severidad con una sonda de ácido nucleico que hibridiza en las mismas condiciones con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de la S?C ID NO: 12 ó SEC ID NO: 13; (ii) una subsecuencia de (i); ó (iii) una cadena complementaria de (i) ó (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a. Ed. Cold Spring Harbor, New York) . La subsecuencia de la SEC ID NO: 12 ó la SEC ID NO: 13 puede tener al menos 100 nucieótidos ó preferiblemente al menos 200 nucleótidos. Además, la secuencia puede codificar a un fragmento de polipéptido que tenga actividad puiulanasa ó isoamilasa, respectivamente. Los polipéptidos genitores pueden también ser variantes 6 fragmentos alélicos de los polipéptidos que tienen actividad pululanasa ó amilasa.

La secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO: 12 ó la S?C ID NO: 13 ó una subsecuencia de las mismas, así como también la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 ó un fragmento de las mismas, pueden usarse para indicar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar el DNA que codifica a los polipéptidos que tienen actividad pululanasa ó isoamilasa, desde cepas de diferente género ó especies conforme a métodos conocidos en la materia. En particular, tales sondas pueden usarse para hibridización con el cDNA ó genómico del genus ó especies de interés, siguiendo procedimientos de manchado Southern estándares, a fin de identificar y aislar el gen correspondiente de ia presente. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero serían al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de extensión. Sondas más largas pueden usarse también. Pueden usarse ambas sondas de DNA y de RNA. Las sondas son típicamente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con "P, 3H, 35S, biotina, ó avidina) . La presente invención abarca tales sondas.

Por consiguiente, un acervo de DNA genómico ó cDNA preparado desde tales organismos diferentes pueden ser cribados por DNA que hibridiza con las sondas descritas anteriormente y que codifican a un polipéptido que tenga actividad pululanasa ó isoamilasa. DNA genómico u otro de tales organismos diferentes pueden ser separados por eiectroforesis de gel de poliacrilamida ó agarosa u otras técnicas de separación. El DNA de los acervos ó el DNA separado puede transferirse a e inmovilizado sobre un transportador adecuado de material de nitrocelulosa u otro. A fin de identificar un clon ó DNA que sea homólogo con la SEC ID NO: 12 ó SEC /ID NO: 13 ó subsecuencias de ias mismas, el material transportador se usa en un manchado Southern. Para propósitos de la presente invención, la hibridización indica que la secuencia de ácido nucleico hibridiza a una sonda de ácidos nucleicos correspondiente a la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID NO: 12 ó SEC ID NO: 13, su cadena complementaria, ó una subsecuencia de las mismas, en condiciones de muy baja ó de muy alta severidad. Moléculas a las cuales hibridiza la sonda de ácido nucleico en estas condiciones se detectan utilizando película de rayos-X.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de extensión, el material transportador es finalmente lavado tres veces cada uno por 15 minutos utilizando 2 x SSC, SDS al 2 - preferiblemente al menos a 45 °C (muy baja severidad), más preferiblemente al menos a 50 °C (baja severidad), más preferiblemente al menos 55 °C (severidad media) , más preferiblemente al menos 60 °C (severidad media-alta) , igualmente más preferiblemente al menos 65 °C (alta severidad) , y más preferiblemente al menos a 70 °C (muy alta severidad) .

Para sondas cortas que tienen aproximadamente 15 nucleót dos hasta aproximadamente 70 nucleotidos de longitud, se definen las condiciones de severidad co o prenibridización, hibridización, y lavado post-hibridización a 5 °C a 10 °C inferior a la T- calculada utilizando ios cálculos de acuerdo a Bolton y McCarty (1962, Proceedings of the Nationaal Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCi 0.09 M pH 7.6, 6 mM de EDTA, NP-40 al 0.5 l , solución de Denhardt IX, 1 M de pirofosfato de sodio, 1 mí-í de fosfato monobásico de sodio, 0.1 M de ATP, y 0.2 mg de RNA de levadura por ml siguiendo procedimientos de manchado Southern estandar.

Para sondas cortas que tienen aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el matenal transportador se lava una vez en 6X de SCC más SDS al C.l y por 15 minutos y dos veces cada una por 15 minutos util zando CX SSC a 5 °C a 10 °C inferior al T calculado.

La presente i vención también concierne a secuencias de ácidos nuclaic~s aisladas producidas por (a) hibridizar un DNA a cond c. nes muy baja, baja, media, media-alta, alta, ó muy alta severidad con la secuencia de SEC ID NO: 12 ó SEC IS NO. 13, ó su cadena complementaria, ó una subsecuencia de la misma.; y (b) secuencia de ácidos nucleicos. La subsecuencia es preferiblemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos tai como una secuencia que codifica a un fragmento de ' polipéptido que tiene actividad pululanasa ó isoamilasa.

Los polipéptidos genitores contemplados tienen al menos 20 %, preferiblemente al menos 40 z , más preferiblemente al menos 60 % , igualmente más preferiblemente al menos 80 l , igualmente más preferiblemente al menos 90 ?, y más preferibelemnte al menos 100 % de la actividad pululanasa ó isoamilasa del polipéptido maduro de la SEC ID N0:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4.

La invención se ilustrará adicionalmente por los siguientes ejemplos no-limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Organismos donantes: El Bacill us acidopull ulyticus comprende a la enzima pulular-asa que codifica a la secuencia de DNA del gen pulB (SEC ID NO: 13) (Kelly, a. P., Diderichsen, B., Jorgensen, S. Y McConnett D. J. (1994) Molecular genetic análisis of the pullulanase B gene of bacillus acidopullulyticus . FEMS Microbiology letters 115, 97-106) .

Otras cepas : Cepa E. coli : células de E. coli SJ2 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacill us brevis . J. bacterial., 172, 4315-4321), se preparó por y se transformó por electroporación utilizando el elctroporador de BIO-RAD Gene Pulser™ como describió el proveedor.

B. subtilis PL1801 . esta cepa es la B. Subtilis DN1885 con genes npr y apr disruptados (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning ofaldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacill us brevis . J. a teixux ., x'¿-, ?Jij- J¿l) .

Se prepararon células competentes y se transformaron como se describió en Yasbin, R.E-., Wilson, G.A. y Young, F.E. (1975) Transformación y transfección en cepas lisogénicas de Bacillus subtilis : evidencia por inducción selectiva de profago en células competentes. J. Bacteriol, 121:296-304.

Plásmidos PMOL944. Este plásmido es un derivado de pUBUO que contiene esencialmente elementos que elaboran el plásmido propagable en Bacill us subtilis, gen de resistencia a la penicilina y que tiene un promotor fuerte y péptido indicador clonado desde el gen amyL de B. Licheniformis ATCC14580. el péptido indicador contiene un sitio SacII que hace conveniente clonar el DNA que codifica a la parte madura de una proteína en-fusion con el péptido indicador. Esto dá como resultado ia expresión de una pre-proteína que está dirigida hacia el exterior de la célula.

El plásmido se construyó por medios de ingeniería genética ordinaria y se describe brevemente en la siguiente.

Construcción de pMOL944: El plásmido pUBUO (McKenzie, T. y colaboradores, 1986, Plasmid 15:93-103) se digirió con la única enzima de restricción Ncil. Un fragmento amplificado por PCR desde el promotor amyL codificado en el plásmido pDN1981 (P. L. Jorgensen y colaboradores, 1990, Gene, 96, p37-41.) se digirió con Ncil e insertó en el pUBUO digerido con Ncil para dar el plásmido pSJ2624.

Los dos iniciadores de PCR usados tuvieron las siguientes secuencias: # LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTG TATCTC AGC-3' # LWN5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCT GCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3 ' El iniciador #LWN5494 inserta un sit: Noi en el plásmido.

El plásmido pSJ2624 se digirió entonces con Sacl y Notl y un nuevo fragmento amplificado por PCR en el promotor amyL codificado en el pDN1981 fue digerido con Sacl y Notl y este fragmento de DNA se insertó en elpSJ2624 digerido con Sacl-Notl para dar el plásmido pSJ2670.

Esta clonación reemplaza a la primera clonación de! promotor amyL con el mismo promotor pero en la dirección opuesta. Los dos iniciadores usados para amplificación por PCR tienen las siguientes secuencias: #LWN5938 5' -GtCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGT AGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3' #LWN5939 5' -GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3' El plásmido pSJ2670 se digirió con las enzimas de restricción Pstl y Bcll y un fragmento amplificado por PCR de una secuencia de DNA clonada que codifica a la amilasa SP722 alcalina (Patente # W09526397-A1 ) se digirió con PstI y Bcll e insertó para dar el plásmido pMOL944. Los dos iniciadores usados para amplificación por PCR tienen las siguientes secuencias: # LWN7864 5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGGCTTGGCAC-3' # LWN7901 S'-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-S' El iniciador # LWN 7901 inserta un sitio SacII en el plásmido.

Subclonación y expresión de la pululanasa pulB en B. subtilis .

El pulB que codifican a la secuencia de DNA de la invención se amplificó por PCR utilizando el grupo de iniciadores para PCR que consiste de estos dos oligonucleótidos : pulB . superior. SacII 5' -CAT TCT GCA GCC GCG GCA GAT TCT ACC TCG ACA GAA GTC-3' pulB. inferior.Notl 5' -GTT GAG ¿A . A GC GGC CGC TTC TTT AAC ACA TGC TAC GG-3' J-IOS SÍ .1CS restricción SacII y NotlI están subrayados .

El iniciador pulB superior SacII está situado inmediatamente después de la secuencia indicadora del gen pulB y será clonado después en el vector pMOL944 que genera una fusión indicadora en la secuencia indicadora amyL.

El iniciador pulB inferior está situado inmediatamente después del terminador de mRNA del gen pulB.

Preparación del DNA genómico: La cepa de Bacill us pull ulyticus (ID noxxxx) se propagó en medio líquido TY. Después de 16 horas de incubación a 30 °C y 300 rpm, las células se cosecharon, y el DNA genómico se aisló por el método descrito por Pitcher y colaboradores (Pitcher, D. G., Sauders, N.A., Owen, R. J. (1989) . Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidiu thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156).

El DNA cromosómico aislado de B. Pull ulyti cus como se describió anteriormente como patrón en una reacción de PCR utilizando la DNA polimerasa Amplitaq (perkin Elmer) conforme a las instrucciones de los fabricantes. La reacción de PCR se puso en reguiador para PCR (10 mM de Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl:, gelatina al 0.01 z (peso/volumen) que contenía 200 µM de cada uno de dNTP, 2.5 unidades de polimerasa Amplitaq (perkin-Elmer, Cetus, USA) y 100 pmoies de cada iniciador.

Las reacciones de PCR se efectuaron utilizando el ciclador térmico de DNA (Landgraf, alemania) . Una incubación a 94 °C por 1 minuto seguido por treinta ciclos de PCR efectuada utilizando un perfil de •i ^ I ? de desnaturalización a 96 °C por 10 segundos, fortalecimiento a 60 °C por 30 segundos, y extensión a 72 °C por 150 segundos. Alícuotas de cinco-µl del producto de amplificación se analizaron por electroforesis en geles al 0.7 % de agarosa (NuSieve, FMC). La apariencia de un fragmento de DNA de 2.5 kb de talla indicó amplificación apropiada del segmento de gen.

Subclonación del fragmento de PCR Alícuotas de cuarenta y cinco µl de los productos de PCR generados co o se describió anteriormente se purificaron utilizándole equipo de purificación por PCR QI?quick (Qiagen, USA) dc acuerdo a las instrucciones del fabricante. El DNA purificado se eluyó en 50 µl de 10 mM de Tris-HCl, pH 8.5.

Se digirieron 5 µg de pMOL944 y veinticinco µl del fragmento purificado por PCR con SacII y Notl, electroferesado en geles de agarosa a temperatura de solidificación baja al 0.8 % (SeaPlaque GTG, FMC), los fragmentos relevantes se extrajeron de los geles, y se purificaron utilizando el equipo de extracción de Gei QIAquick (Qiagen, USA) conforme a las instrucciones del fabricante. El fragmento de DNA aislado por PCR se ligó entonces al pMOL944 digerido y purificado con SacII-Notl. El ligado se efectuó toda la noche a 16 °C utilizando 0.5 µg de cada fragmento de DNA, 1 U de reguladoras de T4 DNA ligasa y T4 ligasa (Boehringer Mannheim, alemania) .

La mezcla de ligado se usó para transformar competentemente PL2306 de B. subtilis . Las células transformadas se plaquearon sobre placas de LBPG-10 µg/ml de kanamicina -0.1 % de AZCl-pululan-agar . Después de 18 horas de incubación a 37 °C que expresan positivamente a la pululanasa clonada aparecieron como colonias circundadas por halos azules. Un clon positivo tal se re-estrió varias veces sobre placas de agar que se usaron anteriormente, este clon se llamó PULxxx. El clon PULxxx se desarrolló toda la noche en TY-10 µg/ml Kanamicina a 37 °C, y al día siguiente se usó 1 ml de células para aislar el plásmido de las células utilizando el equipo Qiaprep Spin Plasmid Miniprep # 27106 conforme a las recomendaciones de los fabricantes para preparaciones- de plasmados de B. subtiiis.

Expresión de Pululanasa.

Se desarrolló PULXXX en 25 X 200 ml de medio BPX con 10 µg/ml de kanamicina en matraces de agitación de dos desviaciones de 500 ml por 5 días a 30 °C a ? r¡ n ~r.tr Sec pulB: (SEC NO: 14) AAAAAATGCTTAATAGAAGGAGTGTAATC GTGTCCCTAATACGTTCTAGGTATAATCATT TTGTCATTCTT TACTGTCGCCATAATGTTTCTAACAGT TGTTTCCCCGCTTATAAAGC TTTAGCAGATTCTACCTCGACAGAAGTCATTGTGCATTATCATCGTTTTGATTCTAACTAT GCAAATTGGGATCTATGGATGTGGCCATATCAACCAGTTAATGGTAATGGAGCAGCATACG AGTTTTCTGGAAAGGATGATTTTGGCGT AAAGCAGATGTTCAAGTGCCTGGGGATGATAC ACAGGTAGGTC GATTGTCCGTACAAATGATTGGAGCCAAAAAAATACATCAGACGATCTC CATATTGATCTGACAAAGGGGCATGAAATATGGATTGTTCAGGGGGATCCCAATATTTATT ACAATCTGAGTGATGCGCAGGCTGCAGCGACTCCAAAGGTTTCGAATGCGTATTTGGATAA TGAAAAAACAGTATTGGCAAAGCTAACTAATCCAATGACATTATCAGATGGATCAAGCGGC TTTACGGTTAC?GATAAAAaU-CAGGGGAACAAATTCCAG TACCGCTGCAACAAATGCGA ACTCAGCCTCCTCGTCTGAGCAGACAGACTTGGTTCAATTGACGTTAGCCAGTGCACCGGA TGTTTCCCATACAATACAAGTAGGAGCAGCCGGTTATGAAGCAGTCAATCTCATACCACGA AATGTATTAAATT GCCTCGTTATTATTACAGCGGAAATGATTTAGGTAACGTTTATTCAA ATAAGGCAACGGCCTTCCGTGTATGGGCTCCAACTGCTTCGGATGTCCAATTACTTTTATA CAATAGTGAAACAGGACCTGTAACCAAACAGCTTGiVAATGCAAAAGAGTGATAACGGTACA TGGAAACTGAAGGTCCCTGGTAATCTGAAAAATTGGTATTATCTCTATCAGGTAACGGTGA ATGGGAAGACACAAACAGCCGTTGACCCTTATGTGCGTGCTATTTCAGTCAATGCAACACG TGGTATGATAGTCGATTTAGAAGATACGAATCCTCCTGGATGGAAAGAAGATCATCAACAG ACACCTGCGAACCCAGTGGATGAAGTAATCTACGAAGTGCATGTGCGTGATTTTTCGATTG ATGCTAATTCAGGCATGAAAAATAAAGGGAAATATCTTGCCTTTACAGAACATGGCACAAA AGGCCCTGATAACGTGAAAACGGGTATTGATAGTTTGAAGGAATTAGGAATCAATGCTGTT CAATTACAGCCGATTGAAGAATTTAACAGCATTGATGAAACCCAACCAAATATGTATAACT GGGGCTATGACCCAAGAAACTACAACGTCCCTGAAGGAGCGTATGCAACTACACCAGAAGG AACGGCTCGCATTACCCAGTTAAAGCAACTGATTCAAAGCATTCATAAAGATCGGATTGCT ATCAATATGGATGTGGTCTATAACCATACCTTTAACGTAGGAGTGTCTGATTTTGATAAGA TTGTTCCGO-ATAeTATTATCGGACAGACAGCGCAGGTAATTATACGAACGGCTCAGGTGT AGGTAATGAAATTGCGACCGAGCGTCCGATGGTCCAAAAGTTCGTTCTGGATTCTGTTAAA TA TGGGTAAAGGAATACCATATCGACGGCT C CGT TCGATCTTATGWCTC TTAGGAAAAGACACCIATGGCCAAAATATCAAAAGAGCTTC ATGCTATTAATCCTGGCATTGTCCTGTATGGAGAACCATGGACTGGCGGTACCTCTGGATT ATCAAGCGACCAACTCGTTACGAAAGGTCAGCAAAAGGGCTTGGGAATTGGCGTATTCAAC GATAATATTCGGAACGGACTCGATGGTAACGT TTTGATAAATCGGCACAAGGATTTGCAA CAGGAGATCCAAACCAAGTTAATGTCATTAAAAATAGAGTTATGGGAAGTATTTCAGATTT CACTTCGGCACCTAGCGAAACCATTAACTATGTAACAAGCCATGATAATATGACATTGTGG GATAAAATTAGCGCAAGTAATCCGAACGATACACAAGCAGATCGAATTAAGATGGATGAAT TGGCTCAAGCTGTGGTATTTACTTCACAAGGGGTACCATTTATGCAAGGTGGAGAAGAAAT GCTGCGGACAAAAGGCGGTAATGATAATAGTTACAATGCCGGGGATAGCGTGAATCAGTTC GATTGGTt^AAGAAAAGCACí^TTTGAAAATGTATTCGACTACTATTCTTGGTTGATTCATC TACGTGATAATCACCCAGCAT CCGTATGACGACAGCGGATCAAATCAAACAAAATCTCAC TTTCTTGGATAGCCCAACGAACACTGTAGCATT GAATTAAAAAATCATGCCAATCATGAT AAATGGAAAAACATTATAGTTATGTATAATCC2AATAAAACTGCACAAACTCTCACTCTAC C^-AGTGGAAATTGGACAATTGTAGGATTAGGCAATCAAGTAGGTGAGAAATCACTAGGCCA TGTAAATGGCACGGTTGAGGTGCCAGCTCTTAGTACGATCATTCTTCATCAGGGTACATCT GAAGATGTCATTGATCAAAA TAATAT GATTAAGAAATGATTTGTAAAACATTTAAGTCC ATTTACACGGGATACTGTGTAAATGGATTTTAGTTTTATCCGTAGCATGTGTTAAAGAAGT AAATAGTAAATGGCAATTT Se indica el objetivo para los dos iniciadores de Medi> TV I r :.o.mo se describió cn Ausubel, F.M. y colaboradores (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley e Hijos, 1995) . Agar LB (como se describe en ausubel, F. M.

Y colaboradores (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley e hijos, 1995).

LBPG es agar LB suplementado con glucosa ax ?.u z y fosfato de potasio 0.05 M, pH 7.0 Se añadió AZCL-Pululan al agar LBPG hasta 0.5 ? de AZCL-pululan de Megazyme, australia.

Medio BPX se describió en EP 0 506 780 (WO 91/09129) .

Ejemplo 2 Purificación de la pululanasa de Bacill us acidopull ulytlc s (Prozyme™) La pululanasa de Bacill us acidopull ulyticus se purificó desde una fermentación de B. Acidopull ulyticus (descrita en EP 63, 909) , la pululanasa que es secretada en el medio.

Se anadio un avuda— ixtro ax 1 v—-a-x1 do de cultivo, el cual se filtró a través de una malla. Esta solución se filtró a través de una placa de filtro profundo Seitz, que dio como resultado una so-r.ción ciara. El filtrado se concentró por ultrafiltración ..core un corte de 10 kDa de membranas de poliétersulfona, seguida por diafiltración con agua destilada para reducir la conductividad. El pH de la enzima concentrada se ajustó a pH 4.5. La conductividad de la enzima concentrada fue de 0.7 S/ciu.

La pululanasa concentrada se aplicó a una columna S-Sepharose FF equilibrada en 20 mí-í de CH:-COOH/NaOH, pH 4.5, y la enzima se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 —> 0.5m) . La actividad de la pululanasa eluída como un solo pico. El conjunto de fracciones con actividad pululanasa se transfirió a 20 mM de KH-PO^/NaOH, pH 7.0 sobre una columna Sephadex G25. La enzima se purificó adicionalmente por aplicación a una columna Q-Sepharose FF equilibrada en 20 icM de KH. PO,/NaOH, pH 7.0. Después de lavar la columna, la pululanasa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 —> 0.5 M) . Las fracciones con actividad de pululanasa se conjuntaron y el regulador se intercambió por 20 mí-í de CH COOH/?aOH, pH 4.5, sobre una columna Sephadex G25. la pululanasa se aplicó entonces a una columna SOURCE 30S equilibrada en 20 mí-í de CH..COOH/?aOH, pH 4.5. Después de .Lavar la coxumna, xa actividad pululanasa se eluyo con un incremento en el gradiente lineal de ?aCl (0 — 0.2 M) . Las fracciones con actividad pululanasa fue conjuntada y concentrada en una celda de ultrafiltración con un corte de 10 kDa de membrana de celulosa regenerada. La enzima concentrada se aplicó a una columna de exclusión de talla Superdex 200 equilibrada en 20 mM de CH3COOH/?aOH, 200 mM de NaCl, pH 4.5. Las fracciones eludías de la columna Superdex200 se analizó por SDS-PAGE y las racciones pulµlanasa pura se conjuntaron.

La pululanasa emigró sobre SDS-PAGE como una banda con Mr - 100 kDa.

Otras pululanasas e isoamilasas pueden purificarse esencialmente de la misma manera.

Sepharose, Sephadex, SOURCE y Superdex son marcas registradas propiedad de Amersham Pharmacia Biotech.

Ejemplo 3 Termoestabilidad de pululanasas e isoatnilasas La termocstabilidad dc las pululanasas e isoamilasas puede ser verificada por medios de DSC (Differential Scanning Calorimetry) . La temperatura de desanturalización térmica, Td, se toma como la máxima del pico de desnaturalización en termogramas (Cp Vs . T) obtenida después de calentar las soluciones de las enzimas a una proporción de calentamiento programada, constante.

Experimenta] Un aparato DSC adecuado, por ejemplo un aparato DSC Iide Hart Scientific (UTA, USA) puede usarse para los experimentos. Se usaron 50 mM de soluciones reguladas como solvente para la enzima (aprox. 2 mg/ml) a ya sea pK 10 (50 mM de regulador de glicina), pH 7 (50 mí-í de regulador HEPES + 10 mM de EDTA) ó bien PH 4 (50 mí-í de regulador de citrato) . La enzima puede purificarse como se describió anteriormente. Se transfiere 750 µl de solución de enzima a una ampolleta obturable con una aleación de níquel-hierro-molibdeno (Hart Scientific) de 1 ml . La ampolletas se cargan a un calorímetro y se enfrían a 5 °C por 15 minutos. El equilibrio térmico se lleva a cabo antes de la exploración DSC. La exploración por DSC se efectúa desde 5 °C hasta 95 °C a una proporción de aprox. 90 K/hr. Las temperaturas dc desnaturalización se determinan con una precisión de aprox. +/- 2 °C. Los resultados se expresan como límite del pico de desnaturalización como una función de pH .

Ejemplo 4 Actividad Ensayo de actividad desramificante: Los resultados posteriores demuestran que la actividad específica (actividad/mg de enzima pura) es altamente dependiente de la clase de enzima. Las isoamilasas son extremadamente activas hacia materiales feculosos ramificados de alto peso molecular tales como glicógeno y amilopectina, mientras que las pululanasas son muy bajas en actividad hacia estos substratos. La unidad de actividad refleja el número de extremos reductores que se forman durante un período de incubación de 10 min. la figura opuesta se observa con pululanasas, por ejemplo baja actividad hacia materiales feculosos ramificados de alto peso molecular tales como glicógeno y amilopectina pero alta actividad hacia por ejemplo pululan.

Una alta actividad hacia amilopectina y glicógeno es preferible particularmente cuando una desramificación enzimética tiene lugar junto con ia acción de una a-amilasa en el proceso de licuefacción. Por otro lado, una alta actividad hacia pequeños oligosacáridos tales como pululan es preferible cuando una desramificación enzimática tiene lugar durante la etapa de sacarificación, por ejemplo después del proceso de licuefacción cuando los componentes de alto peso molecular han sido reducidos a oligosacáridos más pequeños. Si una pululanasa pudiera alterarse para tener una actividad alta (especificidad) hacia compuestos de alto peso molecular tales como amilopectina, esto sería altamente preferible cuando la pululanasa se añade durante el proceso de licuefacción.

Substratos usados: glicógeno de hígado de conejo y pululan. Pruebas anteriores demostraron que una alta concentración de substrato fue necesaria a fin de que el substrato no sea el factor limitante cuando se desarrolla un ensayo lineal. Una concentración de substrato "alta" es, en este contexto, 10 ? peso/volumen. Por el ensayo de Somogyi-Nelson se mide la cantidad de extremos reductores formados por degradación enzimática del substrato. Con tiempos de ensayo normales de hasta 3 horas, la formación de los extremos reductores está bastante limitada, igualmente aunque la concentración de la enzima es alta (10 *. peso/volumen) . Esto significa que el ensayo mide una diferencia relativamente pequeña en extremos reductores en una referencia muy alta lo cual es mucho más alto que la diferencia medible en absorbancia durante el tratamiento de la enzima. Por esta razón, los extremos reductores en glicógeno y pululan se oxidaron con NaBH4 como sigue, a fin de reducir el nivel de referencia del substrato: Se disolvió 1000 mg de glicógeno en 40 mi de agua a la cual se añadió NaOH ai 0.2 - . Se añadieron cuidadosamente 800 mg de NaBH, con agitación. La solución se agitó por 48 horas a 25 °C, después de io cual la reacción se detuvo por adición de amberlita IR-118H, un intercambiador catiónico que elimina los iones boro y detiene la reacción. La solución se filtró para eliminar la matriz y se evapo.ró para dar 10 ml . La solución se dializó extensivamente ccr._ra agua desionizada a fin de eliminar los iones boro residuales. Este método se encontró que reduce el valor de referencia en al menos un factor de 10. El ensayo se condujo conforme al método de Somogyi-Nelson, utilizando 50 icd-l de acetato de sodio, valores de pH de 4.5, 5.0 y 5.5 y una temperatura de 50 °C (isoamilasa) ó 60 °C (pululanasae; , con un tiempo de reacción de 10 min. La glucosa se usó como estándar, una curva estándar se hizo de soluciones que contenían de 0-200 mg de Tabla 3. Glicógeno de hígado de conejo ermp . pH PUN/mg j uiuianase a-i B. 60 °C 4 . 5 50 Tabla 3. (Continuación) Glicógeno de hígado de conejo Temp. pH PUN/mg acidopullulyticus (SEC ID NO: 1) 60°C 5.0 49 60°C 5.5 51 Pululanasa de B. 60°C 4.5 37 deramificans (SEC ID NO: 2) 60°C 5.0 31 60°C 5.5 30 Isoamilasa de 50°C 4.5 2829 Pseudomonas (SEC ID NO: 4) 50°C 5.0 2858 50°C 5.5 2709 Pululan Pululasa de B. 60°C 4.5 402 acidopullulyticus (SEC ID NO: 1) 60°C 5.0 414 60°C 5.5 393 Tabla 3. (Continuación) Glicógeno de hígado de conejo Temp. pH PUN/mg Pululanasa de B. 60°C 4.5 288 der ami f i cans (SEC ID NO: 2) 60°C 5.0 276 60°C 5.5 255 Isoamilasa de 50°C 4.5 14 Pseudomonas (?EC ID NO: 4) 50°C 5.0 14 5.5 6 S?C ID NO: 12: [2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS; (A) LONGITUD: 2181 pares de bases (B)TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: uno solo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA:Rhodothermus marinus DSM 4252 (ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B)LOCALIZACIÓN: 1...2181 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12: ATG TCA CAT AGC GCG CAA CCG GTT ACG TCG GTA CAG GCC GTC TGG CCC 48 Met ser His Ser Ala Gln Pro Val Thr Ser Val Gln Ala Val Trp Pro 1 5 10 15 GGC CGG CCT TAT CCG CTG GGT GCC ACC TGG GAC GGG CTG GGC GTC AAC 96 Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Trp Aßp Gly Leu Gly Val Aßn 20 25 30 TTT GCC CTC TAC AGC CAG CAC GCC GAG GCG GTC GAA CTG GTG CTG TTC 144 Phe Ala Leu Tyr Ser Gln His Ala Glu Ala Val Glu Leu Val Leu Phe 35 40 45 GAC CAC CCG GAC GAT CCC GCG CCT TCG CGC ACG ATC GAA GTG ACC GAA 192 Asp His Pro Asp Aßp Pro Ala Pro Ser Arg Thr He Glu Val Thr Glu 50 55 60 CGG ACA GGC CCG ATC TGG CAT GTG TAC CTG CCC GGC CTG CGT CCC GGC 240 Arg Thr Gly Pro He Trp Hiß Val Tyr Leu Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 CAG CTC TAC GGC TAT CGC GTC TAC GGA CCC TAC CGG CCG GAG GAA GGC 288 Gln Leu Tyr Gly Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Arg Pro Glu Glu Gly 85 90 95 CAC CGC TTC AAT CCG AAC AAG GTG CTG CTC GAC CCC TAC GCG AAG GCC 336 His Arg Phe Aßn Pro Aßn Lyß Val Leu Leu Aßp Pro Tyr Ala Lyß Ala 100 105 110 ATC GGC CGG CCC CTT CGC TGG CAC GAC AGC CTC TTC GGT TAC AAA ATC 384 He Gly Arg Pro Leu Arg Trp His Aßp Ser Leu Phe Gly Tyr Lyß He 115 120 125 GGC GAT CCG GCC GGG GAT CTG TCG TTC TCC GAA GAA GAC AGC GCT CCG 432 Gly Aßp Pro Ala Gly Aßp Leu Ser Phe Ser Glu Glu Asp Ser Ala Pro 130 135 140 TAC GCG CCG CTG GGA GCC GTC GTG GAG GGC TGT TTC GAG TGG GGC GAC 480 Tyr Ala Pro Leu Gly Ala Val Val Glu Gly Cyß Phe Glu Trp Gly Asp 145 150 155 160 GAC CGC CCG CCG CGC ATT CCC TGG GAA GAC ACG ATC ATC TAC GAA ACG 528 Asp Arg Pro Pro Arg He Pro Trp Glu Asp Thr He He Tyr Glu Thr 165 170 175 CAC GTC AAG GGC ATC ACG AAG CTG CAT CCG GAA GTG CCG GAG CCG CTG 576 Hiß Val Lys Gly He Thr Lys Leu His Pro Glu Val Pro Glu Pro Leu 180 185 190 CGG GGG ACG TAT CTG GGG CTG ACC TGC GAG CCG GTG CTG GAG CAC CTG 624 Arg Gly Thr Tyr Leu Gly Leu Thr Cys Glu Pro Val Leu Glu His Leu 195 200 205 AAG CAG CTG GGC GTC ACC ACG ATC CAG CTC CTT CCG GTG CAC GCA AAA 672 Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr He Gln Leu Leu Pro Val His Ala Lys 210 215 220 GTG CAC GAT CGG CAC CTG GTC GAG CGC GGC CTG CGC AAC TAC TGG GGC 720 Val His Asp Arg His Leu Val Glu Arg Gly Leu Arg Asn Tyr Trp Gly 225 230 235 240 TAC AAT CCG CTC TGC TAC TTT GCG CCG GAG CCC GAG TAC GCC ACG AAC 768 Tyr Asn Pro Leu Cyß Tyr Phe Ala Pro Glu Pro Glu Tyr Ala Thr Asn 245 250 255 GGG CCG ATC TCG GCC GTG CGC GAG TTC AAG ATG ATG GTG CGG GCG CTG 816 Gly Pro He Ser Ala Val Arg Glu Phe Lys Met Met Val Arg Ala Leu 260 265 270 CAT GCT GCC GGC TTC GAG GTG ATC GTC GAC GTG GTC TAC AAC CAC ACG 864 Hiß Ala Ala Gly Phe Glu Val He Val Asp Val Val Tyr Asn His Thr 275 280 285 GGC GAA GGC GGC GTG CTG GGC CCC ACG CTG TCG TTC CGG GGC ATC GAC 912 Gly Glu Gly Gly Val Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly He Aßp 290 295 300 AAC CGC GCC TAC TAC AAG GCC GAT CCG AAC AAC CCG CGC TTT CTG GTC 960 Asn Arg Ala Tyr Tyr Lys Ala Asp Pro Aßn Asn Pro Arg Phe Leu Val 305 310 315 320 GAT TAC ACG GGC ACC GGC AAC ACG CTG GAC GTG GGC AAC CCC TAC GTC 1008 Aßp Tyr Thr Gly Thr Gly Aßn Thr Leu Aßp Val Gly Asn Pro Tyr Val 325 330 335 ATC CAG CTC ATC ATG GAC AGC CTG CGC TAC TGG GTC ACT GAA ATG CAC 1056 He Gln Leu He Met Aßp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His 340 345 350 GTC GAC GGC TTT CGG TTC GAC CTG GCC GCC GCG CTG GCC CGC GAG CTG 1104 Val Asp Gly Phe Arg Phe Aßp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg Glu Leu 355 360 365 TAC GAC GTG GAC ATG CTC TCG ACC TTT TTT CAG GTC ATT CAG CAG GAC 1152 Tyr Aßp Val Asp Met Leu Ser Thr Phß Phe Gln Val He Gln Gln Aßp 370 375 380 CCG GTG CTC AGC CAG GTC AAG CTC ATC GCC GAA CCC TGG GAC GTC GGG 1200 Pro Val Leu Ser Gln Val Lys Leu He Ala Glu Pro Trp Asp Val Gly 385 390 395 400 CCG GGG GGG TAT CAG GTG GGA CAT TTT CCC TGG CAG TGG ACC GAG TGG "1248 Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly Hiß Phe Pro Trp Gln Trp Thr Glu Trp 405 410 415 AAC GGC CGC TAT CGT GAC GCC GTG CGC CGC TTC TGG CGG GGC GAT CGG 1296 Asn Gly Arg Tyr Arg Asp Ala Val Arg Arg Phe Trp Arg Gly Asp Arg 420 425 430 GGC CTC AAC GGT GAG TTT GCC ACG CGC TTT GCC GGC TCC AGC GAT CTG 1344 Gly Leu Asn Gly Glu Phe Ala Thr Arg Phe Ala Gly Ser Ser ABp Leu 435 440 445 TAC GAA CGT AGC GGT CGT CGT CCG TTC GCT TCG ATC AAC TTC GTC ACG 1392 Tyr Glu Arg Ser Gly Arg Arg Pro Phe Ala Ser He Asn Phe Val Thr 450 455 460 GCG CAC GAC GGC TTC ACG CTG GAA GAC CTG GTC AGC TAC ACG AAA AAG 1440 Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Aßp Leu Val Ser Tyr Thr Lys Lys 465 470 475 480 CAC AAC GAA GCG AAT CTG GAA GGC AAC CGG GAC GGC ATG GAC GAA AAC 1488 Hxs Aßn Glu Ala Aßn Leu Glu Gly Asn Arg Asp Gly Met Asp Glu Asn 485 490 495 TAC AGC ACG AAC TGC GGG GTG GAG GGA CCC ACG CAG GAT CCG TCC GTG 1536 Tyr Ser Thr Asn Cys Gly Val Glu Gly Pro Thr Gln Aßp Pro Ser Val 500 505 510 CTG GCC TGC CGG GAA GCG CTC AAG CGC AGC CTG ATC AGC ACG CTC TTT 1584 Leu Ala Cys Arg Glu Ala Leu Lys Arg Ser Leu He Ser Thr Leu Phe 515 520 525 CTC TCG CAG GGC GTG CCC ATG CTG CTG GGC GGC GAC GAG CTG TCG CGC 1632 Leu Ser Gln Gly Val Pro Met Leu Leu Gly Gly Asp Glu Leu Ser Arg 530 535 540 ACG CAG CAC GGC AAC AAC AAC GCC TAT TGC CAG GAC AAC GAG ATC AGC 1680 Thr Gln Hiß Gly Asn Asn Asn Ala Tyr Cyß Gln Asp Asn Glu He Ser 545 550 555 560 TGG TAC AAC TGG CAG CTC GAC ACG CGC AAG CAG CAG TTT CTG GAG TTC 1728 Trp Tyr Asn Trp Gln Leu Asp Thr Arg Lys Gln Gln Phe Leu Glu Phe 565 570 575 GTG CGC CAG ACG ATC TGG TTT CGC AAG CAG CAT CGG AGC TTC CGG CGC 1776 Val Arg Gln Thr He Trp Phe Arg Lyß Gln His Arg Ser Phe Arg Arg 580 585 590 CGC CAT TTT CTG ACC GGA TTG CCC AAC GGC GGA AGG CCC CGA CGC AGT 1824 Arg His Phe Leu Thr Gly Leu Pro Asn Gly Gly Arg Pro Arg Arg Ser 595 600 605 CTG GTG GCA CCT GAG GGT CGG CCC ATG CGC CAC GAG GAC TGG ACC AAC 1872 Leu Val Ala Pro Glu Gly Arg Pro Met Arg His Glu Asp Trp Thr Asn 610 615 620 CCG GAG CTG ACG GCC TTC GCA CTG CTG CTG CAC GGC GAC GCC ATT CAG 1920 Pro Glu Leu Thr Ala Phe Gly Leu Leu Leu Hiß Gly Asp Ala He Gln 625 630 635 640 GGG ACC GAC GAG CAC GGA CGA CCG TTT CGC GAC GAC ACG TTT CTG ATT 1968 Gly Thr Asp Glu His G.y Arg Pro Phe Arg Asp Aßp Thr Phe Leu He 645 650 655 CTG TTC AAC AAC GGC AGC GAA GCC GTG CCG GTC GTG GTG CCG GAG GTA 2016 Leu Phe Asn Aßn Gly Ser Glu Ala Val Pro Val Val Val Pro Glu Val 660 665 670 TGC TCC TGT GGC AAG CCG CAC CAC TGG GAG GTG GTC CCG GTG TTT CAA 2064 Cys Ser Cys Gly Lyß Pro His His Trp Glu Val Val Pro Val Phe Gln 675 680 685 CGC AAT GTG GAG CCC CCC ACG TGC GCG CCC GGC GAG ACG CTG TCG CTC 2112 Arg Aßn Val Glu Pro Pro Thr Cys Ala Pro Gly Glu Thr Leu Ser Leu 690 695 700 CCG CCC GGC GTG CTG ACG GTG CTG GTG GCC GTA CCG CCG TTC TCG GAT 2160 Pro Pro Gly Val Lau Thr Val Leu Val Ala Val Pro Pro Phe Ser Asp 705 710 715 720 GGA AAC ACG GAG CCG C.C TOA 2181 725 LISTADO DE SECUENCIAS <110> Novo Nordisk A/S <120> Enzimas desramificantes de almidón <130> Enzimas desramificantes de almidón <140> <141> <160> 14 <170> Patentin Ver. 2.1. <210> 1 <211> 862 <212> PRT <213> Bacillus acidopullulyticus <220> <221> PEPTIDO <222> (1) .. (862) <223> Pululanasa <400> 1 Val Ser Leu He Arg Ser Arg Tyr Asn His Phe Val He Leu Phe Thr 1 5 10 15 Val Ala He Met Phe Leu Thr Val Cys Phe Pro Ala Tyr Lys Ala Leu 20 25 30 Ala Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val He Val His Tyr His Arg Phe Asp 35 0 45 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val 50 55 60 Asn Gly Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly 65 70 "75 80 Val Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu 85 90 95 He Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Ser Asp Asp Leu 100 105 110 His He Asp Leu Thr Lys Gly His Glu He Trp He Val Gln Gly Asp 115 120 125 Prc Asp He Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Ala Gln Ala Ala Ala Thr Pro 13C 135 140 Lys Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asr. Glu Lys Thr Val Leu Ala Lye 145 150 155 160 Leu Thr Asn Pro Met Thr Leu Ser Asp Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val 165 170 175 Thr Asp Lys Thr Thr Gly Glu Gln He Pro Val Thr Ala Ala Thr Asn 180 185 190 Ala Asn Ser Ala Ser Ser Ser Glu Gln Thr Asp Leu Val Gln Leu Thr 195 200 " 205 Leu Ala Ser Ala Pro Asp Val Ser His Thr He Gln val Gly Ala Ala 210 215 220 Gly Tyr Glu Ala Val Asn Leu He Pro Arg Asn Val Leu Asn Leu Pro 225 230 235 240 Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asr. Val Tyr Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp Val Gln Leu 260 265 270 Leu Leu Tyr Aen Sar Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln Leu Glu Met 2"?5 280 285 Gln Lys Ser Asp Asp Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro Gly Asn Leu 290 295 300 Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly Lye Thr Gln 305 310 315 320 Thr Ala al Asp Pro Tyr Val Arg Ala He Ser Val Asn Ala Thr Arg 325 330 335 Gly Met He Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly Trp Lys Glu 340 345 350 Asp His Gln Glp Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val He Tyr Glu 355 360 365 Val His Val Arg Asp Phe Ser He Asp Ala Asn Ser Gly Met Lys Asn 3-7C 375 380 Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys Gly Pro Asp 385 390 395 400 Asn Val Lys Thr Gly He Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly He Asn Ala 405 410 415 Val Glr. Leu Gln Pro He Giu Glu Phe Asn Ser He Asp Glu Thr Gln 420 425 430 Pro Así-. Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asn Val Pro 435 440 445 Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg He Thr Gln 450 455 460 Leu Lys Gln Leu He Gln Ser He His Lys Asp Arg Ile Ala He Asr. 465 470 475 48C Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Asn Val Gly Val Ser Asp Phe 485 490 495 Asp Lys lie.Val Pro Glr. Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Ser Ala Gly Asr. 500 - 505 510 Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Val Gly Asn Glu He Ala Thr Glu Arg Pro 515 520 525 Met Val Gln Lys Phe Val Leu Asp Ser Val Lys Tyr Trp Val Lys Glu 530 535 540 Tyr His He Aep Gly Phe Arg Phe Aep Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys 545 550 555 560 Aep Thr Met Ala Lye He Ser Lye Glu Leu His Ala He Asn Pro Gly 565 570 575 He Val Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ser 580 585 590 Ser Asp Gln Leu Val Thr Lys Gly Gln Gln Lys Gly Leu Gly Ile_Gly 595 600 605 Val Phe Asn Asp Asn He Arg Asn Gly Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp 610 615 620 Lys Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Asp Pro Asn Gln Val Asn Val 625 630 635 640 He Lye Asn Arg Val Met Gly Ser He Ser Asp Phe Thr Ser Ala Pro 645 650 655 Ser Glu Thr He Asn Tyr Val Thr Ser Kis Asp Asn Met Thr Leu Trp 660 665 670 Asp Lys He Ser Ala Ser Asn Pro Asn Asp Thr Gln Ala Aep Arg He 675 68C 685 Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Phe Thr Ser Gln Gly Val 690 695 700 Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asp 705 710 715 72C Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ser Val Asn Gln Phe Asp Trp Ser 725 730 735 Arg Lys Ala Gln Phe Glu Asn Val Phe Asp Tyr Tyr Ser Trp Leu He 740 745 750 Hie Leu Arg Asp Asn Hie Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asp Gin 755 760 765 He Lys Gln Asn Leu Thr Phe Leu Asp Ser Pro Thr Asn Thr Val Ala 770 775 780 Phe Glu Leu Lys Asi. ..s Ala Asn His Asp Lys Trp Lys Asn He He 785 790 795 800 Val Met Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Gln Thr Leu Thr Leu Pro Ser 805 810 815 Gly Asn Trp Thr He Val Gly Leu Gly Asn Gln Val Gly Glu Lys Ser 820 825 830 Leu Gly His Val Asn Gly Thr Val Glu Val Pro Ala Leu Ser Thr He 835 840 845 He Leu HAS Gln Gly Thr Ser Glu Aep Val He Asp Gln Asn 850 855 860 <210> 2 <2il> 915 <212> PRT <213> Bacillus .iesramificans <220> <221> PEPTÜLV <222> (1)...(9: L , <223> Pulula.-.'-sa <400> 2 Asp Gly Asn Thr Thr Thr He He Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly i 5 10 15 Asp Tyr Glr. Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Giy Gly 20 25 30 Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val Ala 35 40 45 Ser Ala Asp He Pro 31y Asn Pro Ser Gln Val Gly He He Val Arg 50 55 60 Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr He Asp Leu 65 70 75 80 Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asr. Ser G n He Phe 85 90 95 Tyr Asr. Glu Lye Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn 100 105 110 Ala Tyr Leu Aap Ala Ser Aen Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro 115 120 125 Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val Kis Asp Asp Thr 130 135 140 Ala Asn Lys Asp He Pro Val Thr Ser Val Lys Aep Ala Ser Leu Gly 145 150 155 160 Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His He Phe Gly 165 170 175 Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asp His Ser Thr Leu Leu Lye Lys Val 180 185 190 Thr Asn Asr. Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr 195 200 205 Gln Tyr Lys Val Ala Met Ser His Ser Ala Gln Pro Val Thr Ser Val 210 215 220 Gln Ala Val Trp Pro Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Trp Aep 225 230 235 240 Gly Leu Gly Val Asn Phe Ala Leu Tyr Ser Glu Ser Gly Val Lys Thr 245 250 255 Asp Leu Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr 260 265 270 Leu Ser He Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val He Pro Arg 275 280 285 Asn Val Leu Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Aep Leu Gly 290 295 300 Asn Thr Tyr Thr Glp Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr 305 310 315 320 Ser Thr Gln Val Asp Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val 325 330 335 Thr Lye He Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala 340 345 350 Thr Val Asn Glr Asr. Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr 355 360 365 Gly Glr. Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala He 37C 375 380 Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met He Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp 3B5 390 395 400 Pro Ala Gl. Trp ? n Ser Asp Lys His He Thr Pro Lys Asn He Glu 405 410 415 Asp Glu Val III. Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser lie Asp Pro 42 425 430 Asn Ser Gly Met Lye Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys 435 440 445 Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly He Asp Ser Leu Lys 450 455 460 Gln Leu Gly He Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn 465 470 475 480 Ser Val Asp Glu Thr Aep Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro 485 490 495 Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly 5C0 505 510 Asn Ala Arg He Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg 515 520 525 Glu His He Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn HAS Thr Phe Ala 530 535 5.40 Thr Gln He Ser sp Phe Asp Lys He Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg 545 550 555 560 Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asp Glu 565 570 575 He Ala Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe He He Asp Ser Leu 580 585 590 Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His He Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu 595 600 605 Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu 610 615 620 His Ala lie Asn Pro Gly He Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly 625 630 635 640 Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Glp Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln 6 5 650 655 Lys Gly Met Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu 660 665 670 Asp Gly Asn Val Fhe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala 675 680 685 Thr Gly Leu Thr Aep Ala He Lye Aen Gly Val Glu Gly Ser He Asn 690 695 700 Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr He Asn Tyr Val Thr Ser His 705 710 715 720 Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys He Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp 725 730 -735 Ser Glu Ala Asp Arg He Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val 740 745 750 Met Thr Ser Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu 755 760 765 Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val 770 775 780 Asn Glu Phe Asp Trp Ser Are Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn 785 790 795 800 Tyr Tyr Ser Gly Leu He HAS Leu Arg Leu Asp HAS Pro Ala Phe Arg 805 810 815 Met Thr Thr Ala Asn Glu He Aen Ser His Leu Glp Phe Leu Aen Ser 320 825 830 Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp Hie Val Aer. Lys Asp 835 840 845 Lys Trp Gly Aer. He He Val Val Tyr Aen Pro Asn Lys Thr Val Ala 850 855 860 Thr He Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala He Asn Ala Thr Ser Gly 865 870 875 880 Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val 885 890 895 Pro Gly He Ser Met Met He Leu His Gln Giu Val Ser Pro Asp His 900 905 910 Gly Lys Lys 915 <210> 3 <211> 726 <212> PRT <213> Rhodothermus mannus <220> <221> PEPTIDO <222> (1)...(726> <223> Isoamilasa <400> 3 Met Ser His Sex Ala Gln Pro Val Thr Ser Val Gln Ala Val Trp Pro 1 5 10 15 Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Trp Asp Gly Leu Gly Val Asn 20 25 30 Phe Ala Leu Tyr Ser Gln His Ala Glu Ala Val Glu Leu Val Leu Phe 35 40 45 Asp His Pro Asp Asp Pro Ala Pro Ser Arg Thr He Glu Val Thr Glu 50 55 60 Arg Thr Gly ?rc He Trp His Val Tyr Leu Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Gly Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Arg Pro Glu Glu Gly 85 90 " 95 Kis Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ala 100 105 110 He Gly Arg Pro Leu Arg Trp His Asp Ser Leu Phe Gly Tyr Lys He 115 120 125 Gly Aep Pro Ala Gly Asp Leu Ser Phe Ser Glu Glu Aep Ser Ala Pro 130 135 140 Tyr Ala Pro Leu Gly Ala Val Val Glu Gly Cys Phe Glu Trp Gly Asp 145 150 155 160 Asp Arg Pro Pro Arg He Pro Trp Glu Asp Thr He He Tyr Glu Thr 165 170 175 His Val Lys Gly He Thr Lys Leu His Pro Glu Val Pro Glu Pro Leu 180 185 19C Arg Gly Thr Tyr Leu Gly Leu Thr Cys Glu Pro Val Leu Glu His Leu 195 200 205 Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr He Gln Leu Leu Pro Val His Ala Lys 210 215 220 Val His Asp Arg HAS Leu Val Glu Arg Gly Leu Arg Asn Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Tyr Asn Pro Leu Cys Tyr Phe Ala Pro Glu Pro Glu Tyr Ala Thr Asp 245 250 255 Gly Pro He Ser Ala Val Arg Glu Phe Lys Met Met Val Arg Ala Leu 260 265 270 HAS Ala Ala Gly Phe Glu Val He Val Asp Val Val Tyr Asn His Thr 275 280 285 Gly Gla Gly sly Val Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly He Asp 2S0 295 300 Aer. 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(1096) <223> Pululanasa <400> 6 Met Leu Arg Tyr Thr Cys Kis Ala Leu Phe Leu Gly Ser Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Ser Gly Cys Asp Asn Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ser Pro 20 25 30 Gly Ser Pro Gly Asr. Pro Gly Asn Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Asp 35 40 45 Pro Gln Asp Val Val Val Arg Leu Pro Aep Val Ala Val Prc sly slu 50 55 60 Ala Val Gl.n Ala Ser Ala Arg Gln Ala Val He Hie Leu Val Acp He 65 70 5 80 Ala Gly He Thr Ser Ser Thr Pro Ala Asp Tyr Ala Thr Lys Asn Leu 85 90 95 Tyr Leu Trp Asn Asn Glu Thr Cys Asp Ala Leu Ser Ala Pro Val Ala 100 105 11C Asp Trp Asn Asp Val Ser Thr Thr Pro Thr Gly Ser Asp Lys Tyr Gly 115 120 125 Pro Tyr Trp Val He Pro Leu Thr Lys Glu Ser Gly Ser He Asn Val 130 135 140 lie Val Arg Asp Gly Thr Asn Lys Leu He Asp Ser Gly Arg Val Ser 145 150 155 160 Phe Ser Asp Phe Thr Asp Arg Thr Val Ser Val He Ala Gly Asn Ser 165 170 175 Ala Val Tyr Ae. 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He Asn Arg He Leu Arg Glu Phe Thr Val Arg 435 440 445 Pro Ala Ala Giy Gly Ser Gly Leu Asp Leu Phe Ala Glu Pro Trp Ala 450 455 460 He Oly C-ly As.-i Ser Tyr Gln Leu Gly Gly Phe Pro Gln Oly Trp Ser 465 470 475 480 Glu Trp Asn Gly Leu Phe Arg Asp Ser Leu Arg Gln Ala Gln Asn Glu 495 490 495 Leu Gly Ser Met Thr He Tyr Val Thr Gln Asp Ala Asn Asp Phe Ser 500 505 510 Gly Ser Ser A ii Leu Phe Gln Ser Ser Gly Arg Ser Pro Trp Asn Ser 515 520 525 He Asn Phe He Asp Val His Asp Gly Met Thr Leu Lys Asp Val Tyr 530 535 540 Ser Cys Asn Gly Ala Asn Asn Ser Glp Ala Trp Pro Tyr Gly Pro Ser 545 550 555 560 Asp Giy Gly Thr Ser Thr Asn Tyr Ser Trp Asp Gln Gly Met Ser Ala 565 570 575 Gly Thr Gly Ala Ala Val Asp Gln Arg Arg Ala Ala Arg Thr Giy Met 580 585 590 Ala Phe Glu Met Leu Ser Ala Gly Thr Pro Leu Met Gln sly sly Asp 595 600 605 Giu Tyr Leu Arg Thr Leu Gln Cys Asn Asn Asp Ala Tyr Asn Leu Asp 610 615 620 Ser Ser Ala Asn Trp Leu Thr Tyr Ser Trp Thr Thr Asp Gln Ser Asn 625 630 635 640 Phe Tyr Thr Phe Ala Glp Arg Leu He Ala Phe Arg Lys Ala His Pro 645 650 655 Ala Leu Arg Pro Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Ser Gln Leu Thr Trp Tyr 6S0 665 670 Glr. 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(774) <223> Isoamii sa Met Phe Asn Lys Tyr Lys Gln He Ser Glu Thr Aep Met Gln Arg Thr 1 5 10 15 He Leu Ala Ala Leu Leu Thr Giy Ala Leu Leu Gly Ala Pro Ala Trp 20 25 30 Ala Ala He Asn Fro Asn Lys Leu Gly Ala Ala Tyr Asp Ala Thr Lys 35 40 45 Ala Aen Val Thr ?t-e Lye Val Tyr Ser Ser Lys Ala Thr Arg He Glu 50 55 60 Leu Tyr Leu " ; r Ser r Ala Thr Gly Ser Ala Glu Lys Ala Lye Tyr 65 70 75 80 Val Met Thr Asn Ser Gly Gly He Trp Ser Val Thr He Pro Thr Ser 85 90 95 Thr Leu Ser Gly fin Gly Leu Gly Gly Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Arg 100 105 no Ala Trp Gly Pro ?sn Trp Pro Tyr Asn Ala Ser Trp Thr Lys Gly Ser 115 120 125 Ser Leu Gly Phe He Ser Asp Val Asp Ala Ala Gly Asn Arg Phe Asn 130 135 140 Pro Asn Lys Leu Leu Ser Asp Pro Tyr Ala Leu Glu Leu Ser His Asp 145 150 155 160 Pro Thr Thr Ala Thr Met Thr Asn Gly Ser He Tyr Ala Ser Gly Ala 165 170 175 Thr Tyr Arg Aen He Asp Ser Gly Ser Ser Ala Pro Lys Gly He Val 180 185 190 Leu Ala Gly Asp Thr Gln Ala Thr Gly Thr Lys Pro Thr Arg Ala Leu 1S5 200 205 Lys Asp Asp Val Val Tyr Glu Ala His Val Arg Gly Leu Thr Met Asn 210 215 220 Asp Thr Ser lie Thr Ala Ala Tyr Arg Gly Thr Tyr Lys Gly Ala Gly 225 230 235 240 Leu Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Val Thr Ala He Glu Phe 245 250 255 Leu Pro Val Gln Glu Thr Gln Asr. 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(* 13 ) <223> Isoa il-sa Met Lys Asp Arg Pro Leu Lys Pro Gly Glu Pro Tyr Pro Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Trp He Glu Glu Glu Asp Gly Val Asn Phe Val Leu Phe Ser Glu 20 25 30 Aen Ala Thr Lys Val Glu Leu Leu Thr Tyr Ser Gln Thr Arg Gln Asp 35 40 45 Glu Pro Lys Glu lie He Glu Leu Arg Gln Arg Thr Gly Asp Leu Trp 50 55 60 Hie Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly Gln Leu Tyr sly Tyr Arg 65 70 75 80 Val Tyr Gly Prc Tyr Lys Pro Glu Glu Gly Leu Arg Phe Asn Pro Asn 1*5 90 95 Lys Val Leu He As-, Pro Tyr Ala Lys Ala He Asn Gly Leu Leu Leu 100 105 110 Trp Aep Asp Ser Val Phe Gly Tyr Lys He Gly Asp Gln Aen sln Asp 115 120 125 Leu Ser Phe Asp Glu Arg Lys Asp Asp Lys Phe lie Pro Lys Gly Val 130 135 140 He He Aen Pro Tyr Phe Asp Trp Glu Aep Glu His Phe Phe Phe Arg 145 150 155 160 Arg Lys He Pro Phe Lys Asp Ser He He Tyr Glu Thr His He Lys 165 170 175 Gly He Thr Lys Leu Arg Gln Asp Leu Pro Glu Asn Val Arg Gly Thr 180 185 190 Phe Leu Giy Leu Ala Ser Asp Thr Met He Asp Tyr Leu Lye Asp Leu 195 200 205 Gly He Thr Thr Val Glu He Met Pro He sln Oln Phe Val Asp slu 210 215 220 Arg Phe He Val Asp Lys Gly Leu Lys Aen Tyr Trp Gly Tyr Asn Pro 225 230 235 240 He Asn Tyr Phe Ser Pro Glu Cye Arg Tyr Ser Ser Ser Gly Cys Leu 245 250 255 Gly Asn Glp Val He Glu Phe Lye Lye Leu Val Asn Ser Leu His Asn 260 265 270 Ala Gly Leu Glu Val He He Asp Val Val Tyr Asn His Thr Ala Glu 275 280 285 Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Lys Gly He Asp Asn Ser 290 295 300 Ser Tyr Tyr Met Leu Asp Pro Lys Asn Lys Arg Tyr Tyr He Asp Phe 305 310 315 320 Thr G'.y Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser His Pro Arg Val Leu Gln 325 330 335 Leu Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Leu Glu Met His Val Asp 340 345 350 Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ala Leu Ala Arg Gln Leu Tyr Ser 355 360 365 Val Asn Met Leu Ser Thr Phe Phe Val Ala He Gln Oln Asp Pro He 370 375 380 Leu Ser Gln Val Lys Leu He Ala Glu Pro Trp Asp Val Gly Pro Gly 385 390 395 400 Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Trp Ala Glu Trp Asn Gly" 405 410 415 Lys Tyr Arg Asp Thr He Arg Arg Phe Trp Arg Gly Asp Prc Val Pro 420 425 430 Tyr Glu Glu Leu Ala Asn Arg Leu Leu Gly Ser Pro Asp Leu Tyr Ala 435 440 445 Gly Ser Asn Lys T..- Pro Phe Ala Ser He Asn Tyr He Thr Ser Hie 450 455 460 Aep Gly Phe Thr Leu Gln Asp Leu Val Ser Tyr Asn Olp Lye His Aen 465 470 475 480 Glu Ala Asn Lys Leu Asn Asn Glu Asp Gly Met Asn Glu Asn Tyr Ser 485 490 495 Trp Asn Cye Gly Val Glu Gly Olu Thr Asr. 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(718) <223> Isoamilasa <400> 10 Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp He Olu Asp Asp Asp Gly Val Asn 20 25 30 Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Gln Lye Tyr Pro Lys Glu He He Glu Val Lys Asn 50 55 60 Lye Thr Gly Asp He Trp Hie Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr siy Pro Tyr Lys Pro slu Leu Gly 85 90 95 Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu He Asp Pro Tyr Ala Lys Ala 100 105 110 He Asn Gly Ser Val He Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys He 115 120 125 Gly Asp Gin Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Giu 130 135 140 Tyr Val Pro Lys Ser Val Val He Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp 145 150 155 160 Glu Asp Phe He Lys Gly Lye Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val He 165 17C 175 Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro 180 185 190 Glu Asn He Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met He • 195 200 205 Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly He Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val 210 215 220 Phe His Phe He Asp Gln Arg Phe Leu Thr Aep Lys Gly Leu Thr Asn 225 230 235 240 Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro He Asn Phe Phe Ser Pro Olu Cys Arg Tyr 245 250 255 Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lye Met 260 265 270 Val Asn Glu Leu HAS Asn Ala Gly He Glu Val He He Asp Val Val 275 280 285 Tyr Asr. 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Anp Glu He Asn Met Tyr Gly Glu ?.rg He Ala Asp ó-'.S 650 655 Asp Ser Phe Leu He He Leu Asn Ala Asn Pro Asn Asn Val Lys Val v360 665 670 Lys Pne Prc Lv« Gly Lys Trp Glu Leu Val He Ser Ser Tyr Leu Arg 675 680 685 Glu He Lys ¡ . r G'u slu Arg He He Glu Gly Glu Lys Glu Leu Glu 690 695 700 He Glu G-y ^rp Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg He Glu Leu 705 710 715 <211> 11 <211> 818 <212> PRT <213> Zea Mays <220> <221> PEPTIDO <222> (1) .. (818) <223> Isoamilasa <400> 11 Arg Leu Val Thr His Ser Thr Arg Thr His Tyr Leu He Gly Gln Ser 1 5 10 15 Gln Thr Asn Trp Ala Prc Ser Pro Pro Leu Pro Leu Pro Met Ala Gln 20 25 30 Lys Leu Pro Cye Val Ser Ser Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Pro Ala 35 40 45 Gly Arg Trp Arg Ala Gly Val Arg Gly Arg Pro Asn Val Ala Gly Leu 50 55 60 Gly Arg Gly Arg Leu Ser Leu His Ala Ala Ala Ala Arg Pro Val Ala 65 70 75 80 Giu Ala Val Gln Ala Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Val 85 90 95 Ala Glu Glu Arg Phe Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly 100 105 110 Met Pro Ala Pro Leu Gly Ala Thr Ala Leu Arg Gly Gly Val Asn Phe 115 120 125 Ala Val Tyr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Ser Leu Ser Leu Phe Ala 130 135 140 Pro Giy Asp Leu Lys Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp 145 150 155 160 Pro Leu Leu Asn Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe He His Gly 165 170 175 Asp Glu Leu His Gly Met Leu Cys Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Val Phe 180 185 190 Ala Pro Glu ?TC Gly Gln Tyr Tyr Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp 195 200 205 Pro Tyr Ala Lys Ala Val Val Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala 210 215 220 Pro Gly Gly Se- Cys Trp Pro Gln Met Ala Gly Met He Pro Leu Pro 225 230 235 240 Tyr Aer, Lys Ph'- Asp Trp Gln Gly Asp Leu Pro Leu Gly Tyr Hie Gln 245 250 255 Lys Asp Leu Val He Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys HAS 2SC 265 270 Asn Ser Ser Lyj Thr Lye His Pro Gly Thr Tyr He Gly Ala Val Ser 275 260 285 Lys Leu Asp HAS Leu Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys He Glu Leu Met 290 295 300 Pro Cys His Glu Phe Asn Glu Leu Glu Tyr Phe Ser Ser Ser Ser Lys 305 310 315 320 Met Asn Phe Trt> Gly Tyr Ser Thr He Asn Phe Phe Ser Pro Met Ala 325 330 335 Arg Tyr Ser S*.r Ser Gly He Arg Asp Ser Gly Cys Gly Ala He Asn 340 345 350 Glu Phe Lye íla Phe Val Arg Glu Ala Hie Lys Arg Gly He Glu Val 355 360 365 He Met Asp Val Val Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Giu Lys Gly 370 375 380 Pro He Leu Ser Phe Arg Gly He Asp Asn Ser Thr Tyr Tyr Met Leu 3B5 390 395 400 Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe 405 410 415 Asn Cys Aen His Pro Val Val Arg Glu Phe He Val Asp Cys Leu Arg 420 425 430 Tyr Trp Val Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala 435 440 445 Ser He Leu Thr Arg Gly Cys Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr 450 455 460 10 Gly Ser Pro Met Glu Gly Asp Ket He Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val 465 470 475 480 Ala Pro Pro Leu He Asp Met He Ser Aen Asp Pro He Leu Gly Asn 485 490 495 Val Lys Leu 11,» Ala Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Glu 500 505 510 Gly Gln Phe Pro His Trp Asn Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr 15 515 520 525 Arg Asp Thr Val Arg Gln Phe He Lye Oly Thr Asp sly Phe Ala Gly 530 535 540 Ala Phe Ala Glu Cys Leu Cys Gly Ser Pro Gln Leu Tyr Gln Ala Gly 545 550 555 560 Gly Arg Lys Pro Trp His Ser He Gly Phe Val Cys Ala His Asp Gly 20 565 570 575 Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val Thr Tyr Asn Ser Lys Tyr Asn Leu Ser 580 585 590 Asn Gly Glu Asp Phe Arg Asp Gly Glu Asp His Asn Leu Ser Trp Asn 595 600 605 Cys Oly Glu Glu Gly Glu Phe Ala Ser Leu Ser Val Arg Arg Leu Arg 25 610 615 620 Lys Arg Gln Met Arg Asp Phe Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly 625 630 635 640 Val Pro Met Phe Tyr Ket Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly 645 650 655 Asn Asn Asn Thr Tyr Cye Hie Asp His Tyr Val Asr. 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(2181) <223> Isoamilasa <400> 12 atg tca cat age gcg caa ccg gtt acg tcg gta cag gcc gtc tgg ccc 48 Met Ser His Ser Ala Gln Pro Val Thr Ser Val Gln Ala Val Trp Pro 1 5 10 15 ggc cgg cct tat ccg ctg ggt gcc acc tgg gac ggg ctg ggc gtc aac 96 Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Trp Asp Gly Leu Gly Val Asn 20 25 30 ttt gcc ctc tac age cag cae gcc gag gcg gtc gaa ctg gtg ctg ttc 144 Phe Ala Leu Tyr Ser Gln Hie Ala Glu Ala Val Glu Leu Val Leu Phe 35 40 45 gac cae ccg gac gat ccc gcg cct tcg cgc acg ate gaa gtg acc gaa 192 Aep HAS Pro Asp Asp Pro Ala Pro Ser Arg Thr He Glu Val Thr Glu 50 55 60 cgg aca ggc ccg ate tgg cat gtg tac ctg ccc ggc ctg cgt ccc ggc 240 Arg Thr Gly Pro lie Trp HAS Val Tyr Leu Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 cag ctc tac cgc tat cgc gtc tac gga ccc tac cgg ccg gag gaa ggc 288 Gln Leu Tyr Gly Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Arg Pro Glu Glu Gly 85 90 95 cae cgc ttc aat ccg aac aag gtg ctg ctc gac ccc tac gcg aag gcc 336 Hie Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ala 100 105 110 ate ggc cgg ccc ctt cgc tgg cae gac age ctc ttc ggt tac aaa ate 384 He Gly Arg Pro Leu Arg Trp His Asp Ser Leu Phe Gly Tyr Lys He 115 120 125 ggc gat ccg gcc ggg gat ctg tcg ttc tec gaa gaa gac age gct ccg 432 Gly Asp Pro Ala Gly Asp Leu Ser Phe Ser Glu Giu Aep Ser Ala Pro 130 135 140 tac gcg ccg ctg gga gcc gtc gtg gag ggc tgt ttc gag tgg ggc gac 480 Tyr Ala Pro Leu Gly Ala Val Val Glu Gly Cye Phe Glu Trp Gly Asp 145 150 155 160 gac cgc ccg ccg cgc att ccc tgg gaa gac acg ate ate tac gaa acg 528 Asp Arg Pro Pro Arg He Pro Trp Glu Asp Thr He He Tyr Glu Thr 165 170 175 cae gtc aag ggc ate acg aag ctg cat ccg gaa gtg ccg gag ccg ctg 576 His Val Lys Gly He Thr Lys Leu Hie Pro Glu Val Pro Glu Pro Leu 180 185 190 cgg ggg acg tat cug 7aq ctg acc tgc gag ccg gtg ctg gag cae ctg 624 Arg Gly Thr Tyr Leu Riy Leu Thr Cys Giu Pro Val Leu Glu His Leu 195 200 205 aag cag ctg ggc gtc acc acg ate cag ctc ctt ccg gtg cae gca aaa 672 Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr He Gln Leu Leu Pro Val His Ala Lys 210 215 220 gtg cae gat cgg Ct,c ctg gtc gag cgc ggc ctg cgc aac tac tgg ggc 720 Val His Asp Arg His Leu Val Glu Arg Gly Leu Arg Asn Tyr Trp Gly 225 230 235 240 tac aat ccg ctc tgc tac ttt gcg ccg gag ccc gag tac gcc acg aac 768 Tyr Aen Pro Leu Cye Tyr Phe Ala Pro Glu Pro Glu Tyr Ala Thr Asn 245 25C 255 ggg ccg ate ;cg gcc gtg cgc gag ttc aag atg atg gtg cgg gcg ctg 816 Gly Pro He Sar Ala Val Arg Glu Phe Lys Met Met Val Arg Ala Leu 260 265 270 cat gct gcc ggc tt g<?g gtg ate gtc gac gtg gtc tac aac cae acg 864 Hie Ala Ala Gly Phe blu Val He Val Asp Val Val Tyr Asn His Thr 275 280 285 ggc gaa ggc ggc gtp ctg ggc ccc acg ctg tcg ttc cgg ggc ate gac 912 Gly Glu Gly Gly Va i Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly He Asp 290 295 300 aac cgc gcc tac tac aag gcc gat ccg aac aac ccg cgc ttt ctg gtc 960 Asn Arg Ala Tyr "yr Lys Ala Aep Pro Asn Asn Pro Arg Phe Leu Val 305 31C 315 320 gat tac acg ggc acc ggc aac acg ctg gac gtg ggc aac ccc tac gtc 1008 Asp Tyr Thr Gly Thr Gly Aßn Thr Leu Asp Val Gly Asn Pro Tyr Val 325 330 335 ate cag ctc ate atg gac age ctg cgc tac tgg gtc act gaa atg cae 1056 He Gln Leu He Met Aep Ser Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met Hie 340 345 350 gtc gac ggc ttt cgg ttc gac ctg gcc gcc gcg ctg gcc cgc gag ctg 1104 Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg Glu Leu 355 360 365 tac gac gtg gac atg ctc tcg acc ttt ttt cag gtc att cag cag gac 1152 Tyr Asp Val Asp Met Leu Ser Thr Phe Phe Gln Val He Gln Gln Asp 370 375 380 ccg gtg ctc age cag gtc aag ctc ate gcc gaa ccc tgg gac gtc ggg 1200 Pro Val Leu Ser Gln Val Lys Leu He Ala Glu Pro Trp Asp Val Gly 385 390 395 400 ccg ggg ggg tat cag gtg gga cat ttt ccc tgg cag tgg acc gag tgg 1248 Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly HAS Phe Pro Trp Gln Trp Thr Glu Trp 405 410 415 aac ggc cgc tat cgt gac gcc gtg cgc cgc ttc tgg cgg ggc gat cgg 1296 Asn Gly Arg Tyr Arg Asp Ala Val Arg Arg Phe Trp Arg Gly Asp Arg 420 425 430 ggc ctc aac cgt gag ttt gcc acg cgc ttt gcc ggc tec age gat ctg 1344 Gly Leu Asn Gly slu Phe Ala Thr Arg Phe Ala Oly Ser Ser Asp Leu 435 440 445 tac gaa cgt age ggt cgt cgt ccg ttc gct tcg ate aac ttc gtc acg 1392 Tyr slu Arg Ser sly Arg Arg Pro Phe Ala Ser He Aen Phe Val Tnr 450 455 460 gcg cae gac ggc ttc acg ctg gaa gac ctg gtc age tac acg aaa aag 1440 Ala HAC Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Thr Lys Lys 465 470 475 480 cae aac gaa gcg aat ctg gaa ggc aac cgg gac ggc atg gac gaa aac 1488 His Asn Glu Ala Asn Leu Glu Gly Asn Arg Asp Gly Met Asp Glu Asn 485 490 495 tac age acg aac tgc ggg gtg gag gga ccc acg cag gat ccg tec gtg 1536 Tyr Ser Thr Asn Cys Gly Val Glu Gly Pro Thr Gln Asp Pro Ser Val 500 505 510 ctg gcc tgc cgg gaa gcg ctc aag cgc age ctg ate age acg ctc ttt 1584 Leu Ala Cys Arg Glu Ala Leu Lys Arg Ser Leu He Ser Thr Leu Phe 515 520 525 ctc tcg cag ggc gtg ccc atg ctg ctg ggc ggc gac gag ctg tcg cgc 1632 Leu Ser Gln aly Val Pro Met Leu Leu Gly Gly Asp Glu Leu Ser Arg 530 535 540 acg cag cae ggc aac a., aac gcc tat tgc cag gac aac gag ate age 1680 Thr Gln His Gly Asr. Aen Asn Ala Tyr Cys Gln Asp Asn Glu He Ser 545 550 555 560 tgg tac aac tgg cae ctc gac acg cgc aag cag cag ttt ctg gag ttc 1728 Trp Tyr Aen Trp Gln Leu Aep Thr Arg Lys Gln Gln Phe Leu Glu Phe 565 570 575 gtg cgc cag acg ate tgg ttt cgc aag cag cat cgg age ttc cgg cgc 1776 Val Are Gln Thr He Trp Phe Arg Lys sln Hie Arg Ser Phe Arg Arg 580 585 590 cgc cat ttt ctg acc gga ttg ccc aac ggc gga agg ccc cga cgc agt 1824 Arg HAS Phe Leu Thr Gly Leu Pro Asn Gly Gly Arg Pro Arg Arg Ser 595 600 605 ctg gtg gca cct gac ggt cgc ccc atg cgc cae gag gac tgg acc aac 1872 Leu Val Ala Pro Glu Gly Arg Pro Met Arg His Glu Asp Trp Thr Asn 61C 615 620 ccg gag ctg acc gcc t te gga ctg ctg ctg cae ggc gac gcc att cag 1920 Pro Glu Leu Thr Ala Phe Gly Leu Leu Leu HAS Gly Asp Ala He Gln 625 630 635 640 ggg acc gac gac cae sga cga ccg ttt cgc gac gac acg ttt ctg att 1968 Gly Thr Asp Glu HÍF Cly Arg Pro Phe Arg Asp Asp Thr Phe Leu He 64? 650 655 ctg ttc aac aac g age gaa gcc gtg ccg gtc gtg gtg ccg gag gta 2016 Leu Phe Asn Asn Giy Ser Glu Ala Val Pro Val Val Val Pro Glu Val 660 665 ' 670 tgc tec tgt ggc aag ccg cae cae tgg gag gtg gtc ccg gtg ttt caa 2064 Cys Ser Cys Gly Lys Pro His His Trp Glu Val Val Pro Val Phe Gln 675 680 685 cgc aat gtg gag ccc ccc acg tgc gcg ccc ggc gag acg ctg tcg ctc 2112 Arg Asn Val Glu Pro Pro Thr Cys Ala Pro Gly Glu Thr Leu Ser Leu 690 695 700 ccg ccc ggc gtg ctg acg gtg ctg gtg gcc gta ccg ccg ttc tcg gat 2160 Pro Pro Gly Val Leu Thr Val Leu Val Ala Val Pro Pro Phe Ser Asp 705 710 715 720 gga aac acs gag ccg gcc tga 2181 Gly Asn Thr Glu Pro Ala 725 <210> 13 <211> 726 <212> PRT <213> Rhodothermus marinus DSM 4252 <400> 13 Met Ser His Ser Ala Gln Pro Val Thr Ser Val Gln Ala Val Trp Pro 10 15 Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Trp Asp Giy Leu Gly Val Asn 20 25 30 Phe Ala Leu Tyr Ser Glp HAS Ala Glu Ala Val Glu Leu Val Leu Phe 35 40 5 Asp HAS Pro Asp Asp Pro Ala Pro Ser Arg Thr He Glu Val Thr Glu 50 55 60 Arg Thr Gly Pro He Trp His Val Tyr Leu Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Gly Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Arg Pro Glu Glu Gly 85 90 95 Hie Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ala 100 105 110 He Gly Arg Pro Leu Arg Trp His Asp Ser Leu Phe Gly Tyr Lys He 115 120 125 Giy Asp Pro Ala Gly Aep Leu Ser Phe Ser Glu Glu Asp Ser Ala Pro 130 135 140 Tyr Ala Pro Leu Gly Ala Val Val Glu Gly Cys Phe Glu Trp Gly Asp 145 150 155 160 Asp Arg Pro Pro Arg He Pro Trp Glu Asp Thr He He Tyr Glu Thr 165 170 175 His Val Lye Gly He Thr Lys Leu His Pro Glu Val Pro Glu Pro Leu 180 185 190 Arg Gly Thr Tyr Leu Gly Leu Thr Cye Glu Pro Val Leu Glu Hie Leu 195 200 205 Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr He Gln Leu Leu Pro Val His Ala Lye 21C 215 220 Val His Aep Arg His Leu Val Glu Arg Gly Leu Arg Asn Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Tyr Asn Pro Leu Cye Tyr Phe Ala Pro Glu Pro Glu Tyr Ala Thr Asn 245 250 255 Gly Pro He Ser Ala Val Arg Glu Phe Lys Met Met Val Arg Ala Leu 260 265 270 His Ala Ala Gly Phe Glu Val He Val Asp Val Val Tyr Asn His Thr 275 280 285 Gly Glu Gly Gly Val Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly He Asp 290 295 300 Asn Arg Ala Tyr Tyr Lys Ala Asp Pro Asn Asn Pro Arg Phe Leu Val 305 310 315 320 Asp Tyr Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asp Val Gly Aen Pro Tyr Val 325 330 335 He Gln Leu He Met Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met Hie 340 345 350 Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg Glu Leu 355 _ 360 365 Tyr Asp Val Asp Met Leu Ser Thr Phe Phe Gln Val He Gln Gln Aep 370 375 380 Pro Val Leu Ser Cln Val Lys Leu He Ala Glu Pro Trp Asp Val Gly 385 390 395 400 Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly Hie Phe Pro Trp Gln Trp Thr Olu Trp 405 410 415 Asn Gly Arg Tyr Arg Aep Ala Val Arg Arg Phe Trp Arg Gly Asp Arg 420 425 ' 430 Gly Leu Asn Gly Glu Phe Ala Thr Arg Phe Ala Gly Ser Ser Asp Leu 435 440 445 Tyr Glu Arg Ser Gly Arg Arg Pro Pne Ala Ser He Asn Phe Val Thr 450 455 460 Ala Hie Asp Gly Phe Tnr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Thr Lys Lys 465 470 475 480 His Asn Glu Ala Asn Leu Glu Gly Asn Arg Aep Gly Met Aep Glu Asn 485 490 495 Tyr Ser Thr Asn Cys Gly Val Glu Gly Pro Thr Gln Asp Pro Ser Val 500 ' 505 510 Leu Ala Cys Arg Glu Ala Leu Lys Arg Ser Leu He Ser Thr Leu Phe 515 520 525 Leu Ser Gln Gly Val Pro Met Leu Leu Gly Gly Asp Glu Leu Ser Arg 530 535 540 Thr Gln His Gly Asn Asn Asn Ala Tyr Cys Oln Asp Asn Glu He Ser 545 550 555 560 Txp Tyr Asn Trp Gln Leu Asp Thr Arg Lys Gln Gln Phe Leu Glu Phe ?f5 570 575 Val Arg Gln Thr He Trp Phe Arg Lys Gln Hie Arg Ser Phe Arg Arg 580 585 590 Arg His Phe Leu Thr Gly Leu Pro Asn Gly Gly Arg Pro Arg Arg Ser 595 600 605 Leu Val Ala Pro Glu Gly Arg Pro Met Arg His Glu Aep Trp Thr Asn 610 615 620 Pro Glu Leu Thr Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Gly Asp Ala He Gln 625 630 635 640 Gly Thr Asp Glu His Gly Arg Pro Phe Arg Asp Asp Thr Phe Leu He 645 650 655 Leu Phe Asn Asn Gly Ser Glu Ala Val Pro Val Val Val Pro Glu Val 66C 665 670 Cys Ser Cys Gly Lys Pro His His Trp Glu Val Val Pro Val Phe Gln 675 680 685 Arg Asn Val Glu Pro Pro Thr Cys Ala Pro Gly Glu Thr Leu Ser Leu 690 695 700 Pro Pro Gly Val Leu Thr Val Leu Val Ala Val Pro Pro Phe Ser Asp 705 710 715 720 Gly Asn Thr Glu Pro Ala 725 <210> 14 <211> 2736 <212> DNA 213> Bacillus acidopullulyticus <220> <221> gen <222> (1) .. (2736> <223> <400> 14 aaaaaatgct taatagaagg agtgtaatct gtgtccctaa tacgttctag gtataatcat 60 tttgtcattc tttttactgt cgccataatg tttctaacag tttgtttccc cgcttataaa 120 gctttagcag attctacctc gacagaagtc attgtgcatt atcatcgttt tgattctaac 180 tatgcaaatt gggatctatg gatgtggcca tatcaaccag ttaatggtaa tggagcagca 240 tacgagtttt ctggaaagga tgattttggc gttaaagcag atgttcaagt gcctggggat 300 gatacacacg taggtctgat tgtccgtaca aatgattgga gccaaaaaaa tacatcagac 360 gatctccata ttgatctgac aaaggggcat gaaatatgga ttgttcaggg ggatcccaat 420 atttattaca atctgagtga tgcgcaggct gcagcgactc caaaggtttc gaatgcgtat 480 ttggataatg aaaaaacagt attggcaaag ctaactaatc caatgacatt atcagatgga 540 tcaagcggct ttacggttac agataaaaca acaggggaac aaattccagt taccgctgca 600 acaaatgcga actcagcctc ctcgtctgag cagacagact tggttcaatt gacgttagcc 660 agtgcaccgg atgtttccca tacaatacaa gtaggagcag ccggttatga agcagtcaat 720 ctcataccac gaaatgtatt aaatttgcct cgttattatt acagcggaaa tgatttaggt 780 aacgtttatt caaataaggc aacggccttc cgtgtatggg ctccaactgc ttcggatgtc 840 caattacttt tatacaatag tgaaacagga cctgtaacca aacagcttga aatgcaaaag 900 agtgataacg gtacatggaa actgaaggtc cctggtaatc tgaaaaattg gtattatetc 960 tatcaggtaa cggtgaatgg gaagacacaa acagccgttg accettatgt gcgtgctatt 1020 tcagtcaatg caacacgtgg tatgatagtc gatttagaag ataegaatec tectggatgg 1080 aaagaagatc atcaacagac acctgcgaac ccagtggatg aagtaatcta cgaagtgcat 1140 gtgcgtgatt tttcgattga tgctaattca ggcatgaaaa ataaagggaa atatettgee 1200 tttacagaac atggcacaaa aggccctgat aacgtgaaaa cgggtattga tagtttgaag 1260 gaattaggaa tcaatgctgt tcaattacag ccgattgaag aatttaacag cattgatgaa 1320 acccaaccaa atatgtataa ctggggctat gacccaagaa actacaacgt ccctgaagga 1380 gcgtatgcaa ctacaccaga aggaacggct cgcattaccc agttaaagca actgattcaa 1440 agcattcata aagatcggat tgctatcaat atggatgtgg tctataacca tacctttaac 1500 gtaggagtgt ctgattttga taagattgtt ccgcaatact attatcggac agacagcgca 1560 ggtaattata cgaacggctc aggtgtaggt aatgaaattg cgaccgagcg tccgatggtc 1620 caaaagttcg ttctggattc tgttaaatat tgggtaaagg aataccatat cgacggcttc 1680 cgtttcgatc ttatggctct tttaggaaaa gacaccatgg ccaaaatatc aaaagagctt 1740 catgctatta atcctggcat tgtcctgtat ggagaaccat ggactggcgg tacctctgga 1800 ttatcaagcg accaactcgt tacgaaaggt cagcaaaagg gcttgggaat tggcgtattc 1860 aacgataata ttcggaacgg actcgatggt aacgtttttg ataaatcggc acaaggattt 1920 gcaacaggag atccaaacca agttaatgtc attaaaaata gagttatggg aagtatttca 1980 gatttcactt cggcacctag cgaaaccatt aactatgtaa caagccatga taatatgaca 2040 ttgtgggata aaattagcgc aagtaatccg aacgatacac aagcagatcg aattaagatg 2100 gatgaattgg ctcaagctgt ggtatttact tcacaagggg taccatttat gcaaggtgga 2160 gaagaaatgc tgcggacaaa aggcggtaat gataatagtt acaatgccgg ggatagcgtg 2220 aatcagttcg attggtcaag aaaaqcacaa tttqaaaatg tattcgacta ctattcttgg 2280 ttgattcatc tacgtgataa tcacccagca ttccgtatga cgacagcgga tcaaatcaaa 2340 caaaatctca ctttcttgga tagcccaacg aacactgtag catttgaatt aaaaaatcat 2400 gccaatcatg ataaatggaa aaacattata gttatgtata atccaaataa aactgcacaa 2460 actctcactc taccaagtgg aaattggaca attgtaggat taggcaatca agtaggtgag 2520 aaatcactag gccatgtaaa tggcacggtt gaggtgccag ctcttagtac gatcattctt 2580 catcagggta catctgaaga tgtcattgat caaaattaat attgattaag aaatgatttg 2640 taaaacattt aagtccattt acacgggata ctgtgtaaat ggattttagt tttatccgta 2700 gcatgtgtta aagaagtaaa tagtaaatgg caattt 2736

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Una variante diseñada genéticamente de una enzima desramificante de almidón genitora, la variante enzimática que está caracterizada porque tiene una termoestabilidad mejorada a un pH en- el rango de 4-6 en comparación con la enzima genitora.

2. La variante enzimática de la reivindicación 1, que está caracterizada porque la enzima es una pululanasa.

3. La variante enzimática de la reivindicación 1, que está caracterizada porque la enzima es una isoamilasa.

4. La variante enzimática de y cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que está caracterizada porque la variante enzimática tiene una termoestabilidad mejorada que se define por calorimetría explorativa diferencial (DSC) que utiliza el método descrito en la presente.

5. La variante enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que está- caracterizada porque la variante enzimática tiene una termoestabilidad mejorada como se define por un incremento de tiempo medio (T?/2) de al menos aproximadamente 5 %, preferiblemente al menos aproximadamente 10 %, más preferiblemente al menos 15 i , más preferiblemente al menos aproximadamente 25 2 , más preferiblemente al menos aproximadamente 50 2 , tales como al menos 100 % , en el "ensayo de Ti,- para licuefacción" descrito en la presente, que utiliza un pH de 5.0 y una temperatura de 95 °C.

6. La variante enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que está caracterizada porque la variante enzimática tiene una termoestabilidad mej orada que se define por un incremento en la actividad residual de la enzima de al menos 5 ?, preferiblemente al menos aproximadamente 10 2 , más preferiblemente al menos aproximadamente 15 Z , más preferibleraente al menos aproximadamente 25 1, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 2 , en el "ensayo para actividad residual después de licuefacción" descrita en la presente, que utiliza un pH de 5.0 y una temperatura de 95 °C.

7. La variante enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que está caracterizada porque la variante enzimática tiene una termoestabilidad mejorada como se define por un incremento en el tiempo medio (Ti/;) de al menos aproximadamente 5 %, preferiblemente al menos aproximadamente 10 I, más preferiblemente al menos aproximadamente 15 %, más preferiblemente al menos aproximadamente 25 %, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 %, tal co o al menos 100 z , en el "ensayo de Ti,; para sacarificación" descrito en la presente, que utiliza un pH de 4.5 y una temperatura de 70 °C.

8. La variante enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que está caracterizada porque la variante enzimática tiene una termoestabilidad mejorada que se define por una actividad enzimática residual de al menos aproximadamente 5 %, preferiblemente al menos aproximadamente 10 %, más preferiblemente al menos aproximadamente 15 I, más preferiblemente al menos aproximadamente 25 ?., más preferiblemente al menos aproximadamente 50 :!, en el "ensayo para actividad residual después de sacarificación" descrito en la presente, que utiliza un pH de 4.5 y una temperatura de 63°C.

9. La variante enzimática de la reivindicación 8, que está caracterizada porque tiene actividad enzimática residual incrementada cuando se ensaya a una temperatura de 70 °C.

10. Una variante diseñada genéticamente de una enzima desramificante de almidón genitora, la variante enzimática que tiene una actividad incrementada hacia amilopectina y/ó glicógeno en comparación con la enzima genitora.

11. La variante enzimática de la reivindicación 10, que está caracterizada porque la enzima genitora es una pululanasa.

12. La vari .ite enzimática de la reivindicación 11, que está caracterizada porque la pululanasa es producida por una pululanasa del genero Bacill us, por ejemplo Bacillus acidopullulyticus ó Bacillus deramificans, ó Pyrococcus, ó Klebsiella, por ejemplo, Klebsiella pneumoniae ó Klebsiella aerogenes .

13. La variante enzimática de la reivindicación 10, que está caracterizada porque la enzima genitora es una isoamilasa, por ej implo una isoamilasa producida por una bacteria del gener'< Pseudomonas, por ejemplo Pseudomona amyl odera osa, c de Sulfolobus, por ejemplo Sulfolobus acidocaldari us ó ulfolobus solfataricus, ó Rhodothermus, por ejemplo Rh dc hermus marinus .

14. La variante enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, que está caracterizada porque la variante enzimática adicionalmente tiene termoestabilidad como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

15. Un método para producir una variante enzimática desramificante de almidón con termoestabilidad mejorada, el método que está caracterizado porque comprende las etapas de: - identificar uno ó más residuos de aminoácidos y/ó regiones de aminoácidos asociadas con termoestabilidad en una primera enzima desramificante de almidón genitora, - identificar uno ó más residuos de aminoácidos y/ó regiones de aminoácidos homologas en una segunda enzima desramificante de almidón genitora por medio de alineación de las secuencias de aminoácidos de las primera y segunda enzimas desramificantes de almidón genitoras. - mutar uno ó más residuos de aminoácidos y/ó regiones de aminoácidos homologas en la segunda enzima desramificante de almidón genitora para producir la variante enzimática con termoestabilidad mejorada.

16. El método de la reivindicación 15, que está caracterizado porque la termoestabilidad incrementada se obtiene por mutación de residuos de aminoácidos y/ó regiones de aminoácidos homologas localizadas en un bucle, preferiblemente bucle 2 ó 3.

17. El método de la reivindicación 15, que está caracterizado porque la mutación se efectúa en al menos un residuo de aminoácido correspondiente a las posiciones 369-397, 419-458, 484-525, 553-568, 582-608, 613-616, 661-670 y 708-739 de la SEC ID NO: 1, posiciones 465-493, 515-554, 580-621, 649-664, 680-711, 714-717, 757-765 y 804-834 de la ?EC ID NO : 2, posiciones 176-195, 218-257, 283-334, 359-381, 395-413, 416-419, 461-470 y 537-568 de la SEC ID ?O: 3, y posiciones 21Q-230, 250-292, 319-376, 401-437, 461-479, 482-485, 533-580 y 605-636 de la SEC ID ?O: 4.

18. El método de la reivindicación 15, que está caracterizado porque la termoestabilidad incrementada se obtiene por reemplazo de al menos un residuo diferente de prolina con un residuo prolina.

19. El método de la reivindicación 15, que está caracterizado porque la termoestabilidad incrementada se obtiene por al menos una substitución Gly en ala.

20. El método de la reivindicación 15, que está caracterizado porque la termoestabilidad incrementada se obtiene por substitución de al menos un residuo Asn ó Gln con otro residuo aminoácido, preferiblemente un residuo aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Leu, lie, Phe, ala, Thr, Ser, y Tyr.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18-20, que está caracterizado porque la substitución se efectúa en el bucle 3, 5 y/ó 6.

22. Un método para producir una variante enzimática desramificante de almidón con especificidad de substrato alterada, el método que está caracterizado porque comprende las etapas de: - identificar uno ó más residuos de aminoácidos en al menos un bucle de aminoácidos asociado con especificidad hacia un substrato deseado en una primera enzima desramificante de almidón genitora, identificar uno ó más residuos de aminoácidos homólogos en al menos un bucle correspondiente en una segunda enzima desramificante de almidón genitor por medio de alineación de las secuencias de aminoácidos de las primera y segunda enzimas desramificantes de almidón genitoras, y - mutar uno ó más residuos de aminoácidos homólogos en al menos un bucle en la segunda enzima desramificante de almidón genitora para producir una variante enzimática con especificidad de substrato alterada.

23. El método de la reivindicación 22, que está caracterizado porque la mutación se efectúa en al menos un residuo de aminoácido correspondiente a las posiciones 369-397, 419-458, 484-525, 553-568, 582-608, 613-616, 661-670 y 708-739 de la SEC ID NO: 1, posiciones 465-493, 515-554, 580-621, 649-664, 680-711, 714-717, 757-765 y 804-834 de la SEC ID NO: 2, posiciones 176-195, 218-257, 283-334, 359-381, 395-413, 416-419, 461-470 y 537-568 de la SEC ID NO: 3, y posiciones 210-230, 250-292, 319-376, 401-437, 461-479, 482-485, 533-580 y 605-636 de la SEC ID NO: 4.

24. El método de la reivindicación 22, que está caracterizado porque la mutación se efectúa en el bucle 1, 2, 4, 5 y/ó 7.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, que está caracterizado porque la mutación es una transferencia de bucle.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-25, que está caracterizado porque la primera enzima desramificante de almidón genitora es una pululanasa.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-26, que está caracterizado porque la especificidad de substrato alterada es una actividad incrementada hacia amilopectina y/ó glicógeno.

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15-27, que está caracterizado porque los residuos de aminoácidos y/ó regiones de aminoácidos homologas adecuadas para la mutación se identifican en una segunda enzima desramificante de almidón genitora por medio de alineación de la secuencia de aminoácidos de la segunda enzima desramificante de almidón genitora con la secuencia más homologa en una alineación clave, en la que dicha alineación clave comprende una alineación de las secuencias de aminoácidos de al menos dos enzimas desramificantes de almidón relevantes.

29. El método de la reivindicación 28, que está caracterizado porque la alineación clave comprende una alineación de al menos dos secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1, 2, 3 y 4.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15-29, que está caracterizado porque la mutación de la segunda enzima desramificante de almidón genitora se efectúa en al menos un bucle de la segunda enzima desramificante de almidón genitora el cual es homólogo con un bucle correspondiente identificado en la Tabla 1 de la presente.

31. Un método para convertir almidón a uno ó más azúcares, el método que está caracterizado porque comprende desramificar el almidón utilizando al menos una variante enzimática como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-30.

32. El métod. de la reivindicación 31, que está caracterizado porqu; la conversión del almidón comprende licuefacción a ura temperatura de al menos aproximadamente 95 °C utilizando al menos una variante enzimática como se definió en cu? lqiiera de las reivindicaciones 1-6 y al menos una a-amilase .

33. El Método de la reivindicación 32, que está caracterizado porque la variante enzimática es una pululanasa ó una isoamilasa.

34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-33, que está caracterizado porque la conversión de almidón comprende sacarificación a una temperatura de al menos aproximadamente 63 °C, preferiblemente al menos aproximadamente 70 °C, utilizando al menos una variante enzimática como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 7-9 y al menos una glucoamílasa.

35. El método de la reivindicación 34, que está caracterizado porque la variante enzimática es una pululanasa.