CN111320700A - 一种重组金黄色葡萄球菌a蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白及其制备方法与应用，属于生物技术领域。重组金黄色葡萄球菌A蛋白即在天然金黄色葡萄球菌A蛋白的N端加了一个短肽YJ后得到的重组蛋白，所述短肽YJ氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因，命名为yj‑rspa基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。与现有技术相比，本发明优化后的基因在原核表达体系中表达量显著提高，对YJ‑rSPA的产业化生产以及今后在生物医药领域抗体处理材料的应用具有重要意义。

Description

一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen也发现类似现象，并将其命名为A抗原。

直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。

天然金黄色葡萄球菌SPA，相对分子质量为42kD，含有16种氨基酸，不含半胱氨酸，所以无二硫键。存在于大多数金黄色葡萄球菌细胞壁中，占整个细胞壁蛋白的6％左右,通过胞壁肤聚糖以共价键与之结合。A蛋白只具有一条肤链，不具有复杂的高级结构。其与IgG结合的功能域主要是由五个高度同源的E、D、A、B、C功能域组成，含有291个氨基酸，其中以B结构域与IgG结合的能力最强。

SPA因为其具有与抗体分子(尤其是IGg亚型)特异性结合的活性基团，所以在免疫检测试剂、诊断试剂盒等科研试剂、免疫吸附材料医疗器械、抗体纯化分离制备等领域有重要的应用价值。SPA作为活性原料添加在试剂、吸附材料到医疗器械等，本身也具有较大的市场价值。因此，SPA规模化制备及其后期的应用至关重要，目前利用原核系统表达重组A蛋白的主要弊端是表达量较低，包涵体的形成、生物活性不高等，真核表达重组A蛋白周期长，操作繁琐，成本高等缺点很难规模化生产。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白及其制备方法与应用。

本发明对金黄色葡萄球菌A蛋白基因结构进行优化，具体而言，本发明通过将YJ短肽与SPA连接制备重组金黄色葡萄球菌A蛋白(YJ-rSPA)，构建原核表达载体pET系列-yj-rspa使其在大肠杆菌宿主中能够得到高水平的表达，提高稳定性，提高活性。对YJ-rSPA产业化生产及其应用具有重要意义。

本发明在SPA的N端加了一个短肽YJ(并通过原核优化)，能够在大肠杆菌稳定高表达，提高了A蛋白的产量及活性，为A蛋白产业化生产及其应用奠定了理论和实践基础。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白，在天然金黄色葡萄球菌A蛋白的N端加了一个短肽YJ后得到的重组蛋白，所述短肽YJ氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的重组金黄色葡萄球菌A蛋白，保留了部分天然的SPA活性结构区域，因此，蛋白的活性部分没有损失，能够保持更好活性，YJ活性肽增加了表达量、稳定性和活性。重组金黄色葡萄球菌A蛋白能够提高表达效率，抗体特异结合作用等活性。

短肽YJ氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有有21个氨基酸，主要是非极性氨基酸，极性氨基酸比率不到18％。加在SPA的N端，能够提高SPA的表达，以及增强表达后的活性和稳定性。

短肽YJ对应的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因，命名为yj-rspa基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因编码如权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌A蛋白。

本发明提供一种重组载体，含有所述的重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因。

进一步，所述载体为含有如权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因的pET系列原核表达载体。

本发明提供一种重组工程菌，包括宿主细胞和共转入宿主细胞的所述的重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因。

进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明提供一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白的制备方法，包括以下步骤：

合成重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因克隆到pET系列载体上，获得重组载体；

将重组载体转入宿主细胞，得到高表达重组金黄色葡萄球菌A蛋白的重组工程菌；

利用重组工程菌表达制备重组金黄色葡萄球菌A蛋白。

本发明根据种属差异而优化的合成的yj-rspa碱基序列与原核表达载体pET系列进行连接，将含有目的基因的重组载体在适宜的宿主中表达。

与现有技术相比，本发明利用优化后的yj-rspa基因可实现原核细菌宿主工程菌YJ-rSPA蛋白的高表达。并且具有较高的生物学活性，具体表现在：

1、其表达量(上清+可溶性表达)约占总蛋白的65％左右，以外分泌加胞内可溶性表达的形式：外分泌表达简化了后期纯化工艺的步骤；并且胞内可溶性表达，将菌体回收进一步处理，纯化YJ-rSPA，明显增加了单次制备的产量；

2、验证了两种形式表达出的YJ-rSPA具有良好的免疫活性。

附图说明

图1：YJ-rSPA工程菌双酶切鉴定结果；

图2：YJ-rSPA蛋白表达验证结果；

图3：YJ-rSPA蛋白表达验证结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

YJ-rSPA的制备及其生物学活性验证

1、YJ-rSPA的获得

采用生物信息学方法，参照生物软件Vector NTI Suitor 7.0对YJ-rSPA核酸序列进行分析和合成，通过PCR将限制性酶切位点Xho I和NdeI分别引到YJ-rSPA基因的上下游，将该基因连接到相同酶切的pET-系列载体上，验证结果见图1所示。双酶切后，分别显示了载体条带和目的条带的DNA分子，因此确定得到重组质粒pET-系列-YJ-rSPA。将重组质粒转化到大肠杆菌中。IPTG诱导表达后得到同时同批以发酵上清和胞内可溶性形式表达的YJ-rSPA重组蛋白(见图2)，并经分离纯化后即可得到蛋白YJ-rSPA。

2、YJ-rSPA表达量分析

含量测定

1)Lowry法测总蛋白含量:以5mg/mL的BSA作为标准蛋白，稀释后标准蛋白的最高浓度为0.5mg/mL。先用0.8％的NaOH和4％NaOH 1:1混合，酒石酸钾和硫酸铜1:1混合，两者总体积100:2混合，取混合液5ml于各试管中，10分钟后，各管加入0.5mL福林酚试剂，30分钟后测其OD600值。

2)灰度扫描分析：利用ScnImage软件对电泳结果进行分析计算，估算出YJ-rSPA所占的百分比，进而估算出YJ-rSPA的浓度。

表1-含量测定结果

3、YJ-rSPA表达量活性分析

采用免疫扩散的试验验证YJ-rSPA与免疫球蛋白IGg的结合活性：

称取一定量的琼脂粉，按1％左右(0.8％～1.5％)的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min；将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却；根据要求(孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径)按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图；挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘；在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏；以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果；加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37℃自由扩散24h～48h。

结果如图3所示，上清和胞内可溶性表达的YJ-rSPA蛋白质都有明显的免疫沉淀线，而对照(即未诱导表达样品)无沉淀线。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海渔霁生物技术有限公司

<120> 一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白及其制备方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Pro Ala Met Ala

20

<210> 2

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaatacctgc tgccgaccgc ggcggcaggc ctgctgctgc tggctgctca gccggcgatg 60

gcggcgcagc agaacgcgtt ctaccaggtt ctgaacatgc cgaacctgaa cgcggatcag 120

tctaacggtt tcatccagag cctgaaagac gatccgtctc agtctgctaa cgttctgggt 180

gaagcacaga aactgaacga tagccaggct ccgaaagctg atgctcagca gaacaaattc 240

aacaaagatc agcagtctgc tttctatgaa atcctgaaca tgccgaacct gaacgaagaa 300

cagcgcaacg gcttcatcca gtccctgaaa gatgacccga gccagtctac caacgttctg 360

ggtgaagcta aaaaactgaa tgaatctcag gcgccaaaag cagataacaa cttcaacaaa 420

gaacagcaga acgctttcta tgaaattctg aacatgccaa acctgaatga agaacagcgt 480

aacggtttca tccagtctct gaaagatgat ccgagccaga gcgctaacct gctggctgaa 540

gcgaaaaaac tgaatgaaag ccaggcgccg aaagcggata acaaattcaa caaagaacag 600

caaaacgcat tctatgaaat cctgcacctg cctaacctga ccgaagagca gcgtaacgcg 660

tttatccaga gcctgaaaga tgatccgtct cagtctgcta acctgctggc ggaagcgaaa 720

aaactgaacg acgcgcaggc gccgaaagct gataacaaat tcaataagga acagcagaac 780

gcgttctacg aaatcctgca cctgccaaac ctgaccgaag aacagcgtaa cggcttcatc 840

cagtctctga aagacgatcc gagcgttagc aaagaaatcc tggctgaagc taaaaaactg 900

aacgatgcgc aggcaccgaa a 921

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaatacctgc tgccgaccgc tgccgcagcg gctggtctgc tgcagctgct gcctgcgatg 60

gcg 63

Claims (8)

1.一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白，其特征在于，在天然金黄色葡萄球菌A蛋白的N端加了一个短肽YJ后得到的重组蛋白，所述短肽YJ氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因，命名为yj-rspa基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因，其特征在于，所述重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因编码如权利要求1所述重组金黄色葡萄球菌A蛋白。

4.一种重组载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因。

5.根据权利要求4所述一种重组载体，其特征在于，所述载体为含有如权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因的pET系列原核表达载体。

6.一种重组工程菌，其特征在于，包括宿主细胞和共转入宿主细胞的如权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因。

7.根据权利要求6所述一种重组工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

8.一种重组金黄色葡萄球菌A蛋白的制备方法，其特征在于，

合成重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将重组金黄色葡萄球菌A蛋白基因克隆到pET系列载体上，获得重组载体；

将重组载体转入宿主细胞，得到高表达重组金黄色葡萄球菌A蛋白的重组工程菌；

利用重组工程菌表达制备重组金黄色葡萄球菌A蛋白。

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