CN103484439A - 高特异性生产α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高特异性生产α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于酶工程领域。本发明对来源于Paenibacillus macerans JFB 05-01的CGTase进行改造，对CGTase的145位的Asp，146位的Arg和147位的Asp进行定点突变，获得的单突变体酶的β-环糊精生产能力较野生型CGTase降低，α-环糊精生产能力有所增加，主产物α-环糊精的特异性增加；对CGTase进行上述突变位点的组合突变，获得双突变体及三突变体；这些突变体与野生型CGTase相比β-环糊精生产能力显著降低，α-环糊精生产能力有所增加，主产物α-环糊精的特异性增加，更利于α-环糊精的工业化生产。

Description

高特异性生产α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

技术领域

本发明涉及一种高特异性生产α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，及其制备和应用方法，属于酶工程领域。

背景技术

环糊精(Cyclodextrin，简称CD)，是一类由淀粉或淀粉类底物在环糊精葡萄糖基转移酶（简称CGTase）作用下生成的由D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键首尾相连的环状化合物，常见的环糊精由6、7和8个葡萄糖单元构成，分别称为α-、β-和γ-环糊精。环糊精分子外侧亲水内部疏水的桶形结构使得其可以与众多的各类疏水性客体分子形成包合物，进而改变这些客体分子的物理和化学性质，这种独特的性质使其在食品、医药、农业、化妆品、化学、环保等领域有广泛的应用前景。

CGTase是α-淀粉酶家族的重要成员，它能催化四种不同的反应：环化反应、歧化反应、偶合反应和水解反应，其中环化反应是CGTase催化的特征反应，是利用CGTase生产环糊精的分子基础。环糊精生产的制约因素之一是目前已知的野生型CGTase生产的环糊精为α-、β-、γ-环糊精的混合物，这不仅给产物的分离纯化带来不便，而且提高了生产成本。因此在环糊精的生产过程中通常添加特定的有机溶剂选择性沉淀目的环糊精，提高CGTase产物特异性。

目前α-环糊精生产一般添加癸醇，但因其沸点高达229℃，增加了蒸馏去除的难度。因此，通过诱变筛选、分子改造等手段获得高α-环糊精特异性的CGTase，可增加有机溶剂的可选择范围甚至不使用有机溶剂，简化生产工艺，降低生产成本。

本发明所使用的来源于Paenibacillus macerans JFB 05-01(CCTCC NO:M 208063)的CGTase在未使用有机溶剂的情况下，酶转化反应初期主要生产α-环糊精，但随着反应的进行，副产物之一β-环糊精比率显著增加，这降低了CGTase（生产α-环糊精）对底物的得率，同时也增加了分离纯化的难度。因此，进一步提高该酶的产α-环糊精能力与特异性有利于α-环糊精生产成本的降低与规模化生产。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高特异性生产α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是相对亲本CGTase有一个、两个或三个氨基酸残基的变化。

所述亲本CGTase的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一个目的是提供高特异性生产α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备和应用方法。

本发明的技术方案主要包括以下内容：

（1）突变位点及突变体选择：

采用SWISS-MODEL对来源于Paenibacillus macerans JFB 05-01的CGTase（以下简称α-CGTase，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）进行同源建模，获得模拟结构，与来源于Bacilluscirculans strain 251的β-GTase分析对比，确定α-CGTase中亚位点-7处参与β-环糊精生成的氨基酸为第145位天冬氨酸Asp145、第146位精氨酸Arg146和第147位天冬氨酸Asp147。

所述发生突变的氨基酸残基为第145位天冬氨酸Asp、第146位精氨酸Arg或第147位天冬氨酸Asp，旨在削弱CGTase在中亚位点-7处与糖单元的结合，进而限制β-环糊精的生成。

第145位天冬氨酸突变为组氨酸，命名为D145H（以下类似），保证α-环糊精的生成，同时引入空间位阻限制β-环糊精的生成。

第146位精氨酸分别突变为甘氨酸Gly（G）、丙氨酸Ala（A）、缬氨酸Val（V）、异亮氨酸Ile（I）、亮氨酸Leu（L）和蛋氨酸Met（M），移除Arg侧链与糖链-7位糖单元形成的氢键，分别命名为：R146G，R146A，R146V，R146I，R146L，R146M；第146位精氨酸分别突变为苯丙氨酸Phe（F）、酪氨酸Tyr（Y）和色氨酸Trp（W），引入空间位阻，同时移除Arg侧链与糖链-7位糖单元形成的氢键，分别命名为：R146F，R146Y，R146W；第146位精氨酸突变为脯氨酸Pro（P），引入空间位阻，同时移除Arg侧链和主链与糖链-7位糖单元形成的氢键，命名为：R146P。

第147位天冬氨酸分别突变为甘氨酸Gly（G）、丙氨酸Ala（A）、缬氨酸Val（V）、异亮氨酸Ile（I）、亮氨酸Leu（L）和蛋氨酸Met（M），移除Asp侧链与糖链-7位糖单元形成的氢键，分别命名为：D147G，D147A，D147V，D147I，D147L，D147M；第147位天冬氨酸突变为苯丙氨酸Phe（F）、酪氨酸Tyr（Y）和色氨酸Trp（W），引入空间位阻，同时移除Asp侧链与糖链-7位糖单元形成的氢键，分别命名为：D147F，D147Y，D147W；第147位天冬氨酸突变为脯氨酸Pro（P），引入空间位阻，同时移除Asp侧链和主链与糖链-7位糖单元形成的氢键，命名为D147P。

将上述三个位点进行突变组合，设计双突变和三突变，分别获得双突变体D145H/R146V，D145H/R146P，D145H/D147V，D145H/D147P，R146V/D147V，R146V/D147P，R146P/D147V，R146P/D147P，及三突变体D145H/R146V/D147V，D147H/R146V/D147P，D145H/R146P/D147V，D145H/R146P/D147P。

（2）突变

针对上述突变体设计引物对，其中上游引物为与CGTase片段基因同源、包含编码突变位点突变后氨基酸的寡核苷酸，下游引物为与上游引物反向互补的寡核苷酸。上、下游引物中突变位点前后碱基数不小于10，单条引物碱基数不超过40。突变用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以携带有CGTase基因的质粒ompA-PET20b(+)/cgt（参见：李彬，吴敬，陈坚.信号肽对浸麻类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中胞外表达的影响[J].工业微生物,2011,41(3):54-59；Paenibacillus macerans JFB 05-01 CCTCC NO:M 208063）为模版，进行重叠PCR。

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Prime STAR HS DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 6min)；72℃继续延伸10min。PCR产物经Dpn I（Fermentas公司）消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化的感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，测序。

（3）突变体及野生酶的表达与纯化：

将测序为正确突变的质粒（对于野生酶，直接用模版质粒）转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm，培养8～10h，按5%接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)；大肠杆菌在37℃摇床培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵48小时后，将发酵液于4℃、10000g离心15min除菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体酶样品。

本发明通过对CGTase进行定点突变，获得了多种单突变体、双突变体及三突变体，所得突变体生产β-CD的活力下降，生产α-CD的活力增强；产物中α-CD的比例提高，有利于简化α-CD的后续纯化工艺与实现规模化生产，并且能显著降低α-环糊精的生产成本，具备广泛的工业化应用前景。

附图说明

图1为α-CGTase与Bacillus circulans strain 251来源的β-CGTase比较；氨基酸黑色棒状显示为α-CGTase中的序列¹⁴⁴ADRDQ¹⁴⁸及N193和Y195位点，对应的灰色棒状显示为β-CGTase中序列¹⁴⁴ASSDQ¹⁴⁸及N193和Y195位点，糖单元灰色棒状状显示的为结合于β-CGTase-1至-7位点的含有7个葡萄糖单元的糖链。

具体实施方式

实施例1 本例说明突变体酶及野生酶的制备。

1）定点突变

以质粒ompA-PET20b(+)/cgt（参见：李彬，吴敬，陈坚.信号肽对浸麻类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中胞外表达的影响[J].工业微生物,2011,41(3):54-59；Paenibacillus macerans JFB 05-01CCTCC NO:M 208063）为模版，利用合成的突变引物，进行重叠PCR。

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Prime STAR HS DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件均为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 6min)；72℃继续延伸10min。PCR产物经Dpn I（Fermentas公司）消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，测序。

2）突变体酶及野生酶的表达与纯化

将测序为正确突变的质粒（对于野生酶，直接用模版质粒）转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8～10h，按4%接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)；大肠杆菌在37℃摇床培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵48小时后，将发酵液于4℃、10000rpm离心15min除菌体，收集上清液。

往上清液中缓慢加入25%的(NH₄)₂SO₄，4℃放置盐析过夜。4℃、10000g离心15min，收集沉淀。用20mM磷酸缓冲液（pH6.5）复溶沉淀后，在20mmol/L磷酸缓冲液（pH6.5）中透析过夜，期间更换2-3次透析缓冲液，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品。

采用AKTA蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，整个纯化过程在层析柜中进行，控制温度为4℃。阴离子交换色谱纯化步骤：(1)平衡：用5倍体积的20mmol/L磷酸缓冲液A（pH6.5）平衡DEAE阴离子交换色谱柱；(2)上样：预先处理好的样品以1mL/min的流速上样；(4)洗脱，流速1.0mL/min，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活性的洗脱液；活力组分在50mM pH5.5磷酸缓冲液中透析过夜后，得到纯化突变体酶（每种突变体酶及野生酶纯化过程一致）。

实施例2 本实施例说明酶活分析。

酶活测定方法：

甲基橙法测定α-环化活力的方法：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有2.0mL预先用50mM磷酸缓冲液（pH5.5）配制的1%(w/v)可溶性淀粉溶液中（底物45℃预热10min），在45℃下反应10min后，加入0.2mL 3.0M的盐酸终止反应，再加入0.2mL用0.44mM甲基橙，在16℃下保温15min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需的酶量。

酚酞法测定β-环化活力的方法：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有2.0mL预先用50mM磷酸缓冲液（pH5.5）配制的1%(w/v)可溶性淀粉溶液中（底物45℃预热10min），在45℃下反应10min后，加入0.2mL 0.6M的盐酸终止反应，灭酶10min，加入0.2mL 0.6M碳酸钠调节pH，加入0.2mL 1.2mM酚酞(20%乙醇溶解)，25℃保温15min，在550nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需酶量。

实施例3 本实施例说明HPLC方法分析环糊精生成量。

配制5%(w/v)可溶性淀粉溶（pH5.5）液作为底物。分别加入一定量的CGTase野生酶及突变酶，加酶量为4U/g淀粉，置于45℃、150rpm反应10h。取样,沸水浴煮10min灭酶，取500μL与95%（V/V）乙醇1:1混合，室温放置2h沉淀大分子量的糊精或极限糊精,12000rpm离心20min，取上清进行HPLC分析。

采用HPLC进行产物分析的色谱条件是:Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱Thermo Aps-2 HYPERSIL(4.6mm×250mm)，Agilent 2410示差检测器；流动相(V/V)为70%乙腈水溶液，流速0.8mL·min^-1；柱温40℃。

实施例4 本实施例说明野生酶及单突变体酶活性及酶转化产物分析结果。

野生酶及单突变体酶活性结果如表1所示（由于γ-CD生成活性极低，占总活性的比率可忽略不计，这里不作为参考指标），Arg146的突变使α-CD生成活性稍有增加，Asp147的突变使β-CD生成活性降低，在限制β-CD生成活性比率方面Asp145、Arg146和Asp147的突变都有效果，其中以Asp147的突变尤为显著。

表1 野生酶及单突变体酶活比较

野生酶及单突变体酶转化产物结果如表2所示，Asp145、Arg146和Asp147的突变酶转化产物γ-CD产量无明显变化，β-CD产量都有明显下降，主产物α-CD的产量不下降，这与反应酶转化初始情况的酶活结果相一致。在提高产物特异性方面以Asp147的突变效果显著，此处位点的大部分突变体酶转化产物α-CD比率超过70%，Asp145、Arg146的突变以D145H、R146V和R146P效果显著。

表2 野生酶及单突变体酶转化产物比较

实施例5 本实施例说明野生酶及组合突变体酶活性及酶转化产物分析结果

选择实施例4中三处位点对应效果明显的单突变体D145H、R146V、R146P、D147V和D147P为模版设计引物，进行组合突变。野生酶及组合突变体酶活性结果如表3所示，绝大多数组合突变体，β-CD生产活性比率小于6.5%，即小于野生酶（13.0%）。酶转化结果（表4）表明，β-CD比率下降明显，基本能降至野生型的一半或接近一半，和γ-CD的低比率相近。主产物α-CD的产量提升了1g/L以上，主产物α-CD的比率由野生型的63.2%提升至74%-79%不等。

表3 野生酶及组合突变体酶活比较

表4 野生酶及组合突变体酶环化产物比较

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，相对于具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的CGTase，包括一个、两个或三个氨基酸残基的变化，所述变化与CGTase产α-环糊精的特异性相关。

2.权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸残基为第145位天冬氨酸Asp、第146位精氨酸Arg或第147位天冬氨酸Asp。

3.权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述一个氨基酸残基的变化得到的突变体为：

（1）第145位天冬氨酸发生突变，得到突变体D145H；

（2）第146位精氨酸发生突变，得到突变体：R146G、R146A、R146V、R146I、R146L、R146M、R146F、R146Y、R146W或R146P；

（3）第147位天冬氨酸发生突变，得到突变体：D147G、D147A、D147V、D147I、D147L、D147M、D147F、D147Y、D147W或D147P。

4.权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述2个氨基酸残基的变化得到的突变体为：D145H/R146V、D145H/R146P、D145H/D147V、D145H/D147P、R146V/D147V、R146V/D147P、R146P/D147V或R146P/D147P。

5.权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述3个氨基酸残基的变化得到的突变体为：D145H/R146V/D147V、D147H/R146V/D147P、D145H/R146P/D147V或D145H/R146P/D147P。

6.编码权利要求1-5所述任一CGTase突变体的基因序列。

7.携带权利要求6所述DNA序列的质粒或细胞。

8.权利要求7所述的细胞，其特征在于，是微生物细胞，包含细菌、真菌或古菌。

9.获得权利要求1-5所述任一突变体的方法，其特征在于，可通过定点突变、定向进化或诱变获得突变体。

10.权利要求1-5所述任一突变体在α-环糊精生产中的应用。

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