CN101294149A

CN101294149A - 一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达

Info

Publication number: CN101294149A
Application number: CNA2008100241623A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 吴敬; 李兆丰; 李彬; 成成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2008-10-29

Abstract

一种α－环糊精葡萄糖基转移酶(简称α－CGT酶)基因的克隆与表达，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05－01总DNA获得cgt基因SEQ ID NO：1，cgt基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现cgt基因在胞外的高效表达；该cgt基因全长2061个核苷酸，编码687个氨基酸，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达α－CGT酶。重组酶具有环化活性，能转化淀粉及相关基质成环糊精。该重组α－CGT酶的最适温度为40～45℃，最适pH 5.5，在40℃下具有较高的热稳定性，在50℃以上热稳定性较差。此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能用于α－环糊精和β－环糊精的工业生产。

Description

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达

技术领域

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶(简称α-CGT酶)基因的克隆与表达，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种编码软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01α-CGT酶的DNA序列及其表达。

背景技术

CGT酶是一个多功能型的酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基化反应(歧化反应、环化反应和偶合反应)和水解反应。CGT酶通过环化反应能利用淀粉生产环糊精，这是其工业应用的基础。除了通过环化反应生产环糊精，最近也用CGT酶催化偶合和歧化反应，转移供体如淀粉或环糊精上的低聚糖到各种受体分子上，得到各种特殊的低聚糖。通过催化不同受体分子的糖基化反应，对诸如甜菊苷、橘皮苷、芸香苷、维生素C、鼠李糖、抗坏血酸等进行糖基化，能显著提高受体分子的功能性、水溶性、对化学物质的稳定性。另外，CGT酶极限糊精的应用也被发现，它可应用于造纸工业中的表面施胶和涂布，能改善纸张的书写性能并具有光滑且适于印刷的表面。CGT酶也可用来处理生面团，通过CGT酶的歧化反应，能增加该面团所制作的焙烤产品的体积。

生产CGT酶的微生物种类众多，有芽孢杆菌、放线菌、微球菌、短杆菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使用的CGT酶主要来自芽孢杆菌属。根据环化反应在起始阶段所生成环糊精的主要类型不同，CGT酶可分为α、β和γ型CGT酶，即α-、β-和γ-CGT酶。大部分CGT酶为β型。

目前，许多CGT酶已经得到了纯化，相应的CGT酶的编码基因(cgt基因)得到了克隆。由于能分泌CGT酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌株的低生产能力，重组大肠杆菌在工业化生产CGT酶中已经在国外得到了极大的重视。目前，诱导型启动子P_lac、P_tac、P_trp和P_L已经广泛应用于在重组大肠杆菌中过量生产CGT酶，但是有关利用适宜载体和宿主对CGT酶进行胞外表达的报道不多，重组CGT酶大多是作为一种包涵体在细胞内部进行积累的，因此，这种包涵体的活化需要复杂的变性和重折叠等关键过程，不利于工业化生产。在国内，CGT酶的克隆与表达迄今为止鲜有报道，国内大部分研究者主要致力于提高原始菌株的酶产量。

环糊精是由六个以上葡萄糖连结而成的具有环状疏水圆锥形结构的低聚糖非还原性化合物系列，其中最常用的是α-、β-、γ-环糊精，它们分别由6、7、8个葡萄糖单元构成。目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等，因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。国际市场对环糊精的年需求已达到10万吨以上，国内也已接近万吨；仅制备医药片剂一项需求就达数千吨，而目前环糊精总产量仅万吨左右，国内仅700余吨，而且绝大部分是β-环糊精，同时有少量的α-环糊精和混合环糊精。随着应用领域的不断拓展，环糊精的需求量一直在逐年大幅度增长，目前，环糊精的年增长率达到20％～30％。环糊精在各个工业领域中的应用比例大致为：食品工业80％、医药10％、农药5～10％。

和β-环糊精、γ-环糊精结构相比，α-环糊精最大的特点是具有更小的环结构和更小的空腔，因此具有独特的性质和特有的用途。一般来说，α-环糊精可以复合具有低分子量的分子或者包接脂肪族的侧链。在食品工业上，能作为天然色素、香料和维生素等的载体；能稳定食品中的某些成分，防止其挥发，抗氧化、抗光和热分解等；除去食品中的臭味和苦涩味；使某些食品形成长期稳定的乳状液等。特别值得注意的是，α-环糊精具有抗过敏作用，可抑制IgE抗体，一些含α-环糊精的保健食品已经面市。食用该类产品可消除过敏，预防支气管哮喘、过敏性皮炎、鼻炎等症；α-环糊精也是一种难消化膳食纤维，食后有降血糖的作用。目前，由于β-环糊精的工业化生产比较成熟，价格较低，因此应用面最广，但是，许多研究证实，在一些场合α-环糊精的使用效果明显好于β-环糊精。但由于α-环糊精的价格较高，限制了其广泛的应用。

为了降低α-环糊精的商业成本，首先必须降低α-CGT酶的生产成本。Peanibacillus macerans是最常用于α-CGT酶的工业化生产，但同样存在生产能力较低的缺陷。在以前的报道中，重组α-CGT酶在大肠杆菌中一般定位于胞内形成包涵体或存在于周质中，不利于重组α-CGT酶的回收与使用。因此，如何使α-CGT酶基因在大肠杆菌中得到高效的胞外表达，对降低α-CGT酶的生产成本显得非常重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种α-CGT酶，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供一种编码该α-CGT酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达载体。

本发明的又一个目的是提供包含本发明表达载体的宿主细胞。

本发明的技术方案：一种α-环糊精葡萄糖基转移酶，缩写为α-CGT酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶的基因，缩写为cgt基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的cgt基因的表达方法：由软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01总DNA获得cgt基因SEQ ID NO：1，cgt基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现cgt基因的高效表达；

(1)软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01总DNA的提取。

P.macerans JFB05-01菌株在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μLRNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％SDS(十二烷基硫酸钠)和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μLNaCl(5M)和80μLCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即得到P.maceransJFB05-01总DNA。

(2)α-CGT酶编码基因的克隆：

以P.macerans JFB05-01总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Nco I和EcoR I，PCR扩增cgt基因。

引物1：5’-CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC-3’

引物2：5’-CTCgAgAgAATTCggATTTTgCCAgTCCAC-3’

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到2061bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒。命名为cgt/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定。

(3)cgt基因的改造：

以cgt/pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，以消除基因内部的Nco I位点，设计引物：

引物3：5’-CAATgTgggTCCCACAATgggCCAgCC-3’

引物4：5’-ggCTggCCCATTgTgggACCCACATTg-3’

PCR反应在50μL体系中进行，5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板cgt/pMD18-T simple 1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

反应条件为在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，培养挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基，经37℃培养过夜，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定。

(4)cgt基因在表达载体上的构建：

用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和扩增的cgt基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的cgt/pET20b(+)质粒(图1)。

(5)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：

将质粒cgt/pET20b(+)热击转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，再100mg/L氨苄青霉素-LB平板上经37℃培养过夜，挑选含质粒cgt/pET20b(+)的E.coli BL21(DE3)转化子在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄12.54g/L，KH₂PO₄2.31g/L)，30℃培养至OD达0.6后用终浓度0.01μM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导，降温至25℃培养，90h时产α-CGT酶达22.5U/mL。

(6)重组α-CGT酶的纯化和特性。

将上述α-CGT酶发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含α-CGT酶酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6)中透析过夜后，得纯化α-CGT酶酶制品。纯化后重组α-CGT酶达到电泳纯，表观分子量70000道尔顿。纯化过程电泳图见图2。

本发明的有益效果：本发明提供了cgt基因的高效表达方法。提取P.macerans JFB05-01总DNA，设计引物PCR得到编码α-CGT酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，全长2061个核苷酸，编码687个氨基酸。以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，可实现cgt基因的高效表达，重组酶具有环化活性。该α-CGT酶的最适温度为40～45℃，最适pH 5.5，在40℃下具有较高的热稳定性，在50℃以上热稳定性较差。此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能用于α-环糊精和β-环糊精的工业生产。

生物材料样品保藏

软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2008年4月24日，保藏编号CCTCC NO：M 208063。

附图说明

图1用于生产重组α-CGT酶的cgt/pET20b(+)质粒。

图2重组α-CGT酶分离纯化SDS-PAGE图谱。

1、发酵上清液；M、标准蛋白分子量；2、通过Ni柱纯化后样品。

图3重组α-CGT酶最适温度(以可溶性淀粉为底物)。

图4重组α-CGT酶最适pH(以可溶性淀粉为底物)。

pH 3-6，使用柠檬酸缓冲液；pH 6-8，使用磷酸钠缓冲液；pH 8-11，使用甘氨酸/氢氧化钠缓冲液。

图5重组α-CGT酶在40℃(◆)，45℃(●)和50℃(▲)下的稳定性研究(以可溶性淀粉为底物)。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01总DNA的提取。

P.macerans JFB05-01菌株在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μLRNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％SDS(十二烷基硫酸钠)和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μLNaCl(5M)和80μL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为P.maceransJFB05-01总DNA。

实施例2

本实施例说明α-CGT酶编码基因的克隆程序。

引物1：5’-CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC-3’

引物2：5’-CTCgAgAgAATTCggATTTTgCCAgTCCAC-3’

反应条件为在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。扩增得到大约2100bp的PCR片段，割胶回收。回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，平板上长了大约十几个菌落，挑四个菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明插入片段含有一个长2061bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由687个氨基酸编码的蛋白质。

实施例3

本实施例说明cgt基因的改造程序。

由于在目标基因内部存在一个Nco I酶切位点，而基因两端分别为Nco I和EcoR I位点，所以设计引物将Nco I位点突变去除，以方便下步的克隆表达。以连接了cgt基因的pMD18-T simple载体为模板进行定点突变PCR，设计引物：

引物3：5’-CAATgTgggTCCCACAATgggCCAgCC-3’

引物4：5’-ggCTggCCCATTgTgggACCCACATTg-3’

反应条件为在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞。转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果正确，验证了已经成功突变去除Nco I位点。

实施例4

本实施例说明cgt基因在表达载体上的构建程序。

用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记。将pET20b(+)质粒和cgt基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的cgt/pET20b(+)质粒(图1)。

实施例5

本实施例说明大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。

将质粒cgt/pET20b(+)热击转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，再氨苄青霉素(100mg/L)-LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子(含cgt/pET20b(+)的E.coliBL21(DE3))在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄12.54g/L，KH₂PO₄2.31g/L)30℃培养至OD达0.6后用终浓度0.01μMIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导，降温至25℃培养，90h时产酶达22.5U/mL。

实施例6

本实施例说明α-CGT酶的纯化和特性。

以可溶性淀粉为底物时，α-CGT酶的最适温度为40～45℃(图3)，最适pH5.5(图4)，在40℃下具有较高的热稳定性，在50℃以上热稳定性较差(图5)。

序列表

SEQ ID NO：1

tcacccgata cgagcgtgga caacaaggtc aatttcagta cggacgtcat ctatcagatt 60

gtgaccgacc gcttcgcgga cggggacagg acgaacaatc cggcggggga tgcgttcagc 120

ggcgaccgat ccaatttgaa gctctatttc gggggagact ggcaggggat tatcgacaag 180

attaacgacg gttatttgac cggcatgggc gtcaccgccc tctggatatc ccagcctgtg 240

gaaaatatca cctccgtcat caagtattcc ggcgttaaca atacgtctta tcacggttac 300

tgggcgaggg attttaagca aaccaacgac gctttcgggg attttgccga ttttcaaaat 360

ctgattgata cggctcacgc tcataacatc aaggtcgtga tcgacttcgc ccccaaccac 420

acgtctccgg ccgacaggga caaccccggc ttcgccgaga acggtgcgct gtatgataac 480

ggttcgctgc tcggcgccta cagcaatgat acggccggcc ttttccatca taacgggggg 540

accgattttt ccacgattga agacggtatt tacaagaacc tctacgacct ggcggacatc 600

aaccataaca acaacgctat ggacgcttat tttaaaagcg ctatcgacct ttggctcggc 660

atgggtgtgg acgggattcg ttttgacgcg gtgaagcata tgcctttcgg ctggcaaaaa 720

agcttcgttt cctcgattta cggcggcgat catccggtat ttacgttcgg ggaatggtat 780

cttggcgcgg atcaaaccga cggagacaac attaaattcg ccaacgaaag cgggatgaac 840

ctgctggact ttgaatacgc gcaggaagtg cgcgaagtgt tccgggacaa aacggaaacg 900

atgaaggatc tctatgaggt gctggccagc acggagtcgc aatacgacta catcaacaat 960

atggtgacct tcatcgacaa ccatgatatg gaccggttcc aggttgccgg ttccggtacg 1020

cgggcgaccg agcaagcgtt ggcgctgacg ctgacttccc gcggcgtgcc agccatctac 1080

tacggcacgg agcagtacat gaccggcgat ggcgacccca acaaccgggc gatgatgacc 1140

tcgtttaata ccgggacgac ggcttataaa gtgattcagg cattggcgcc gctgcgtaaa 1200

tccaatccgg ccatcgctta tgggacgacg acagagcgct gggttaacaa cgatgtgttg 1260

attattgaac gcaaattcgg cagcagcgcc gctttggtgg cgattaatcg aaactcgtcc 1320

gccgcttatc cgatttcggg tctgttgagt tcgctgccgg cgggcactta ttcggatgta 1380

ttgaacggac tcttaaacgg caactccatt accgtgggca gcggcggcgc cgtcaccaac 1440

tttacgctgg cggccggcgg cacggcggta tggcagtaca cagcgccgga aacgtcgccg 1500

gcgatcggca atgtgggtcc caccatgggc cagccgggga atatagtgac gattgacggc 1560

cgcggctttg gcggcacggc gggcacggtt tatttcggga cgacggcggt gaccggctcc 1620

ggcatcgtaa gctgggagga cacgcagatt aaggcggtca taccgaaggt cgcggcgggc 1680

aaaacgggcg tatcggtcaa aacgtcgtcc ggcaccgcca gcaatacatt caaaagcttc 1740

aatgtactga cgggggatca ggtcacggtg cgtttcctgg tcaatcaagc caataccaat 1800

tacggaacaa atgtttatct tgtcggcaac gccgccgagc tcggctcctg ggacccgaac 1860

aaagcgattg ggccgatgta caatcaggtg atcgccaagt acccgtcctg gtattacgat 1920

gtcagcgtgc cggcggggac aaagctggat tttaaattta ttaaaaaggg cggcggtacg 1980

gtgacttggg aaggcggggg caaccatacg tacacgacgc cggccagcgg cgtagggacg 2040

gtgacggtgg actggcaaaa t 2061

SEQ ID NO：2

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp

5 10 15

Val Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg

20 25 30

Thr Asn Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn

35 40 45

Leu Lys Leu Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys

50 55 60

Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp

65 70 75

Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser

80 85 90

Gly Val Asn Asn Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe

95 100 105

Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn

110 115 120

Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His Asn Ile Lys Val Val Ile Asp

125 130 135

Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Asp Arg Asp Asn Pro Gly

140 145 150

Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn Gly Ser Leu Leu Gly

155 160 165

Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His His Asn Gly Gly

170 175 180

Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys Asn Leu Tyr

185 190 195

Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp Ala Tyr

200 205 210

Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp Gly

215 220 225

Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr

245 250 255

Phe Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn

260 265 270

Ile Lys Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu

275 280 285

Tyr Ala Gln Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr

290 295 300

Met Lys Asp Leu Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr

305 310 315

Asp Tyr Ile Asn Asn Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met

320 325 330

Asp Arg Phe Gln Val Ala Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln

335 340 345

Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr

350 355 360

Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn

365 370 375

Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr Gly Thr Thr Ala Tyr Lys

380 385 390

Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser Asn Pro Ala Ile

395 400 405

Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn Asn Asp Val Leu

410 415 420

Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu Val Ala Ile

425 430 435

Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu Leu Ser

440 445 450

Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu Leu

455 460 465

Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala

485 490 495

Pro Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly

500 505 510

Gln Pro Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly

515 520 525

Thr Ala Gly Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser

530 535 540

Gly Ile Val Ser Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro

545 550 555

Lys Val Ala Ala Gly Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser

560 565 570

Gly Thr Ala Ser Asn Thr Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly

575 580 585

Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn

590 695 600

Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly

605 610 615

Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly Pro Met Tyr Asn Gln Val

620 625 630

Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp Val Ser Val Pro Ala

635 640 645

Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys Gly Gly Gly Thr

650 655 660

Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr Thr Pro Ala

665 670 675

Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

680 685 687

Claims

1、一种α-环糊精葡萄糖基转移酶，缩写为α-CGT酶，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

2、一种编码权利要求1所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶的基因，缩写为cgt基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3、一种如权利要求2所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的表达方法，其特征是由软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01总DNA获得cgt基因SEQ ID NO：1，cgt基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现cgt基因的高效表达；

(1)软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-0 1总DNA的提取：

P.macerans JFB05-01菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％十二烷基硫酸钠溶液和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μL 5M的NaCl溶液和80μL十六烷基三甲基溴化铵，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即得到P.maceransJFB05-01总DNA；

(2)α-CGT酶编码基因的克隆：

以P.macerans JFB05-01总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Nco I和EcoRI，PCR扩增cgt基因；

引物1：5’-CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC-3’

引物2：5’-CTCgAgAgAATTCggATTTTgCCAgTCCAC-3’

反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到2061bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为cgt/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；

(3)cgt基因的改造：

引物3：5’-CAATgTgggTCCCACAATgggCCAgCC-3’

引物4：5’-ggCTggCCCATTgTgggACCCACATTg-3’

反应条件为在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，培养挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基，经37℃培养过夜，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定；

(4)cgt基因在表达载体上的构建：

用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和扩增的cgt基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的cgt/pET20b(+)质粒；

(5)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：

将质粒cgt/pET20b(+)热击转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，再100mg/L氨苄青霉素-LB平板上经37℃培养过夜，挑选含质粒cgt/pET20b(+)的E.coli BL21(DE3)转化子在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基，30℃培养至OD达0.6后用终浓度0.01μM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导，降温至25℃培养，90h时产α-CGT酶达22.5U/mL；

(6)重组α-CGT酶的纯化和特性：

将上述α-CGT酶发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含α-CGT酶酶活的洗脱液；活力组分在pH＝6、50mM磷酸钠缓冲液中透析过夜后，得纯化α-CGT酶酶制品。