JP4230498B2 - 新規トランスフェラーゼ及びアミラーゼ、それらの製造法及び利用、並びに該新規酵素類の遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、I−新規トランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造法、並びに該酵素の遺伝子及びその利用、II−新規アミラーゼ、その製造法及び該酵素を用いたα,α−トレハロースの製造法、並びに該酵素の遺伝子及びその利用に関するものである。
I−本発明は、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質として、その還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼとその製造法に関し、詳しくは、Sulfolobales目の古細菌、例えばSulfolobus属、Acidianus属等の細菌の産生する上記酵素に関するものである。
また、本発明は上記の新規アミラーゼをコードするDNA断片及びこのDNA断片の遺伝子工学的な利用に関する。
I.酵素トランスフェラーゼの背景技術
デンプン、及びマルトオリゴ糖等のデンプン分解物に作用する糖転移酵素については、今までに様々なグルコシルトランスフェラーゼ、及びサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ(CGTase)などが見出されている(生物化学実験法25、澱粉・関連糖質酵素実験法、学会出版センター刊、及びBIOINDUSTRY,Vol.9、No.1(1992)39−44など参照)。これらの酵素はグルコシル基をα−1,2、α−1,3、α−1,4、α−1,6位に転移する酵素であるが、α−1,α−1位に転移するような酵素は未だに知られていない。α−1,α−1結合に作用する酵素としては、トレハロース分解酵素であるトレハラーゼがあるが、あくまでトレハロースを唯一の基質とする分解酵素であり、その平衡及び反応速度は分解反応側に偏っている。
アミラーゼはデンプンを加水分解する酵素の総称であり、その中でα−アミラーゼはα−1,4グルコシド結合をエンド様式で加水分解する活性を持つ酵素である。α−アミラーゼは生物界に広く存在し、ほ乳類においては、消化酵素として、唾液、膵液中に認められる。植物においては、麦芽等に多く認められる。また微生物界においても広く分布しており、特にAspergillus属に属するかび、Bacillus属に属する細菌の産生するα−アミラーゼ等が産業上使用されている(アミラーゼ、中村道徳監修、学会出版センター刊、1986年)。
本発明は、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼ (以下、本発明の新規トランスフェラーゼ、或いは単に本発明の酵素又は本酵素とも称する)を提供するものである。
また、本発明は前記遺伝子を用いた組換え新規トランスフェラーゼおよびその製造法の提供を目的としている。
前記遺伝子で形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規トランスフェラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなるもの、である。
本発明は、少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成される3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖及び/又は2糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼを提供するものである。
また、本発明は前記遺伝子を用いた組換え新規アミラーゼおよびその製造法の提供をその目的としている。
さらに本発明は、組換え新規アミラーゼを用いたα,α‐トレハロースの製造法の提供をその目的としている。
(1)糖鎖中のα‐1,4グルコシド結合をエンド型で加水分解する活性、
(2)少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成され、かつその結合がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖および/または2糖を遊離する活性、および
(3)少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα‐1,α‐1結合であり、かつ該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、2つ目と3つ目のグルコース間のα‐1,4結合を加水分解し、α,α‐トレハロースを遊離する主要な活性を有する新規アミラーゼをコードするDNA配列を含んでなるもの、である。
上記組換え新規アミラーゼ、および
少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である三糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα‐1,4結合をα‐1,α‐1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼとを、
少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖と接触させる工程を含んでなるもの、である。
本発明者らにより自然界から実質的に純粋な形で分離した後述の新菌株KM1株は、平成6年(1994)4月1日に受託番号FERM BP−4626の番号のもとに工業技術院生命工学技術研究所に寄託されている。
本発明による新規トランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpKT22(後記する実施例I−14参照)で形質転換された大腸菌株E.coli JM109/pKT22は、平成6年(1994年)10月21日に受託番号FERM BP‐4843の番号のもとに、またプラスミドp09T1(後記する実施例I−16参照)で形質転換された大腸菌E.coli JM109/p09T1は平成7年(1995年)5月9日に受託番号FERM BP−5093の番号のもとに工業技術院生命工学技術研究所に寄託されている。
本発明の新規トランスフェラーゼを産生する微生物
本発明において利用されうる古細菌としては、Sulfolobus solfataricus ATCC 35091(DSM 1616)株、Sulfolobus solfataricus DSM 5833株、Sulfolobus solfataricus KM1株(本発明者らにより自然界から実質的に純粋な形で分離した後述の新菌株)、Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909(DSM 639)株、Acidianus brierleyi DSM 1651株等を挙げることができる。
上記において例示した微生物の中で、Sulfolobus solfataricus KM1株は本発明者らが群馬県の温泉から分離した菌株であって、次の様な性質を示すものである。
(1)形態的性質
菌の形、大きさ:球菌(不規則) 直径0.6〜2μm
(2)生育最適条件
pH:3〜5.5の範囲で生育し、最適生育pHは3.5〜4.5
温度:55℃〜85℃の範囲で生育し、最適生育温度は75℃〜80℃
硫黄を代謝できる
(3)好気性、嫌気性の区別:好気性
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)発行 Catalogue of Strains 5版(1993)に記載のSulfolobus solfataricus Medium等を好ましく用いることができる。更に糖源としてデンプン、マルトオリゴ糖等を加えてもよい。また、培養条件も上記の生育可能な温度及びpHのもとであれば特に限定されない。
本発明の新規トランスフェラーゼ産生のための培養条件は、該トランスフェラーゼを産生しうる範囲内で適宜選択すればよい。液体振とう培養又は通気撹拌培養の場合は各微生物が生育するpH、培養温度で、2日〜7日間の培養が適当である。培地としては、例えば、American Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)及びDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)発行 Catalogue of Strains 5版(1993)に記載のSulfolobus solfataricus Medium等を好ましく用いることができる。更に糖源としてデンプン、マルトオリゴ糖等を加えてもよい。
上記微生物の産生する本発明の新規トランスフェラーゼの抽出は、まず上記のような培養方法により得られた培養物から公知の方法、例えば遠心分離により菌体を得て、これを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕等により菌体を破砕し、遠心分離またはろ過により該トランスフェラーゼを含有する菌体抽出物を得る。
本発明の酵素例として、Sulfolobus solfataricus KM1株、Sulfolobus solfataricus DSM 5833株、Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株、Acidianus brierleyi DSM1651株の微生物がそれぞれ産生したトランスフェラーゼについてそれらの酵素学的な諸性質を下記の第1表にまとめて示す。なお、表中のデータは、実施例I−6及び7に示した具体例に基づくものである。
マルトトリオースを基質として用いた場合、主反応であるグルコシルトレハロースの生成とともに、副反応としてマルトース及びグルコースが等モル生成された。
マルトテトラオース以上の重合度nを持つ糖では、主反応として、還元末端のグルコース単位がα−1、α−1結合した糖が生成され、同様に副反応として等モルずつの重合度(n−1)糖及びグルコースが生成された。
註2:酵素作用/酵素反応様式
還元末端がα−1,4結合でグルコースが3つ結合したマルトトリオース以上の糖の還元末端の糖を、転移によりα−1,α−1で結合させる活性を有する酵素と考えられる。また基質濃度が低い場合、及び長時間反応させた場合等においては、副反応、即ち、グルコースポリマーからグルコースを遊離する活性も有する。この詳細は、実施例I−7の具体例において示す通りである。
本発明は、本酵素を用い、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質として作用させ、少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα−1,α−1結合で、該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα−1,4結合である糖を製造することを特徴とする末端の2糖がα−1,α−1結合である糖の製造法を提供するものであるが、該本発明の製造法を、最も典型的な具体例、即ち、グルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖の製造法でもって以下説明する。
本発明によれば、更に上記の新規トランフェラーゼをコードする遺伝子が提供される。
上記の通り、新規トランフェラーゼの遺伝子が提供されたことから、本発明によれば、この遺伝子の発現産物である組換え新規トランフェラーゼが提供される。
本発明による新規トランスフェラーゼをコードするDNA断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むDNA分子、特に発現ベクター、の形態として宿主細胞の形質転換を行えば、宿主細胞において本発明による組換え新規トランスフェラーゼを産生させることができる。
更に本発明によれば、上記の組換え新規トランスフェラーゼを用いた、グルコシルトレハロースおよびマルトオリゴシルトレハロース等のいわゆるトレハロースオリゴ糖の製造法が提供される。
本発明の新規アミラーゼを産生する微生物
本発明において利用されうる古細菌としては、Sulfolobus solfataricus KM1株(本発明者らにより自然界から実質的に純粋な形で分離した前述の新菌株)、Sulfolobus solfataricus DSM 5833株、Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909(DSM 639)株等を挙げることができる。
本発明の新規アミラーゼ産生のための培養条件は、該アミラーゼを産生しうる範囲内で適宜選択すればよい。液体振とう培養又は通気撹拌培養の場合は各微生物が生育するpH、培養温度で、2日〜7日間の培養が適当である。培地としては、例えば、American Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)及びDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)発行 Catalogue of Strains 5版(1993)に記載のものを好ましく用いることができる。更に糖源としてデンプン、マルトオリゴ糖等を加えてもよい。
上記微生物の産生する本発明の新規アミラーゼの抽出は、まず上記のような培養方法により得られた培養物から公知の方法、例えば、遠心分離により菌体を得て、これを適切な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕等により菌体を破砕し、遠心分離又はろ過により該アミラーゼを含有する菌体抽出物を得る。
本発明の酵素例として、Sulfolobus solfataricus KM1株、Sulfolobus solfataricus DSM 5833株、及びSulfolobus acidocaldarius ATCC 33909(DSM 639)株の古細菌がそれぞれ産生した新規アミラーゼについてそれらの酵素学的な諸性質を下記の第2表にまとめて示す。なお、表中のデータは、実施例II−5に示した具体例に基づくものである。
可溶性デンプンを基質として用いた場合、反応初期にヨウ素デンプン反応が速やかに消失し、引き続き、マルトース、グルコースを主成分として若干量のマルトトリオース、マルトテトラオースを生成するように分解した。
註2:酵素作用/酵素反応様式
本酵素はデンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖を基質とした場合、加水分解反応により主にグルコース、マルトースを生成し、少量のマルトトリオース、マルトテトラオースを生成する。本活性の作用機作についてはこれらの基質に対してエンド型に作用するアミラーゼ活性と共にその還元末端側から主に単糖、2糖を生成する活性を有する。
よって、本酵素は新規なアミラーゼであると考えられる。この詳細は、実施例II−5の具体的な例において示す通りである。
本発明のα,α−トレハロースの製造法において使用するトランスフェラーゼとしては、前述のI.新規トランフェラーゼの項において詳説した本発明のトランフェラーゼを用いることができる。具体的には、例えばSulfolobus solfataricus ATCC 35091(DSM 1616)株、Sulfolobus solfataricus DSM 5833株、Sulfolobus solfataricus KM1株、Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909(DSM 639)株、Acidianus brierleyi DSM 1651株等が産生するトランスフェラーゼを挙げることができる。
本発明は、本発明の新規アミラーゼとトランスフェラーゼとを用いて、α,α−トレハロースを製造する方法を提供するものであるが、該本発明の製造法を、最も典型的な具体例、即ち、デンプン、デンプン分解物、及びマルトオリゴ糖等の糖原料から、α,α−トレハロースを製造する方法でもって以下説明する。なお、デンプン等に上記の2つの酵素が作用する機構は、多分、以下の通りであると考えられる。すなわち、デンプン、デンプン分解物、或いはマルトオリゴ糖に本発明の新規アミラーゼがそのエンド型活性により、まず作用してこのものをアミロース又はマルトオリゴ糖に分解し、続いて、トランスフェラーゼの作用によって該アミロース又はマルトオリゴ糖の還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転位させ、更に、再び新規アミラーゼが作用してα,α−トレハロースと、重合度を2つ減じたアミロース又はマルトオリゴ糖を生成し、こうして生じたアミロース又はマルトオリゴ糖に上記の反応が繰り返されて、延いては、高収率でα,α−トレハロースが生成されるようになるのではないかと考えられる。
本発明によれば更に上記の新規アミラーゼをコードする遺伝子が提供される。
本発明による新規アミラーゼをコードしている遺伝子を含むDNA断片の具体例としては、図34または図38に示される制限酵素地図で表されるDNA断片が挙げられる。
本発明による配列番号5に示される塩基配列の639番または642番から2315番の配列を有するDNA断片、または配列番号7に示される塩基配列の1176番から2843番の配列を有するDNA断片は塩基配列が定まっていることから、そのDNA断片を取得する一つの手段は核酸合成の手法に従って製造することである。
上記の通り、新規アミラーゼの遺伝子が提供されたことから、本発明によれば、この遺伝子の発現産物である組換え新規アミラーゼが提供される。
後記する実施例II−24において明らかにされているように、配列番号7に示される1393番から2116番までの配列を有するDNA断片が、このDNA断片の起源であるSulfolobus acidocaldarius ATCC33909株またはSulfolobus solfataricus KM1株以外の他の菌株由来のDNA断片とハイブリッドを形成している。一方、上記したように、これらの菌株から性質の酷似した新規アミラーゼの存在を今般確認した。また後記する実施例II−23において明らかにされるように、Sulfolobus solfataricus KM1株とSulfolobus acidocaldarius ATCC33909株の2株の間で、新規アミラーゼのアミノ酸配列の相同性はギャップを考慮して計算した場合59%である。従って、配列番号6または8に示されるアミノ酸配列とある程度の相同性ある配列において、新規アミラーゼ活性が保持されうることは当業者に明らかであるといえる。
本発明による新規アミラーゼをコードするDNA断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むDNA分子、特に発現ベクター、の形態として宿主細胞の形質転換を行えば、宿主細胞において本発明による新規アミラーゼを産生させることができる。
本発明によれば、上記の組換え新規アミラーゼと、前記した組換え新規トランスフェラーゼを用いた、α,α‐トレハロースの製造法が提供される。
α,α‐トレハロースの製造法の好ましい態様によれば、本発明による組換え新規アミラーゼと、組換え新規トランスフェラーゼは同時にデンプン、デンプン分解物、マルトオリゴ糖等の糖と、混合され、接触されてよい。また、組換え新規トランフェラーゼ及び組換え新規アミラーゼのいずれか一方を天然由来の酵素に置き換えることも好ましい。
下記の第3表に示す菌株についてグルコシルトレハロース生成活性を調べた。方法としては、各菌株の培養菌体を超音波破砕処理、遠心分離を行い、その上清に基質であるマルトトリオースを最終的に10%となるように加え、60℃で24時間反応後、100℃で5分間加熱処理して反応を停止させた後、生成したグルコシルトレハロースを、以下に示す条件のHPLC分析法により測定した。
カラム: TOSOH TSK-gel Amide-80(4.6 ×250mm )
溶媒 : 75%アセトニトリル
流速 : 1.0ml/min
温度 : 室温
検出器: 示差屈折計
酵素活性は、マルトトリオースを1時間に1μmolのグルコシルトレハロースに変換する酵素活性を1ユニットとして示した。但し、第3表においては菌体g当りの活性として示した。
Sulfolobus solfataricus KM1株を、2g/リットルの可溶性デンプン及び2g/リットルの酵母エキスを含むAmericanType Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)に記載の培地番号1304の培地で75℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は3.3g/リットルであった。
なお、活性測定は、実施例I−1と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第4表に示す。
Sulfolobus solfataricus DSM5833株を、2g/リットルの可溶性デンプン及び2g/リットルの酵母エキスを含むAmerican Type Culture Collection(ATCC)発行Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)に記載の培地番号1304の培地で75℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は1.7g/リットルであった。
さらに同様の条件にてクロマトフォーカシングを行い、標的トランスフェラーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜(分子量カット13000)にて濃縮し、引き続き5mMのEDTAを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)にて洗浄、脱塩した。
なお、活性測定は、実施例I−1と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第5表に示す。
Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株を、2g/リットルの可溶性デンプン及び2g/リットルの酵母エキスを含むAmerican Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)に記載の培地番号1304の培地(pH3.0)で75℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は2.9g/リットルであった。
なお、活性測定は、実施例I−1と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第6表に示す。
Acidianus brierleyi DSM 1651株を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)発行 Catalogueof Strains 5版(1993)に記載の培地番号150の培地で70℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は0.6g/リットルであった。
なお、活性測定は、実施例I−1と同様に行った。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第7表に示す。
実施例I−2で得られた精製酵素の酵素学的諸性質を測定した。
ネイティブな状態での精製酵素の分子量測定は、ゲル濾過クロマトグラフィー(カラム:Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg)により行った。マーカータンパク質として分子量200,000;97,400;68,000;43,000;29,000;18,400;14,300のものを用いた。
その結果、該トランスフェラーゼの分子量は54,000であった。
ゲル濃度6%のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量測定を行った。マーカータンパク質として分子量200,000;116,300;97,400;66,300;55,400;36,500;31,000;21,500;14,400のものを用いた。
その結果、該トランスフェラーゼの分子量は76,000であった。
ゲル濾過クロマトグラフィーとSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量の測定値に相違が見られたが、これは多分、ゲル濾過カラムの充填剤とタンパク質との間に何らかの相互作用が働くためではないかと考えられる。よって、ゲル濾過による分子量の値は本酵素のネイティブな状態での分子量を示しているとは必ずしもいえない。
アガロースゲル等電点電気泳動の結果、等電点は6.1であった。
得られた精製酵素の各温度、各pHにおける安定性を、それぞれ図2、図3に示す。測定は、pH3〜5の間はグリシン塩酸系緩衝液を、pH4〜6の間は酢酸ナトリウム系緩衝液を、pH5〜8の間は燐酸ナトリウム系緩衝液を、pH8〜9の間はトリス塩酸系緩衝液を、pH9〜10の間は炭酸水素ナトリウム系緩衝液を、pH11〜13の間はKCl−NaOH系緩衝液をそれぞれ用いた。
本酵素は85℃で6時間の処理で安定であり、またpH4.0〜10.0の室温6時間の処理で安定であった。
得られた精製酵素の各温度、各pHにおける反応性を、それぞれ図4、図5に示す。測定は、pH3〜5の間はグリシン塩酸系緩衝液(□)を、pH4〜5.5の間は酢酸ナトリウム系緩衝液(●)を、pH5〜7.5の間は燐酸ナトリウム系緩衝液(△)を、pH8〜9の間はトリス塩酸系緩衝液(◇)をそれぞれ用いた。本酵素は60〜80℃付近に反応最適温度、pH5.0〜6.0付近に反応最適pHを有する。
実施例I−1のグルコシルトレハロース生成活性の測定法において以下の第8表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を実施例I−1と同様に行い、活性化又は阻害の有無を調べた。その結果、銅イオン、SDSにて阻害を受けることがわかった。糖関連酵素ではカルシウムイオンによって活性化される場合が多く認められるが、本酵素ではカルシウムイオンによっては活性化されない。
基質を100mMのマルトトリオース(G3)〜マルトヘプタオース(G7)とし、実施例I−2で得られた精製酵素13.5Units/ml(マルトトリオースを基質として作用させたときの酵素活性)をそれぞれ作用させ、対応するα−1,α−1転移体を生成させた。各生成物の分析法は実施例I−1の方法により行い、その収率及び酵素活性を調べた。なお、第10表中での酵素活性は、各マルトオリゴ糖を1時間に1μmol の対応するα−1,α−1転移体に変換する酵素活性を1ユニットとして示した。結果は以下の第10表に示した通りである。
実施例I−2で得られた精製酵素10Units/mlを用い、基質を可溶性デンプン(ナカライテスク社製、特級品)のα−アミラーゼ分解物(ヨウ素デンプン反応を示さずオリゴ糖にまで分解されたもの:なおここにおいて用いられたα−アミラーゼは、Sigma 社製のA-0273 アスペルギルス・オリゼ由来のもの)とし、グルコシルトレハロース及び各種のマルトオリゴシルトレハロースの製造を試みた。反応液は以下に示す条件下のHPLC分析法により分析を行った。
カラム: BIORAD AMINEX HPX-42A (7.8 ×300mm )
溶媒 : 水
流速 : 0.6ml/min
温度 : 85℃
検出器: 示差屈折計
図9にそのHPLCによる分析チャートを示した(A) 。なお対照として、本酵素トランスフェラーゼを添加しない場合のHPLCチャートを示した(B) 。その結果、反応生成物のオリゴ糖類は還元末端がα−1,α−1に転移されるため、対照のアミラーゼのみによる生成物よりも各々保持時間が短いオリゴ糖類を生じた。これらの反応物の例として、実施例I−7の場合と同様に3糖、4糖、及び5糖をそれぞれ分取し、 1H−NMR、13CーNMRにより解析を行ったところ、いずれも還元末端のグルコース残基1個がα−1,α−1で結合した構造を示し、それぞれグルコシルトレハロース(α−D−マルトシル α−D−グルコピラノシド)、マルトシルトレハロース(α−D−マルトトリオシル α−D−グルコピラノシド)、及びマルトトリオシルトレハロース(α−D−マルトテトラオシル α−D−グルコピラノシド)であることを確認した。これらの化学式はそれぞれ以下の通りである。
α,α−トレハロース:Sigma 社製
可溶性デンプン:ナカライテスク社製、特級品
Klebsiella pneumoniae 由来プルラナーゼ:和光純薬製、165-15651
パインデックス#1及びパインデックス#3:松谷化学製
マルトース(G2):和光純薬製
マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)、マルトペンタオース(G5)、マルトヘキサオース(G6)、マルトヘプタオース(G7)、及びアミロース DP−17:林原バイオケミカル製
アミロペクチン:ナカライテスク社製、特級品
イソマルトース:和光純薬製
イソマルトトリオース:和光純薬製
イソマルトテトラオース:生化学工業製
イソマルトペンタオース:生化学工業製
パノース:東京化成工業製
下記の第11表に示す菌株について活性を調べた。方法としては各菌株の培養菌体を超音波破砕処理、遠心分離を行い、その上清を粗酵素液として、これに基質であるマルトトリオシルトレハロースを最終的に10mMとなるように加え、60℃、pH5.5(50mM酢酸ナトリウム緩衝液)で反応後、100℃で5分間加熱処理して反応を停止させた後、生成したα,α−トレハロースを、以下に示す条件のHPLC分析法により測定した。
カラム: TOSOH TSK-gel Amide-80(4.6 ×250mm )
溶媒 : 72.5%アセトニトリル
流速 : 1.0ml/min
温度 : 室温
検出器: 示差屈折計
トレハロースオリゴ糖分解活性は、マルトトリオシルトレハロースから1時間に1μmolのα,α−トレハロースを遊離する酵素活性を1Unitとして示した。但し、第11表においては菌体g当りの活性として示した。また、マルトトリオシルトレハロースの調製は、50mM酢酸(pH5.5)を含む10%マルトペンタオースにSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを10Units/mlとなるように添加して60℃で24hr反応させた後、上記条件のTSK-gel Amide-80 HPLC columnにより分取することによって行った。なお、Sulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼの活性は、マルトトリオースを基質としてpH5.5、60℃で1時間に1μmolのグルコシルトレハロースを生成する酵素活性を1Unitと定義する。
カラム: BIO-RAD AMINEX HPX-42A(7.8 ×300mm )
溶媒 : 水
流速 : 0.6ml/min
温度 : 85℃
検出器: 示差屈折計
デンプン分解活性は、デンプン- ヨウ素複合体の青紫色による620nmの吸光を10分に10%減少させる酵素量を1Unitと定義した。但し、第11表においては菌体g当たりの活性として示した。
Sulfolobus solfataricus KM1株を、2g/リットルの可溶性デンプン及び2g/リットルの酵母エキスを含むAmerican Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)に記載の培地番号1304の培地で75℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は3.3g/リットルであった。
Sulfolobus solfataricus DSM5833株を、2g/リットルの可溶性デンプン及び2g/リットルの酵母エキスを含むAmerican Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)に記載の培地番号1304の培地で75℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は1.2g/リットルであった。
Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909株を、2g/リットルの可溶性デンプン及び2g/リットルの酵母エキスを含むAmerican Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)に記載の培地番号1304の培地で75℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は2.7g/リットルであった。
実施例II−2で得られた精製酵素の酵素学的諸性質を測定した。
ゲル濃度6%のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量測定を行った。マーカータンパク質として分子量200,000;116,300;97,400;66,300;55,400;36,500;31,000;21,500;14,400のものを用いた。
その結果、該アミラーゼの分子量は61,000であった。
アガロースゲル等電点電気泳動の結果、等電点は4.8であった。
得られた精製酵素の各温度、各pHにおける安定性を、それぞれ図12、図13に示す。酵素活性の測定は、実施例II−1においてマルトトリオシルトレハロースを用いた測定法に準じて行ない、pH3〜5の間はグリシン塩酸系緩衝液を、pH4〜6の間は酢酸ナトリウム系緩衝液を、pH5〜8の間は燐酸ナトリウム系緩衝液を、pH8〜9の間はトリス塩酸系緩衝液を、pH9〜10の間は炭酸水素ナトリウム系緩衝液を、pH11〜
13.5の間はKCl−NaOH系緩衝液をそれぞれ用いた。
本酵素は85℃で6時間の処理で安定であり、またpH3.5〜10.0の室温6時間の処理で安定であった。
得られた精製酵素の各温度、各pHにおける反応性を、それぞれ図14、図15に示す。酵素活性の測定は、実施例II−1においてマルトトリオシルトレハロースを用いた測定法に準じて行ない、pH2〜4の間はクエン酸ナトリウム系緩衝液(□)を、pH4〜5.5の間は酢酸ナトリウム系緩衝液(●)を、pH5〜7.5の間は燐酸ナトリウム系緩衝液(△)を、pH8〜9の間はトリス塩酸系緩衝液(◇)をそれぞれ用いた。
本酵素は70〜85℃付近に反応最適温度、pH4.5〜5.5付近に反応最適pHを有する。
実施例II−1のマルトトリオシルトレハロース分解活性測定法において以下の第15表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を実施例II−1と同様に行い、活性化又は阻害の有無を調べた。その結果、銅イオン、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)によって阻害を受けることがわかった。但し、SDSによる阻害については透析、限外瀘過などの方法でSDSを除去することにより、酵素活性が回復した。糖関連酵素ではカルシウムイオンによって活性化される場合が多く認められるが、本酵素ではカルシウムイオンによっては活性化されない。
本精製酵素25.0Units/ml(マルトトリオシルトレハロースを基質として作用させたときの酵素活性)を以下の第16表に示す10mMの基質(アミロペクチン、可溶性デンプンについては2.8%)に作用させ、分解性及び分解生成物の分析を行った。各種マルトオリゴ糖、アミロース DP−17、アミロペクチン、可溶性デンプン、各種イソマルトオリゴ糖、及びパノースについては単糖+2糖の生成活性を指標として、また、各種トレハロースオリゴ糖、アミロース DP−17α−1,α−1転移体(アミロース DP−17の還元末端側の、1つ目と2つ目のグルコース残基間の結合がα−1,α−1であるオリゴ糖)についてはα,α−トレハロースの生成活性を指標として、マルトース及びα,α−トレハロースについてはグルコースの生成活性を指標として実施例II−1に示したTSK-gel Amide-80 HPLC による分析法で分析を行った。
なお、第16表中での酵素活性は、各々単糖及び2糖を1時間に1μmol遊離する酵素活性を1Unitとして示した。
本精製酵素200Units/ml(マルトトリオシルトレハロースを基質として作用させたときの酵素活性)による、可溶性デンプンに作用させた時のヨウ素発色の消失、及び単糖及び2糖の生成量から求めたデンプン加水分解率の経時変化を、実施例II−1に示したデンプン分解活性測定法、及びAMINEX HPX-42A HPLC による分析法により分析を行った。
その結果、図20に示した様に、本精製酵素に関してはヨウ素反応呈色度が50%消失した時点での加水分解率は3.7%と低く、従ってエンド型アミラーゼの性質を示すことが確認された。
ウリジンジホスホグルコース[グルコース-6 - 3H ]、及びマルトテトラオースにグリコーゲンシンターゼ(ウサギ骨格筋由来、Sigma 社製G-2259)を作用させ、非還元末端のグルコース残基を 3Hで放射能ラベル化したマルトペンタオースを合成させ、分取精製した。次にこの放射能ラベル化した10mMのマルトペンタオースを基質とし、Sulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼ10 Units/ml(マルトトリオースを基質として作用させたときの酵素活性)を添加し、60℃、3hr作用させ、非還元末端のグルコース残基を 3Hで放射能ラベル化したマルトトリオシルトレハロースを合成させ、分取精製した。(なお、この生成物にグルコアミラーゼ(Rhizopus由来、生化学工業製)を作用させ、グルコースとα,α−トレハロースに完全に分解させた。これらを薄層クロマトグラフィーにて分取し、それぞれ液体シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、α,α−トレハロース画分に放射活性は見られず、グルコース画分に放射活性が認められ、よって、非還元末端のグルコース残基が放射能ラベル化されていることを確認した。)
以上のように調製した非還元末端のグルコース残基を 3Hで放射能ラベル化したマルトペンタオース、及び非還元末端のグルコース残基を 3Hで放射能ラベル化したマルトトリオシルトレハロースを基質として、これらに実施例II−2で得られた精製酵素をそれぞれ50 Units/ml 及び5 Units/ml 作用させ、反応前、及び60℃、0.5、1及び3時間後にサンプリングを行った。この反応物を薄層クロマトグラフィー(Kieselgel 60 メルク社製、溶媒:ブタノール−エタノール−水=5:5:3)で展開した。得られた各糖に相当するところを分取し、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。その結果をそれぞれ図21、及び図22に示す。
ブタ膵臓由来α−アミラーゼは、マルトオリゴ糖を還元末端から2糖または3糖単位で加水分解することが知られている(澱粉・関連糖質酵素実験法 P135 、中村道徳、貝沼圭二、学会出版センター)。そこで、本発明の新規アミラーゼの比較例としてブタ膵臓由来α−アミラーゼ(Sigma 社製、A-6255)1Units/ml(デンプンを基質として、pH6.9、20℃において3分間に1mgのマルトースに相当する還元糖を生成する酵素量を1Unitとする)を以下の第17表に示す10mMの基質にpH6.9 、20℃にて作用させ、分解性及び分解生成物の分析を行った。酵素活性は2糖+3糖の生成活性を指標として、実施例II−1に示したTSK-gel Amide-80 HPLC 分析法で分析を行った。
なお、第17表中での酵素活性は、各オリゴ糖を1時間に1μmol 遊離する酵素活性を1Unitとして示した。
実施例II−2で得られた本精製酵素150Units/ml、及びSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼ10Units/mlを用い、基質を、可溶性デンプン(ナカライテスク社製、特級品);デンプン分解物として、Klebsiella pneumoniae 由来のプルラナーゼ(和光純薬製)25Units/mlで40℃、1hrの条件の下で予めα−1,6結合を分解しておいた可溶性デンプン;また別のデンプン分解物として、Bacillus amylolichefaciens由来のα- アミラーゼ(ベーリンガーマンハイム社製)12.5Units/mlで30℃、2.5hrの条件の下で予め部分分解しておいた可溶性デンプン;パインデックス#1;パインデックス#3(ともに松谷化学製);G3〜G7マルトオリゴ糖各単独;及びアミロースDP−17(いずれも林原バイオケミカル製)として、それぞれ最終濃度10%、60℃、pH5.5の条件下で約100hr反応させ、用いた酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。
実施例II−2で得られた本精製酵素、及びSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を、Klebsiella pneumoniae 由来のプルラナーゼ(和光純薬製)25Units/mlで40℃、1hrの条件下で前処理した可溶性デンプンとし、該基質(最終濃度10%)に第19表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加して60℃、pH5.5にて約100hr反応させて、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−1に示したTSK-gel Amide-80 HPLC 分析法により分析を行い、生成したα,α−トレハロースの収率を調べた。
本発明の新規アミラーゼの比較として、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis及びAspergillus oryzae由来のアミラーゼ(それぞれ、生化学工業製100200、Sigma 製 A-3403 、及び A-0273 :いずれも60℃にて活性を有する)を用い、Sulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼとの併用において、基質をKlebsiella pneumoniae 由来のプルラナーゼ(和光純薬製)25Units/mlで40℃、1hrの条件下で前処理した可溶性デンプン(最終濃度10%)として、該基質に、第20表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、60℃、pH5.5にて約100hr反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−1に示したTSK-gel Amide-80 HPLC分析法により分析を行い、生成したα,α−トレハロースの収率を調べた。
実施例II−2で得られた本精製酵素、及びSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を、アミロース DP−17(林原バイオケミカル製)(最終濃度10%)として、該基質に、第21表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、60℃、pH5.5にて約100hr反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。反応液は未反応の基質をグルコアミラーゼにて分解後、実施例II−1に示したTSK-gel Amide-80 HPLC 分析法により分析を行い、生成したα,α−トレハロースの収率を調べた。
実施例II−2で得られた本精製酵素、及びSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を可溶性デンプンとし、該基質の最終濃度5%、10%、20%、及び30%のものに、第22表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、60℃、pH5.5にて約100hr反応させ、これらの酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。この際、反応途中、0hrから96hrの間、0hrも含めて12hr毎に合計9回、5Units/mlとなるようプルラナーゼ(Klebsiella pneumoniae 由来品、和光純薬製)を添加し、40℃、1hrの条件下で処理した。
実施例II−2で得られた本精製酵素、及びSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を、可溶性デンプン(最終濃度10%)として、該基質に第23表に示した濃度の酵素をそれぞれ添加し、60℃、pH5.5にて約120hr反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。この際、反応途中24hr後に1回(a)、48hr後に1回(b)、72hr後に1回(c)、96hr後に1回(d)、24hrから96hrの間、24hr毎に合計4回(e)、0hrから96hrの間、0hrも含めて12hr毎に合計9回(f)、及び0hrから12hrの反応初期段階に、0hrも含めて3hr毎に合計5回、その後は24hrから96hrの間、12hr毎に合計7回(g)の条件の下で表中に示した濃度となるようにプルラナーゼ(Klebsiella pneumoniae 由来品)を添加し、いずれの場合にも添加後40℃、1hrの条件の下でプルラナーゼ処理をした。
実施例II−2で得られた本精製酵素、及びSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを、それぞれ320Units /g −基質、及び20Units /g −基質となるように添加し、基質をアミロースDP−17として、第24及び25表に示した基質濃度及び反応温度において、それぞれ約100hr反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。
40%)とすると不溶化し、収率が著しく低下するが、高温にすると基質が溶解し、収率も高く維持できた。収率は75.1%に達した。
実施例II−2で得られた本精製酵素、Sulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼ、及び市販耐熱性プルラナーゼ(デブランチングエンザイム アマノ (Bacillus sp.由来品、天野製薬社製);なお、疎水クロマトグラフィー TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650Sにより、混在するグルコアミラーゼ活性及びα−アミラーゼ活性を除去した)を、それぞれ1280Units /g −基質、80Units /g −基質、及び32Units /mlとなるように添加し、基質を可溶性デンプンとして、第26及び27表に示した基質濃度及び反応温度において、それぞれ約100hr反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。
40〜60℃に上げると温度依存的に反応速度は増加することがわかった。また、低温(40〜50℃)では基質濃度を高濃度(20〜30%)とすると不溶化し、収率が著しく低下するが、高温(60℃)にすると基質が溶解し、収率も高く維持できた。収率は、74.1%に達した。
実施例II−2で得られた本精製酵素、及びSulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを用い、基質を可溶性デンプン(最終濃度10%)として、該基質にそれぞれ1280Units /g −基質、及び80Units /g −基質となるように添加し、60℃、pH5.0にて約100hr反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。この際、0hrから12hrの反応初期段階に、0hrも含めて3hr毎に合計5回、その後は24hrから96hrの間、24hr毎に合計3回の条件の下でイソアミラーゼ(Pseudomanas amyloderamosa 由来品、生化学工業)を第28表に示した濃度となるように添加し、いずれの場合にも添加後40℃、1hrの条件の下でイソアミラーゼ処理をした。
実施例II−2で得られた本精製酵素、Sulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼ、及びSulfolobus solfataricus KM1株の枝切り酵素(参考例II−3の方法に準じて菌体抽出液より分離精製したもの)を、それぞれ1280Units /g −基質、80Units /g −基質、及び下表中に示す濃度となるように添加し、基質を可溶性デンプン(最終濃度10%)として、60℃、pH5.5として、約100hr反応させ、これら酵素の相乗作用を利用したα,α−トレハロースの製造を試みた。
Sulfolobus solfataricus KM1株由来の精製トランスフェラーゼを、20Units /g −基質となるように添加し、基質をアミロースDP−17として、第30及び31表に示した基質濃度及び反応温度において、それぞれ約100hr反応させ、還元末端側のグルコース残基がα−1,α−1結合した対応のトレハロースオリゴ糖を生成させた。
アミロース DP−17を5、10、20、30、40%(w/vol) 溶液となるように加熱溶解した後、35、40、50、60、70、80℃の高温槽に入れ、経時的にサンプリングし、生じた不溶物を濾過して得られた上清溶液中のアミロース DP−17濃度を求め、平衡となった濃度を飽和点として溶解度を求めた。
Sulfolobus solfataricus KM1株を、2g/リットルの可溶姓デンプン及び2g/リットルの酵母エキスを含むAmerican Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of Bacteria and Phages 18版(1992)に記載の培地番号1304の培地で75℃、3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は3.3g/リットルであった。
以上の精製操作により部分精製された枝切り酵素の比活性は495Units /mgであった。
参考例II−3で得られた部分精製枝切り酵素の酵素学的諸性質を測定した。
以下の第33表に示す基質及び各活性測定法を用いて、各基質に対する反応性及び作用を調べた。
得られた部分精製酵素の各pH及び各温度における反応性を、それぞれ第35及び36表に示す。測定は、pH3〜5の間はグリシン塩酸系緩衝液を、pH4〜5.5の間は酢酸ナトリウム系緩衝液を、pH5〜7.5の間は燐酸ナトリウム系緩衝液をそれぞれ用いた。
クロマトフォーカーシングにより分離された枝切り酵素画分のpH測定の結果、等電点は4.4であった。
以下の第37表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を参考例II−3と同様に行い、活性化又は阻害の有無を調べた。その結果、銅イオンにより阻害を受けることがわかった。糖関連酵素ではカルシウムイオンによって活性化される場合が多く認められるが、本酵素はカルシウムイオンによっては活性化されない。
実施例I−2で得られた精製酵素の部分アミノ酸配列の決定は岩松(生化学 63、139(1991))らの方法により行った。すなわち、精製された新規トランスフェラーゼを、泳動用緩衝液(10%グリセロール、2.5%SDS、2%2‐メルカプトエタノール、62mMトリス塩酸緩衝液(pH6.8))に懸濁し、SDSポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、当該酵素をゲルよりポリビニリデンジフロリド(PVDF)膜(ProBlot、(アプライド、バイオシステムズ社))に、エレクトロブロッティング(ザルトブロットIIs型(ザルトリウス社))を160mAで1時間行った。
Achromobacter protease消化ペプチドフラグメント
AP−1:Val Ile Arg Glu Ala Lys (配列番号9)
AP−2:Ile Ser Ile Arg Gln Lys (配列番号10)
AP−3:Ile Ile Tyr Val Glu (配列番号11)
AP−4:Met Leu Tyr Val Lys (配列番号12)
AP−5:Ile Leu Ser Ile Asn Glu Lys (配列番号13)
AP−6:Val Val Ile Leu Thr Glu Lys (配列番号14)
AP−7:Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Val Lys (配列番号15)
AP−8:Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys (配列番号16)
AP−9:Val Ala Val Leu Phe Ser Pro Ile Val (配列番号17)
AP−10:Ile Asn Ile Asp Glu Leu Ile Ile Gln Ser Lys (配列番号18)
AP−11:Glu Leu Gly Val Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile (配列番号19)
Asp-N 消化ペプチドフラグメント
DN−1:Asp Glu Val Phe Arg Glu Ser (配列番号20)
DN−2:Asp Tyr Phe Lys (配列番号21)
DN−3:Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys (配列番号22)
DN−4:Asp Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys (配列番号23)
DN−5:Asp Phe Glu Asn Phe Glu Lys (配列番号24)
DN−6:Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile (配列番号25)
DN−7:Asp Ile Ile Glu Asn (配列番号26)
DN−8:Asp Asn Ile Glu Tyr Arg Gly (配列番号27)
Sulfolobus solfataricus KM1株の菌体は実施例I−2の方法に従って得た。
実施例I−9により決定されたSulfolobus solfataricus KM1株由来新規トランスフェラーゼの部分アミノ酸配列の情報をもとにオリゴヌクレオチドDNAプライマーをDNA合成装置(アプライドバイオシステムズ社製モデル381)によって作成した。その配列は下記の通りであった。
DN−1
アミノ酸配列 N末端 AspGluValPheArgGluSe C末端
DNAプライマー 5’TTCACGAAAAACCTCATC 3’ (配列番号28)
塩基配列 C T TG T T
DN−8
アミノ酸配列 N末端 AspAsnIleGluTyrArgGly C末端
DNAプライマー 5’GATAACATAGAATACAGAGG 3’(配列番号29)
塩基配列 T T G T G
このDNAプライマーを各々100pmolおよび実施例I−10で調製されたSulfolobus solfataricus KM1株の染色体DNA 100ngを用いてPCR法を実施した。PCR装置はパーキンエルマー社製、GeneAmp PCRシステムモデル9600を用い、1サイクルを94℃で30秒、50℃で1分および72℃で2分で行い、サイクル数30回および総液量100μlで実施した。
実施例I−10で調製されたSulfolobus solfataricus KM1株の染色体DNA 100μgを制限酵素Sau3Alで部分消化した。反応液をスクロース密度勾配を用いて超遠心で5〜10kbのDNA断片を分離精製した。一方、プラスミドベクターpUC118をBamHIで消化し、アルカリホスファターゼにより末端を脱リン酸化したものと、上記5〜10kbの長さを持つSulfolobus solfataricus KM1株の染色体DNA断片をT4DNAリガーゼにより連結(ライゲーション)した。この挿入断片を含むpUC118プラスミドベクターを含んだ混合液を用いて、E. coli JM109細胞を形質転換した。これを50μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレート培地に蒔きコロニーを形成させ、DNAライブラリーを作成した。
なお、以上の実施例で使用された制限酵素としては、全て市販品(宝酒造株式会社より購入)を利用した。
実施例I−12で得られたプラスミドpKT11、pKT21中の挿入断片の共通部分のDNA塩基配列を決定した。
実施例I−12で得られたpKT21についてSphIおよびXbaIで切断し、同酵素で切断したpUC119(宝酒造社製)に連結したものをpKT22とした。図27にその手段を示した。pKT22に挿入された新規トランスフェラーゼ遺伝子を含む断片中、マルチクローニングサイトを除く塩基配列は、配列番号1の塩基番号1〜2578の配列であった。
実施例I−4で得られた新規トランスフェラーゼの部分アミノ酸配列の決定は実施例I−9に記載される方法に従って行った。以下に決定された部分アミノ酸配列を示す。
Achromobacter protease 消化ペプチドフラグメント
AP−6 :Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys (配列番号30)
AP−8 :Asp His Val Phe Gln Glu Ser His Ser (配列番号31)
AP−10:Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr (配列番号32)
AP−12:Ile Ile Ile Val Glu Lys (配列番号33)
AP−13:Leu Gln Gln Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys (配列番号34)
AP−14:Asn Met Leu Glu Ser (配列番号35)
AP−16:Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val Phe Asn Gln Lys (配列番号36)
AP−18:Gln Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys (配列番号37)
AP−19:Lys Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys (配列番号38)
AP−20:Ile Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu (配列番号39)
AP−23:Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr (配列番号40)
AP−28:Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro (配列番号41)
Asp-N 消化ペプチドフラグメント
DN−1:Asp His Ser Arg Ile (配列番号42)
DN−5:Asp Leu Arg Tyr Tyr Lys (配列番号43)
DN−6:Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys (配列番号44)
Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909株の染色体DNAは実施例I−4の方法に従って得た菌体より実施例I−10の方法に従って得た。上記染色体DNAをSau3AIで部分消化した後、EMBL3 BamHI切断アーム(STRATAGENE社製)に、T4DNAリガーゼにより連結(ライゲーション)した。パッケージングはSTRATAGENE社製 GigapackII Goldを用いて行った。上記ライブラリーを大腸菌LE392に37℃15分間感染させた後、NZY寒天プレート培地に播種し、37℃で約8から12時間程度培養して、プラークを形成させた。約2時間、4℃で保存した後、ナイロンメンブレン(アマシャム社製,Hybond N+)へDNAを吸着させた。2xSSPEで軽く洗浄した後、80℃で2時間ベーキングを行った。プローブは実施例I−14で得られたpKT22のEcoRI−XbaI断片(配列番号1の824番より2578番へ対応する)を用い、アマシャム社製 メガプライムDNA標識システムを用いて32Pで標識した。
3.8kbpのXbaI断片についてpUC118の上記サイトへ挿入した。このプラスミドを「p09T1」と称する。このプラスミドの挿入断片の制限酵素地図を図29に示す。またその作成方法を図30に示す。上記p09T1について新規トランスフェラーゼをコードしている領域を中心に実施例I−13の方法に従って塩基配列の決定を行った。決定された塩基配列およびそこさら推定されるアミノ酸配列は配列番号3および4に示される通りである。このアミノ酸配列中に実施例I−15で得られた部分アミノ酸配列に相当する配列が全て認められた。このアミノ酸配列は長さが680個で、推定分子量80.1kDaのタンパク質をコードしているものと考えられた。この分子量はSulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株由来新規トランスフェラーゼの精製酵素をSDS−PAGEにかけることによって得られた分子量の値にほぼ一致した。またプラスミドp09T1を含む形質転換体について実施例I−14の方法に従って新規トランスフェラーゼ活性を確認した。
Sulfolobus solfataricus DSM 5833株、Sulfolobus shibatae DSM 5389株、E.coli JM109株の染色体DNAを実施例I−10に準じた方法で得て、これを制限酵素PstIおよびEcoRIで消化した。
配列番号2のKM1株由来の新規トランスフェラーゼのアミノ酸配列と配列番号4のATCC33909株由来の新規トランスフェラのアミノ酸配列とを、また配列番号1のKM1株由来の新規トランスフェラーゼの塩基配列と配列番号3のATCC33909株由来の新規トランスフェラーゼの塩基配列とを配列解析ソフト,ジェネティックス(ソフトウエアー開発)を用いてギャップを考慮した解析を行った。アミノ酸配列についての結果を図31に、塩基配列についての結果を図32に示した。それぞれの図中上段にATCC33909株の配列を、下段にKM1株の配列を示し、中段の(*)は両者で一致する配列を、また(.)は両者で性質の似たアミノ酸配列であることを示す。相同性はアミノ酸配列レベルで49%、塩基配列レベルで57%であった。
可溶性デンプン(ナカライテスク社製、特級品)のα−アミラーゼ分解物であってヨウ素デンプン反応を示さずオリゴ糖にまで分解されたもの(α−アミラーゼは、Sigma 社製のA-0273 アスペルギルス・オリゼ由来のものを用いた)を基質とした。
カラム: BIORAD AMINEX HPX-42A (7.8 ×300mm )
溶媒 : 水
流速 : 0.6ml/min
温度 : 85℃
検出器: 示差屈折計
図33(A) にHPLCによる分析の結果を(B) に組換え新規トランスフェラーゼを添加しない場合のHPLC分析の結果を示した。その結果、反応生成物のオリゴ糖類は対照のアミラーゼのみによる生成物よりも各々保持時間が短かった。また、基質マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)およびマルトペンタオース(G5)(いずれも林原バイオケミカル社製)からの主生成物である3糖、4糖および5糖をTSK-gel amide-80 HPLC columnにて分取し、 1H−NMR、13C−NMRにより解析を行った。その結果、いずれも還元末端のグルコース残基1個がα‐1,α‐1で結合した構造を示し、それぞれグルコシルトレハロース(α‐D‐マルトシル α‐D‐グルコピラノシド)、マルトシルトレハロース(α‐D‐マルトトリオシル α‐D‐グルコピラノシド)およびマルトトリオシルトレハロース(α‐D‐マルトテトラオシル α‐D‐グルコピラノシド)であることが確認された。
基質を100mMのマルトトリオース(G3)〜マルトヘプタオース(G7)(いずれも林原バイオケミカル社製)とし、実施例I−14で得られた粗酵素液を凍結乾燥した後、50mM酢酸ナトリウム溶液(pH5.5)に懸濁し、濃縮酵素とした。この濃縮酵素12.7Unit/ml (マルトトリオースを基質として作用させたときの酵素活性)をそれぞれの基質に作用させ、対応するα‐1,α‐1転移体を生成させた。各生成物の分析法は実施例I−1の方法に従って行い、その収率および酵素活性を調べた。結果は第38表に示される通りであった。なお、第38表中での酵素活性は、マルトオリゴ糖を1時間に1μmolの対応するα‐1,α‐1転移体に変換する酵素活性を1Unitとして示した。
実施例II−2で得られた精製酵素の部分アミノ酸配列の決定は岩松ら(生化学 63、139(1991))の方法により、またN末端アミノ酸配列の決定はMatsudaira T(J.Biol.Chem.262,10035-10038(1987) )の方法により行った。
N末端アミノ酸配列
Thr Phe Ala Tyr Lys Ile Asp Gly Asn Glu (配列番号45)
部分アミノ配列
P−6 : Leu Gly Pro Tyr Phe Ser Gln (配列番号46)
P−7 : Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly (配列番号47)
P−10: Tyr Asn Arg Ile Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu (配列番号48)
Asn Asp Pro Arg Val Val Asn Pro
Sulfolobus solfataricus KM1株を、2g/リットルの可溶性デンプンおよび2g/リットルの酵母エキスを含むAmerican Type Culture Collection(ATCC)発行 Catalogue of
Bacteria and Phages 18版,1992に記載の培地番号1304の培地で、75℃で3日間培養した。遠心分離により集菌し、−80℃にて保存した。菌体の収率は3.3g/リットルであった。
実施例II−16で調製されたSulfolobus solfataricus KM1株の染色体DNA 100μgを制限酵素Sau3AIで部分消化した。反応液をショ糖密度勾配遠心分離法を用いて分画し、5〜10kbのDNA断片を分離精製した。一方プラスミドベクターpUC118(宝酒造社製)をBamHIで消化し、アルカリホスファターゼにより末端を脱リン酸化し精製したものと、上記5〜10kbの染色体DNA断片をT4DNAリガーゼにより連結(ライゲーション)した。この挿入断片を含んだpUC118プラスミドベクターを含んだ混合液を用いて、大腸菌JM109細胞(宝酒造社製)を形質転換した。これを50μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレート培地に播種しコロニーを形成させて、DNAライブラリーを作成した。
このプラスミドの挿入断片の制限酵素地図は図34に示される通りであった。
実施例II−17で得られたプラスミドpKA1中の挿入断片の(後記するpKA2に対応する領域の)DNA塩基配列を決定した。
実施例II−17で得られたpKA1について制限酵素PstIで部分消化したものをpKA2とした。図35はその制限酵素地図を示したものである。pKA2を含む形質転換体の活性は次のようにして調べた。まず上記形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で37℃で一晩培養した。遠心分離により集菌した菌体を1gあたり4mlのpH5.5(50mM酢酸ナトリウム緩衝液)へ懸濁し、超音波破砕処理および遠心分離を行ない、その上清を70℃で1時間熱処理し、宿主のアミラーゼを失活させた。遠心分離により沈澱物を除去し、限外濾過膜(分子量カット13,000)で濃縮したものを粗酵素液として、以下の実験に用いた。
前記粗酵素液35.2Units/ml(ここで1Unit とは、マルトトリオシルトレハロースを基質として作用させたときの酵素活性で、反応条件は実施例II−1に従い、1時間にマルトトリオシルトレハロースからα,α‐トレハロースを1μmol生成する活性として定義した)を、以下の第39表に示す10mMの基質(アミロペクチン、可溶性デンプンについては3.0%)に作用させ、分解性及び分解生成物の分析を行った。各種マルトオリゴ糖、アミロースDP−17、アミロペクチン、可溶性デンプン、各種イソマルトオリゴ糖、及びパノースについては単糖+2糖の生成活性を指標として、また、各種トレハロースオリゴ糖、アミロースDP−17α−1,α−1転移体(アミロースDP−17の還元末端側の、1つ目と2つ目のグルコース残基間の結合がα−1,α−1であるオリゴ糖)についてはα,α−トレハロースの生成活性を指標として、マルトース及びα,α−トレハロースについてはグルコースの生成活性を指標として実施例II−1に示したTSK-gel Amide-80 HPLC による分析法で分析を行った。
なお、表中での酵素活性は、各々単糖及び2糖を1時間に1μmol遊離する酵素活性を1Unitとして示した。
カラム:AMINEX HPX-42A (7.8 X 300mm )
溶媒 :水
流速 :0.6ml/min
温度 :85℃
検出器:示差屈折計
以上の結果より、本酵素に関しては還元末端側のグルコース残基がα−1,α−1結合したマルトトリオシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖に、極めてよく作用し、α,α−トレハロースと重合度が2つ減少した対応するマルトオリゴ糖を生成することが確認された。またマルトース(G2)〜マルトペンタオース(G5)、アミロース、可溶性デンプンからは、主としてグルコースまたはマルトースを遊離することが確認された。しかしながらα,α−トレハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、およびパノースに対してはいずれも反応しなかった。
前記粗酵素液150Unit/ml (活性単位は上記(1)と同様)を可溶性デンプンに作用させた。実施例II−1に示したデンプン分解活性測定法と同様の条件でヨウ素発色の消失を測定し、また上記(1)に示した基質特異性を決定する際の条件のHPLC分析法の条件に従って単糖、および2糖の生成量を測定した。これらからデンプン加水分解率を求めた。
その経時変化は図37に示される通りであった。図から、ヨウ素反応呈色度が50%消失した時点でのデンプンの加水分解率は4.5%と低く、従って本粗酵素はエンド型アミラーゼの性質を示すことが確認された。
ウリジンジホスホグルコース[グルコース-6-3H]、およびマルトテトラオースにグリコーゲンシンターゼ(ウサギ骨格筋由来、Sigma 社製G-2259)を作用させ、非還元末端のグルコース残基を3Hで放射能ラベルしたマルトペンタオースを合成し、これを分取精製した。
実施例II−4で得た精製酵素の部分アミノ酸配列の決定は実施例II−15に記載される方法に従って行った。部分アミノ酸配列は下記の通りであった。
AP−9 Leu Asp Tyr Leu Lys (配列番号49)
AP−10 Lys Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Leu Gly Val His
(配列番号50)
AP−11 Lys Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys (配列番号51)
AP−12 His Ile Leu Gln Glu Ile Ala Glu Lys (配列番号52)
AP−16 Lys Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn Ser Val (配列番号53)
AP−17 Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn (配列番号54)
AP−18 Asp Tyr Try Tyr Gln Asp Phe Gly Arg Ile Glu Asp Ile Glu
(配列番号55)
AP−21 Lys Ile Asp Ala Gln Trp Val (配列番号56)
実施例II−20により決定された部分アミノ酸配列の情報を基にオリゴヌクレオチドDNAプライマーをDNA合成装置(アプライドバイオシステムズ社モデル381)によって作成した。その配列は下記の通りであった。
AP−10
アミノ酸配列 N末端 Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro C末端
DNAプライマー5’ AGCTAGTAGATATCAACC 3’
(配列番号57)
塩基配列 A G C C G
AP−11
(相補鎖)
アミノ酸配列 N末端 Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys C末端
DNAプライマー5’TTTTCCATCATAAACAAAAACATC 3’
(配列番号58)
塩基配列 C A G T G T
C
Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909株の染色体DNAは実施例II−4の方法に従って得た菌体より、実施例II−16の方法に従って得た。上記染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した後,EMBL3 BamHI切断アーム(STRATAGENE社製)にT4DNAリガーゼにより連結(ライゲーション)した。パッケージングはSTRATAGENE社製,GigapackII Goldを用いて行った。上記ライブラリーを大腸菌LE392に37℃15分感染させた後、NZY寒天プレート培地に播種し、37℃で約8から12時間程度培養して、プラークを形成させた。約2時間、4℃で保存した後、ナイロンメンブレン(アマシャム社製、Hybond N+)へDNAを吸着させた。2xSSPEで軽く洗浄した後80℃2時間ベーキングを行った。プローブは実施例II−21のPCR断片を用い、アマシャム社製メガプライムDNA標識システムを用いて32Pで標識した。
このアミノ酸配列中に実施例II−20で得られた部分アミノ酸配列に相当する配列が全て認められた。このアミノ酸配列は長さが556個で、推定分子量64.4kDaのタンパク質をコードしているものと考えられた。この分子量はSulfolobus acidocaldarius ATCC33909株由来新規アミラーゼの精製酵素をSDS−PAGEにかけることによって得られた分子量の値にほぼ一致した。またプラスミドp09A1を含む形質転換体について実施例II−19の方法に従って新規アミラーゼ活性を確認した。
配列番号6のKM1株由来の新規アミラーゼのアミノ酸配列と、配列番号8のATCC33909株由来の 新規アミラーゼのアミノ酸配列とを、また配列番号5のKM1株由来の新規アミラーゼの塩基配列と、配列番号7のATCC33909株由来の新規アミラーゼの塩基配列とを、配列解析ソフト、ジェネティックス(ソフトウエアー開発)を用いてギャップを考慮してそれぞれ解析した。アミノ酸配列についての結果を図40に、塩基配列についての結果を図41に示す。それぞれの図中下段にKM1株の配列を、上段にATCC33909株の配列結果を示し、中段の(*)は両者で一致する配列を、また中段の(.)は両者で性質の似たアミノ酸を示す。相同性はアミノ酸レベルで約59%、塩基配列レベルで64%であった。
Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909株由来新規アミラーゼ遺伝子の他の生物種の染色体DNAとのハイブリダイゼーション試験
Sulfolobus solfataricus DSM5833株、Sulfolobus shibatae DSM 5389株、Acidianus brierleyi DSM 1651株、E.coli JM109株の染色体DNAを実施例II−16の方法に準じて制限酵素Hind III で消化した。
実施例II−19で得られた粗精製組換え新規アミラーゼおよび実施例I−20で得られた濃縮組換え新規トランスフェラーゼ並びに10%可溶性デンプン(ナカライテスク社製、特級品)を用い、プルラナーゼを補助的に添加して、α,α−トレハロースの製造を試みた。反応は以下のように行った。
TSK-gel Amide-80 HPLC による分析結果は図42に示される通りであった。
本発明の新規な精製法に基づく酵素製造法により得られるマルトオリゴ糖等の糖に作用してグルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖等を生成する能力を有する新規トランスフェラーゼを用いることにより、マルトオリゴ糖等の原料を用いて効率的で、かつ高収率にグルコシルトレハロース及びマルトオリゴシルトレハロースなどのトレハロースオリゴ糖等を製造する新規な方法を提供することができる。
1. 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が74000〜76000であり、且つ、
下記の理化学的性質を有する上記酵素:
(1) 至適pH:4.5〜6.0
(2) 至適温度:60〜80℃
(3) 安定pH:4.5〜10.0
(4) 温度安定性:80℃で6時間の処理により90%以上残存。
2. すべてのグルコース残基がα−1,4結合であるマルトオリゴ糖を基質とし、その還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が74000〜76000であり、且つ、
下記の理化学的性質を有する上記酵素:
(1) 至適pH:4.5〜6.0
(2) 至適温度:60〜80℃
(3) 安定pH:4.5〜10.0
(4) 温度安定性:80℃で6時間の処理により90%以上残存。
3. 等電点電気泳動法による等電点が5.3〜6.3である、態様1または2に記載の酵素。
4. 5mM CuSO4で100%阻害される、態様1〜3のいずれかに記載の酵素。
5. Sulfolobales目の古細菌から得られる、態様1〜4のいずれかに記載の酵素。
6. Sulfolobus属に属する細菌から得られる、態様5に記載の酵素。
7. Acidianus属に属する細菌から得られる、態様5に記載の酵素。
8. Sulfolobus solfataricusに属する細菌から得られる、態様6に記載の酵素。
9. Sulfolobus solfataricus KM1株(FERM BP−4626)から得られる、態様8に記載の酵素。
10. Sulfolobus solfataricus DSM 5833株から得られる、態様8に記載の酵素。
11. Sulfolobus acidocaldariusに属する細菌から得られる、態様6に記載の酵素。
12. Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株から得られる、態様11に記載の酵素。
13. Acidianus brierleyiに属する細菌から得られる、態様7に記載の酵素。
14. Acidianus brierleyi DSM 1651株から得られる、態様13に記載の酵素。
15. 態様1〜4のいずれかに記載のトランスフェラーゼ産生能を有するSulfolobus属に属する細菌またはAcidianus属に属する細菌を培地に培養し、培養物より、マルトオリゴ糖を基質としてトレハロースオリゴ糖を生成する活性を指標とする活性測定法に基づいて、該トランスフェラーゼを単離精製することを特徴とする態様1〜4のいずれかに記載のトランスフェラーゼの製造法。
16. Sulfolobus solfataricusに属する細菌を培養する、態様15に記載の製造法。
17. Sulfolobus solfataricus KM1株(FERM BP−4626)を培養する、態様16に記載の製造法。
18. Sulfolobus solfataricus DSM 5833株を培養する、態様16に記載の製造法。
19. Sulfolobus acidocaldariusに属する細菌を培養する、態様15に記載の製造法。
20. Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株を培養する、態様19に記載の製造法。
21. Acidianus brierleyiに属する細菌を培養する、態様15に記載の製造法。
22. Acidianus brierleyi DSM 1651株を培養する、態様21に記載の製造法。
23. 態様1〜4のいずれかに記載の酵素を用い、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質として作用させ、少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα−1,α−1結合で、該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα−1,4結合である糖を製造することを特徴とする末端の2糖がα−1,α−1結合である糖の製造法。
24. マルトオリゴ糖各単独またはそれらの混合物を基質として用いる、態様23に記載の製造法。
25. グルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を製造する、態様24に記載の製造法。
26. 少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成される3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖及び/又は2糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼであって、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が61,000〜64,000であり、且つ、
下記の理化学的性質を有する上記酵素:
(1) 至適pH:4.5〜5.5
(2) 至適温度:60〜85℃
(3) 安定pH:4.0〜10.0
(4) 温度安定性:80℃で6時間の処理により100%残存。
27. 少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα−1,α−1結合で、該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、2つ目と3つ目のグルコース間のα−1,4結合を加水分解し、α,α−トレハロースを遊離する主要な活性を有する態様26に記載の新規アミラーゼ。
28. 基質の分子鎖中のα−1,4結合をエンド型で加水分解する活性を合わせ持つ、態様26或いは27に記載の新規アミラーゼ。
29. グルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を基質とし、還元末端側の2つ目と3つ目のグルコース間のα−1,4結合を加水分解し、α,α−トレハロースを遊離する活性を有する、態様26、27或いは28に記載の新規アミラーゼ。
30. 等電点電気泳動法による等電点が4.3〜5.4である、態様26〜29のいずれかに記載の酵素。
31. 5mM CuSO4で100%阻害される、態様26〜30のいずれかに記載の酵素。
32. Sulfolobales目に属する古細菌から得られる、態様26〜31のいずれかに記載の酵素。
33. Sulfolobus属に属する細菌から得られる、態様32に記載の酵素。
34. Sulfolobus solfataricusに属する細菌から得られる、態様33に記載の酵素。
35. Sulfolobus solfataricus KM1株(FERM BP−4626)或いはその変異株から得られる、態様34に記載の酵素。
36. Sulfolobus solfataricus DSM 5833株或いはその変異株から得られる、態様34に記載の酵素。
37. Sulfolobus acidocaldariusに属する細菌から得られる、態様33に記載の酵素。
38. Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株或いはその変異株から得られる、態様37に記載の酵素。
39. 態様26〜31のいずれかに記載のアミラーゼを産生する能力を有するSulfolobus属に属する細菌を培地に培養し、培養物より、トレハロースオリゴ糖を基質としてα,α−トレハロースを生成する活性を指標とする活性測定法に基づいて、該アミラーゼを単離精製することを特徴とする態様26〜31のいずれかに記載のアミラーゼの製造法。
40. Sulfolobus solfataricusに属する細菌を培養する、態様39に記載のアミラーゼの製造法。
41. Sulfolobus solfataricus KM1株(FERM BP−4626)を培養する、態様40に記載のアミラーゼの製造法。
42. Sulfolobus solfataricus DSM 5833株を培養する、態様40に記載のアミラーゼの製造法。
43. Sulfolobus acidocaldariusに属する細菌を培養する、態様39に記載のアミラーゼの製造法。
44. Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株を培養する、態様43に記載のアミラーゼの製造法。
45. 態様26〜38のいずれかに記載の新規アミラーゼと、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質としてその還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる作用を有する態様1〜14のいずれかに記載の新規トランスフェラーゼとを組み合わせて用いることを特徴とするα,α−トレハロースの製造法。
46. 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼを60〜80℃で作用させる、態様45に記載のα,α−トレハロースの製造法。
47. 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼの反応液中の濃度がそれぞれ1.5Units/ml及び0.1Unit/ml 以上である、態様45或いは46に記載のα,α−トレハロースの製造法。
48. 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼの反応液中の濃度がそれぞれ1.5Units/ml及び1Unit/ml 以上であり、かつアミラーゼ対トランスフェラーゼの濃度比が0.075〜100である、態様45或いは46に記載のα,α−トレハロースの製造法。
49. 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼの反応液中の濃度がそれぞれ15Units/ml及び1Unit/ml 以上であり、かつアミラーゼ対トランスフェラーゼの濃度比が3〜40である、態様48に記載のα,α−トレハロースの製造法。
50. 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質として用いる、態様45〜49のいずれかに記載のα,α−トレハロースの製造法。
51. デンプン又はデンプン分解物を基質として用いる、態様45〜49のいずれかに記載のα,α−トレハロースの製造法。
52. デンプン分解物が酸分解或いは酵素分解によって製造されるデンプン分解物である、態様51に記載のα,α−トレハロースの製造法。
53. デンプン分解物が枝切り酵素を用いて得られるものである、態様52に記載のα,α−トレハロースの製造法。
54. 枝切り酵素がプルラナーゼ或いはイソアミラーゼである、態様53に記載のα,α−トレハロースの製造法。
55. すべてのグルコース残基がα−1,4結合であるマルトオリゴ糖を各単独又はそれらの混合物として基質に用いる、態様45〜49のいずれかに記載のα,α−トレハロースの製造法。
56. 更に枝切り酵素を組み合わせて用いる、態様45或いは46に記載のα,α−トレハロースの製造法。
57. 枝切り酵素がプルラナーゼ或いはイソアミラーゼである、態様56に記載のα,α−トレハロースの製造法。
58. α,α−トレハロースの製造のいずれかの段階でプルラナーゼ或いはイソアミラーゼを1回以上組み合わせて用いる、態様57に記載のα,α−トレハロースの製造法。
59. α,α−トレハロースの製造の初期段階でプルラナーゼ或いはイソアミラーゼを1回以上組み合わせて用いる、態様58に記載のα,α−トレハロースの製造法。
60. デンプン又はデンプン分解物を基質として用いる、態様56〜59のいずれかに記載のα,α−トレハロースの製造法。
61. デンプン分解物が酸分解或いは酵素分解によって製造されるデンプン分解物である、態様60に記載のα,α−トレハロースの製造法。
62. デンプン分解物が枝切り酵素を用いて得られるものである、態様61に記載のα,α−トレハロースの製造法。
63. 枝切り酵素がプルラナーゼ或いはイソアミラーゼである、態様62に記載のα,α−トレハロースの製造法。
64. 該トランスフェラーゼとして、Sulfolobales目に属する古細菌由来の酵素を用いる、態様45〜63のいずれかに記載のα,α−トレハロースの製造法。
65. 該トランスフェラーゼとして、Sulfolobus属に属する細菌から得られる酵素を用いる、態様64に記載のα,α−トレハロースの製造法。
66. 該トランスフェラーゼとして、Acidianus属に属する細菌から得られる酵素を用いる、態様64に記載のα,α−トレハロースの製造法。
67. 該トランスフェラーゼとして、Sulfolobus solfataricusに属する細菌から得られる酵素を用いる、態様65に記載のα,α−トレハロースの製造法。
68. Sulfolobus solfataricus KM1株(FERM BP−4626)或いはその変異株から得られる酵素を用いる、態様67に記載のα,α−トレハロースの製造法。
69. Sulfolobus solfataricus DSM 5833株或いはその変異株から得られる酵素を用いる、態様67に記載のα,α−トレハロースの製造法。
70. 該トランスフェラーゼとして、Sulfolobus acidocaldariusに属する細菌から得られる酵素を用いる、態様65に記載のα,α−トレハロースの製造法。
71. Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株或いはその変異株から得られる酵素を用いる、態様70に記載のα,α−トレハロースの製造法。
72. 該トランスフェラーゼとして、Acidianus brierleyiに属する細菌から得られる酵素を用いる、態様66に記載のα,α−トレハロースの製造法。
73. Acidianus brierleyi DSM 1651株或いはその変異株から得られる酵素を用いる、態様72に記載のα,α−トレハロースの製造法。
74. 態様1に記載の新規トランスフェラーゼをコードするDNA配列を含んでなるDNA断片であって、図26に示される制限酵素地図で表される上記DNA断片。
75. 態様1に記載の新規トランスフェラーゼをコードするDNA配列を含んでなるDNA断片であって、図29に示される制限酵素地図で表される上記DNA断片。
76. 配列番号2に示されるアミノ酸配列またはその等価配列をコードするDNA配列を含んでなる、DNA断片。
77. 配列番号1に示される塩基配列の335番から2518番までの塩基配列を含んでなる、態様76に記載のDNA断片。
78. 配列番号1に示される塩基配列の1番から2578番までの塩基配列を含んでなる、態様76に記載のDNA断片。
79. 配列番号4に示されるアミノ酸配列またはその等価配列をコードするDNA配列を含んでなる、DNA断片。
80. 配列番号3に示される塩基配列の816番から2855番までの塩基配列を含んでなる、態様79に記載のDNA断片。
81. 配列番号3に示される塩基配列の1番から3467番までの塩基配列を含んでなる、態様79に記載のDNA断片。
82. Sulfolobales目に属する古細菌由来である、態様74〜81のいずれかに記載のDNA断片。
83. Sulfolobus属に属する細菌由来である、態様82に記載のDNA断片。
84. Sulfolobus solfataricusに属する細菌由来である、態様83に記載のDNA断片。
85. Sulfolobus solfataricus KM1株由来である、態様84に記載のDNA断片。
86. Sulfolobus acidocaldariusに属する細菌由来である、態様83に記載のDNA断片。
87. Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909株由来である、態様86に記載のDNA断片。
88. 配列番号1に示される塩基配列の1880番から2257番までの塩基配列、またはその相補体に、60℃、6xSSPEのイオン強度下でハイブリッドを形成し、かつ少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα‐1,4結合をα‐1,α‐1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼをコードするDNA断片、および該DNA断片によりコードされるアミノ酸配列をコードするDNA断片。
89. 配列番号2に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなる、ポリペプチド。
90. 配列番号4に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなる、ポリペプチド。
91. 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα‐1,4結合をα‐1,α‐1結合に転移させる作用を有する、態様89または90に記載のポリペプチド。
92. 前記作用の至適温度が60〜80℃である、態様89〜91のいずれかに記載のポリペプチド。
93. 態様74〜88のいずれかに記載のDNA断片を含んでなる、組換えDNA分子。
94. 態様74〜88のいずれかに記載のDNA断片がプラスミドベクターに組み込まれてなる、態様93に記載の組換えDNA分子。
95. 態様93または94に記載の組換えDNA分子によって形質転換された、宿主細胞。
96. 宿主細胞がEscherichia属またはBacillus属に属する微生物である、態様95に記載の宿主細胞。
97. 宿主細胞がEscherichia coli JM109株である、態様96に記載の宿主細胞。
98. 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα‐1,4結合をα‐1,α‐1結合に転移させる作用を有する組換え新規トランスフェラーゼの製造法であって、
態様95〜97のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規トランスフェラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなる、上記方法。
99. 態様74〜88のいずれかに記載のDNA断片によりコードされる組換え新規トランスフェラーゼ、または態様89〜92のいずれかに記載のポリペプチドを含んでなる組換え新規トランスフェラーゼの製造法であって、
態様95〜97のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規トランスフェラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなる、上記方法。
100. 少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα‐1,α‐1結合で、該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα‐1,4結合であるトレハロースオリゴ糖の製造法であって、
態様98または99で得られた組換え新規トランスフェラーゼを、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖と接触させることを含んでなる、上記方法。
101. 態様26に記載の新規アミラーゼをコードするDNA配列を含んでなるDNA断片であって、図34に示される制限酵素地図で表される、上記DNA断片。
102. 態様26に記載の新規アミラーゼをコードするDNA配列を含んでなるDNA断片であって、図38に示される制限酵素地図で表される、上記DNA断片。
103. 態様27に記載の新規アミラーゼをコードするDNA配列を含んでなる、態様101に記載のDNA断片。
104. 態様27に記載の新規アミラーゼをコードするDNA配列を含んでなる、態様102に記載のDNA断片。
105. 糖鎖中のα‐1,4結合をエンド型で加水分解する活性を有する新規アミラーゼをコードするDNA配列を含んでなる、態様101〜104のいずれかに記載のDNA断片。
106. 前記新規アミラーゼが、トレハロースオリゴ糖を基質とし、還元末端側の2つ目と3つ目のグルコース間のα‐1,4結合を加水分解し、α,α‐トレハロースを遊離する活性を有するものである、態様101〜105のいずれかに記載のDNA断片。
107. 前記新規アミラーゼの至適温度が60〜85℃である、態様101〜106のいずれかに記載のDNA断片。
108. 配列番号6に示されるアミノ酸配列、またはその等価配列をコードするDNA配列を含んでなる、DNA断片。
109. 配列番号5に示される塩基配列の642番から2315番までの塩基配列を含んでなる、態様108に記載のDNA断片。
110. 配列番号5に示される塩基配列の639番から2315番までの塩基配列を含んでなる、態様108に記載のDNA断片。
111. 配列番号5に示される塩基配列の1番から2691番までの塩基配列を含んでなる、態様108に記載のDNA断片。
112. 配列番号8に示されるアミノ酸配列、またはその等価配列をコードするDNA配列を含んでなる、DNA断片。
113. 配列番号7に示される塩基配列の1176番から2843番までの塩基配列を含んでなる、態様112に記載のDNA断片。
114. 配列番号7に示される塩基配列の1番から3600番までの塩基配列を含んでなる、態様112に記載のDNA断片。
115. Sulfolobales目に属する古細菌由来である、態様101〜114のいずれかに記載のDNA断片。
116. Sulfolobus属に属する細菌由来である、態様115に記載のDNA断片。
117. Sulfolobus solfataricusに属する細菌由来である、態様116に記載のDNA断片。
118. Sulfolobus solfataricus KM1株由来である、態様117に記載のDNA断片。
119. Sulfolobus acidocaldariusに属する細菌由来である、態様116に記載のDNA断片。
120. Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909株由来である、態様119に記載のDNA断片。
121. 配列番号7に示される塩基配列の1393番から2121番までの塩基配列、またはその相補体に、60℃、6xSSPEのイオン強度下でハイブリッドを形成し、かつ少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成された3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して、主に単糖および/または2糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼをコードするDNA断片、および該DNA断片によりコードされるアミノ酸配列をコードするDNA断片。
122. 配列番号7に示される塩基配列の1393番から2121番までの塩基配列、またはその相補体に、60℃、6xSSPEのイオン強度下でハイブリッドを形成し、かつ少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα‐1,α‐1結合であり、かつ該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、2つ目と3つ目のグルコース間のα‐1,4結合を加水分解し、α,α‐トレハロースを遊離する主要な活性を有する新規アミラーゼをコードするDNA断片、および該DNA断片によりコードされるアミノ酸配列をコードするDNA断片。
123. 配列番号6に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなる、ポリペプチド。
124. 配列番号8に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなる、ポリペプチド。
125. そのN末端に更にMetを有してなる、態様123に記載のポリペプチド。
126. 少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα‐1,α‐1結合で、該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα‐1,4結合である、3糖以上の糖を基質とし、2つ目と3つ目のグルコース間のα‐1,4結合を加水分解し、α,α‐トレハロースを遊離する作用を有する、態様123〜125のいずれかに記載のポリペプチド。
127. (1)糖鎖中のα‐1,4グルコシド結合をエンド型で加水分解する活性、
(2)少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成され、かつその結合がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して単糖および/または2糖を遊離する活性、および
(3)少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα‐1,α‐1結合であり、かつ該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、2つ目と3つ目のグルコース間のα‐1,4結合を加水分解し、α,α‐トレハロースを遊離する主要な活性
を有する、態様123〜125のいずれかに記載のポリペプチド。
128. 作用の至適温度が60〜85℃である、態様123〜127のいずれかに記載のポリペプチド。
129. 態様101〜122のいずれかに記載のDNA断片を含んでなる、組換えDNA分子。
130. 態様101〜122のいずれかに記載のDNA断片がプラスミドベクターに組み込まれてなる、態様129記載の組換えDNA分子。
131. 態様129または130に記載の組換えDNA分子によって形質転換された、宿主細胞。
132. 宿主細胞がEscherichia属またはBacillus属に属する微生物である、態様131に記載の宿主細胞。
133. 宿主細胞がEscherichia coli JM109株である、態様132に記載の宿主細胞。
134. 組換え新規アミラーゼの製造法であって、
該組換え新規アミラーゼが
少なくとも還元末端側の3糖がグルコース単位で構成され、該末端側の1つ目と2つ目のグルコース間の結合がα‐1,α‐1結合であり、かつ該末端側の2つ目と3つ目のグルコース間の結合がα‐1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、2つ目と3つ目のグルコース間のα‐1,4結合を加水分解し、α,α‐トレハロースを遊離する主要な活性を有するものであり、
態様131〜133のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規アミラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなる、上記方法。
135. 態様101〜122のいずれかに記載のDNA断片によりコードされる組換え新規アミラーゼ、または態様123〜128のいずれかに記載のポリペプチドを含んでなる組換え新規アミラーゼの製造法であって、
態様131〜133のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規アミラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなる、上記方法。
136. α,α‐トレハロースの製造法であって、態様1〜14のいずれかに記載の新規トランスフェラーゼまたは態様98もしくは99で得られた組換え新規トランスフェラーゼ、および
態様134または135で得られた組換え新規アミラーゼとを、
少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖と接触させる工程を含んでなる、上記方法。
137. α,α‐トレハロースの製造法であって、
態様98または99で得られた組換え新規トランスフェラーゼ、および
態様26〜38のいずれか記載の新規アミラーゼまたは態様134もしくは135で得られた組換え新規アミラーゼとを、
少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖と接触させる工程を含んでなる、上記方法。
138. 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖がデンプンまたはデンプン分解物である、態様136または137に記載の方法。
139. デンプン分解物が、デンプンを酸分解、または酵素分解することによって製造されたものである、態様138に記載の方法。
140. デンプン分解物が、デンプンの枝切り酵素による分解産物である、態様138に記載の方法。
141. 枝切り酵素がプルラナーゼまたはイソアミラーゼである、態様140に記載の方法。
142. 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖が、全てのグルコース残基がα‐1,4結合であるマルトオリゴ糖の単独または混合物である、態様136または137に記載の方法。
143. 50〜85℃の温度で実施される、態様136〜142のいずれかに記載の方法。
配列番号:1
配列の長さ:2578
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
GCATGCCATT AAAAGATGTA ACATTTTACA CTCCAGACGG TAAGGAGGTT GATGAGAAAG 60
CATGGAATTC CCCAACGCAA ACTGTTATTT TCGTGTTAGA GGGGAGCGTA ATGGATGAGA 120
TTAACATCTA TGGAGAGAGA ATTGCGGATG ATTCATTCTT GATAATTCTT AACGCAAATC 180
CCAATAACGT AAAAGTGAAG TTCCCAAAGG GTAAATGGGA ACTAGTTGTT GGTTCTTATT 240
TGAGAGAGAT AAAACCAGAA GAAAGAATTG TAGAAGGTGA GAAGGAATTG GAAATTGAGG 300
GAAGAACAGC ATTAGTTTAT AGGAGGACAG AACT ATG ATA ATA GGC ACA TAT AGG 355
Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg
1 5
CTG CAA CTC AAT AAG AAA TTC ACT TTT TAC GAT ATA ATA GAA AAT TTG 403
Leu Gln Leu Asn Lys Lys Phe Thr Phe Tyr Asp Ile Ile Glu Asn Leu
10 15 20
GAT TAT TTT AAA GAA TTA GGA GTA TCA CAC CTA TAT CTA TCT CCA ATA 451
Asp Tyr Phe Lys Glu Leu Gly Val Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile
25 30 35
CTT AAG GCT AGA CCA GGG AGC ACT CAC GGC TAC GAT GTA GTA GAT CAT 499
Leu Lys Ala Arg Pro Gly Ser Thr His Gly Tyr Asp Val Val Asp His
40 45 50 55
AGT GAA ATT AAT GAG GAA TTA GGA GGA GAA GAG GGG TGC TTT AAA CTA 547
Ser Glu Ile Asn Glu Glu Leu Gly Gly Glu Glu Gly Cys Phe Lys Leu
60 65 70
GTT AAG GAA GCT AAG AGT AGA GGT TTA GAA ATC ATA CAA GAT ATA GTG 595
Val Lys Glu Ala Lys Ser Arg Gly Leu Glu Ile Ile Gln Asp Ile Val
75 80 85
CCA AAT CAC ATG GCG GTA CAT CAT ACT AAT TGG AGA CTT ATG GAT CTG 643
Pro Asn His Met Ala Val His His Thr Asn Trp Arg Leu Met Asp Leu
90 95 100
TTA AAG AGT TGG AAG AAT AGT AAA TAC TAT AAC TAT TTT GAT CAC TAC 691
Leu Lys Ser Trp Lys Asn Ser Lys Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp His Tyr
105 110 115
GAT GAT GAC AAG ATA ATC CTC CCA ATA CTT GAG GAC GAG TTG GAT ACC 739
Asp Asp Asp Lys Ile Ile Leu Pro Ile Leu Glu Asp Glu Leu Asp Thr
120 125 130 135
GTT ATA GAT AAG GGA TTG ATA AAA CTA CAG AAG GAT AAT ATA GAG TAC 787
Val Ile Asp Lys Gly Leu Ile Lys Leu Gln Lys Asp Asn Ile Glu Tyr
140 145 150
AGA GGG CTT ATA TTA CCT ATA AAT GAT GAA GGA GTT GAA TTC TTG AAA 835
Arg Gly Leu Ile Leu Pro Ile Asn Asp Glu Gly Val Glu Phe Leu Lys
155 160 165
AGG ATT AAT TGC TTT GAT AAT TCA TGT TTA AAG AAA GAG GAT ATA AAG 883
Arg Ile Asn Cys Phe Asp Asn Ser Cys Leu Lys Lys Glu Asp Ile Lys
170 175 180
AAA TTA CTA TTA ATA CAA TAT TAT CAG CTA ACT TAC TGG AAG AAA GGT 931
Lys Leu Leu Leu Ile Gln Tyr Tyr Gln Leu Thr Tyr Trp Lys Lys Gly
185 190 195
TAT CCA AAC TAT AGG AGA TTT TTC GCA GTA AAT GAT TTG ATA GCT GTT 979
Tyr Pro Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Asp Leu Ile Ala Val
200 205 210 215
AGG GTA GAA TTG GAT GAA GTA TTT AGA GAG TCC CAT GAG ATA ATT GCT 1027
Arg Val Glu Leu Asp Glu Val Phe Arg Glu Ser His Glu Ile Ile Ala
220 225 230
AAG CTA CCA GTT GAC GGT TTA AGA ATT GAC CAC ATA GAT GGA CTA TAT 1075
Lys Leu Pro Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr
235 240 245
AAC CCT AAG GAG TAT TTA GAT AAG CTA AGA CAG TTA GTA GGA AAT GAT 1123
Asn Pro Lys Glu Tyr Leu Asp Lys Leu Arg Gln Leu Val Gly Asn Asp
250 255 260
AAG ATA ATA TAC GTA GAG AAG ATA TTG TCA ATC AAC GAG AAA TTA AGA 1171
Lys Ile Ile Tyr Val Glu Lys Ile Leu Ser Ile Asn Glu Lys Leu Arg
265 270 275
GAT GAT TGG AAA GTA GAT GGG ACT ACT GGA TAT GAT TTC TTG AAC TAC 1219
Asp Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr
280 285 290 295
GTT AAT ATG CTA TTA GTA GAT GGA AGT GGT GAG GAG GAG TTA ACT AAG 1267
Val Asn Met Leu Leu Val Asp Gly Ser Gly Glu Glu Glu Leu Thr Lys
300 305 310
TTT TAT GAG AAT TTC ATT GGA AGG AAA ATC AAT ATA GAC GAG TTA ATA 1315
Phe Tyr Glu Asn Phe Ile Gly Arg Lys Ile Asn Ile Asp Glu Leu Ile
315 320 325
ATA CAA AGT AAA AAA TTA GTT GCA AAT CAG TTA TTT AAA GGT GAC ATT 1363
Ile Gln Ser Lys Lys Leu Val Ala Asn Gln Leu Phe Lys Gly Asp Ile
330 335 340
GAA AGA TTA AGC AAG TTA CTG AAC GTT AAT TAC GAT TAT TTA GTA GAT 1411
Glu Arg Leu Ser Lys Leu Leu Asn Val Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Asp
345 350 355
TTT CTA GCA TGT ATG AAA AAA TAC AGG ACT TAT TTA CCA TAT GAG GAT 1459
Phe Leu Ala Cys Met Lys Lys Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Tyr Glu Asp
360 365 370 375
ATT AAC GGA ATA AGG GAA TGC GAT AAG GAG GGA AAG TTA AAA GAT GAA 1507
Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys Asp Lys Glu Gly Lys Leu Lys Asp Glu
380 385 390
AAG GGA ATC ATG AGA CTC CAA CAA TAC ATG CCA GCA ATC TTC GCT AAG 1555
Lys Gly Ile Met Arg Leu Gln Gln Tyr Met Pro Ala Ile Phe Ala Lys
395 400 405
GGC TAT GAG GAT ACT ACC CTC TTC ATC TAC AAT AGA TTA ATT TCC CTT 1603
Gly Tyr Glu Asp Thr Thr Leu Phe Ile Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Leu
410 415 420
AAC GAG GTT GGG AGC GAC CTA AGA AGA TTC AGT TTA AGC ATC AAA GAC 1651
Asn Glu Val Gly Ser Asp Leu Arg Arg Phe Ser Leu Ser Ile Lys Asp
425 430 435
TTT CAT AAC TTT AAC CTA AGC AGA GTA AAT ACC ATA TCA ATG AAC ACT 1699
Phe His Asn Phe Asn Leu Ser Arg Val Asn Thr Ile Ser Met Asn Thr
440 445 450 455
CTT TCC ACT CAT GAT ACT AAA TTC AGT GAA GAC GTT AGA GCT AGA ATA 1747
Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Phe Ser Glu Asp Val Arg Ala Arg Ile
460 465 470
TCA GTA CTA TCT GAG ATA CCA AAG GAG TGG GAG GAG AGG GTA ATA TAC 1795
Ser Val Leu Ser Glu Ile Pro Lys Glu Trp Glu Glu Arg Val Ile Tyr
475 480 485
TGG CAT GAT TTG TTA AGG CCA AAT ATT GAT AAA AAC GAT GAG TAT AGA 1843
Trp His Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile Asp Lys Asn Asp Glu Tyr Arg
490 495 500
TTT TAT CAA ACA CTT GTG GGA AGT TAC GAG GGA TTT GAT AAT AAG GAG 1891
Phe Tyr Gln Thr Leu Val Gly Ser Tyr Glu Gly Phe Asp Asn Lys Glu
505 510 515
AGA ATT AAG AAC CAC ATG ATT AAG GTC ATA AGA GAA GCT AAG GTA CAT 1939
Arg Ile Lys Asn His Met Ile Lys Val Ile Arg Glu Ala Lys Val His
520 525 530 535
ACA ACG TGG GAA AAT CCT AAT ATA GAG TAT GAA AAG AAG GTT CTG GGT 1987
Thr Thr Trp Glu Asn Pro Asn Ile Glu Tyr Glu Lys Lys Val Leu Gly
540 545 550
TTC ATA GAT GAA GTG TTC GAG AAC AGT AAT TTT AGA AAT GAT TTT GAA 2035
Phe Ile Asp Glu Val Phe Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Asp Phe Glu
555 560 565
AAT TTT GAA AAG AAA ATA GTT TAT TTC GGT TAT ATG AAA TCA TTA ATC 2083
Asn Phe Glu Lys Lys Ile Val Tyr Phe Gly Tyr Met Lys Ser Leu Ile
570 575 580
GCA ACG ACA CTT AGG TTC CTT TCG CCC GGT GTA CCA GAT ATT TAT CAA 2131
Ala Thr Thr Leu Arg Phe Leu Ser Pro Gly Val Pro Asp Ile Tyr Gln
585 590 595
GGA ACT GAA GTT TGG AGA TTC TTA CTT ACA GAC CCA GAT AAC AGA ATG 2179
Gly Thr Glu Val Trp Arg Phe Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Met
600 605 610 615
CCG GTG GAT TTC AAG AAA CTA AAG GAA TTA TTA AAT AAT TTG ACT GAA 2227
Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu Lys Glu Leu Leu Asn Asn Leu Thr Glu
620 625 630
AAG AAC TTA GAA CTC TCA GAT CCA AGA GTC AAA ATG TTA TAT GTT AAG 2275
Lys Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Val Lys Met Leu Tyr Val Lys
635 640 645
AAA TTG CTA CAG CTT AGA AGA GAG TAC TCA CTA AAC GAT TAT AAA CCA 2323
Lys Leu Leu Gln Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Leu Asn Asp Tyr Lys Pro
650 655 660
TTG CCC TTT GGC TTC CAA AGG GGA AAA GTA GCT GTC CTT TTC TCA CCA 2371
Leu Pro Phe Gly Phe Gln Arg Gly Lys Val Ala Val Leu Phe Ser Pro
665 670 675
ATA GTG ACT AGG GAG GTT AAA GAG AAA ATT AGT ATA AGG CAA AAA AGC 2419
Ile Val Thr Arg Glu Val Lys Glu Lys Ile Ser Ile Arg Gln Lys Ser
680 685 690 695
GTT GAT TGG ATC AGA AAT GAG GAA ATT AGT AGT GGA GAA TAC AAT TTA 2467
Val Asp Trp Ile Arg Asn Glu Glu Ile Ser Ser Gly Glu Tyr Asn Leu
700 705 710
AGT GAG TTG ATT GGG AAG CAT AAA GTC GTT ATA TTA ACT GAA AAA AGG 2515
Ser Glu Leu Ile Gly Lys His Lys Val Val Ile Leu Thr Glu Lys Arg
715 720 725
GAG TGAACTACCT ACATAGATTT ATTCTTGAAC TACTCTGGTC AGAAATGTAT 2568
Glu
TACGCAGATC 2578
配列番号:2
配列の長さ:728
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys Lys Phe Thr Phe
1 5 10 15
Tyr Asp Ile Ile Glu Asn Leu Asp Tyr Phe Lys Glu Leu Gly Val Ser
20 25 30
His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile Leu Lys Ala Arg Pro Gly Ser Thr His
35 40 45
Gly Tyr Asp Val Val Asp His Ser Glu Ile Asn Glu Glu Leu Gly Gly
50 55 60
Glu Glu Gly Cys Phe Lys Leu Val Lys Glu Ala Lys Ser Arg Gly Leu
65 70 75 80
Glu Ile Ile Gln Asp Ile Val Pro Asn His Met Ala Val His His Thr
85 90 95
Asn Trp Arg Leu Met Asp Leu Leu Lys Ser Trp Lys Asn Ser Lys Tyr
100 105 110
Tyr Asn Tyr Phe Asp His Tyr Asp Asp Asp Lys Ile Ile Leu Pro Ile
115 120 125
Leu Glu Asp Glu Leu Asp Thr Val Ile Asp Lys Gly Leu Ile Lys Leu
130 135 140
Gln Lys Asp Asn Ile Glu Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Pro Ile Asn Asp
145 150 155 160
Glu Gly Val Glu Phe Leu Lys Arg Ile Asn Cys Phe Asp Asn Ser Cys
165 170 175
Leu Lys Lys Glu Asp Ile Lys Lys Leu Leu Leu Ile Gln Tyr Tyr Gln
180 185 190
Leu Thr Tyr Trp Lys Lys Gly Tyr Pro Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala
195 200 205
Val Asn Asp Leu Ile Ala Val Arg Val Glu Leu Asp Glu Val Phe Arg
210 215 220
Glu Ser His Glu Ile Ile Ala Lys Leu Pro Val Asp Gly Leu Arg Ile
225 230 235 240
Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys Glu Tyr Leu Asp Lys Leu
245 250 255
Arg Gln Leu Val Gly Asn Asp Lys Ile Ile Tyr Val Glu Lys Ile Leu
260 265 270
Ser Ile Asn Glu Lys Leu Arg Asp Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Thr
275 280 285
Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr Val Asn Met Leu Leu Val Asp Gly Ser
290 295 300
Gly Glu Glu Glu Leu Thr Lys Phe Tyr Glu Asn Phe Ile Gly Arg Lys
305 310 315 320
Ile Asn Ile Asp Glu Leu Ile Ile Gln Ser Lys Lys Leu Val Ala Asn
325 330 335
Gln Leu Phe Lys Gly Asp Ile Glu Arg Leu Ser Lys Leu Leu Asn Val
340 345 350
Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Asp Phe Leu Ala Cys Met Lys Lys Tyr Arg
355 360 365
Thr Tyr Leu Pro Tyr Glu Asp Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys Asp Lys
370 375 380
Glu Gly Lys Leu Lys Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Leu Gln Gln Tyr
385 390 395 400
Met Pro Ala Ile Phe Ala Lys Gly Tyr Glu Asp Thr Thr Leu Phe Ile
405 410 415
Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Leu Asn Glu Val Gly Ser Asp Leu Arg Arg
420 425 430
Phe Ser Leu Ser Ile Lys Asp Phe His Asn Phe Asn Leu Ser Arg Val
435 440 445
Asn Thr Ile Ser Met Asn Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Phe Ser
450 455 460
Glu Asp Val Arg Ala Arg Ile Ser Val Leu Ser Glu Ile Pro Lys Glu
465 470 475 480
Trp Glu Glu Arg Val Ile Tyr Trp His Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile
485 490 495
Asp Lys Asn Asp Glu Tyr Arg Phe Tyr Gln Thr Leu Val Gly Ser Tyr
500 505 510
Glu Gly Phe Asp Asn Lys Glu Arg Ile Lys Asn His Met Ile Lys Val
515 520 525
Ile Arg Glu Ala Lys Val His Thr Thr Trp Glu Asn Pro Asn Ile Glu
530 535 540
Tyr Glu Lys Lys Val Leu Gly Phe Ile Asp Glu Val Phe Glu Asn Ser
545 550 555 560
Asn Phe Arg Asn Asp Phe Glu Asn Phe Glu Lys Lys Ile Val Tyr Phe
565 570 575
Gly Tyr Met Lys Ser Leu Ile Ala Thr Thr Leu Arg Phe Leu Ser Pro
580 585 590
Gly Val Pro Asp Ile Tyr Gln Gly Thr Glu Val Trp Arg Phe Leu Leu
595 600 605
Thr Asp Pro Asp Asn Arg Met Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu Lys Glu
610 615 620
Leu Leu Asn Asn Leu Thr Glu Lys Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg
625 630 635 640
Val Lys Met Leu Tyr Val Lys Lys Leu Leu Gln Leu Arg Arg Glu Tyr
645 650 655
Ser Leu Asn Asp Tyr Lys Pro Leu Pro Phe Gly Phe Gln Arg Gly Lys
660 665 670
Val Ala Val Leu Phe Ser Pro Ile Val Thr Arg Glu Val Lys Glu Lys
675 680 685
Ile Ser Ile Arg Gln Lys Ser Val Asp Trp Ile Arg Asn Glu Glu Ile
690 695 700
Ser Ser Gly Glu Tyr Asn Leu Ser Glu Leu Ile Gly Lys His Lys Val
705 710 715 720
Val Ile Leu Thr Glu Lys Arg Glu
725
配列番号:3
配列の長さ:3467
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC 33909株
配列
GCTAATAAAC TGAACAATGA GGACGGAATG AATGAAAATT ATAGCTGGAA TTGTGGAGTA 60
GAAGGAGAAA CTAACGATTC TAATATTCTT TATTGTAGAG AAAAACAAAG AAGAAATTTT 120
GTAATAACAT TATTTGTTAG CCAAGGTATA CCAATGATCT TAGGGGGAGA CGAAATAGGA 180
AGAACACAAA AAGGCAACAA TAATGCTTTT TGTCAGGATA ATGAGACAAG TTGGTATGAT 240
TGGAACCTTG ATGAAAATCG TGTAAGGTTT CATGATTTTG TGAGGAGACT TACCAATTTT 300
TATAAAGCTC ATCCGATATT TAGGAGGGCT AGATATTTTC AGGGTAAGAA GTTACACGGT 360
TCCCCATTAA AGGATGTGAC GTGGCTAAAA CCTGACGGCA ATGAAGTTGA TGATTCAGTG 420
TGGAAATCTC CAACAAATCA TATTATTTAT ATATTAGAGG GAAGTGCTAT CGATGAAATA 480
AATTATAATG GAGAAAGGAT AGCTGACGAC ACTTTTCTAA TTATTTTGAA TGGAGCAAGT 540
ACTAATCTTA AGATAAAAGT ACCTCATGGA AAATGGGAGT TAGTGTTACA TCCTTATCCA 600
CATGAGCCAT CTAACGATAA AAAGATAATA GAAAACAACA AAGAAGTAGA AATAGATGGA 660
AAGACTGCAC TAATTTACAG GAGGATAGAG TTCCAGTGAT ATCAGCAACC TACAGATTAC 720
AGTTAAATAA GAATTTTAAT TTTGGTGACG TAATCGATAA CCTATGGTAT TTTAAGGATT 780
TAGGAGTTTC CCATCTCTAC CTCTCTCCTG TCTTA ATG GCT TCG CCA GGA AGT AAC 836
Met Ala Ser Pro Gly Ser Asn
1 5
CAT GGG TAC GAT GTA ATA GAT CAT TCA AGG ATA AAC GAT GAA CTT GGA 884
His Gly Tyr Asp Val Ile Asp His Ser Arg Ile Asn Asp Glu Leu Gly
10 15 20
GGA GAG AAA GAA TAC AGG AGA TTA ATA GAG ACA GCT CAT ACT ATT GGA 932
Gly Glu Lys Glu Tyr Arg Arg Leu Ile Glu Thr Ala His Thr Ile Gly
25 30 35
TTA GGT ATT ATA CAG GAC ATA GTA CCA AAT CAC ATG GCT GTA AAT TCT 980
Leu Gly Ile Ile Gln Asp Ile Val Pro Asn His Met Ala Val Asn Ser
40 45 50 55
CTA AAT TGG CGA CTA ATG GAT GTA TTA AAA ATG GGT AAA AAG AGT AAA 1028
Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp Val Leu Lys Met Gly Lys Lys Ser Lys
60 65 70
TAT TAT ACG TAC TTT GAC TTT TTC CCA GAA GAT GAT AAG ATA CGA TTA 1076
Tyr Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Pro Glu Asp Asp Lys Ile Arg Leu
75 80 85
CCC ATA TTA GGA GAA GAT TTA GAT ACA GTG ATA AGT AAA GGT TTA TTA 1124
Pro Ile Leu Gly Glu Asp Leu Asp Thr Val Ile Ser Lys Gly Leu Leu
90 95 100
AAG ATA GTA AAA GAT GGA GAT GAA TAT TTC CTA GAA TAT TTC AAA TGG 1172
Lys Ile Val Lys Asp Gly Asp Glu Tyr Phe Leu Glu Tyr Phe Lys Trp
105 110 115
AAA CTT CCT CTA ACA GAG GTT GGA AAT GAT ATA TAC GAC ACT TTA CAA 1220
Lys Leu Pro Leu Thr Glu Val Gly Asn Asp Ile Tyr Asp Thr Leu Gln
120 125 130 135
AAA CAG AAT TAT ACC CTA ATG TCT TGG AAA AAT CCT CCT AGC TAT AGA 1268
Lys Gln Asn Tyr Thr Leu Met Ser Trp Lys Asn Pro Pro Ser Tyr Arg
140 145 150
CGA TTC TTC GAT GTT AAT ACT TTA ATA GGA GTA AAT GTC GAA AAA GAT 1316
Arg Phe Phe Asp Val Asn Thr Leu Ile Gly Val Asn Val Glu Lys Asp
155 160 165
CAC GTA TTT CAA GAG TCC CAT TCA AAG ATC TTA GAT TTA GAT GTT GAT 1364
His Val Phe Gln Glu Ser His Ser Lys Ile Leu Asp Leu Asp Val Asp
170 175 180
GGC TAT AGA ATT GAT CAT ATT GAT GGA TTA TAT GAT CCT GAG AAA TAT 1412
Gly Tyr Arg Ile Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Glu Lys Tyr
185 190 195
ATT AAT GAC CTG AGG TCA ATA ATT AAA AAT AAA ATA ATT ATT GTA GAA 1460
Ile Asn Asp Leu Arg Ser Ile Ile Lys Asn Lys Ile Ile Ile Val Glu
200 205 210 215
AAA ATT CTG GGA TTT CAG GAG GAA TTA AAA TTA AAT TCA GAT GGA ACT 1508
Lys Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys Leu Asn Ser Asp Gly Thr
220 225 230
ACA GGA TAT GAC TTC TTA AAT TAC TCC AAC TTA CTG TTT AAT TTT AAT 1556
Thr Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr Ser Asn Leu Leu Phe Asn Phe Asn
235 240 245
CAA GAG ATA ATG GAC AGT ATA TAT GAG AAT TTC ACA GCG GAG AAA ATA 1604
Gln Glu Ile Met Asp Ser Ile Tyr Glu Asn Phe Thr Ala Glu Lys Ile
250 255 260
TCT ATA AGT GAA AGT ATA AAG AAA ATA AAA GCG CAA ATA ATT GAT GAG 1652
Ser Ile Ser Glu Ser Ile Lys Lys Ile Lys Ala Gln Ile Ile Asp Glu
265 270 275
CTA TTT AGT TAT GAA GTT AAA AGA TTA GCA TCA CAA CTA GGA ATT AGC 1700
Leu Phe Ser Tyr Glu Val Lys Arg Leu Ala Ser Gln Leu Gly Ile Ser
280 285 290 295
TAC GAT ATA TTG AGA GAT TAC CTT TCT TGT ATA GAT GTG TAC AGA ACT 1748
Tyr Asp Ile Leu Arg Asp Tyr Leu Ser Cys Ile Asp Val Tyr Arg Thr
300 305 310
TAT GCT AAT CAG ATT GTA AAA GAG TGT GAT AAG ACC AAT GAG ATA GAG 1796
Tyr Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys Asp Lys Thr Asn Glu Ile Glu
315 320 325
GAA GCA ACC AAA AGA AAT CCA GAG GCT TAT ACT AAA TTA CAA CAA TAT 1844
Glu Ala Thr Lys Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys Leu Gln Gln Tyr
330 335 340
ATG CCA GCA GTA TAC GCT AAA GCT TAT GAA GAT ACT TTC CTC TTT AGA 1892
Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys Ala Tyr Glu Asp Thr Phe Leu Phe Arg
345 350 355
TAC AAT AGA TTA ATA TCC ATA AAT GAG GTT GGA AGC GAT TTA CGA TAT 1940
Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Ile Asn Glu Val Gly Ser Asp Leu Arg Tyr
360 365 370 375
TAT AAG ATA TCG CCT GAT CAG TTT CAT GTA TTT AAT CAA AAA CGA AGA 1988
Tyr Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val Phe Asn Gln Lys Arg Arg
380 385 390
GGA AAA ATC ACA CTA AAT GCC ACT AGC ACA CAT GAT ACT AAG TTT AGT 2036
Gly Lys Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr His Asp Thr Lys Phe Ser
395 400 405
GAA GAT GTA AGG ATG AAA ATA AGT GTA TTA AGT GAA TTT CCT GAA GAA 2084
Glu Asp Val Arg Met Lys Ile Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu
410 415 420
TGG AAA AAT AAG GTC GAG GAA TGG CAT AGT ATC ATA AAT CCA AAG GTA 2132
Trp Lys Asn Lys Val Glu Glu Trp His Ser Ile Ile Asn Pro Lys Val
425 430 435
TCA AGA AAT GAT GAA TAT AGA TAT TAT CAG GTT TTA GTG GGA AGT TTT 2180
Ser Arg Asn Asp Glu Tyr Arg Tyr Tyr Gln Val Leu Val Gly Ser Phe
440 445 450 455
TAT GAG GGA TTC TCT AAT GAT TTT AAG GAG AGA ATA AAG CAA CAT ATG 2228
Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Asp Phe Lys Glu Arg Ile Lys Gln His Met
460 465 470
ATA AAA AGT GTC AGA GAA GCT AAG ATA AAT ACC TCA TGG AGA AAT CAA 2276
Ile Lys Ser Val Arg Glu Ala Lys Ile Asn Thr Ser Trp Arg Asn Gln
475 480 485
AAT AAA GAA TAT GAA AAT AGA GTA ATG GAA TTA GTG GAA GAA ACT TTT 2324
Asn Lys Glu Tyr Glu Asn Arg Val Met Glu Leu Val Glu Glu Thr Phe
490 495 500
ACC AAT AAG GAT TTC ATT AAA AGT TTC ATG AAA TTT GAA AGT AAG ATA 2372
Thr Asn Lys Asp Phe Ile Lys Ser Phe Met Lys Phe Glu Ser Lys Ile
505 510 515
AGA AGG ATA GGG ATG ATT AAG AGC TTA TCC TTG GTC GCA TTA AAA ATT 2420
Arg Arg Ile Gly Met Ile Lys Ser Leu Ser Leu Val Ala Leu Lys Ile
520 525 530 535
ATG TCA GCC GGT ATA CCT GAT TTT TAT CAG GGA ACA GAA ATA TGG CGA 2468
Met Ser Ala Gly Ile Pro Asp Phe Tyr Gln Gly Thr Glu Ile Trp Arg
540 545 550
TAT TTA CTT ACA GAT CCA GAT AAC AGA GTC CCA GTG GAT TTT AAG AAA 2516
Tyr Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Val Pro Val Asp Phe Lys Lys
555 560 565
TTA CAC GAA ATA TTA GAA AAA TCC AAA AAA TTT GAA AAA AAT ATG TTA 2564
Leu His Glu Ile Leu Glu Lys Ser Lys Lys Phe Glu Lys Asn Met Leu
570 575 580
GAG TCT ATG GAC GAT GGA AGA ATT AAG ATG TAT TTA ACA TAT AAG CTT 2612
Glu Ser Met Asp Asp Gly Arg Ile Lys Met Tyr Leu Thr Tyr Lys Leu
585 590 595
TTA TCC CTA AGA AAA CAG TTG GCT GAG GAT TTT TTA AAG GGC GAG TAT 2660
Leu Ser Leu Arg Lys Gln Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Tyr
600 605 610 615
AAG GGA TTA GAT CTA GAA GAA GGA CTA TGT GGG TTT ATT AGG TTT AAC 2708
Lys Gly Leu Asp Leu Glu Glu Gly Leu Cys Gly Phe Ile Arg Phe Asn
620 625 630
AAA ATT TTG GTA ATA ATA AAA ACC AAG GGA AGT GTT AAT TAC AAA CTG 2756
Lys Ile Leu Val Ile Ile Lys Thr Lys Gly Ser Val Asn Tyr Lys Leu
635 640 645
AAA CTT GAA GAG GGA GCA ATT TAC ACA GAT GTA TTG ACA GGA GAA GAA 2804
Lys Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr Thr Asp Val Leu Thr Gly Glu Glu
650 655 660
ATT AAA AAA GAG GTA CAG ATT AAT GAG CTA CCT AGG ATA CTA GTT AGA 2852
Ile Lys Lys Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro Arg Ile Leu Val Arg
665 670 675
ATG TAAGTTATAA TAATCCGATT TTTATGTGAC AAGATTTACG CTTACGAAAA 2905
Met
680
GGACTGTTAA ATCAACTTTT ATGTGAATTA TGAAACGTAA ATTATAAGTT TCCTGAGGAT 2965
AAACATATAT ATCTCTATCT CTCATTGATA TCACATGAGT ATTAGATTAA GGGGAAGTAA 3025
TTCTTACGGA CATTCAGGCT GGTTTACAGT ATACTGTAGA ATATGTAATA GGAAAATAAG 3085
AATAGGAACG GACTTAGTCT ACAAATGCCC TAAATGTGAA AAGAAGTATA ACGCATTCTT 3145
CTGTGAAGCA GATGCTAGGG GATTAAAGAA AAAGTGCCCA TACTGTGGTA CTGAACTTGT 3205
CAGTGCAATT TAAGACTCAA ATAGAAGGTA AAAATATTTT TATACTGAAT AATGAGTTGT 3265
TTTACGCTGA TACGGATATA GTTATTCGAA ATCAAGATTT TATTAAGAAA CTCACCTTTA 3325
CACAATATAA TAAGATTGCC TATATTGACA TGGACATAGA AACGACAGAA TTTAAGATAT 3385
TAAGATTAGT AGTGTGTAAA ACTAGAATAA ATATTTATGT TTGCAACGTA ATTGGTAAAT 3445
TGAAAGAAAC TAATTTTGAA AA 3467
配列番号:4
配列の長さ:680
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
起源
生物:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC 33909株
配列
Met Ala Ser Pro Gly Ser Asn His Gly Tyr Asp Val Ile Asp His Ser
1 5 10 15
Arg Ile Asn Asp Glu Leu Gly Gly Glu Lys Glu Tyr Arg Arg Leu Ile
20 25 30
Glu Thr Ala His Thr Ile Gly Leu Gly Ile Ile Gln Asp Ile Val Pro
35 40 45
Asn His Met Ala Val Asn Ser Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp Val Leu
50 55 60
Lys Met Gly Lys Lys Ser Lys Tyr Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Pro
65 70 75 80
Glu Asp Asp Lys Ile Arg Leu Pro Ile Leu Gly Glu Asp Leu Asp Thr
85 90 95
Val Ile Ser Lys Gly Leu Leu Lys Ile Val Lys Asp Gly Asp Glu Tyr
100 105 110
Phe Leu Glu Tyr Phe Lys Trp Lys Leu Pro Leu Thr Glu Val Gly Asn
115 120 125
Asp Ile Tyr Asp Thr Leu Gln Lys Gln Asn Tyr Thr Leu Met Ser Trp
130 135 140
Lys Asn Pro Pro Ser Tyr Arg Arg Phe Phe Asp Val Asn Thr Leu Ile
145 150 155 160
Gly Val Asn Val Glu Lys Asp His Val Phe Gln Glu Ser His Ser Lys
165 170 175
Ile Leu Asp Leu Asp Val Asp Gly Tyr Arg Ile Asp His Ile Asp Gly
180 185 190
Leu Tyr Asp Pro Glu Lys Tyr Ile Asn Asp Leu Arg Ser Ile Ile Lys
195 200 205
Asn Lys Ile Ile Ile Val Glu Lys Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu
210 215 220
Lys Leu Asn Ser Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Phe Leu Asn Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Leu Leu Phe Asn Phe Asn Gln Glu Ile Met Asp Ser Ile Tyr Glu
245 250 255
Asn Phe Thr Ala Glu Lys Ile Ser Ile Ser Glu Ser Ile Lys Lys Ile
260 265 270
Lys Ala Gln Ile Ile Asp Glu Leu Phe Ser Tyr Glu Val Lys Arg Leu
275 280 285
Ala Ser Gln Leu Gly Ile Ser Tyr Asp Ile Leu Arg Asp Tyr Leu Ser
290 295 300
Cys Ile Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys
305 310 315 320
Asp Lys Thr Asn Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Arg Asn Pro Glu Ala
325 330 335
Tyr Thr Lys Leu Gln Gln Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys Ala Tyr
340 345 350
Glu Asp Thr Phe Leu Phe Arg Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Ile Asn Glu
355 360 365
Val Gly Ser Asp Leu Arg Tyr Tyr Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His
370 375 380
Val Phe Asn Gln Lys Arg Arg Gly Lys Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser
385 390 395 400
Thr His Asp Thr Lys Phe Ser Glu Asp Val Arg Met Lys Ile Ser Val
405 410 415
Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu Trp Lys Asn Lys Val Glu Glu Trp His
420 425 430
Ser Ile Ile Asn Pro Lys Val Ser Arg Asn Asp Glu Tyr Arg Tyr Tyr
435 440 445
Gln Val Leu Val Gly Ser Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Asp Phe Lys
450 455 460
Glu Arg Ile Lys Gln His Met Ile Lys Ser Val Arg Glu Ala Lys Ile
465 470 475 480
Asn Thr Ser Trp Arg Asn Gln Asn Lys Glu Tyr Glu Asn Arg Val Met
485 490 495
Glu Leu Val Glu Glu Thr Phe Thr Asn Lys Asp Phe Ile Lys Ser Phe
500 505 510
Met Lys Phe Glu Ser Lys Ile Arg Arg Ile Gly Met Ile Lys Ser Leu
515 520 525
Ser Leu Val Ala Leu Lys Ile Met Ser Ala Gly Ile Pro Asp Phe Tyr
530 535 540
Gln Gly Thr Glu Ile Trp Arg Tyr Leu Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg
545 550 555 560
Val Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu His Glu Ile Leu Glu Lys Ser Lys
565 570 575
Lys Phe Glu Lys Asn Met Leu Glu Ser Met Asp Asp Gly Arg Ile Lys
580 585 590
Met Tyr Leu Thr Tyr Lys Leu Leu Ser Leu Arg Lys Gln Leu Ala Glu
595 600 605
Asp Phe Leu Lys Gly Glu Tyr Lys Gly Leu Asp Leu Glu Glu Gly Leu
610 615 620
Cys Gly Phe Ile Arg Phe Asn Lys Ile Leu Val Ile Ile Lys Thr Lys
625 630 635 640
Gly Ser Val Asn Tyr Lys Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr Thr
645 650 655
Asp Val Leu Thr Gly Glu Glu Ile Lys Lys Glu Val Gln Ile Asn Glu
660 665 670
Leu Pro Arg Ile Leu Val Arg Met
675 680
配列番号:5
配列の長さ:2691
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
CTGCAGTAAC TAGCGCTATC GAAGACGTTA TAAAGAGAAG GATAAATAGA GTTCCAGTGA 60
GTCTAGAAGA CCTTTTTGAA TAAGGACTTT AATATCATTT AAATTTATTT TTTGGAACAT 120
GCAGAGGTAA ACCCATGAAT GTCATTTTCG ACGTATTAAA CGAGATCCAT GGGTTTTTTG 180
GTGCATTGTG GGCGGGAGCA GCTCTACTTA ACTACTTAGT TAAGCCTCAA GATAAGAGGC 240
AATTTGAGAG AATAGGGAAA TTCTTCATGA TAAACTCAGT CATTACAGTA ATAACTGGGA 300
TAATAATTTT CGCCTACATT TACCTAGCCC CTTATCAAGG GAATTTATTT CTAGTAGCGG 360
CAATTCTACG TTCAAGCCTT GACATTAGGT TAAGGGCCTT ACTAAACTTA ATAGGAGGAG 420
CGTTTGGGTT ATTGGCTTTT GGGGCAGGGA TAGTTATAAG CAATAGGATA AGGCTTATGG 480
TACGTGTTAA GGAAGGTGAC GCTACAATCC TAGAGTTGAG GAATAGTATT GCCAATTTAT 540
CTAAAATTAG TTTAATCTTC TTATTACTTT CCTTAGCCAT GATGATACTT GCTGGTTCCA 600
TAGCACAAGT TATAAGTTAG AGTTGAAAGA AAAATTTA ATG ACG TTT GCT TAT AAA 656
Met Thr Phe Ala Tyr Lys
0 1 5
ATA GAT GGA AAT GAG GTA ATC TTT ACC TTA TGG GCA CCT TAT CAA AAG 704
Ile Asp Gly Asn Glu Val Ile Phe Thr Leu Trp Ala Pro Tyr Gln Lys
10 15 20
AGC GTT AAA CTA AAG GTT CTA GAG AAG GGA CTT TAC GAA ATG GAA AGA 752
Ser Val Lys Leu Lys Val Leu Glu Lys Gly Leu Tyr Glu Met Glu Arg
25 30 35
GAT GAA AAA GGT TAC TTC ACC ATT ACC TTA AAC AAC GTA AAG GTT AGA 800
Asp Glu Lys Gly Tyr Phe Thr Ile Thr Leu Asn Asn Val Lys Val Arg
40 45 50
GAT AGG TAT AAA TAC GTT TTA GAT GAT GCT AGT GAA ATA CCA GAT CCA 848
Asp Arg Tyr Lys Tyr Val Leu Asp Asp Ala Ser Glu Ile Pro Asp Pro
55 60 65
GCA TCC AGA TAC CAA CCA GAA GGT GTA CAT GGG CCT TCA CAA ATT ATA 896
Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Glu Gly Val His Gly Pro Ser Gln Ile Ile
70 75 80 85
CAA GAA AGT AAA GAG TTC AAC AAC GAG ACT TTT CTG AAG AAA GAG GAC 944
Gln Glu Ser Lys Glu Phe Asn Asn Glu Thr Phe Leu Lys Lys Glu Asp
90 95 100
TTG ATA ATT TAT GAA ATA CAC GTG GGG ACT TTC ACT CCA GAG GGA ACG 992
Leu Ile Ile Tyr Glu Ile His Val Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr
105 110 115
TTT GAG GGA GTG ATA AGG AAA CTT GAC TAC TTA AAG GAT TTG GGA ATT 1040
Phe Glu Gly Val Ile Arg Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile
120 125 130
ACG GCA ATA GAG ATA ATG CCA ATA GCT CAA TTT CCT GGG AAA AGG GAT 1088
Thr Ala Ile Glu Ile Met Pro Ile Ala Gln Phe Pro Gly Lys Arg Asp
135 140 145
TGG GGT TAT GAT GGA GTT TAT TTA TAT GCA GTA CAG AAC TCT TAC GGA 1136
Trp Gly Tyr Asp Gly Val Tyr Leu Tyr Ala Val Gln Asn Ser Tyr Gly
150 155 160 165
GGG CCA GAA GGT TTT AGA AAG TTA GTT GAT GAA GCG CAC AAG AAA GGT 1184
Gly Pro Glu Gly Phe Arg Lys Leu Val Asp Glu Ala His Lys Lys Gly
170 175 180
TTA GGA GTT ATT TTA GAC GTA GTA TAC AAC CAC GTT GGA CCA GAG GGA 1232
Leu Gly Val Ile Leu Asp Val Val Tyr Asn His Val Gly Pro Glu Gly
185 190 195
AAC TAT ATG GTT AAA TTG GGG CCA TAT TTC TCA CAG AAA TAC AAA ACG 1280
Asn Tyr Met Val Lys Leu Gly Pro Tyr Phe Ser Gln Lys Tyr Lys Thr
200 205 210
CCA TGG GGA TTA ACC TTT AAC TTT GAC GAT GCT GAA AGC GAT GAG GTT 1328
Pro Trp Gly Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asp Ala Glu Ser Asp Glu Val
215 220 225
AGG AAG TTC ATC TTA GAA AAC GTT GAG TAC TGG ATT AAG GAA TAT AAC 1376
Arg Lys Phe Ile Leu Glu Asn Val Glu Tyr Trp Ile Lys Glu Tyr Asn
230 235 240 245
GTT GAT GGG TTT AGA TTA GAT GCG GTT CAT GCA ATT ATT GAC ACT TCT 1424
Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val His Ala Ile Ile Asp Thr Ser
250 255 260
CCT AAG CAC ATC TTG GAG GAA ATA GCT GAC GTT GTG CAT AAG TAT AAT 1472
Pro Lys His Ile Leu Glu Glu Ile Ala Asp Val Val His Lys Tyr Asn
265 270 275
AGG ATT GTC ATA GCC GAA AGT GAT TTA AAC GAT CCT AGA GTC GTT AAT 1520
Arg Ile Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asp Pro Arg Val Val Asn
280 285 290
CCC AAG GAA AAG TGT GGA TAT AAT ATT GAT GCT CAA TGG GTT GAC GAT 1568
Pro Lys Glu Lys Cys Gly Tyr Asn Ile Asp Ala Gln Trp Val Asp Asp
295 300 305
TTC CAT CAT TCT ATT CAC GCT TAC TTA ACT GGT GAG AGG CAA GGC TAT 1616
Phe His His Ser Ile His Ala Tyr Leu Thr Gly Glu Arg Gln Gly Tyr
310 315 320 325
TAT ACG GAT TTC GGT AAC CTT GAC GAT ATA GTT AAA TCG TAT AAG GAC 1664
Tyr Thr Asp Phe Gly Asn Leu Asp Asp Ile Val Lys Ser Tyr Lys Asp
330 335 340
GTT TTC GTA TAT GAT GGT AAG TAC TCC AAT TTT AGA AGA AAA ACT CAC 1712
Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys Tyr Ser Asn Phe Arg Arg Lys Thr His
345 350 355
GGA GAA CCA GTT GGT GAA CTA GAC GGA TGC AAT TTC GTA GTT TAT ATA 1760
Gly Glu Pro Val Gly Glu Leu Asp Gly Cys Asn Phe Val Val Tyr Ile
360 365 370
CAA AAT CAC GAT CAA GTC GGA AAT AGA GGC AAA GGT GAA AGA ATA ATT 1808
Gln Asn His Asp Gln Val Gly Asn Arg Gly Lys Gly Glu Arg Ile Ile
375 380 385
AAA TTA GTC GAT AGG GAA AGC TAC AAG ATC GCT GCA GCC CTT TAC CTT 1856
Lys Leu Val Asp Arg Glu Ser Tyr Lys Ile Ala Ala Ala Leu Tyr Leu
390 395 400 405
CTT TCC CCC TAT ATT CCA ATG ATT TTC ATG GGA GAG GAA TAC GGT GAG 1904
Leu Ser Pro Tyr Ile Pro Met Ile Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Glu
410 415 420
GAA AAT CCC TTT TAT TTC TTT TCT GAT TTT TCA GAT TCA AAA CTG ATA 1952
Glu Asn Pro Phe Tyr Phe Phe Ser Asp Phe Ser Asp Ser Lys Leu Ile
425 430 435
CAA GGT GTA AGG GAA GGG AGA AAA AAG GAA AAC GGG CAA GAT ACT GAC 2000
Gln Gly Val Arg Glu Gly Arg Lys Lys Glu Asn Gly Gln Asp Thr Asp
440 445 450
CCT CAA GAT GAA TCA ACT TTT AAC GCT TCC AAA CTG AGT TGG AAG ATT 2048
Pro Gln Asp Glu Ser Thr Phe Asn Ala Ser Lys Leu Ser Trp Lys Ile
455 460 465
GAC GAG GAA ATC TTT TCA TTT TAC AAG ATT TTA ATA AAA ATG AGA AAG 2096
Asp Glu Glu Ile Phe Ser Phe Tyr Lys Ile Leu Ile Lys Met Arg Lys
470 475 480 485
GAG TTG AGC ATA GCG TGT GAT AGG AGA GTA AAC GTC GTG AAT GGC GAA 2144
Glu Leu Ser Ile Ala Cys Asp Arg Arg Val Asn Val Val Asn Gly Glu
490 495 500
AAT TGG TTG ATC ATC AAG GGA AGA GAA TAC TTT TCA CTC TAC GTT TTC 2192
Asn Trp Leu Ile Ile Lys Gly Arg Glu Tyr Phe Ser Leu Tyr Val Phe
505 510 515
TCT AAA TCA TCT ATT GAA GTT AAG TAC AGT GGA ACT TTA CTT TTG TCC 2240
Ser Lys Ser Ser Ile Glu Val Lys Tyr Ser Gly Thr Leu Leu Leu Ser
520 525 530
TCA AAT AAT TCA TTC CCT CAG CAT ATT GAA GAA GGT AAA TAT GAG TTT 2288
Ser Asn Asn Ser Phe Pro Gln His Ile Glu Glu Gly Lys Tyr Glu Phe
535 540 545
GAT AAG GGA TTT GCT TTA TAT AAA CTT TAGGACA GGAGAGTTTA AAAATTTCTA 2342
Asp Lys Gly Phe Ala Leu Tyr Lys Leu
550 555
TGAATGATTA TACTTTAGAT GATGAGTAAA AGCAAGATCG ATGAGGAAGA GAAAAGGAGA 2402
AGAGAAGAAG TCAAAAAGTT AGTAATGCTC TTAGCAATGT TAAGATAATG TTTTTTTAAA 2462
CTCAAATAAT AATAAATACC ATCATGTCAA TATTCTTCAG AACTAGAGAT AGACCTTTAC 2522
GTCCCGGAGA TCCGTATCCA TTAGGTTCAA ATTGGATAGA AGATGAGGAT GGCGTAAATT 2582
TTTCCTTGTT CTCAGAGAAT GCAGACAAAG TGGAGTTGAT TCTTTATTCA CAAACAAATC 2642
AAAAGTATCC AAAGGAGATA ATAGAGGTTA AGAATAGAAC GGGGGATCC 2691
配列番号:6
配列の長さ:558
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Thr Phe Ala Tyr Lys Ile Asp Gly Asn Glu Val Ile Phe Thr Leu Trp
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Gln Lys Ser Val Lys Leu Lys Val Leu Glu Lys Gly Leu
20 25 30
Tyr Glu Met Glu Arg Asp Glu Lys Gly Tyr Phe Thr Ile Thr Leu Asn
35 40 45
Asn Val Lys Val Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr Val Leu Asp Asp Ala Ser
50 55 60
Glu Ile Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Glu Gly Val His Gly
65 70 75 80
Pro Ser Gln Ile Ile Gln Glu Ser Lys Glu Phe Asn Asn Glu Thr Phe
85 90 95
Leu Lys Lys Glu Asp Leu Ile Ile Tyr Glu Ile His Val Gly Thr Phe
100 105 110
Thr Pro Glu Gly Thr Phe Glu Gly Val Ile Arg Lys Leu Asp Tyr Leu
115 120 125
Lys Asp Leu Gly Ile Thr Ala Ile Glu Ile Met Pro Ile Ala Gln Phe
130 135 140
Pro Gly Lys Arg Asp Trp Gly Tyr Asp Gly Val Tyr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Gln Asn Ser Tyr Gly Gly Pro Glu Gly Phe Arg Lys Leu Val Asp Glu
165 170 175
Ala His Lys Lys Gly Leu Gly Val Ile Leu Asp Val Val Tyr Asn His
180 185 190
Val Gly Pro Glu Gly Asn Tyr Met Val Lys Leu Gly Pro Tyr Phe Ser
195 200 205
Gln Lys Tyr Lys Thr Pro Trp Gly Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asp Ala
210 215 220
Glu Ser Asp Glu Val Arg Lys Phe Ile Leu Glu Asn Val Glu Tyr Trp
225 230 235 240
Ile Lys Glu Tyr Asn Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val His Ala
245 250 255
Ile Ile Asp Thr Ser Pro Lys His Ile Leu Glu Glu Ile Ala Asp Val
260 265 270
Val His Lys Tyr Asn Arg Ile Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asp
275 280 285
Pro Arg Val Val Asn Pro Lys Glu Lys Cys Gly Tyr Asn Ile Asp Ala
290 295 300
Gln Trp Val Asp Asp Phe His His Ser Ile His Ala Tyr Leu Thr Gly
305 310 315 320
Glu Arg Gln Gly Tyr Tyr Thr Asp Phe Gly Asn Leu Asp Asp Ile Val
325 330 335
Lys Ser Tyr Lys Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys Tyr Ser Asn Phe
340 345 350
Arg Arg Lys Thr His Gly Glu Pro Val Gly Glu Leu Asp Gly Cys Asn
355 360 365
Phe Val Val Tyr Ile Gln Asn His Asp Gln Val Gly Asn Arg Gly Lys
370 375 380
Gly Glu Arg Ile Ile Lys Leu Val Asp Arg Glu Ser Tyr Lys Ile Ala
385 390 395 400
Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Ser Pro Tyr Ile Pro Met Ile Phe Met Gly
405 410 415
Glu Glu Tyr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Tyr Phe Phe Ser Asp Phe Ser
420 425 430
Asp Ser Lys Leu Ile Gln Gly Val Arg Glu Gly Arg Lys Lys Glu Asn
435 440 445
Gly Gln Asp Thr Asp Pro Gln Asp Glu Ser Thr Phe Asn Ala Ser Lys
450 455 460
Leu Ser Trp Lys Ile Asp Glu Glu Ile Phe Ser Phe Tyr Lys Ile Leu
465 470 475 480
Ile Lys Met Arg Lys Glu Leu Ser Ile Ala Cys Asp Arg Arg Val Asn
485 490 495
Val Val Asn Gly Glu Asn Trp Leu Ile Ile Lys Gly Arg Glu Tyr Phe
500 505 510
Ser Leu Tyr Val Phe Ser Lys Ser Ser Ile Glu Val Lys Tyr Ser Gly
515 520 525
Thr Leu Leu Leu Ser Ser Asn Asn Ser Phe Pro Gln His Ile Glu Glu
530 535 540
Gly Lys Tyr Glu Phe Asp Lys Gly Phe Ala Leu Tyr Lys Leu
545 550 555
配列番号:7
配列の長さ:3600
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
ATTCGTTTTG AGTCACTCGG CGTAGGTCTG TAGTCTTTCT TGGCGAGGGC TAATAAGTTG 60
AGATAATGCT TGCCAAGAAT CGAAGAAGGC GTCCTGCCCT GCATGAAATC GATTACCTCG 120
GCACTAACTC CGAGCTCCGC GAGTTTAGTA GTCACGAATT TGCGTACATA TTTCGGCGCT 180
ATCCCTTTCT CATGCAATAA ATTCTTCGCG TAGTTGTACG TTATATCAGT CTTAGCTATA 240
GACGAAATGT GAAAGACATA GAACACTTTC TTTGGCCCTC TAGTCCAGTT GAGCGTGTAT 300
ACGTAGAAGC CGTCCTCTTT CACGTTGTTC TTCTCGTCAT ACTCATTGAG AACCTTTACA 360
GCCTCCCTAA GCCTTATACC GCTCTCAAGG AGGAGCTTGA AGACTAGCTC TACCTCAATA 420
CCTCTAACAG CCTCCAACCA CCTCCCTATC TCGTCAGCTC CTGGAACCTT AAGATCAACA 480
CCAGACTTTT TCGTTTTCAG CTTTTTCCAT GCCTCAAGAT CCCCTTTCCA CTTGTAGAAC 540
TTCTTCCAGG CTAGGATAGA GTTCTTAGCA TTACTAGGGG GCTTCTTCAG ATAATTGATA 600
TACTGCCTGC AAGTTTCCTC ACTGGCCATT TTCAAACAAT ATTCATAAAA TTCAATTAAT 660
TCCTTTTCCG TGAGACCATT TTTGCCCTCC CTAGAAGTAA GGGAGTTTAG GGCAAATCCC 720
TTACTCTCTT CATCATTTGA AAGAGGGGTT TTAGGGGATT CCTCCCCTAA CCAGGGCTTT 780
GGCCCCTGGG ACCAGGGTTC GAGTCCCTGC CCGGCTACCT TTGAAAGGTT AGGGGGATAC 840
ACCCTAATAC CCCACTTCTA TCTTACAATT TCAGGTAAGT CTTTACTAGG TCAACTAAAG 900
CACCAACGTA AGTCTCCTTC GTCTTACCAC CTTGACTCTT CTTGATAAAG TAAACATAAT 960
ATCATCCATA GACTTACCTT ATTCTTATAT TACCATATGA TTTTATTATT TTGTATTTCT 1020
ATTAGATAAG TCCCACTCAT AGAACAAATG ATGGTTTTAA CTTATATACT AAATACTCTA 1080
ATAACTCAAC AATAATAAGA ATTTAATCAG TTCTGATAAG TATTTTCACT CGAAAACATT 1140
TAAATATATT AAGACATAAT TTCTATTTAA ACAGC ATG TTT TCG TTC GGT GGA AAT 1196
Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn
1 5
ATT GAA AAA AAT AAA GGT ATC TTT AAG TTA TGG GCA CCT TAT GTT AAT 1244
Ile Glu Lys Asn Lys Gly Ile Phe Lys Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn
10 15 20
AGT GTT AAG CTG AAG TTA AGC AAA AAA CTT ATT CCA ATG GAA AAA AAC 1292
Ser Val Lys Leu Lys Leu Ser Lys Lys Leu Ile Pro Met Glu Lys Asn
25 30 35
GAT GAG GGA TTT TTC GAA GTA GAA ATA GAC GAT ATC GAG GAA AAT TTA 1340
Asp Glu Gly Phe Phe Glu Val Glu Ile Asp Asp Ile Glu Glu Asn Leu
40 45 50 55
ACC TAT TCT TAT ATT ATA GAA GAT AAG AGA GAG ATA CCT GAT CCC GCA 1388
Thr Tyr Ser Tyr Ile Ile Glu Asp Lys Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala
60 65 70
TCA CGA TAT CAA CCT TTA GGA GTT CAT GAC AAA TCA CAA CTT ATA AGA 1436
Ser Arg Tyr Gln Pro Leu Gly Val His Asp Lys Ser Gln Leu Ile Arg
75 80 85
ACA GAT TAT CAG ATT CTT GAC CTT GGA AAA GTA AAA ATA GAA GAT CTA 1484
Thr Asp Tyr Gln Ile Leu Asp Leu Gly Lys Val Lys Ile Glu Asp Leu
90 95 100
ATA ATA TAT GAA CTC CAC GTT GGT ACT TTT TCC CAA GAA GGA AAT TTC 1532
Ile Ile Tyr Glu Leu His Val Gly Thr Phe Ser Gln Glu Gly Asn Phe
105 110 115
AAA GGA GTA ATA GAA AAG TTA GAT TAC CTC AAG GAT CTA GGA ATC ACA 1580
Lys Gly Val Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr
120 125 130 135
GGA ATT GAA CTG ATG CCT GTG GCA CAA TTT CCA GGG AAT AGA GAT TGG 1628
Gly Ile Glu Leu Met Pro Val Ala Gln Phe Pro Gly Asn Arg Asp Trp
140 145 150
GGA TAC GAT GGT GTT TTT CTA TAC GCA GTT CAA AAT ACT TAT GGC GGA 1676
Gly Tyr Asp Gly Val Phe Leu Tyr Ala Val Gln Asn Thr Tyr Gly Gly
155 160 165
CCA TGG GAA TTG GCT AAG CTA GTA AAC GAG GCA CAT AAA AGG GGA ATA 1724
Pro Trp Glu Leu Ala Lys Leu Val Asn Glu Ala His Lys Arg Gly Ile
170 175 180
GCC GTA ATT TTG GAT GTT GTA TAT AAT CAT ATA GGT CCT GAG GGA AAT 1772
Ala Val Ile Leu Asp Val Val Tyr Asn His Ile Gly Pro Glu Gly Asn
185 190 195
TAC CTT TTA GGA TTA GGT CCT TAT TTT TCA GAC AGA TAT AAA ACT CCA 1820
Tyr Leu Leu Gly Leu Gly Pro Tyr Phe Ser Asp Arg Tyr Lys Thr Pro
200 205 210 215
TGG GGA TTA ACA TTT AAT TTT GAT GAT AGG GGA TGT GAT CAA GTT AGA 1868
Trp Gly Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asp Arg Gly Cys Asp Gln Val Arg
220 225 230
AAA TTC ATT TTA GAA AAT GTC GAG TAT TGG TTT AAG ACC TTT AAA ATC 1916
Lys Phe Ile Leu Glu Asn Val Glu Tyr Trp Phe Lys Thr Phe Lys Ile
235 240 245
GAT GGT CTG AGA CTG GAT GCA GTT CAT GCA ATT TTT GAT AAT TCG CCT 1964
Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Ile Phe Asp Asn Ser Pro
250 255 260
AAG CAT ATC CTC CAA GAG ATA GCT GAA AAA GCC CAT CAA TTA GGA AAA 2012
Lys His Ile Leu Gln Glu Ile Ala Glu Lys Ala His Gln Leu Gly Lys
265 270 275
TTT GTT ATT GCT GAA AGT GAT TTA AAT GAT CCA AAA ATA GTA AAA GAT 2060
Phe Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asp Pro Lys Ile Val Lys Asp
280 285 290 295
GAT TGT GGA TAT AAA ATA GAT GCT CAA TGG GTT GAC GAT TTC CAC CAC 2108
Asp Cys Gly Tyr Lys Ile Asp Ala Gln Trp Val Asp Asp Phe His His
300 305 310
GCA GTT CAT GCA TTC ATA ACA AAA GAA AAA GAT TAT TAT TAC CAG GAT 2156
Ala Val His Ala Phe Ile Thr Lys Glu Lys Asp Tyr Tyr Tyr Gln Asp
315 320 325
TTT GGA AGG ATA GAA GAT ATA GAG AAA ACT TTT AAA GAT GTT TTT GTT 2204
Phe Gly Arg Ile Glu Asp Ile Glu Lys Thr Phe Lys Asp Val Phe Val
330 335 340
TAT GAT GGA AAG TAT TCT AGA TAC AGA GGA AGA ACT CAT GGT GCT CCT 2252
Tyr Asp Gly Lys Tyr Ser Arg Tyr Arg Gly Arg Thr His Gly Ala Pro
345 350 355
GTA GGT GAT CTT CCA CCA CGT AAA TTT GTA GTC TTC ATA CAA AAT CAC 2300
Val Gly Asp Leu Pro Pro Arg Lys Phe Val Val Phe Ile Gln Asn His
360 365 370 375
GAT CAA GTA GGA AAT AGA GGA AAT GGG GAA AGA CTT TCC ATA TTA ACC 2348
Asp Gln Val Gly Asn Arg Gly Asn Gly Glu Arg Leu Ser Ile Leu Thr
380 385 390
GAT AAA ACG ACA TAC CTT ATG GCA GCC ACA CTA TAT ATA CTC TCA CCG 2396
Asp Lys Thr Thr Tyr Leu Met Ala Ala Thr Leu Tyr Ile Leu Ser Pro
395 400 405
TAT ATA CCG CTA ATA TTT ATG GGC GAG GAA TAT TAT GAG ACG AAT CCT 2444
Tyr Ile Pro Leu Ile Phe Met Gly Glu Glu Tyr Tyr Glu Thr Asn Pro
410 415 420
TTT TTC TTC TTC TCT GAT TTC TCA GAT CCC GTA TTA ATT AAG GGT GTT 2492
Phe Phe Phe Phe Ser Asp Phe Ser Asp Pro Val Leu Ile Lys Gly Val
425 430 435
AGA GAA GGT AGA CTA AAG GAA AAT AAT CAA ATG ATA GAT CCA CAA TCT 2540
Arg Glu Gly Arg Leu Lys Glu Asn Asn Gln Met Ile Asp Pro Gln Ser
440 445 450 455
GAG GAA GCG TTC TTA AAG AGT AAA CTT TCA TGG AAA ATT GAT GAG GAA 2588
Glu Glu Ala Phe Leu Lys Ser Lys Leu Ser Trp Lys Ile Asp Glu Glu
460 465 470
GTT TTA GAT TAT TAT AAA CAA CTG ATA AAT ATC AGA AAG AGA TAT AAT 2636
Val Leu Asp Tyr Tyr Lys Gln Leu Ile Asn Ile Arg Lys Arg Tyr Asn
475 480 485
AAT TGT AAA AGG GTA AAG GAA GTT AGG AGA GAA GGG AAC TGT ATT ACT 2684
Asn Cys Lys Arg Val Lys Glu Val Arg Arg Glu Gly Asn Cys Ile Thr
490 495 500
TTG ATC ATG GAA AAA ATA GGA ATA ATT GCA TCG TTT GAT GAT ATT GTA 2732
Leu Ile Met Glu Lys Ile Gly Ile Ile Ala Ser Phe Asp Asp Ile Val
505 510 515
ATT AAT TCT AAA ATT ACA GGT AAT TTA CTT ATA GGC ATA GGA TTT CCG 2780
Ile Asn Ser Lys Ile Thr Gly Asn Leu Leu Ile Gly Ile Gly Phe Pro
520 525 530 535
AAA AAA TTG AAA AAA GAT GAA TTA ATT AAG GTT AAC AGA GGT GTT GGG 2828
Lys Lys Leu Lys Lys Asp Glu Leu Ile Lys Val Asn Arg Gly Val Gly
540 545 550
GTA TAT CAA TTA GAA TGAAAGATCG ACCATTAAAG CCTGGTGAAC CTTATCCTTT 2883
Val Tyr Gln Leu Glu
555
AGGGGCAACT TGGATAGAGG AAGAAGATGG AGTTAATTTT GTACTATTCT CTGAGAACGC 2943
CACAAAAGTA GAACTGTTAA CGTACTCTCA GACTAGACAA GATGAGCCAA AGGAAATAAT 3003
AGAACTTAGA CAGAGAACCG GAGATCTCTG GCATGTTTTT GTACCTGGTT TAAGACCAGG 3063
TCAGTTGTAT GGGTACAGGG TGTATGGTCC ATATAAACCA GAGGAAGGGT TAAGGTTTAA 3123
TCCTAATAAA GTACTGATAG ATCCTTATGC AAAAGCTATA AACGGATTAT TACTATGGGA 3183
TGATTCGGTC TTTGGATATA AAATTGGAGA TCAGAACCAG GATCTCAGTT TCGATGAGAG 3243
AAAAGACGAT AAATTTATAC CTAAAGGGGT CATAATAAAT CCTTATTTTG ATTGGGAGGA 3303
CGAGCATTTC TTCTTTAGAA GAAAGATACC TTTTAAGGAT AGTATAATTT ATGAGACACA 3363
TATAAAAGGA ATAACTAAAT TAAGGCAAGA TTTACCGGAG AACGTTAGAG GCACTTTTTT 3423
GGGTTTAGCA TCAGATACTA TGATTGATTA CCTAAAAGAT TTAGGAATTA CAACCGTTGA 3483
GATAATGCCT ATTCAGCAAT TTGTAGATGA GAGATTCATT GTCGATAAAG GGTTAAAGAA 3543
CTACTGGGGT TACAATCCGA TAAATTATTT CTCTCCTGAA TGTAGATACT CAAGCTC 3600
配列番号:8
配列の長さ:556
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn Ile Glu Lys Asn Lys Gly Ile Phe Lys
1 5 10 15
Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn Ser Val Lys Leu Lys Leu Ser Lys Lys
20 25 30
Leu Ile Pro Met Glu Lys Asn Asp Glu Gly Phe Phe Glu Val Glu Ile
35 40 45
Asp Asp Ile Glu Glu Asn Leu Thr Tyr Ser Tyr Ile Ile Glu Asp Lys
50 55 60
Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Leu Gly Val His
65 70 75 80
Asp Lys Ser Gln Leu Ile Arg Thr Asp Tyr Gln Ile Leu Asp Leu Gly
85 90 95
Lys Val Lys Ile Glu Asp Leu Ile Ile Tyr Glu Leu His Val Gly Thr
100 105 110
Phe Ser Gln Glu Gly Asn Phe Lys Gly Val Ile Glu Lys Leu Asp Tyr
115 120 125
Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Gly Ile Glu Leu Met Pro Val Ala Gln
130 135 140
Phe Pro Gly Asn Arg Asp Trp Gly Tyr Asp Gly Val Phe Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Gln Asn Thr Tyr Gly Gly Pro Trp Glu Leu Ala Lys Leu Val Asn
165 170 175
Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Ala Val Ile Leu Asp Val Val Tyr Asn
180 185 190
His Ile Gly Pro Glu Gly Asn Tyr Leu Leu Gly Leu Gly Pro Tyr Phe
195 200 205
Ser Asp Arg Tyr Lys Thr Pro Trp Gly Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asp
210 215 220
Arg Gly Cys Asp Gln Val Arg Lys Phe Ile Leu Glu Asn Val Glu Tyr
225 230 235 240
Trp Phe Lys Thr Phe Lys Ile Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His
245 250 255
Ala Ile Phe Asp Asn Ser Pro Lys His Ile Leu Gln Glu Ile Ala Glu
260 265 270
Lys Ala His Gln Leu Gly Lys Phe Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn
275 280 285
Asp Pro Lys Ile Val Lys Asp Asp Cys Gly Tyr Lys Ile Asp Ala Gln
290 295 300
Trp Val Asp Asp Phe His His Ala Val His Ala Phe Ile Thr Lys Glu
305 310 315 320
Lys Asp Tyr Tyr Tyr Gln Asp Phe Gly Arg Ile Glu Asp Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Phe Lys Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys Tyr Ser Arg Tyr Arg
340 345 350
Gly Arg Thr His Gly Ala Pro Val Gly Asp Leu Pro Pro Arg Lys Phe
355 360 365
Val Val Phe Ile Gln Asn His Asp Gln Val Gly Asn Arg Gly Asn Gly
370 375 380
Glu Arg Leu Ser Ile Leu Thr Asp Lys Thr Thr Tyr Leu Met Ala Ala
385 390 395 400
Thr Leu Tyr Ile Leu Ser Pro Tyr Ile Pro Leu Ile Phe Met Gly Glu
405 410 415
Glu Tyr Tyr Glu Thr Asn Pro Phe Phe Phe Phe Ser Asp Phe Ser Asp
420 425 430
Pro Val Leu Ile Lys Gly Val Arg Glu Gly Arg Leu Lys Glu Asn Asn
435 440 445
Gln Met Ile Asp Pro Gln Ser Glu Glu Ala Phe Leu Lys Ser Lys Leu
450 455 460
Ser Trp Lys Ile Asp Glu Glu Val Leu Asp Tyr Tyr Lys Gln Leu Ile
465 470 475 480
Asn Ile Arg Lys Arg Tyr Asn Asn Cys Lys Arg Val Lys Glu Val Arg
485 490 495
Arg Glu Gly Asn Cys Ile Thr Leu Ile Met Glu Lys Ile Gly Ile Ile
500 505 510
Ala Ser Phe Asp Asp Ile Val Ile Asn Ser Lys Ile Thr Gly Asn Leu
515 520 525
Leu Ile Gly Ile Gly Phe Pro Lys Lys Leu Lys Lys Asp Glu Leu Ile
530 535 540
Lys Val Asn Arg Gly Val Gly Val Tyr Gln Leu Glu
545 550 555
配列番号:9
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Val Ile Arg Glu Ala Lys
1 5
配列番号:10
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Ile Ser Ile Arg Gln Lys
1 5
配列番号:11
配列の長さ:5
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Ile Ile Tyr Val Glu
1 5
配列番号:12
配列の長さ:5
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Met Leu Tyr Val Lys
1 5
配列番号:13
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Ile Leu Ser Ile Asn Glu Lys
1 5
配列番号:14
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Val Val Ile Leu Thr Glu Lys
1 5
配列番号:15
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg Val Lys
1 5 10
配列番号:16
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys
1 5 10
配列番号:17
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Val Ala Val Leu Phe Ser Pro Ile Val
1 5 9
配列番号:18
配列の長さ:11
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Ile Asn Ile Asp Glu Leu Ile Ile Gln Ser Lys
1 5 10
配列番号:19
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Glu Leu Gly Val Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile
1 5 10
配列番号: 20
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Glu Val Phe Arg Glu Ser
1 5
配列番号:21
配列の長さ:4
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Tyr Phe Lys
1
配列番号:22
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys
1 5
配列番号:23
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys
1 5
配列番号:24
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Phe Glu Asn Phe Glu Lys
1 5
配列番号:25
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile
1 5
配列番号:26
配列の長さ:5
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Ile Ile Glu Asn
1 5
配列番号:27
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Asn Ile Glu Tyr Arg Gly
1 5
配列番号:28
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
YTCWCKRAAW ACYTCATC 18
配列番号:29
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
GATAAYATWG ARTAYAGRGG 20
配列番号:30
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Arg Asn Pro Glu Ala Tyr Thr Lys
1 5
配列番号:31
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Asp His Val Phe Gln Glu Ser His Ser
1 5
配列番号:32
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Ile Thr Leu Asn Ala Thr Ser Thr
1 5
配列番号:33
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Ile Ile Ile Val Glu Lys
1 5
配列番号:34
配列の長さ:11
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Leu Gln Gln Tyr Met Pro Ala Val Tyr Ala Lys
1 5 10
配列番号:35
配列の長さ:5
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Asn Met Leu Glu Ser
1 5
配列番号:36
配列の長さ:13
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Lys Ile Ser Pro Asp Gln Phe His Val Phe Asn Gln Lys
1 5 10
配列番号:37
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Gln Leu Ala Glu Asp Phe Leu Lys
1 5
配列番号:38
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Lys Ile Leu Gly Phe Gln Glu Glu Leu Lys
1 5 10
配列番号:39
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Ile Ser Val Leu Ser Glu Phe Pro Glu Glu
1 5 10
配列番号:40
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Leu Lys Leu Glu Glu Gly Ala Ile Tyr
1 5
配列番号:41
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Glu Val Gln Ile Asn Glu Leu Pro
1 5
配列番号:42
配列の長さ:5
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Asp His Ser Arg Ile
1 5
配列番号:43
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Asp Leu Arg Tyr Tyr Lys
1 5
配列番号:44
配列の長さ:14
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Asp Val Tyr Arg Thr Tyr Ala Asn Gln Ile Val Lys Glu Cys
1 5 10
配列番号:45
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:N端フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Thr Phe Ala Tyr Lys Ile Asp Gly Asn Glu
1 5 10
配列番号:46
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Leu Gly Pro Tyr Phe Ser Gln
1 5
配列番号:47
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly
1 5
配列番号:48
配列の長さ:19
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物:Sulfolobus solfataricus
株名:KM1
配列
Tyr Asn Arg Ile Val Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asp Pro Arg Val
1 5 10 15
Val Asn Pro
配列番号:49
配列の長さ:5
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Leu Asp Tyr Leu Lys
1 5
配列番号:50
配列の長さ:17
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Lys Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
His
17
配列番号:51
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Lys Asp Val Phe Val Tyr Asp Gly Lys
1 5
配列番号:52
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
His Ile Leu Gln Glu Ile Ala Glu Lys
1 5
配列番号:53
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Lys Leu Trp Ala Pro Tyr Val Asn Ser Val
1 5 10
配列番号:54
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Met Phe Ser Phe Gly Gly Asn
1 5
配列番号:55
配列の長さ:14
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Asp Tyr Try Tyr Gln Asp Phe Gly Arg Ile Glu Asp Ile Glu
1 5 10
配列番号:56
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源:Sulfolobus acidocaldarius
株名:ATCC33909
配列
Lys Ile Asp Ala Gln Trp Val
1 5
配列番号:57
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
AGCWAGKAGM TAYCARCC 18
配列番号:58
配列の長さ:24
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
YTTHCCATCR TAWACRAAWA CATC 24
Claims (27)
- 下記新規アミラーゼと、下記新規トランスフェラーゼとを組み合わせて用いることを特徴とするα,α−トレハロースの製造法:
上記新規アミラーゼは、
配列番号49〜56から選ばれる1つ以上のアミノ酸配列を有する Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株から得られる、少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成される3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖及び/又は2糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼであって、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が61,000〜64,000であり、且つ、
下記の理化学的性質を有する:
(1) 至適pH:5.0〜5.5
(2) 至適温度:60〜80℃
(3) 安定pH:4.0〜13.0
(4) 温度安定性:80℃で6時間の処理により100%残存;
および
上記新規トランスフェラーゼは、
配列番号30〜44から選ばれる1つ以上のアミノ酸配列を有する Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株から得られる、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が74000〜76000であり、且つ、
下記の理化学的性質を有する:
(1) 至適pH:4.5〜5.5
(2) 至適温度:70〜80℃
(3) 安定pH:4.0〜10.0
(4) 温度安定性:80℃で6時間の処理により90%以上残存。 - 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼを60〜80℃で作用させる、請求項1に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼの反応液中の濃度がそれぞれ1.5Units/ml及び0.1Unit/ml 以上である、請求項1或いは2に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼの反応液中の濃度がそれぞれ1.5Units/ml及び1Unit/ml 以上であり、かつアミラーゼ対トランスフェラーゼの濃度比が0.075〜100である、請求項1或いは2に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 該アミラーゼ及び該トランスフェラーゼの反応液中の濃度がそれぞれ15Units/ml及び1Unit/ml 以上であり、かつアミラーゼ対トランスフェラーゼの濃度比が3〜40である、請求項4に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質として用いる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- デンプン又はデンプン分解物を基質として用いる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- デンプン分解物が酸分解或いは酵素分解によって製造されるデンプン分解物である、請求項7に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- デンプン分解物が枝切り酵素を用いて得られるものである、請求項8に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 枝切り酵素がプルラナーゼ或いはイソアミラーゼである、請求項9に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- すべてのグルコース残基がα−1,4結合であるマルトオリゴ糖を各単独又はそれらの混合物として基質に用いる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 更に枝切り酵素を組み合わせて用いる、請求項1或いは2に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 枝切り酵素がプルラナーゼ或いはイソアミラーゼである、請求項12に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- α,α−トレハロースの製造のいずれかの段階でプルラナーゼ或いはイソアミラーゼを1回以上組み合わせて用いる、請求項13に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- α,α−トレハロースの製造の初期段階でプルラナーゼ或いはイソアミラーゼを1回以上組み合わせて用いる、請求項14に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- デンプン又はデンプン分解物を基質として用いる、請求項12〜15のいずれか一項に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- デンプン分解物が酸分解或いは酵素分解によって製造されるデンプン分解物である、請求項16に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- デンプン分解物が枝切り酵素を用いて得られるものである、請求項17に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- 枝切り酵素がプルラナーゼ或いはイソアミラーゼである、請求項18に記載のα,α−トレハロースの製造法。
- α,α‐トレハロースの製造法であって、下記新規トランスフェラーゼまたは下記組換え新規トランスフェラーゼ、および
下記組換え新規アミラーゼとを、
少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖と接触させる工程を含んでなる、上記方法:
上記トランスフェラーゼは、
配列番号30〜44から選ばれる1つ以上のアミノ酸配列を有する Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株から得られる、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼであって、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が74000〜76000であり、且つ、
下記の理化学的性質を有する:
(1) 至適pH:4.5〜5.5
(2) 至適温度:70〜80℃
(3) 安定pH:4.0〜10.0
(4) 温度安定性:80℃で6時間の処理により90%以上残存;
上記組換え新規トランスフェラーゼは、
配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列またはその配列においていくつかのアミノ酸の挿入、置換または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって新規トランスフェラーゼ活性を依然として保持する配列をコードするDNA配列を含んでなる組換えDNA分子によって形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物中に組換え新規トランスフェラーゼを生成させ、これを採取して得られた組換え新規トランスフェラーゼである;
および、
上記組換え新規アミラーゼは、
配列番号6または配列番号8に示されるアミノ酸配列またはその配列においていくつかのアミノ酸の挿入、置換または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって、少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成される3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖及び/又は2糖を遊離する新規アミラーゼ活性を依然として保持する配列をコードするDNA配列を含んでなる組換えDNA分子によって形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物中に組換え新規アミラーゼを生成させ、これを採取して得られた組換え新規アミラーゼである。 - α,α‐トレハロースの製造法であって、
下記組換え新規トランスフェラーゼ、および
下記新規アミラーゼまたは下記組換え新規アミラーゼとを、
少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖と接触させる工程を含んでなる、上記方法:
上記組換え新規トランスフェラーゼは、
配列番号2または配列番号4に示されるアミノ酸配列またはその配列においていくつかのアミノ酸の挿入、置換または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって、少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα−1,4結合である3糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−1,4結合をα−1,α−1結合に転移させる新規トランスフェラーゼ活性を依然として保持する配列をコードするDNA配列を含んでなる組換えDNA分子によって形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物中に組換え新規トランスフェラーゼを生成させ、これを採取して得られた組換え新規トランスフェラーゼである;
上記新規アミラーゼは、
配列番号49〜56から選ばれる1つ以上のアミノ酸配列を有する Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909株から得られる、少なくとも還元末端から3つ以上の糖がグルコース単位で構成される3糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖及び/又は2糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼであって、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が61,000〜64,000であり、且つ、
下記の理化学的性質を有する:
(1) 至適pH:5.0〜5.5
(2) 至適温度:60〜80℃
(3) 安定pH:4.0〜13.0
(4) 温度安定性:80℃で6時間の処理により100%残存;
および、
上記組換え新規アミラーゼは、
配列番号6または配列番号8に示されるアミノ酸配列またはその配列においていくつかのアミノ酸の挿入、置換または欠失、若しくは両末端への付加がなされたものであって新規アミラーゼ活性を依然として保持する配列をコードするDNA配列を含んでなる組換えDNA分子によって形質転換された宿主細胞を培養し、その培養物中に組換え新規アミラーゼを生成させ、これを採取して得られた組換え新規アミラーゼである。 - 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖がデンプンまたはデンプン分解物である、請求項20または21に記載の方法。
- デンプン分解物が、デンプンを酸分解、または酵素分解することによって製造されたものである、請求項22に記載の方法。
- デンプン分解物が、デンプンの枝切り酵素による分解産物である、請求項22に記載の方法。
- 枝切り酵素がプルラナーゼまたはイソアミラーゼである、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも還元末端から3つ以上のグルコース残基がα‐1,4結合である3糖以上の糖が、全てのグルコース残基がα‐1,4結合であるマルトオリゴ糖の単独または混合物である、請求項20または21に記載の方法。
- 50〜85℃の温度で実施される、請求項20〜26のいずれか一項に記載の方法。
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