CN110184248B - 一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，该方法包括以下步骤：⑴菌种活化：将购买的三种嗜热脂肪芽胞杆菌冷冻干燥菌粉分别培养，分别得到三种活化的嗜热脂肪芽胞杆菌；⑵菌种保藏：将三种活化的嗜热脂肪芽胞杆菌分别培养，分别得到三种斜面菌种；⑶菌种试管培养：将三种斜面菌种分别培养，分别得到试管种子菌种BTS‑Ⅰ、BTS‑Ⅱ、BTS‑Ⅲ；⑷三角瓶种子培养：将BTS‑Ⅰ、BTS‑Ⅱ、BTS‑Ⅲ试管种子菌种分别培养，分别得到三种摇瓶种子菌种；⑸淀粉分支酶的液体发酵；⑹淀粉分支酶分离制备；⑺淀粉分支酶冻干；⑻淀粉分支酶纯化，即得纯化的淀粉分支酶。本发明诱导筛选的菌种生长稳定，发酵生产的淀粉分支酶活力高、嗜热性能好，可在高温中保持较高的酶活性。

Description

一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法
技术领域
本发明涉及微生物菌种诱导选育、酶制剂发酵生产和淀粉改性领域，尤其涉及一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法。
背景技术
在自然界中淀粉主要以直链淀粉和支链淀粉两种形式贮藏多糖。直链淀粉是通过α-1,4-D-葡萄糖苷键连接而成的线性长链分子，其中有少量α-1,6糖苷键（areview [J]. JFood Sci, 2017），而支链淀粉在直链淀粉链上以α-1,6-糖苷键链接为分支，其分支点位置、分支度丰富（[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 1995, 35(5): 373-403.）。淀粉分支酶(Starch branching enzyme; EC 2.4.1.18)是一类糖基转移酶，属于糖苷水解酶家族13(GH13)（[J]. Carbohydr Res, 1993, 250(1): R7-R20；Appl Microbiol Biotechnol,2001, 57(5-6): 653-659）。淀粉分支酶能催化淀粉分子中α-1,4-糖苷键的断裂，在原主链上形成新的α-1,6-分支点。淀粉分支酶广泛分布于动物、植物、微生物中，它可以通过酶催化反应对淀粉中的α-糖苷键进行断裂后重新链接而改变淀粉的结构，所以在生物改性淀粉的制备中是重要的催化剂之一。
淀粉的工业化应用中常出现淀粉溶解度低、易回生、高粘度等现象，制约其使用领域。因此，通过合理的方法对淀粉的结构组成进行改造制备改性淀粉，能增加淀粉的应用范围，提高淀粉利用效率。使用物理或化学改性手段获得的改性淀粉改善了淀粉应用性能，虽已推广应用并产生了较高的经济价值，但产品中一般存在化学试剂残留、生成副产物多等问题，对环境造成不利影响（王旭青，[D].物理化学方法改性淀粉在造纸中的应用,江南大学硕士论文,2015；张宝军，[D].淀粉复合物的制备及其在纸张阻隔涂布中的应用，华南理工大学硕±学位论文，2016）。生物酶法制备改性淀粉因底物选择性高、产物特强异性、反应条件温和且工艺绿色环保，逐步受到重视。赵方等以α-淀粉酶改性木薯淀粉制备了阳离子酶改性淀粉乳胶液应用于瓦楞纸表面施胶剂（赵方等，酶改性淀粉接枝物的制备及性能[J].造纸化学品,2012,31(7):49-52.）；张映桤等将未经氧化的原玉米淀粉使用α-淀粉酶酶改性，制成表面施胶液用于文化纸表面施胶（张映桤等，酶改性淀粉在文化纸中的应用，[J].造纸化学品，2008，20（3）：38-40）。其它相关研究还有利用α-中温淀粉酶制备改性淀粉施胶液对牛皮挂面纸进行表面施胶（徐梦蝶，[D].交联淀粉牛皮挂面纸互穿网络增强及机理研究，南京林业大学硕士论文,2015）；4-α-葡萄糖基转移酶、分支酶对淀粉的改性作用等（姜欢，[D].4-α-葡萄糖基转移酶、分支酶对淀粉的改性作用研究）等。
淀粉分支酶广泛存在于生物体内，由于来源差异，其催化活性与底物的链长、空间位置、种类均有关系。在工业应用中，与动植物来源的酶相比，微生物来源的分支酶有诸多优势：菌种来源广泛、易于选育和培养、生产工艺简单、产量不受资源影响、副产物少、对环境影响小。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种活力高、嗜热性能好的嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，包括以下步骤：
⑴菌种活化：
将购买的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ冷冻干燥菌粉按20mg~50 mg/8~10mL分别接种于牛肉浸膏液体培养基中，三种菌分别于45 ℃、50℃、55 ℃恒温摇床中，以150 r/min的转速培养72 h，分别得到活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ；
⑵菌种保藏：
将所述活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ使用接种环按0.1~0.2mL/8~10mL分别接种于牛肉浸膏琼脂糖培养基中，分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，当菌落均匀长满斜面后，于冰箱0℃~4℃过夜后，再于-18℃冷冻保藏，分别得到三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种；
⑶菌种试管培养：
将所述三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种使用接种环按2~3环/8~10mL分别接种于种子试管培养基中，分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，分别得到三种试管种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用；其中：嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅲ；
⑷三角瓶种子培养：
将所述BTS-Ⅰ试管种子菌种、BTS-Ⅱ试管种子菌种、BTS-Ⅲ试管种子菌种按5%~10%的接种比例分别接种于摇瓶发酵培养基中，在摇床为转速150 r/min的条件下分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72 h，分别得到BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用；
⑸淀粉分支酶的液体发酵：
在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；然后将所述BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种按5%~10%的接种比例接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中发酵培养，得到发酵种子菌种；
在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；将所述发酵种子菌种按5%~10%的接种比例接种其中进行扩大培养，即得淀粉分支酶发酵液；
⑹淀粉分支酶分离制备：
所述淀粉分支酶发酵液经膜浓缩后离心，得浓缩分支酶；
⑺淀粉分支酶冻干：
所述浓缩分支酶经冷冻干燥、粉粹、过60目筛，即得冻干分支酶产品；
⑻淀粉分支酶纯化：
所述浓缩分支酶样品经硫酸铵盐析、柱层析分离，即得纯化的淀粉分支酶。
所述步骤⑴中嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ的微生物编号为CGMCC1.1865；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ的微生物编号为CGMCC1.1923；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ的生物编号为ACTT7953。
所述步骤⑴中牛肉浸膏液体培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol /L NaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L；然后分装至25mL的试管或250mL三角瓶中，其中试管每管8~10mL，三角瓶每瓶150mL；封装后无菌膜封口，121℃灭菌20min后冷却即得。
所述步骤⑵中牛肉浸膏琼脂糖培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol/L NaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L，再加入1.5%的琼脂糖，加热融化后分装至25mL的试管或φ8cm的培养皿中，其中试管每管8~10mL，培养皿每个15~20mL，试管无菌膜封口，培养皿加盖后121℃灭菌20min，趁热放于无菌工作台，试管保持斜角10~15度，培养皿水平放置，冷却凝固后即得。
所述步骤⑶中种子试管培养基是指按质量百分比计依次将葡萄糖0.05%、酵母膏0.1%、大豆蛋白胨0.2%、NaCl 0.1%、余量为去离子水混合均匀后得到pH值为7.0~7.5的液体，该液体分装至25mL的试管中，每管8~10mL，无菌膜封口，121 ℃灭菌20min后冷却即得。
所述步骤⑷中摇瓶发酵培养基是指按质量百分比计依次将淀粉0.1%、大豆蛋白胨0.2%、NaCl 0.1%、K2HPO4 0.1%、酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%、余量为去离子水混合均匀后得到pH值为7.0~7.5的液体，该液体分装于250mL三角瓶中，每瓶150mL，无菌膜封口，121℃灭菌20 min后冷却即得。
所述步骤⑸中发酵培养基是指按质量百分比计依次将麦芽糊精0.2%、大豆蛋白胨0.2%、酵母膏0.1%、NaCl 0.1%、余量为去离子水混合均匀，1mol/L NaOH溶液调整pH后得到pH值为7.0~7.5的液体。
所述步骤⑸中发酵条件是指温度为45℃或50℃或55℃、通气量为1.5L/min、搅拌转速为150~200r/min，发酵时间为36~72h。
所述步骤⑹中膜浓缩是指将淀粉分支酶发酵液经10μm膜、3~4Bar板框压滤，得上清液A，然后再经0.45μm膜、3~4Bar板框压滤，得上清液B；所述上清液B使用E2012C-28D、截留分子量≤1000的超滤膜浓缩至原液体积的5~8%。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明以购买的初始的嗜热脂肪芽孢杆菌为出发菌种经诱导培养，筛选，得到产酶性能良好的斜面保藏生产菌株。生产菌株经液体发酵培养后得到一定密度的菌细胞培养液，然后经离心（或过滤）、膜浓缩后可得到液体分支酶粗酶制品。粗酶制品再经硫酸铵盐析、柱层析分离后得到比酶活≥10000U/g蛋白质的电泳纯的液体分支酶。
2、经测试，本发明诱导筛选的菌种生长稳定，发酵生产的淀粉分支酶活力高、嗜热性能好，在65~70℃高温中长时间可保持较高的酶活性。
⑴淀粉分支酶最适作用pH
配制0.02mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH从3.6~9.4，每相邻两个点pH相差0.2，共20个醋酸-醋酸钠缓冲液。分别使用各缓冲液溶解配制1%的淀粉溶液和0.1%淀粉分支酶各2mL，相同pH溶液混合后以酶活力测定方法测定其酶活力。结果pH=5.4为淀粉分支酶最适作用pH，说明此淀粉分支酶是一种酸性作用酶。
⑵淀粉分支酶最适作用温度
用pH=5.4的0.02mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制1%的淀粉溶液和0.1%淀粉分支酶，各取2mL共10组混合，分别在45℃~90℃（相邻2组相差5℃）以酶活力测定方法测定其酶活力。结果淀粉分支酶最适作用温度为65℃~70℃，最高90℃处理30min时仍然具有30%的酶活力，说明此淀粉分支酶是一种嗜热酶。
⑶淀粉分支酶的最适温度时的作用时间
用pH=5.4的0.02mol醋酸-醋酸钠缓冲液配制1%的淀粉溶液和0.1%淀粉分支酶，各取2mL共10组混合，65℃反应0h~9h（每相邻2组相隔1h），以酶活力测定方法测定其酶活力，0h时作为对照组。结果在3h~4h 时酶活力最强，9h时其酶活仍然具有70%以上的酶活，说明此淀粉分支酶是一种非常稳定的嗜热酶。
⑷淀粉分支酶离子抑制剂和激活剂
配制实验用的各个离子溶液，浓度均为0.02mol/L，以各离子溶液分别配制1%的淀粉溶液和0.1%淀粉分支酶2mL混合后以酶活力测定方法测定其酶活力，对照组为无离子水组。结果Zn2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Sn2+、Cd2+为激活剂，Al3+为抑制剂。磷酸盐和醋酸盐对淀粉分支酶具有稳定作用。
⑸淀粉分支酶分子量
采用SDS-PAGE凝胶电泳法对本发明所得的淀粉分支酶进行分子量测定，其原理是当分子量在15k Da-200k Da 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。其中相对迁移率为蛋白样品距加样端迁移距离（cm）与溴酚蓝区带中心距(电泳前沿)和加样端距离（cm）的比值。淀粉分支酶电泳目标条带的确定是以SPD-G150分离的纯酶作为对照条带。
【SDS-PAGE凝胶电泳法】
电泳溶液配制见表1。
表1 SDS-PAGE凝胶电泳溶液配制表
Figure 931546DEST_PATH_IMAGE001
样品处理：将已知分子量的标准蛋白marker和SPD-G150分离的纯酶溶液与上样缓冲液以 1:1 比例混合均匀，沸水浴煮沸 5min，取 10μL 上样。
电泳操作：80V电泳浓缩胶，140V 电泳分离胶。
电泳结束后，小心把聚丙烯酰胺凝胶胶块转移到胶盒中，加入染色液染色 2~4h后，用蒸馏水洗去残留染色液，再用脱色液脱色2~3次，直至能够清晰辨别条带为止。分支酶分子测定线性方程回归结果见表2。鉴定结果见表3。
表2 SDS-PAGE凝胶电泳结果表
Figure 703193DEST_PATH_IMAGE002
表3 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果
Figure 591514DEST_PATH_IMAGE003
注：*代表具有淀粉分支酶活性。
从SDS-PAGE凝胶电泳图分析，浓缩酶共显示出5条带， DEAE-32分离的酶显示出2条带，SPD-G150分离的酶只有1条带，根据迁移率对比和酶活性测定，确定相对迁移率在0.58~0.60附近的条带为淀粉分支酶电泳条带，其中SPD-G150分离得到的淀粉分支酶为单一条带的纯酶。
分子测定以相对迁移率f为横坐标，marker的分子量（M）的对数值LgM为纵坐标得回归方程（R2≥0.9950）。将SPD-G150分离纯酶的电泳相对迁移率代入回归方程，分子量测定为31KDa左右（参见图5），为单亚基酶。
⑹淀粉分支酶酶活测定
测定原理是淀粉分支酶制剂能将淀粉分子链中的α-1, 4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精，少量单糖、麦芽糖和低聚糖，随后并以α-1, 6葡萄糖苷链接为分支淀粉，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度变化计算酶活力。
测定方法参考GB1886. 174-2016《食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂》中的A2方法测定，和李太贵等的方法（李太贵.沈波.陈能.罗玉坤.沈波.陈能.罗玉坤，Q酶对水稻籽粒坚白形成的影响.[J]作物学报, 1997,23(3):338-344），并做了适当修改。测定方法如下：
①配制1mol /L NaOH溶液100mL，1mol/L HCl溶液100mL, 0.2mol /L pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液100mL（配制方法：86mL 0.2mol/L醋酸钠和14mL 0.2mol/L醋酸溶液混合）。作为调整pH的溶液。
②称取100mg固体酶，无离子水定容至100mL，（或1mL液体酶无离子水定容至100mL）。作为测定样品。
③称取可溶性淀粉100mg，加1mL无水乙醇，1mL 1mol /L NaOH溶液溶解，无离子水定容至100mL，配制得到0.1%淀粉溶液。
④称取20mg碘，200mg碘化钾，于棕色容量瓶中，无离子水定容至100mL，配制成含碘0.02%和0.2%碘化钾的碘液，用作反应的显色剂。
⑤.吸取样品酶液0.1mL，0.2mol/L pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液0.9mL，0.1%可溶性淀粉溶液1mL，放入10mL试管，60℃恒温反应10min。对照为0.1%可溶性淀粉溶液1mL，0.2mol/L pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液1mL， 65℃恒温反应10min。反应完成后，于沸水中保持5min使酶灭活，然后凉水降温至室温。加入1mol /L HCl溶液0.1mL，1mL碘液，2mL无离子水，混匀后，以无离子水为空白，在分光光度计上测定波长660 nm处酶反应液和对照的吸光度值。
反应液和对照均不少于2个平行样，吸光度值为平行样的平均值。
⑥分支酶酶活力定义：在65℃温度、pH 5.4时，1g固体酶（或1mL液体酶）1min内使1mg/mL的淀粉溶液碘蓝值降低1%即为淀粉分支酶的一个活性单位[U/(mL min)]。
酶活力计算公式：
分支酶活力U=（OD660对照- OD660样品) ×稀释倍数/反应时间
=（OD660对照- OD660样品) ×1000/10
=（OD660对照- OD660样品) ×100
其中：稀释倍数=淀粉量（g）/酶量（g）=0.1×1×1000/(100/100×0.1)=1000
反应时间为10min。
分支酶比酶活力单位：1g固体（或1mL液体）支链淀粉酶所含活力单位除以支链淀粉酶中的蛋白含量（g/g或g/mL），即为支链淀粉酶的比酶活单位（U/g蛋白质），它反应了酶产品的纯度，比酶活越高，酶产品纯度越高。
经测试，本发明液体发酵酶液酶活力≥12.5U/mL；浓缩液体酶活力≥100U/mL；冷冻干燥固体酶活力≥500U/g、比酶活≥1000U/g蛋白质。
⑺发酵液菌密度OD值测定
将培养一定时间的菌种取样，摇匀，以去离子水对照，测定OD 540 nm处的光吸收值即为菌种生长时点的菌体密度。经测试，本发明OD540nm(1cm)在1.50~2.50。
3、本发明所得的淀粉分支酶具有催化水解淀粉的α- (1,4)–糖苷键转化为α-(1,6)–糖苷键，对淀粉进行改性，改善淀粉性能，增加淀粉用途，提高其使用功能，例如改性淀粉可广泛用于纸张表面施，提高纸张性能，也可减少造纸工业中化工产品的使用量，减少环境污染，同时淀粉分支酶还可以用于其他生物转化加工领域。因此，本发明具有广阔的应用前景，产品具有显著的经济效益和环境效益。
4、本发明所得的淀粉分支酶加到一定浓度的各种淀粉中，经恒温、离心、干燥等可得到改性淀粉，其在水中的分散性比原淀粉显著增高，粘度比原淀粉有较大的降低，其产品广泛用于各类纸张表面施胶。
【BTS-Ⅰ淀粉分支酶对淀粉的改性作用】
分别称取分析纯马铃薯淀粉、食用马铃薯淀粉、分析纯玉米淀粉、食用玉米淀粉、分析纯小麦淀粉、食用小麦淀粉各100g，加入1000mL水，按每单位酶活8~15g淀粉比例加入固体或液体分支酶（固体酶活力1340U/g，液体酶活力22.7U/mL），混匀，60℃~65℃、搅拌速度150r/min反应4h，12000g×离心8min。沉淀加水1000mL洗涤、离心两次后于75℃~80℃鼓风干燥，粉粹，过80目筛，得到改性淀粉，收率≥70%。
测定淀粉和改性淀粉的粘度，结果见表4。
表4 BTS-Ⅰ淀粉分支酶对淀粉的改性作用
Figure 474020DEST_PATH_IMAGE004
注：粘度测定温度30℃。
【改性淀粉过程中糖的测定】
测定原理：在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸（DNS）共热被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖量与棕红色物质颜色的深浅程度呈比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的OD值，查对标准曲线即可得出样品中还原糖的含量 。测定方法如下：
①DNS试剂配制：将3.15g 3,5-二硝基水杨酸和131mL 2mol/L NaOH溶液加入到250mL含有92.5g酒石酸钾纳的热水溶液中，混匀后再加入2.5g结晶酚和2.5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至500mL，储于棕色瓶中备用。
②葡萄糖标准曲线的制作
精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖0.18016g，置100 mL容量瓶中加热蒸馏水溶解稀释至刻度，其浓度为10. mmoL/ mL，取1mL，然后稀释1000倍，得到浓度为10μmoL/ mL的葡萄糖标准溶液。取9支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的10μmoL/ mL葡萄糖标准液，用0.02 mol/L pH6.5磷酸缓冲液补充至2 mL，加1.0 mL DNS溶液，置煮沸水中5 min，流水冷却，加纯水14mL，分光光度计测定OD540nm值，每管平行3份，取平均值。以OD540nm值为横坐标，葡萄糖浓度（μmoL/ mL）为纵坐标回归得到作葡萄糖标准曲线方程Y=15.251X+0.1372(R2≥0.996)。
糖含量计算公式：
糖含量(%)=180.16Yn×100%/106V
其中：Y为标准曲线方程计算得到的糖浓度；
n为糖溶液的稀释倍数；
V为测定糖溶液的取样体积（ml）；
180.16为葡萄糖的摩尔质量，106为换算系数。
经测试，本发明改性淀粉过程中所生成的糖含量在10%~15%。
结果表明BTS-Ⅰ淀粉分支酶作用于马铃薯淀粉、玉米淀粉和小麦淀粉后，在不同浓度条件下，均能降解淀粉长链产生分枝淀粉，同时产生少量的单糖和低聚糖，使淀粉粘度大幅度下降。故BTS-Ⅰ淀粉分支酶对马铃薯淀粉、玉米淀粉和小麦淀粉均具有较好的改性作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明保藏的嗜热脂肪芽孢杆菌。
图2为本发明嗜热脂肪芽孢杆菌BST-Ⅰ显微图（10×100）。
图3为本发明分支酶DEAE-32层析分离洗脱曲线。
图4为本发明分支酶SPD-G150层析分离洗脱曲线。
图5为本发明分支酶电泳鉴定图。
图6为本发明分支酶产品图。
具体实施方式
一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，包括以下步骤：
⑴菌种活化：
将购买的嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ冷冻干燥菌粉按20mg~50 mg/8~10mL分别接种于牛肉浸膏液体培养基中，三种菌分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温摇床中，以150 r/min的转速培养72 h，分别得到活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ。期间取培养液涂片染色观察有芽孢杆菌（参见图2），即表明菌种活化成功。
其中：嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)Ⅰ购买于中科院微生物（微生物编号CGMCC1.1865）；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ购买于中科院微生物（微生物编号CGMCC1.1923）；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ购于江苏昆山爱达斯工业公司（生物编号ACTT7953）。
牛肉浸膏液体培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol /L NaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L；然后分装至25mL的试管或250mL三角瓶中，其中试管每管8~10mL，三角瓶每瓶150mL；封装后无菌膜封口，121℃灭菌20min后冷却即得。
⑵菌种保藏：
将活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ使用接种环按0.1~0.2mL/8~10mL分别接种于牛肉浸膏琼脂糖培养基中，分别于45℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，当菌落均匀长满斜面后（参见图1），于冰箱0℃~4℃过夜后，再于-18℃冷冻保藏，分别得到三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种。保藏菌种每隔6个月接种于牛肉浸膏琼脂糖试管培养基中，以便传代保藏。-80℃冷冻可保藏2年后再传代保藏。
其中：牛肉浸膏琼脂糖培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol /L NaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L，再加入1.5%的琼脂糖，加热融化后分装至25mL的试管或φ8cm的培养皿中，其中试管每管8~10mL，培养皿每个15~20mL，试管无菌膜封口，培养皿加盖后121℃灭菌20min，趁热放于无菌工作台，试管保持斜角10~15度，培养皿水平放置，冷却凝固后即得。
⑶菌种试管培养：
将三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种使用接种环按2~3环/8~10mL分别接种于种子试管培养基中，分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，分别得到三种试管种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用。
其中：嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅲ。
种子试管培养基是指按质量百分比计依次将葡萄糖0.05%、酵母膏0.1%、大豆蛋白胨0.2%、NaCl 0.1%、余量为去离子水混合均匀后得到pH值为7.0~7.5的液体，该液体分装至25mL的试管中，每管8~10mL，无菌膜封口，121 ℃灭菌20min后冷却即得。
⑷三角瓶种子培养：
将BTS-Ⅰ试管种子菌种、BTS-Ⅱ试管种子菌种、BTS-Ⅲ试管种子菌种按5%~10%的接种比例分别接种于摇瓶发酵培养基中，在摇床为转速150 r/min的条件下分别于45 ℃、50℃、55 ℃恒温培养72 h，分别得到BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用。
其中：摇瓶发酵培养基是指按质量百分比计依次将淀粉0.1%、大豆蛋白胨0.2%、NaCl 0.1%、K2HPO4 0.1%、酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%、余量为去离子水混合均匀后得到pH值为7.0~7.5的液体，该液体分装于250mL三角瓶中，每瓶150mL，无菌膜封口，121 ℃灭菌20 min后冷却即得。
【菌种诱导培养和筛选】
将嗜热脂肪芽孢杆菌Ⅰ按5%~10%的接种比例分别接种于20个摇瓶发酵培养基中，保持其他培养基成分不变，但分别改变摇瓶发酵培养基的碳源种类及浓度，葡萄糖（0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%），麦芽糖（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%），可溶性淀粉（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），麦芽糊精（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），采用摇瓶培养，接种于150 mL摇瓶发酵培养基中，于45 ℃、150 r/min摇床培养72 h。分别测定各摇瓶发酵液中的菌体密度值和淀粉分支酶活性，结果见表5。
表5碳源诱导物种类及浓度对嗜热脂肪芽孢杆菌Ⅰ发酵菌体密度值和淀粉分支酶活性的影响
Figure 514919DEST_PATH_IMAGE005
由表5结果可知，不同培养基碳源诱导物对菌体密度值和淀粉分支酶活性的影响，最高为麦芽糊精，因此选择发酵培养基的最适碳源诱导物种类和浓度为0.2%麦芽糊精。
分别测定各摇瓶发酵液中的菌体密度值和淀粉分支酶活性。选择菌密度值最大，淀粉分支酶活力最高的最适碳源诱导物种类和浓度为0.2%麦芽糊精。将嗜热脂肪芽孢杆菌Ⅱ、Ⅲ使用相同于嗜热脂肪芽孢杆菌Ⅰ的碳源种类和浓度诱导方法进行试验，结果基本一致（结果见表6和表7）。
表6碳源诱导物种类及浓度对嗜热脂肪芽孢杆菌Ⅱ发酵菌体密度值和淀粉分支酶活性的影响
Figure 395150DEST_PATH_IMAGE006
表7碳源诱导物种类及浓度对嗜热脂肪芽孢杆菌Ⅲ发酵菌体密度值和淀粉分支酶活性的影响
Figure 833085DEST_PATH_IMAGE007
将经过碳源诱导的嗜热脂肪芽孢杆菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别接种于试管牛肉浸膏琼脂糖培养基中，分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，然后使用无菌水按1：10、1：100、1：1000、1：10000比例分别稀释并涂布接种于平板培养皿琼脂糖培养基中，培养皿导置平放于恒温培养箱中，三种菌分别于45 ℃、50 ℃、55℃恒温培养72 h。观察平板培养皿上的菌落，挑选单一的、生长厚实的菌落分别接种于试管牛肉浸膏琼脂糖斜面培养基中，三种菌分别于45℃、50 ℃、55℃恒温培养72 h，观察菌落覆盖长满培养基斜面后，说明菌种筛选完成。将筛选后的菌种扩培接种于试管牛肉浸膏琼脂糖斜面培养基中可进行传代保藏。
【三种嗜热脂肪芽孢杆菌产淀粉分支酶能力比较和筛选】
将试管种子的嗜热脂肪芽孢杆菌BTS-Ⅰ、BTS-Ⅱ和BTS-Ⅲ分别接种于摇瓶培养基中，于45℃、50℃、55℃恒温培养72h，测定并比较三种嗜热脂肪芽孢杆菌发酵液的菌体密度值和淀粉分支酶活性，结果见表8。表8 BTS-Ⅰ、BTS-Ⅱ和BTS-Ⅲ菌种发酵结果
Figure 440653DEST_PATH_IMAGE008
结果为BTS-Ⅰ＞BTS-Ⅲ＞BTS-Ⅱ，确认以上所有菌种均可作为分支酶的发酵初始菌种，其中嗜热脂肪芽孢杆菌BTS-Ⅰ为最优良的分支酶发酵初始菌种。
通过摇瓶发酵试验比较三种菌种生长、产酶活性，确认以上所有菌种均可作为分支酶的发酵初始菌种，其中嗜热脂肪芽孢杆菌BTS-Ⅰ为最优良的分支酶发酵初始菌种。
⑸淀粉分支酶的液体发酵：
在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；然后将BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种或BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种或BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种按5%~10%的接种比例接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中，在温度为45 ℃或50℃或55℃、通气量为1.5L/min、搅拌转速为150~200r/min的条件下发酵36~72h；当发酵时间超过36h后，取3mL发酵液，测定菌密度值BTS-Ⅰ达到1.8以上或BTS-Ⅱ达到1. 5以上或BTS-Ⅲ达到1.6以上后，得到发酵种子菌种。
在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；将发酵种子菌种按5%~10%的接种比例接种其中进行扩大培养，在温度为45℃或50℃或55℃、通气量为15L/min、搅拌转速为100~200r/min的条件下发酵36~72h，发酵期间使用1mol/L NaOH溶液调整pH值至6.0~7.0，并添加无菌水保持发酵总体积在60~65L；36h后测定发酵液菌密度BTS-Ⅰ超过1.8或BTS-Ⅱ超过1.5或BTS-Ⅲ超过1.6，发酵结束，否则继续发酵直至72h，即得淀粉分支酶发酵液。
其中：发酵培养基是指按质量百分比计依次将麦芽糊精0.2%、大豆蛋白胨0.2%、酵母膏0.1%、NaCl 0.1%、余量为去离子水混合均匀，1mol/L NaOH溶液调整pH后得到pH值为7.0~7.5的液体。
⑹淀粉分支酶分离制备：
淀粉分支酶发酵液经10μm膜、3~4Bar板框压滤，得上清液A，然后再经0.45μm膜、3~4Bar板框压滤，得上清液B；上清液B使用超滤膜(E2012C-28D，截留分子量上限≤1000）浓缩至原液体积的5~8%，然后12000g×离心10min再次去除沉淀，得浓缩分支酶。-18℃保藏，可作为液体酶产品使用。
⑺淀粉分支酶冻干：
浓缩分支酶放入80cm×80cm冷冻钢盘中，厚度1.5~2.0cm，于冷冻干燥机中-40℃预冻4h，然后于80mmgH真空度按冻干曲线-40℃~-4℃10h、-4℃~30℃10h、30℃10h进行冻干，冻干后经粉粹、过60目筛，即得冻干分支酶产品。按50g/袋封装于塑料袋，真空封口包装，-18℃保藏。保藏的冻干淀粉分支酶见图6。
⑻淀粉分支酶纯化：
浓缩分支酶样品放入玻璃烧杯中，加入硫酸铵至饱和度80，用1mol/L NaOH溶液调整pH=4.5后，于0~4℃沉淀12h，15000 g×离心15min，得到沉淀物；沉淀物用250mL，pH=6.5的0.02mol/L磷酸缓冲液（PBS溶液）溶解后，装入截留分子量4000da的透析袋中，使用0.02mol/L的PBS溶液为透析液，0~4℃透析，每次使用透析液5L，4~6h更换透析液，直至使用0.1mol/L的AgNO3溶液检测无SO4 2-离子，共更换透析液5次，透析30h。即得透析分支酶。
透析分支酶装入截留分子量8000da的透析袋中，放已平铺了100g分子量20000da的聚乙二醇的平皿中，0~4℃浓缩至原体积的1/5，得到浓缩酶液。
将已经处理好的DEAE-32 纤维素装柱（φ20mm×L300mm），用0.02mol、pH=6.5的PBS溶液对DEAE-32 纤维素离子交换层析柱平衡4~6小时，将浓缩酶液加入层析柱，用PBS溶液平衡至用紫外分光光度仪在OD280nm检测平衡洗脱液使无蛋白吸收峰，再用含0.5mol/L的NaCl的PBS溶液液洗脱，流速0.8~1mL/min。核酸蛋白检测仪记录洗脱曲线（见附图3），自动部分收集器收集洗脱液，每管3mL，测定具有酶活性的洗脱峰部分。测定酶活力为4.57U/mL，蛋白质1.015mg/mL。比酶活4500U/g蛋白质。洗脱液经PBS溶液透析除去其他离子，聚乙二醇20000浓缩，用于凝胶层析分离。
将处理好的Sephadex G-150凝胶装柱（φ10mm×L200mm），用0.02mol/L 、pH=6.5的PBS溶液对凝胶层析柱平衡1~2柱体积，然后将聚乙二醇20000浓缩的酶液取1mL上样，相同PBS溶液洗脱，流速0.5mL/min。核酸蛋白检测仪记录洗脱曲线（参见图4），自动部分收集器收集洗脱液，每管2mL，即得纯化的淀粉分支酶。
实施例1 采用菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌BTS-Ⅰ。
1.分支酶的液体发酵
在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃。将培养好的BTS-Ⅰ试管种子菌种接种于2瓶三角瓶摇瓶培养基中，于45℃恒温摇床转速150 r/min培养72 h。然后接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中，发酵参数为：温度45 ℃、通气量2.0L/min、搅拌转速150～200r/min，发酵时间72h。取3mL发酵液，测定菌密度值达到2.10，分支淀粉酶活力15.5U/mL。
在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃。将在5L发酵罐中的4L发酵好的种子菌种接种其中进行扩大培养，发酵参数：温度45℃、通气量20L/min、搅拌转速200r/min，发酵时间60h，发酵期间使用1mol/LNaOH溶液调整发酵液pH保持在6.0~7.0间，并添加无菌水保持发酵液总体积在60~65L。停止发酵，测定发酵液菌密度2.10，液体酶活力31.85U/mL。
2.分支酶分离制备
60L发酵液经10μm膜， 3~4Bar板框压滤，得上清液55L，然后再经0.22μm膜3~4Bar板框压滤，得上清液52L。上清液使用超滤膜(E2012C-28D，截留分子量上限≤1000）浓缩至6.2L。测定酶活力329.4U/mL。浓缩酶-18℃保藏，可作为液体酶产品使用。
6.2L液体浓缩酶放入80cm×80cm冷冻钢盘中，厚度1.5~2.0cm，于冷冻干燥机中-35℃预冻4h，然后按冻干曲线-35℃~0℃4h、0℃~40℃4h，40℃16h进行冻干，真空度80mmgH。冻干酶粉粹，过60目筛，得到冻干分支酶产品1120g，10g/袋封装于塑料袋，真空封口包装，-18℃保藏。测定冷冻干燥分支酶的酶活力1387U/g，蛋白质0.28/g，比酶活4953U/g蛋白质。冻干分支酶产品-18℃保藏。
3.分支酶对淀粉的改性作用
食用马铃薯淀粉600g加入3000mL水溶胀，按每单位酶活15g淀粉比例加入冻干分支酶（酶活单位1387U/g），混匀，60℃、150r/min搅拌反应4h，1μm膜，4Bar负压压滤，沉淀加水2000mL洗涤、压滤两次后于80℃鼓风干燥，粉粹，过80目筛，得到改性淀粉537g，测定30℃时改性淀粉的粘度：浓度 10%、15%、20%的改性淀粉粘度分别为720、1600、2000mpa.s（30℃），与原相同浓度淀粉粘度的1000、2000、4000mpa.s相比，粘度具有明显降低。
实施例2 采用菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌BTS-Ⅱ。
1.分支酶的液体发酵
在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至50℃。将培养好的BTS-Ⅱ试管种子菌种接种于2瓶三角瓶摇瓶培养基中，于50℃恒温摇床转速150 r/min培养72h。然后接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中，发酵参数为：温度50℃、通气量2.0L/min、搅拌转速150～200r/min，发酵时间72h。取3mL发酵液，测定菌密度值达到1.45，分支淀粉酶活力9.0U/mL。
在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至50℃。将在5L发酵罐中的4L发酵好的种子菌种接种其中进行扩大培养，发酵参数：温度50℃、通气量20L/min、搅拌转速200r/min，发酵时间72h，发酵期间使用1mol/LNaOH溶液调整发酵液pH保持在6.0~7.0间，并添加无菌水保持发酵液总体积在60~65L。停止发酵，测定发酵液菌密度1.68，液体酶活力12.5U/mL。
2.分支酶分离制备
60L发酵液经10μm膜， 3~4Bar板框压滤，得上清液55L，然后再经0.45μm膜3~4Bar板框压滤，得上清液52L。上清液使用超滤膜(E2012C-28D，截留分子量上限≤1000）浓缩至4.5L。测定酶活力129.4U/mL。浓缩酶-18℃保藏，可作为液体酶产品使用。
4.5L液体浓缩酶放入80cm×80cm冷冻钢盘中，厚度1.5～2.0cm,于冷冻干燥机中-35℃预冻4h，然后按冻干曲线-35℃～0℃4h、0℃～40℃4h,30℃16h进行冻干，真空度80mmgH。冻干酶粉粹，过60目筛，得到冻干分支酶产品1150g，10g/袋封装于塑料袋，真空封口包装，-18℃保藏。测定冷冻干燥分支酶的酶活力686U/g，蛋白质0.54/g，比酶活1270U/g蛋白质。冻干分支酶产品-18℃保藏。
3.分支酶对淀粉的改性作用
食用玉米淀粉2kg加入4L水溶胀，按每单位酶活8g淀粉比例加入冻干分支酶（酶活单位686U/g）搅拌反应4.5h，1μm膜，4Bar负压压滤，沉淀加水4L洗涤、压滤两次后于80℃鼓风干燥，粉粹，过80目筛，得到改性淀粉1.75kg，测定30℃时改性淀粉的粘度：浓度 10%、15%、20%的改性淀粉粘度分别为100、250、400mpa.s，与原相同浓度淀粉粘度的350、2000、4000mpa.s相比，粘度降低显著。
实施例3 采用菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌BTS-Ⅲ。
1.分支酶的液体发酵
在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至55℃。将培养好的BTS-Ⅲ试管种子菌种接种于2瓶三角瓶摇瓶培养基中，于55℃恒温摇床转速150 r/min培养72h。然后接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中，发酵参数为：温度55℃、通气量2.0L/min、搅拌转速150～200r/min，发酵时间68h。取3mL发酵液，测定菌密度值达到1.62，分支淀粉酶活力18.5U/mL。
在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至55℃。将在5L发酵罐中的4L发酵好的种子菌种接种其中进行扩大培养，发酵参数：温度55℃、通气量20L/min、搅拌转速200r/min，发酵时间64h，发酵期间使用1mol/LNaOH溶液调整发酵液pH保持在6.0~7.0间，并添加无菌水保持发酵液总体积在60~65L。停止发酵，测定发酵液菌密度1.90，液体酶活力22.5U/mL。
2.分支酶分离制备
55L发酵液经10μm膜， 3~4Bar板框压滤，得上清液52L，然后再经0.22μm膜3~4Bar板框压滤，得上清液51L。上清液使用超滤膜(E2012C-28D，截留分子量上限≤1000）浓缩至5.0L。测定酶活力260U/mL。浓缩酶-18℃保藏，可作为液体酶产品使用。
5L液体浓缩酶放入80cm×80cm冷冻钢盘中，厚度1.5~2.0cm,于冷冻干燥机中-30℃预冻4h,然后按冻干曲线-35℃~0℃6h、0℃~30℃6h, 30℃18h进行冻干，真空度80mmgH。冻干酶粉粹，过60目筛，得到冻干分支酶产品1335g，10g/袋封装于塑料袋，真空封口包装，-18℃保藏。测定冷冻干燥分支酶的酶活力1031U/g，蛋白质0.49/g，比酶活2104U/g蛋白质。冻干分支酶产品-18℃保藏。
3.分支酶对淀粉的改性作用
食用小麦淀粉2kg加入4L水溶胀，按每单位酶活10g淀粉比例加入冻干分支酶（酶活单位1031U/g），混匀，65℃、150r/min搅拌反应4h，1μm膜，4Bar负压压滤，沉淀加水4L洗涤、压滤两次后于80℃鼓风干燥，粉粹，过80目筛，得到改性淀粉1.56kg，测定30℃时改性淀粉的粘度：浓度 10%、15%、20%的改性淀粉粘度分别为250、1200、3000mpa.s，与原相同浓度淀粉粘度的550、2500、5000mpa.s相比，粘度降低显著。
上述实施例1~3中：固体酶产品蛋白质含量测定按GB5009. 5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》所列方法测定，液体酶产品蛋白质含量按考马斯亮蓝G-250法测定。
粘度测定按GB/T22427.7-2008《中华人民共和国国家标准淀粉粘度测定》中方法一测定。

Claims (7)

1.一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，包括以下步骤：
⑴菌种活化：
将购买的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ冷冻干燥菌粉按20mg~50 mg/8~10mL分别接种于牛肉浸膏液体培养基中，三种菌分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温摇床中，以150 r/min的转速培养72 h，分别得到活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ；所述嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ的微生物编号为CGMCC1.1865；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ的微生物编号为CGMCC1.1923；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ的生物编号为ACTT7953；
⑵菌种保藏：
将所述活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ使用接种环按0.1~0.2mL/8~10mL分别接种于牛肉浸膏琼脂糖培养基中，分别于45℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，当菌落均匀长满斜面后，于冰箱0℃~4℃过夜后，再于-18℃冷冻保藏，分别得到三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种；
⑶菌种试管培养：
将所述三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种使用接种环按2~3环/8~10mL分别接种于种子试管培养基中，分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，分别得到三种试管种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用；其中：嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅲ；
⑷三角瓶种子培养：
将所述BTS-Ⅰ试管种子菌种、BTS-Ⅱ试管种子菌种、BTS-Ⅲ试管种子菌种按5%~10%的接种比例分别接种于摇瓶发酵培养基中，在摇床为转速150 r/min的条件下分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72 h，分别得到BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用；
⑸淀粉分支酶的液体发酵：
在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；然后将所述BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种按5%~10%的接种比例接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中发酵培养，得到发酵种子菌种；
在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；将所述发酵种子菌种按5%~10%的接种比例接种其中进行扩大培养，即得淀粉分支酶发酵液；
⑹淀粉分支酶分离制备：
所述淀粉分支酶发酵液经膜浓缩后离心，得浓缩分支酶；所述膜浓缩是指将淀粉分支酶发酵液经10μm膜、3~4Bar板框压滤，得上清液A，然后再经0.45μm膜、3~4Bar板框压滤，得上清液B；所述上清液B使用E2012C-28D、截留分子量≤1000的超滤膜浓缩至原液体积的5~8%；
⑺淀粉分支酶冻干：
所述浓缩分支酶经冷冻干燥、粉粹、过60目筛，即得冻干分支酶产品；
⑻淀粉分支酶纯化：
所述浓缩分支酶样品经硫酸铵盐析、柱层析分离，即得纯化的淀粉分支酶；所述硫酸铵盐析是指浓缩分支酶样品放入玻璃烧杯中，加入硫酸铵至饱和度80，用1mol/L NaOH溶液调整pH=4.5后，于0~4℃沉淀12h，15000 g×离心15min，得到沉淀物；沉淀物用250mL，pH=6.5的0.02mol/L磷酸缓冲液溶解后，装入截留分子量4000da的透析袋中，使用0.02mol/L的PBS溶液为透析液，0~4℃透析，每次使用透析液5L，4~6h更换透析液，直至使用0.1mol/L的AgNO3溶液检测无SO4 2-离子，共更换透析液5次，透析30h，即得透析分支酶。
2.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑴中牛肉浸膏液体培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol/LNaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L；然后分装至25mL的试管或250mL三角瓶中，其中试管每管8~10mL，三角瓶每瓶150mL；封装后无菌膜封口，121℃灭菌20min后冷却即得。
3.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑵中牛肉浸膏琼脂糖培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol/L NaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L，再加入1.5%的琼脂糖，加热融化后分装至25mL的试管或φ8cm的培养皿中，其中试管每管8~10mL，培养皿每个15~20mL，试管无菌膜封口，培养皿加盖后121℃灭菌20min，趁热放于无菌工作台，试管保持斜角10~15度，培养皿水平放置，冷却凝固后即得。
4.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑶中种子试管培养基是指按质量百分比计依次将葡萄糖0.05%、酵母膏0.1%、大豆蛋白胨0.2%、NaCl 0.1%、余量为去离子水混合均匀后得到pH值为7.0~7.5的液体，该液体分装至25mL的试管中，每管8~10mL，无菌膜封口，121 ℃灭菌20min后冷却即得。
5.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑷中摇瓶发酵培养基是指按质量百分比计依次将淀粉0.1%、大豆蛋白胨0.2%、NaCl0.1%、K2HPO4 0.1%、酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%、余量为去离子水混合均匀后得到pH值为7.0~7.5的液体，该液体分装于250mL三角瓶中，每瓶150mL，无菌膜封口，121 ℃灭菌20min后冷却即得。
6.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑸中发酵培养基是指按质量百分比计依次将麦芽糊精0.2%、大豆蛋白胨0.2%、酵母膏0.1%、NaCl 0.1%、余量为去离子水混合均匀，1mol/L NaOH溶液调整pH后得到pH值为7.0~7.5的液体。
7.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑸中发酵条件是指温度为45℃或50℃或55℃、通气量为1.5L/min、搅拌转速为150~200r/min，发酵时间为36~72h。
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