CN113025590A

CN113025590A - 一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法及其应用

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Publication number: CN113025590A
Application number: CN201911341391.2A
Authority: CN
Inventors: 李梦娇; 石艳丽; 温朝; 王冠凤; 郭学平
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN113025590B

Abstract

本发明公开了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法及其应用，该方法优化了含CGTase基因的重组大肠杆菌的发酵培养过程，在发酵培养的过程中添加甘氨酸、Ca²⁺、β‑环糊精、牛磺酸和乳糖五种成分，提高了膜通透性，抑制了包涵体的形成，有效促进了环糊精葡萄糖基转移酶蛋白的异源分泌表达，提高了环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力，进一步提高了该酶对线性底物的转化率，从而提高了以麦芽糊精等线性底物生产AA‑2G的产量，更加有利于AA‑2G的工业化生产。

Description

一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法，属于酶工程和培养基技术领域。

背景技术

维生素C葡萄糖苷，中文名2-O-α-D吡喃葡萄糖基抗坏血酸（AA-2G），是维生素C和淀粉类物质经糖基转移酶作用的产物，由日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现。维生素C葡萄糖苷为维生素C的糖类衍生物，主要作为美白添加剂应用于化妆品中，并且具有优良的稳定性和抗氧化性，是较好的L-抗坏血酸替代品。

目前，应用于化妆品的AA-2G大部分由日本林原公司提供，具有市场垄断地位。AA-2G的价格昂贵，大约是维生素C的100多倍。因此优化适合生产AA-2G的糖基转移酶活性对于推动我国AA-2G的工业化生产具有重要的意义。

最具工业化前景、用于生产AA-2G的糖基转移酶为环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）。CGTase为α-淀粉酶家族的主要成员，作为一种多功能酶，主要催化四种反应，包括三种转糖基反应-环化反应、歧化反应、偶合反应以及一种水解反应。环化反应作为分子内转糖基反应，其原理主要是将线状麦芽低聚糖的非还原末端与同一分子内的还原性末端结合生成环糊精；歧化反应的原理主要是将线状麦芽低聚糖断裂，其中一部分转移至另一线状受体上；偶合反应作为环化反应的逆反应，其原理为断裂环糊精的环状结构并使之与线状低聚糖结合；水解反应主要是将线状低聚糖分子与水分子结合；其中歧化反应占据主导地位。CGTase催化合成AA-2G的机理主要是利用偶合和歧化两种特异性转糖苷反应将糖基供体上的葡萄糖基连接到维生素C的C-2上。目前常用的糖基供体主要有α-环糊精、β-环糊精、麦芽糊精、可溶性淀粉、麦芽糖等，环糊精合成AA-2G的转化率较高，但α-环糊精价格昂贵、β-环糊精难溶于水，所以从生产成本考虑，两者均不适于大规模生产AA-2G；而麦芽糊精等线性底物合成AA-2G的转化率低，线状底物主要是通过CGTase催化歧化反应合成AA-2G。因此提高CGTase的歧化活力对AA-2G的工业化生产具有重要意义。

大肠杆菌具有遗传背景清楚、生长速度快和表达量高等优点，是目前基因表达技术中应用最广泛的表达系统。然而，由于大肠杆菌过高的表达水平以及缺乏真核生物的蛋白加工体系，常常容易导致错误折叠的蛋白聚集形成包涵体，产生没有活性的酶；且大肠杆菌具有双膜结构-内膜和外膜，外膜包含脂多糖，脂多糖通常被认为是可以引起人类和其他哺乳动物发热的一种内毒素。常用的促进蛋白可溶性表达的方法有降低蛋白合成速度和优化培养条件，如李兆丰2009年发表的博士论文“软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析”一文中提出的提高CGTase胞外酶活的方法为先低温诱导后高温分泌以及在发酵培养基中添加150 mM甘氨酸和20 mM Ca²⁺，虽然提高了CGTase胞外酶活，但较多的Ca²⁺稳定外膜的脂多糖，对后续内毒素的去除不利。如王蕾2018年发表的博士论文“环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性分子改造及发酵制备研究”一文中提出乳糖作为诱导剂能够诱导CGTase在重组大肠杆菌中的表达；环糊精在蛋白质复性再折叠过程中，可与蛋白肽链中侧链疏水的氨基酸特别是芳香族氨基酸形成可逆的包埋复合物，从而抑制因疏水聚集而介导的蛋白聚集体或包涵体的生成，使更多的蛋白肽链折叠成有活性的蛋白。

牛磺酸是由哺乳动物的胰腺通过转化半胱氨酸产生的天然氨基磺酸。其具有调节细胞中钙离子的性质，因此在眼用组合物中添加牛磺酸可预防黄斑变性。牛磺酸还能够维持细胞内外渗透压平衡、保护细胞膜。目前，未见牛磺酸能提高CGTase歧化活力的相关报道。

发明内容

针对大肠杆菌中环糊精葡萄糖基转移酶易形成包涵体、不易分泌表达的不足，本发明提供了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法，该方法对含编码环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组大肠杆菌的发酵过程进行优化，向发酵培养基中加入甘氨酸、Ca²⁺、β-环糊精、牛磺酸和乳糖，所得环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力明显提高。

目前，生产环糊精葡萄糖基转移酶的常用方法是构建含有该酶的重组大肠杆菌，然后对该重组大肠杆菌进行发酵培养，使重组大肠杆菌分泌表达环糊精葡萄糖基转移酶。本发明对重组大肠杆菌分泌表达环糊精葡萄糖基转移酶的发酵过程进行优化，在发酵的过程中加入甘氨酸、Ca²⁺、β-环糊精、牛磺酸和乳糖，以克服环糊精葡萄糖基转移酶易形成包涵体、不易分泌表达的不足，提高最终得到的环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力。本发明具体技术方案如下：

一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法，该方法是：在环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中进行异源表达的发酵过程中，向发酵培养基中添加甘氨酸、Ca²⁺、β-环糊精、牛磺酸和乳糖。通过添加这些成分，降低包涵体的形成，提高环糊精葡萄糖基转移酶的分泌表达量，提高酶的歧化活力。

进一步的，本发明通过上述5种成分提高了环糊精葡萄糖基转移酶在重组大肠杆菌中的分泌表达，尤其是目前未见牛磺酸有此作用的公开，本发明属于首创。甘氨酸、Ca²⁺、β-环糊精、牛磺酸和乳糖的加入时机对酶的歧化活力有一定影响。经试验验证，当β-环糊精和牛磺酸在发酵开始时加入（即β-环糊精和牛磺酸加在最初的发酵培养基中）、而甘氨酸、Ca²⁺和乳糖在发酵中后期加入时，所得酶的歧化活力更高。

优选的，当β-环糊精和牛磺酸在发酵开始时加入（即β-环糊精和牛磺酸加在最初的发酵培养基中）、而甘氨酸、Ca²⁺和乳糖在菌体培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时加入时，所得酶的歧化活力更高。

进一步的，甘氨酸在发酵体系中的浓度为100 mmol/L-300 mmol/L，优选为200mmol/L。

进一步的，Ca²⁺在发酵体系中的浓度为5 mmol/L -15 mmol/L，优选为5 mmol/L-10mmol/L，最优选为10 mmol/L。Ca²⁺可以由氯化钙、硝酸钙等可溶性钙盐提供。与已有报道相比，本发明降低了发酵体系中Ca²⁺的浓度，降低了所得环糊精葡萄糖基转移酶中脂多糖的含量。

进一步的，β-环糊精在发酵体系中的浓度为5 mmol/L -20 mmol/L，优选为5mmol/L -10 mmol/L，更优选为10 mmol/L。

进一步的，牛磺酸在发酵体系中的浓度为0. 8 mmol/L -1.1 mmol/L，优选为1mmol/L。

进一步的，乳糖在发酵体系中的浓度为5 mmol/L -30 mmol/L，优选为15 mmol/L。

进一步的，本发明所用发酵培养基为TB培养基，培养基包括以下有效成分：胰蛋白胨10-15g/L、酵母粉20-25 g/L、甘油3-6 g/L、KH₂PO₄ 2-5 g/L、K₂HPO₄.3H₂O 15-20 g/L。在发酵初期，按照上述浓度向该培养基中加入β-环糊精和牛磺酸，然后进行发酵，发酵至OD₆₀₀为0.4-0.6时按照上述浓度再加入甘氨酸、Ca²⁺和乳糖，直至发酵结束。

进一步的，在发酵培养基中还含有90-110 μg/mL的氨苄青霉素，以抑制杂菌的生长。

进一步的，本发明所述大肠杆菌为含编码环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组大肠杆菌。所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因与GenBank数据库中的Bacillus circulans 251环糊精葡萄糖基转移酶一致（登录号为X78145.1）。本领域技术人员可以根据现有技术中公开的基因工程的手段，构建该重组大肠杆菌。本发明提供了一种具体的含编码环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组大肠杆菌的构建方法：

（1）以来源于环状芽孢杆菌（Bacillus circulans Jordan）的环糊精葡萄糖基转移酶核苷酸序列为基础，设计扩增引物，以环状芽孢杆菌（Bacillus circulans Jordan）基因组为模板进行基因扩增，构建含CGTase基因的质粒载体；

（2）将含CGTase基因的质粒载体转化进宿主细胞中；

（3）挑选阳性克隆，即为重组大肠杆菌。

进一步的，上述重组大肠杆菌的构建方法中，所用环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans Jordan）可以从ATCC微生物菌种保藏中心购买得到。

进一步的，上述重组大肠杆菌的构建方法中，所述质粒载体为pET系列，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

进一步的，上述优化方法中，发酵培养的温度、搅拌速度等条件可以参照现有技术中公开的方法进行选择。在本发明某一具体实施方式中，发酵培养的温度为22-28℃，搅拌速度为180-220 rpm，添加甘氨酸、Ca²⁺和乳糖后，在此条件下继续发酵70-75h。

本发明上述发酵得到的发酵液中，环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力高，经验证，歧化活力最高可达105 U/mL，用于生产AA-2G能够提高糖基供体底物的转化率，使AA-2G的产量提高。进一步的，本发明还提供了一种生产AA-2G的方法，该方法包括制备环糊精葡萄糖基转移酶的步骤，所述环糊精葡萄糖基转移酶采用上述的提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法制得。

本发明将CGTase在大肠杆菌中异源表达，优化了含CGTase基因的重组大肠杆菌的发酵培养过程，在发酵培养的过程中添加甘氨酸、Ca²⁺、β-环糊精、牛磺酸和乳糖五种成分，提高了膜通透性，抑制了包涵体的形成，有效促进了环糊精葡萄糖基转移酶蛋白的异源分泌表达，提高了环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力，进一步提高了该酶对线性底物的转化率，从而提高了以麦芽糊精等线性底物生产AA-2G的产量，更加有利于AA-2G的工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。

下述实施例中，所用质粒pET20b(+)、T4 DNA连接酶、感受态细胞E.coli JM109、感受态细胞E.coli BL21(DE3)购自优宝生物、TaKaRa以及诺唯赞公司。

下述实施例中，所用LB培养基组成均为：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10g/L。

下述实施例中，所用TB培养基组成均为：胰蛋白胨12 g/L、酵母粉24 g/L、甘油5g/L、KH₂PO₄ 2.31 g/L、K₂HPO₄.3H₂O 16.43 g/L。

实施例1：重组大肠杆菌的构建

以来源于环状芽孢杆菌（Bacillus circulans Jordan）的环糊精葡萄糖基转移酶核苷酸序列为基础，根据环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，设计并合成含有XhoI和BamHI酶切位点的用于扩增CGTase基因片段的引物，采用化学合成法合成不含自身信号肽序列的CGTase基因。用于构建重组大肠杆菌的质粒是pET20b(+)，带有T7启动子和pelB信号肽序列。将pET20b(+)和CGTase基因片段分别进行XhoI和BamHI双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞中，经过培养后挑取阳性克隆，测序正确则获得表达质粒cgt/pET20b(+)。将表达质粒转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养，并将其保存在甘油管中，即为重组大肠杆菌。

环糊精葡萄糖基转移酶的发酵

实施例2

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为10 mM，添加牛磺酸至浓度为0.8 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加10 mM β-环糊精和0.8 mM牛磺酸，含100 μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加乳糖、甘氨酸和氯化钙，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖15 mmol/L、甘氨酸200mmol/L、CaCl₂ 10 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

实施例3

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为10 mM，添加牛磺酸至浓度为1 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加10 mM β-环糊精和1 mM牛磺酸，含100 μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加乳糖、甘氨酸和氯化钙，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖15 mmol/L、甘氨酸200 mmol/L、CaCl₂ 10 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

实施例4

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为10 mM，添加牛磺酸至浓度为1.1 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加10 mM β-环糊精和1.1 mM牛磺酸，含100 μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加乳糖、甘氨酸和氯化钙，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖15 mmol/L、甘氨酸200mmol/L、CaCl₂ 10 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

实施例5

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为5 mM，添加牛磺酸至浓度为1 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加5 mM β-环糊精和1 mM牛磺酸，含100μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.4时，添加乳糖、甘氨酸和氯化钙，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖30 mmol/L、甘氨酸300 mmol/L、CaCl₂ 15 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

实施例6

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为20 mM，添加牛磺酸至浓度为1 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加20 mM β-环糊精和1 mM牛磺酸，含100 μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加乳糖、甘氨酸和氯化钙，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖5 mmol/L、甘氨酸100 mmol/L、CaCl₂ 5 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

实施例7

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为10 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加10 mM β-环糊精，含100 μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加乳糖、甘氨酸、氯化钙和牛磺酸，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖15 mmol/L、甘氨酸200 mmol/L、CaCl₂10 mmol/L、牛磺酸0.8mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15 min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

对比例1

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（含100μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加乳糖、甘氨酸和CaCl₂，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖15 mmol/L、甘氨酸200 mmol/L、CaCl₂10 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

对比例2

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为10 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加10 mM β-环糊精，含100 μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加乳糖使其在培养体系中的浓度为15 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

对比例3

向LB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，将实施例1保存的重组大肠杆菌接种于LB培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），25℃培养生长8h，得到种子液。向TB培养基中添加氨苄青霉素使其浓度为100 μg/mL，添加β-环糊精至浓度为10 mM，按5%的接种量将种子液接入TB培养基中（添加10 mM β-环糊精，含100 μg/mL氨苄青霉素），在25℃、200 rpm的摇床中培养，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加甘氨酸和乳糖，它们在培养体系中的浓度分别为乳糖15 mmol/L、甘氨酸200 mmol/L，继续发酵培养72h后，将一定体积发酵液于4℃、12000 rpm离心15min，取上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

对比例4

按照实施例3的方法制备环糊精葡萄糖基转移酶，不同的是：不加入牛磺酸。所得上清液为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

对比例5

按照实施例3的方法制备环糊精葡萄糖基转移酶，不同的是：当菌体培养至OD₆₀₀为5时添加乳糖、甘氨酸和氯化钙。所得上清液为环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液。

验证例1 环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力测定

将上述实施例2-7和对比例1-5所得的粗酶液分别进行催化歧化反应的活力测定。方法如下：

取600 μL含有终浓度4 mmol/L的EPS（4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷）和20mmol/L的麦芽糖溶液于50℃水浴中保温10min，加入30 μL上述实施例和对比例所得的粗酶液，反应75min，然后加入50 μL 3 mol/L HCl溶液终止反应，5 min后加入50 μL 3 mol/LNaOH溶液中和，然后加入100 μL α-葡萄糖苷酶于60℃反应60min，加入100 μL 1 mol/LNa₂CO₃溶液，混匀，在405 nm处测定吸光值。环糊精葡萄糖基转移酶催化歧化反应的活力定义为在该测定条件下每分钟转化1 μmol EPS所需的酶量。

测定结果如下表1所示。

从上表结果可以看出，在重组大肠杆菌产环糊精葡萄糖基转移酶发酵培养过程中，在TB培养基中添加10 mM β-环糊精和1 mM牛磺酸，培养至OD₆₀₀为0.6，添加15mM乳糖、200 mM 甘氨酸和10 mM Ca²⁺，环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力最高，为105 U/mL。其余实施例酶歧化活力虽然低于最优实施例，但均高于对比例，说明本发明这五种成分的组合对环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力的提高有明显的增效作用。

验证例2 制备AA-2G

在反应容器中加入终浓度50 g/L的维生素C、50 g/L的麦芽糊精为底物，加入终浓度10g/L的Na₂SO₃作为抗氧化剂，用20%的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.0，加入等量上述实施例和对比例获得的CGTase粗酶液，在35℃、150 r/min的水浴摇床中反应24h。反应结束后加入50 U/mL葡萄糖淀粉酶，50℃、150 r/min的水浴摇床中反应24h。所得样品12000 r/min离心15min，将上清液适度稀释后用0.45 μm超滤膜过滤，并用HPLC检测AA-2G的浓度。HPLC色谱条件如下：Agilent 1200 HPLC色谱仪，Agilent 自动进样器，Algilent SB-Aq 5μm（4.6mmx250 mm），LC-9A紫外检测器；流动相为20 mmol/L的稀磷酸，流速0.8 mL/min；柱温35℃；进样量10 μL。

利用CGTase粗酶液制得的AA-2G产量如下表2所示。

从上表可以看出，实施例所得的CGTase催化合成AA-2G的产量均高于对比例，且实施例3所得的CGTase催化合成AA-2G的产量最高为3.74 g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法，其特征是：环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中进行异源表达的发酵过程中，向发酵培养基中添加甘氨酸、Ca²⁺、β-环糊精、牛磺酸和乳糖。

2.根据权利要求1所述的优化方法，其特征是：β-环糊精和牛磺酸在发酵开始时加入，所述甘氨酸、Ca²⁺和乳糖在发酵中后期加入；优选的，甘氨酸、Ca²⁺和乳糖在发酵至OD₆₀₀为0.4-0.6时加入。

3.根据权利要求2所述的优化方法，其特征是：所述大肠杆菌为含编码环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组大肠杆菌。

4.根据权利要求1或2所述的优化方法，其特征是：甘氨酸在发酵体系中的浓度为100mmol/L-300 mmol/L，优选为200 mmol/L。

5.根据权利要求1或2所述的优化方法，其特征是：Ca²⁺在发酵体系中的浓度为5 mmol/L-15 mmol/L，优选为10 mmol/L。

6.根据权利要求1或2所述的优化方法，其特征是：β-环糊精在发酵体系中的浓度为5mmol/L -20 mmol/L，优选为5 mmol/L -10 mmol/L，最优选为10 mmol/L。

7.根据权利要求1或2所述的优化方法，其特征是：牛磺酸在发酵体系中的浓度为0. 8mmol/L -1.1 mmol/L，优选为1mmol/L。

8.根据权利要求1或2所述的优化方法，其特征是：乳糖在发酵体系中的浓度为5 mmol/L -30 mmol/L，优选为15 mmol/L。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的优化方法，其特征是：所述发酵培养基为TB培养基，成分包括：胰蛋白胨10-15g/L、酵母粉20-25 g/L、甘油3-6 g/L、KH₂PO₄ 2-5 g/L、K₂HPO₄.3H₂O 15-20 g/L；优选的，发酵培养的温度为22-28℃，搅拌速度为180-220 rpm。

10.一种生产维生素C葡萄糖苷的方法，其特征是：包括制备环糊精葡萄糖基转移酶的步骤，所述环糊精葡萄糖基转移酶采用权利要求1-9中任一项所述的提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法制得。