CN102533701B

CN102533701B - 一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法

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Publication number: CN102533701B
Application number: CN201210035298.0A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈晟; 段绪果; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-02-16
Filing date: 2012-02-16
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2032-02-16
Also published as: CN102533701A

Abstract

本发明公开了一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法，属于发酵工程技术领域。本发明以重组大肠杆菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)为生产菌株，在工业级发酵培养基中连续流加甘油进行分批补料发酵，发酵后期通过添加Tween 80来促进活性蛋白聚集体解聚提高酶的分泌，发酵35小时，胞外酶活可达386U/mL。采取本策略进行发酵实现了酶的高效胞外表达，大幅提高了生产强度。由于酶分泌到培养基中，菌体经过简单的过滤就可得到酶液，工艺简单易行，减少了后续提取成本，适合工业化生产。

Description

一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法

技术领域

本发明涉及一种淀粉脱支酶的发酵生产方法，特别是一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高重组淀粉脱支酶胞外分泌的发酵生产方法。

背景技术

淀粉脱支酶(E.C.3.2.1.41)是一类能够水解支链淀粉、α-极限糊精等分子中α-1，6葡萄糖苷键的淀粉水解酶。淀粉脱支酶通常和其它淀粉酶复配用于生产葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品。淀粉脱支酶可以切断淀粉中的分支点，加速后续酶的反应，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。目前能够在最适温度和最适pH上同时实现与糖化酶进行较好配合的商品化淀粉脱支酶主要是美国杰能科公司的Optimax L-1000。我国虽然对淀粉脱支酶进行了大量的研究，但是还没有实现该酶的工业化生产，还需要依赖进口。

近年来国内外学者把淀粉脱支酶的开发研究作为非常重要的研究主题。Bunzo Mikami等对来源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脱支酶蛋白晶体结构进行解析，发现该酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)₈桶状结构。近年来国外学者从极端嗜热微生物中分离出具有可以耐受接近100℃高温的淀粉脱支酶，但是这些酶往往只有在pH 6.0以上才具有较高的活性。R Koch等从Fervidobacterium pennavorans中分离到最适pH在4.5到5.0，而且能够在70℃条件下具有较高稳定性的淀粉脱支酶。国内主要研究了产淀粉脱支酶野生菌的筛选鉴定、重组菌构建、发酵条件优化以及在淀粉原料酶解中的应用。唐宝英等人从土壤中分离出一株产淀粉脱支酶芽孢杆菌，通过诱变和产酶条件优化，酶活从1.6U/mL提高到8.8U/mL，该酶最适反应温度和pH分别为75℃和4.6，在55℃反应条件下，在pH4.0-8.0范围内活性稳定。张明炎等将来源于地衣芽孢杆菌的淀粉脱支酶编码基因克隆大肠杆菌中进行表达，摇瓶发酵产酶最高达到6.5U/mL。苏喆等实现了来源于Thermotoga maritima的淀粉脱支酶编码基因在枯草芽孢杆菌中的成功表达，该酶最适温度90℃，最适pH 6.0，发酵酶活可达89.1U/mL。但是这些菌株的产酶水平仍然较低，生产成本高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法，以解决现有发酵工艺中胞外酶活较低、生产成本高、无法实现工业化生产的问题。为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

(1)重组菌构建

根据NCBI上登录的pulB的基因序列(Genbank号JN872757.1)，采用化学全合成方法合成淀粉脱支酶基因序列pulB。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有T7启动子。将pET20b(+)质粒和含有pulB基因的质粒分别进行Nco I和HindIII双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有100mg/L氨苄青霉素液体的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒pulB/pET20b(+)。

将质粒pulB/pET20b(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上，37℃培养8h，命名为pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)。挑单菌落至液体LB中，37℃培养过夜，保存甘油管。

(2)种子制备

将-80℃甘油管保存的菌株接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度37℃，初始pH值7.10，培养时间10小时。

(3)发酵工艺

将活化后的种子培养液接种入发酵培养基中，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持20-30％，控制温度为30±1℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0±0.5，培养5-6小时；

待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料液使溶氧维持在20-30％，温度维持在30±1℃，流加氨水控制pH 7.0±0.5，当菌体OD₆₀₀达到15-30时补加0.75-1.5％(m/V)的甘氨酸；

继续培养至菌体吸光度OD₆₀₀达到45-60时，降温至23-30℃，通过补加浓度为200g/L乳糖溶液，使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L。同时溶氧控制在20-30％，控制pH 7.0±0.5，诱导15小时左右，添加0.1-1.0％浓度的Tween 80，继续发酵1-10小时。

所述种子培养基的组成为：工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH 7.10，种子培养基还可以添加100mg/L氨苄青霉素。

所述发酵培养基的组成为：甘油6g/L，工业级蛋白胨12g/L，工业级酵母粉24g/L，KH₂PO₄2.31g/L，K₂HPO₄3H₂O 16.43g/L，微量元素液10mL/L，发酵培养基还可以添加100mg/L氨苄青霉素。

所述微量元素液为：FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L，CuSO₄·5H₂O 1.0g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5g/L，Na₂B₄O₇·10H₂O，0.23g/L，CaCl₂ 2.0g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.1g/L。

所述补料液为：甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。

所述甘油补料液质量分数为50％(500g/L)；甘油含量的测定方法采用HPLC：ZorbaxExtend-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱温35℃，进样量：10μL，差示折光检测器温度：35℃，流速：1.0mL/min，流动相：纯水；发酵培养4小时后，每隔1小时，对发酵液中甘油浓度进行一次测定，根据测定结果加入一定体积的补料液，使发酵液中甘油浓度维持在2-5g/L。

所述发酵液中乳糖浓度的测定方法参见GB/T 5413.5-1997；每隔1小时，对发酵液中乳糖浓度进行测定，根据结果加入一定体积的乳糖诱导液，使发酵液中乳糖浓度维持在4-6g/L。

本发明采用添加Tween 80结合其它发酵控制工业(如：分段控温发酵工艺、恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵控制工艺、诱导控制工艺)，促进重组大肠杆菌活性蛋白聚集体解聚，实现了胞外高效发酵生产淀粉脱支酶，发酵结束后胞外重组淀粉脱支酶酶活为386U/mL。由于淀粉脱支酶分泌到培养基中，菌体经过简单的过滤就可得到酶液，工艺简单易行，减少了后续提取成本，适合工业化生产。

具体实施方式

实施例1

具体过程如下：以构建的重组大肠杆菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)为生产菌种。

1、种子培养：将-80℃甘油管保存的菌种接入种子培养基(工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH 7.10)中，使用恒温摇床进行培养：转速200rpm/min，温度37℃，培养8小时。

2、发酵产酶：

分批发酵阶段：将种子液以8％接种量接入发酵培养基(甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/L)，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30％，控制温度为30℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0，培养时间6个小时；

补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌体以0.2h^-1的比生长速率进行生长，控制温度30℃，溶氧维持在30％，当菌体OD₆₀₀达到15，采用一次性添加的方式，加入0.75％甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0；

诱导培养阶段：当菌体OD₆₀₀达到50时，将温度降为30℃，溶氧维持在30％，连续补加0.3g·L^-1·h^-1乳糖，每5h降低10％的乳糖流速，通过补加浓度为200g/L乳糖溶液，使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L。同时溶氧控制在20-30％，控制pH 7.0±0.5，诱导20小时左右。

发酵培养结束后，离心获得菌体和胞外上清液，菌体经过超声破碎后离心，得到超声破碎上清和超声破碎沉淀。超声破碎沉淀用0.1M pH4.5醋酸buffer悬浮。然后分别测定胞外上清液、超声破碎上清和超声破碎沉淀悬浮液的淀粉脱支酶活力。胞外上清酶活为15.5U/mL，超声破碎上清酶活为98U/mL，超声破碎沉淀悬浮液酶活为393U/mL。

结果表明，胞外酶活较低，而超声破碎沉淀中含有大量具有淀粉脱支酶活性的重组蛋白，经过分析发现这些蛋白是具有淀粉脱支酶活性的蛋白聚集体。

实施例2

具体过程如下：以本实验室构建的重组大肠杆菌ompA-pulA/pET24a/BL21(DE3)为生产菌种。

1、种子培养：将-80℃甘油管保存的菌种接入种子培养基(工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，100mg/L氨苄青霉素，pH 7.10)中，使用恒温摇床进行培养：转速200rpm/min，温度37℃，培养8小时。

2、发酵产酶：

分批发酵阶段：将种子液以8％接种量接入发酵培养基(甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/L，氨苄青霉素100mg/L)，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30％，控制温度为30℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0，培养时间6个小时；

补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌体以02h^-1的比生长速率进行生长，控制温度30℃，溶氧维持在30％，当菌体OD₆₀₀达到15，采用一次性添加的方式，加入0.75％甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0；

诱导培养阶段：当菌体OD₆₀₀达到50时，将温度降为25℃，溶氧维持在30％，连续补加0.3g·L^-1·h^-1乳糖，每5h降低10％的乳糖流速，通过补加浓度为200g/L乳糖溶液，使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L。同时溶氧控制在20-30％，控制pH 7.0±0.5，诱导15小时左右，添加0.5％浓度的Tween 80，继续发酵5小时。

发酵培养结束后，离心获得菌体和胞外上清液，菌体经过超声破碎后离心，得到超声破碎上清和超声破碎沉淀，沉淀用0.1M pH4.5醋酸buffer悬浮。分别测定胞外上清液、超声破碎上清和超声破碎沉淀悬浮液的淀粉脱支酶活力。胞外上清酶活为386U/mL，超声破碎上清酶活为82U/mL，超声破碎沉淀悬浮液酶活为51U/mL。

结果表明，Tween80的添加促进了胞内活性蛋白聚集体的解聚，提高了淀粉脱支酶的胞外分泌效率。

Claims

1.一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法，其特征在于以含有重组淀粉脱支酶编码基因的大肠杆菌为生产菌株，发酵工艺如下：

将活化后的种子培养液接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持20-30％，控制温度为25-37℃，流加氨水控制pH7.0±0.5，培养5-6小时；

待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料液使溶氧维持在20-30％，温度维持在25-37℃，流加氨水控制pH7.0±0.5，当菌体OD600达到15-30时补加0.75-1.5％(m/V)的甘氨酸；

继续培养至菌体吸光度OD600达到45-60时，降温至23-30℃，通过补加乳糖溶液，使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L；同时溶氧控制在20-30％，控制pH7.0±0.5，诱导15小时，添加0.5％吐温80后再继续发酵5小时，所述吐温80的添加量为5g/L；所述淀粉脱支酶编码基因编码序列如Genbank号JN872757.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特在在于菌体吸光度OD600达到45-60时，降温至25℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子活化用培养基的组成为：工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH7.10。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为：甘油6g/L，工业级蛋白胨12g/L，工业级酵母粉24g/L，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO4 3H2O16.43g/L，微量元素液10mL/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述种子培养基中还含有氨苄青霉素，浓度为100mg/L。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中还含有氨苄青霉素浓度为100mg/L。