CN103911388B - 重组艾塞那肽的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；其中，本发明还包括对Exendin‑4进行酰胺化处理的步骤。本发明利用了pET‑31b(+)本身的可以大规模，高产量的生产多肽的优点，保留了它的功能强大的启动子，克服了目前其他生产工艺中该蛋白产物容易形成包涵体的缺点，利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白的N末端进行切割，切割后的蛋白质完全是具有天然序列的Exendin‑4。经过工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化后得到重组艾塞那肽。产量可以达到500mg/升以上，比目前最先进的工艺产量提高了20倍，且均为可溶性蛋白。

Description

重组艾塞那肽的生产工艺

技术领域

本发明涉及生物多肽的合成技术领域，尤其涉及一种改进的重组艾塞那肽的生产工艺。

背景技术

糖尿病是继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人类健康的慢性非传染性疾病，近年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病患病率呈急剧上升趋势。目前我国糖尿病患者已逾7000万，并且糖尿病患者增长率是欧美国家的2倍。2型糖尿病(Type 2 Diabetes，T2DM)是糖尿病的主体，占糖尿病患者的90％左右。T2DM是由遗传和多种环境因素相互作用而引起胰岛索分泌或作用缺陷。其患病率较高，尤以中老年人为多，并呈现年轻化趋势。胰岛口细胞数目减少或分泌功能障碍是导致T2DM发病的中心环节。治疗一般遵循生活方式干预(如饮食控制、运动治疗等)、口服降糖药和联合使用胰岛素等方式。传统治疗T2DM的药物的副作用都较大，长期使用会因胰岛素分泌过度导致胰岛口细胞功能衰竭。

近年来胰高血糖素样肽1（GLP1）和enendin－4成为糖尿病治疗研究的热点。因为它们具有在血糖浓度较高的情况下促进胰岛素分泌的特性，而在血糖正常的情况下不发挥作用，不仅可使初治的２型糖尿病患者血糖恢复正常，而且对磺脲类药物治疗失效者也有降血糖作用。

Exendin-4是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离提取获得。它的氨基酸残基与哺乳动物GLP-1序列有53％的同源性，并且生物学效应也几乎完全一致其与GLP-1的最大不同之处在于N端第2位的甘氨酸(Gly)耐血液中二肽基肽酶（DPP-Ⅳ），GLP-1的相同位置则为极易被DPP-Ⅳ切断的丙氨酸（Ala），故Exendin-4被吸收入血后的半衰期较长（t1/2=9.7h ）。Exendin-4是一种强效GLP-1受体激动剂，能模拟GLP-1这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。艾塞那肽（Exenatide）的活性主要通过与人体胰脏GLP-1受体结合而介导，由环腺苷酸（cAMP）依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为Exendin-4的氨基酸结构及生物活性与GLP-1均具有相关性，故通常也被视为肠促胰岛素的一种。 由于Exendin-4的降糖作用时间较长，延缓胃排空和抑制摄食冲动对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物，因此其作为2型糖尿病治疗药物开发的潜力巨大。

目前对Exendin-4进行的药物研究主要为制备工艺，作用机制，内分泌代谢病临床，分子药理学和药剂学研究。已上市的Exendin-4药物（Exenatide）采用的是多肽合成法的制备工艺。

化学合成成本高（对原料氨基酸及仪器设备要求极高）、产量少，而利用基因工程生产Exendin－4，不仅可以实现工业化的大规模生产、有效地降低生产成本，而且对环境影响小，产品品质更安全。但用基因工程方法直接表达生产Exendin-4这样的39肽，表达水平低，且容易降解，可采用与载体蛋白(如硫氧还蛋白等)连结融合表达的方法。但这种方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所占比例很小，产量很低，且融合蛋白裂解后多肽种类很多，分离纯化困难的问题。行之有效的增加基因的表达产物的方法是构建基因串联体，根据目标基因的特点和表达产物的特性，运用适当的分子生物学操作技术将目的基因按一定的方式串联在一起，置于表达载体启动子控制之下进行表达，再将表达的串联体产物用特定的物质(酶或化学试剂)裂解，以获得目标肽单体。比如pET-31b（+）是一个常用的生产多肽的质粒，但是它用来生产多肽，当初设计是为了避免多肽容易被大肠杆菌体内的蛋白水解酶水解，所以让目的多肽和KSI融合蛋白一起表达，形成了包涵体，这对生产Exendin-4来说是个很大的缺点，如果让Exendin-4先生成包涵体再复性会造成纯化成本的大大提高和活性的难以恢复，这已是重组艾塞那肽的产业化生产的瓶颈。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供重组艾塞那肽的生产工艺，旨在解决现有重组艾塞那肽的生产工艺成本高、产量低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；

其中，构建工程菌的步骤包括：

（1）重组Exendin－4多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin－4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的目的基因；

（2）MAG2010质粒：取pET31b(+)质粒，切割掉SEQ ID No.2所示KSI融合基因片段，更换为SEQ ID No.3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GB1蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子；

（3）工程菌的构建：按照启动子-6X组氨酸-GB1-tag-肠激酶的裂解位点-exedin-4-双终止密码子 的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4，将重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4以CaCl2法转化受菌体BL21(DE3) plays，在37℃下在LB培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin-4融合表达的工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/ BL21(DE3)plays；

要使生物合成Exendin-4能进行扩大规模的生产应用，关键之一是对发酵过程优化，最大可能的利用菌株Exendin-4高产能力，以最经济的方式进行生产。

一般来说，生产可溶性蛋白时不能采用高密度发酵的方法，因为这样容易形成包涵体，目前国内外利用的培养基大多为2XYT培养基或者LB培养基来进行培养，利用的大多是实验室内研究型的摇瓶法培养。

发酵表达的步骤包括：

（1）挑单菌落到装有30 mL 目标培养基中，31℃，200rpm活化过夜；

（2）将30mL菌液接到200 mL 2XYT培养基中，32℃，200rpm 培养约2.6 hr；

（3）以10％的接种量，接到5 L MMBL培养基中，32℃，240rpm培养约3 hr；

（4）接到60 L发酵培养基中；

（5）控制生长期pH为6.8；用搅拌速度及通气量使DO≥10% ；待培养基中葡萄糖的浓度降至0.2g/L时开始补料；当OD550达到10左右时加入13 mL 1M IPTG诱导，终浓度为0.2mM，把pH缓慢调至7.00，继续培养10 小时后结束；

纯化目的蛋白的步骤采用离子交换层析-柱层析-三明治型的亲和层析进行分离和纯化；该工程菌经过发酵、纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产率；

其中，对Exendin-4进行酰胺化处理。

所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其中，所述酰胺化处理包括：

将磁珠固定化的1.0mM的羧肽酶Y，或者1.0m的羧肽酶A溶于N-苯丙氨酸甲酯中，加入25毫升的氨水和 0.4M的重组艾塞那肽，5mM的 EDTA , 反应体系总体积共计500毫升，在75℃下反应20个小时，8000rpm 离心5分钟，氨化后的重组艾塞那肽，用HPLC进行纯化,用10%-100%甲醇或者乙腈溶液进行洗脱，收集样品，所得样品利用减压蒸发除去有机溶剂，重溶于醋酸盐缓冲液中，然后真空干燥得到白色粉末状艾塞那肽，并于-20℃保存。

所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其中，所述三明治型的亲和层析包括亲和层析一、酶裂解和亲和层析二，具体步骤如下：

（1）亲和层析一：采用GE 公司的IgG- sepharose-fast flow column,首先用3个柱体积的50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCI的缓冲液平衡柱子，然后用将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱，用1倍体积上述缓冲液洗然后用5mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液洗去未结合的杂质，接着用500mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，收集、浓缩，用足量的20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6 透析12小时；

（2）肠激酶处理：1 μl的重组牛肠激酶轻链亚基在20℃，20mM Tris-HCl，100mMNaCl，pH7.6的条件下8h可以完全切割融合蛋白；

（3）亲和层析二：将上述处理过的重组Exendin-4结合在镍柱上，先用起始缓冲液冲洗脱磷酸盐缓冲液，保留洗脱组分，浓缩，冷冻干燥，得到重组的艾塞那肽。

由于艾塞那肽是一个分子量比较小的多肽，并不适合用大分子蛋白的体系进行表达，所以我们采用专门用来改造后的生产多肽表达体系：pET-31b（+）质粒 和 E. Coli(DE3) PlyS进行生产，采用这个体系有以下优点： pET-31b（+）是一个生产多肽的质粒，目的多肽和KSI融合蛋白一起表达，形成了包涵体，可以避免生产的多肽被大肠杆菌体内的蛋白水解酶水解，但是这对生产Exendin-4来说是个很大的缺点，如果让Exendin-4首先生成包涵体的形式然后再复性会造成纯化成本的大大提高和活性的难以恢复，所以我们对pET-31b（+）进行了改造，将pET-31b（+）中的KSI融合蛋白序列完全删除，同时删除蛋氨酸裂解位点（ALWN切割位点）和C末端（多肽羧基端的）组氨酸标记（His6-tag）以及终止子, 在删除的位置，取代以蛋氨酸+ His₆-tag+GB1突变序列+肠激酶裂解序列，我们将改造的pET-31b（+）形成的新质粒重新命名为Mag2010，有了这个质粒，我们首先取得Exendin-4的原始序列，然后按照大肠杆菌对于遗传密码子的偏好进行了改造，采用适合大肠杆菌表达的遗传序列，人工合成改造的Exendin-4的全序列，然后克隆岛PUC57质粒中进行大规模扩增，将扩增后的Exendin-4序列切割并纯化，然后克隆到改造好的Mag2010质粒中，并在C末端添加双重终止子，这么做的好处是利用了pET-31b(+)本身的可以大规模，高产量的生产多肽的优点，保留了它的功能强大的启动子，克服了该质粒容易形成包涵体的缺点，利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白的N末端进行切割，切割后的蛋白质完全是具有天然序列的Exendin-4。利用大肠杆菌 E.Coli BL21(DE3)PlyS表达体系的原因在于Exendin-4没有需要糖基化修饰等翻译后修饰，DNA转录时也不需要转录后修饰，所以特别适合用大肠杆菌体系进行生产，再加上我们克服了形成包涵体的问题，而E.Coli BL21(DE3)PlyS 的优点在于可以大量表达外源蛋白，而且耐外源蛋白等毒素的干扰。

本发明通过连接GB1标记融合蛋白将艾塞那肽有90%的形成包涵体的可能性变成了90%的形成可溶性蛋白。实验证明，绝大部分重组产生的艾塞那肽都处于可溶蛋白中。

在国内外进行的艾塞那肽表达的体系中，很多人采用了His6-Thioredoxin A(TrxA) 融合蛋白和Exendin-4 进行融合表达，融合蛋白分子量为14.7+4.2=18.9kd,exendin在融合蛋白中的比率为4.2/18.9=22.2%. 我们采用了自身分子量较小的GB1和Exendin-4进行融合表达，融合蛋白分子量为14.7+4.2=18.9kd, exendin在融合蛋白中的比率为4.2/11.9=35.3%。也就是说，Exendin-4在融合蛋白中的比重大大增加了，在类似的体系下，假如表达的融合蛋白总量相等，那么exendin-4在我们的体系中产量是其他体系的1.59倍。

本发明采用GB1和His-tag双标记的体系使得在纯化过程中既可以采用镍柱亲和层析，又可以采用GB1亲和层析，相对于其他的纯化方法，可以有更多的纯化选择方式。

在现有的文献报道中，产量很低，最多的也就是28毫克/升的产量，利用本发明的发酵体系，我们可以达到500毫克/升的产率，这个产量为目前发酵工艺的20倍左右，所以规模化生产后可以大大降低成本。对于艾塞那肽类的药物成本价格降低和药物的普及有着难以估量的意义，就像重组人胰岛素开发成功后对于胰岛素的普及那样有着重要的社会价值和经济价值。

本发明的生产工艺相对于目前的工艺有着显著的特点：产量可以达到500mg/升以上，比目前最先进的工艺产量提高了20倍，且均为可溶性蛋白， 在生产过程中，我们采用了本公司独特具有自主知识产权的的发酵工艺，产量大大提高，我们采用的双重亲和纯化工艺，配合传统的纯化方法，纯化效率有了极大的提高，前期粗提取的纯化，减轻了后继纯化的压力，降低了纯化的成本。

附图说明

图1为发酵过程中细菌生长曲线图。

图2为发酵过程参数监测结果图。

图3为质粒的稳定性分析结果图。

图4为质粒的细胞内含量图。

图5为活性细胞的检测结果图。

图6为聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明提供重组艾塞那肽的生产工艺，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供的重组艾塞那肽的生产工艺，其主要包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；下面对各步骤进行详细说明。

一、工程菌的构建

（1）重组Exendin－4多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin－4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的目的基因；合成后的基因克隆进质粒PUC57中，转化进大肠杆菌DH5а中进行扩增，然后用EZ Bioresearch 公司的质粒提取试剂盒进行纯化，切割后的目的基因出纯化备用。

（2）MAG2010质粒：MAG2010质粒：取pET31b(+)质粒，切割掉SEQ ID No.2所示KSI融合基因片段，更换为SEQ ID No.3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GB1蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子；构建的质粒顺序为：蛋氨酸编码序列+6XHis-tag编码序列 + GB-1编码序列 + 肠激酶酶切位点编码序列 + 和目的蛋白的基因 + 甘氨酸编码 + 双终止子。

（3）工程菌的构建：按照启动子-6X组氨酸-GB1-tag-肠激酶的裂解位点-exedin-4-双终止密码子 的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4，将重组质粒pET-31(b+)-Exendin-4以CaCl2法转化受菌体BL21(DE3) plays，在37℃下在LB培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin-4融合表达的工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/ BL21(DE3)plays。

亚克隆所用的质粒购自美国Novagen公司, 大肠杆菌DH5а和BL21(DE3)PlyS 分别购自北京索莱宝生物科技有限公司公司和红叶生物科技有限公司，所用的限制性内切酶购自大连宝生物（Takara）, 肠激酶购自美国西格玛公司（Sigma），质粒提取试剂盒采用本公司销售的美国EZ Bioresearch 小量质粒提取试剂盒。

本发明所采用的pET31b(+)质粒，其本身为一个生产带有包涵体的低分子肽的质粒，即其用来生产不溶性的包涵体的质粒，而是用来生产可溶性蛋白的质粒，所以需对该质粒进行改造，彻底去除原来容易生成包涵体的可溶性蛋白标签KSI，并且切除了该质粒最具特征的AWNI内切酶位点，替代以His-tag+GB1蛋白标签，从而使一个完全生产不可溶的包涵体的质粒变成了一个专门用来生产可溶性融合蛋白的新的质粒。本发明通过连接GB1标记融合蛋白将艾塞那肽有90%的形成包涵体的可能性变成了90%的形成可溶性蛋白。实验证明，绝大部分重组产生的艾塞那肽都处于可溶蛋白中。

二、工程菌的发酵表达

1、种子活化：

（1）种子活化：取冻存的工程菌划线在含100ul/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于20ml LB培养液中（含Amp100ul/ml），37℃培养过夜。

（2）种子液制备：取活化种子，按5％接种量接种于200ml 2XYT培养液中（含Amp100ul/ml），37℃培养6小时。

（3）5L发酵罐发酵：将种子液按5％接种量接种于装有MMBL培养基的发酵罐中，37℃，控制pH在7.0左右，通过通气及转速控制溶氧在30％。OD600为20左右时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导10小时后下罐。离心，收集菌体。

2、培养基配方

（1）L B 液体培养基（一级摇瓶）

（2）MMBL液体培养基(二级培养基)

3、发酵生产步骤：

（1）挑单菌落到装有30 mL 目标培养基中，31℃，200rpm活化过夜。将30mL菌液接到200 mL 2XYT培养基中，32℃，200rpm 培养约2.6 hr。

（2）以10％的接种量，接到5 L MMBL培养基中，32℃，240rpm培养约3 hr。

（3）接到60 L发酵培养基中。

（4）控制生长期pH为6.8；用搅拌速度及通气量使DO≥10% ；待培养基中葡萄糖的浓度降至0.2g/L时开始补料。当OD550达到10左右时加入13 mL 1M IPTG诱导（终浓度为0.2mM），把pH缓慢调至7.00，继续培养10 小时后结束。

发酵记录见下表

实验结果：

图1发酵过程中细菌生长曲线图。将4ml MMBL培养基倒入比色杯中，选用550nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用新鲜的MMBL液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，是培养液实际的OD值。

发酵过程参数监测结果见图2。（1）温度：设定为32℃，发酵过程中有轻微波动（2）转速：起始转速设定为250rpm，转速与溶解氧联动，当溶氧降低至设定最低值时，转速开始增加，以保证发酵罐中的溶解氧浓度维持在一定浓度。（3）pH：发酵罐灭菌后pH为7.15，接种前调整为6.8，发酵5hr时IPTG诱导，pH开始回升，控制pH在7.2～7.3之间直至发酵结束。（4）溶解氧：发酵设置溶解氧≥10，与转速和通风量联动，当溶氧降至最低值时，通风量增大，转速开始增加，以维持溶解氧浓度。

质粒的稳定性分析结果见图3。将含有质粒的单细菌培养细胞稀释106倍，取10毫升培养，直到细胞浓度为 108 CFU/ml, 然后再用新鲜的培养基稀释 104- 106倍， 重复以上操作直到细胞完成200 代非饱和生长，为了保证细胞一直处于对数期生长，细胞的浓度用OD600 来监控生长，并且用平板计数来确定。 在每个稀释点，稀释的培养细胞铺板在LBHagar 板上（含5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside），用带有蓝色Lac+(plasmid-containing) 和白色的white Lac− (plasmid-free)来比较数量的差异，同时细胞传代的数量也可以用来鉴定质粒的稳定性。

质粒的细胞内含量见图4。为了从侧面的方面考证细胞中质粒的含量，将各个时间点的发酵液离心，得到菌体，利用小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提，抽提得到的质粒在1%的Agar胶上进行检测，10小时内细胞中含有足量的质粒来表达所需蛋白的mRNA。

活性细胞的检测结果见图5。将各个时间点的发酵液离心，得到菌体，利用细胞计数器在显微镜下检测，然后铺板进行平板培养，培养得到的结果和显微镜检测的结果差异比较可以得到死细胞数。

三、目的蛋白的纯化

将60L发酵后的发酵液利用连续流离心机进行离心沉淀(8000rpm)，得到5000g菌体沉淀，弃上清。所得菌体用磷酸盐缓冲液(pH=7.4)清洗3次，清洗后的菌体进行破碎。

破碎工艺1：超声波破碎：

功率60%, 工作3秒，间隔3秒，300个循环，直到超声液变得澄清透明为止，离心10，000 rpm 10分钟，去除沉淀（未破碎的细胞，细胞壁等），所得组分均由SDS-PAGE进行检测分析。

破碎工艺2：低温高压破碎

采用JN-3000低温超高压连续流细胞破碎机，将连续流离心机和JN-3000低温超高压连续流细胞破碎以联用，可以解决菌体收集，细胞破碎-去除破碎后的细胞碎片，收集上清（含可溶性蛋白质）的操作流程的全自动化，大大节省了人力，和时间。主要技术指标： 压力200MPa连续流35ml/分 (2.1升/小时)电源220V 1.5KW破碎全程在水浴槽中进行，加冰块。

图6是聚丙烯酰胺凝胶电泳图。从发酵罐中取样20微升，分别加入2X上样缓冲液，室温孵育30分钟，上样，在伯乐Mini-3电泳中进行凝胶电泳，结果显示在分子量11.92附近出现明显的条带，和预期的目的蛋白分子量相符。

核酸杂质的处理：

添加20mg/L 的DNase， RNase 进行水解核酸，水解温度为37℃，孵育时间为30min。

硫酸铵沉淀：

然后将破碎机核酸酶处理后的上清用梯度硫酸铵进行分级沉淀：在不断搅拌中缓慢加入所需的硫酸铵的用量，硫酸铵的浓度分别为（20%，40%， 60%，80%），将沉淀后的重组Exendin-4（40-80%）重新溶解磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中。

离子交换层析：

取5千克GE Healthcare life science 的阳离子交换柱 QSHP（GE Healthcare），装柱,先用磷酸盐缓冲液(pH=7.4)洗脱5个柱体积，然后采用含有不同浓度（0.1M-0.5M）的氯化钠的磷酸缓冲液（pH=7）,进行梯度洗脱（3个柱体积/缓冲液。所得组分均由SDS-PAGE进行检测分析。

柱层析：

根据Exendin-4融合蛋白的分子量在～12 KD的特点，将洗脱得到的融合蛋白利用切相流浓缩，上柱, 采用5KG的GE Healthcare life science 分子筛 Sephadex G-50medium 进一步分离，采用15L的磷酸盐缓冲液（50mM, pH=7）进行缓冲液，洗脱体积为3个柱体积。

酰胺化：采用的酶为重组甘氨酸酰胺化单氧酶，采用反应体系， 100 mM TES (N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethane sulfonic acid)， 4.7μM 铜离子，5.5mM 维生素C 缓冲液, 1mU/ml 甘氨酸酰胺化酶， pH 7.0, 反应温度为 37° C. 反应时间：3小时。

亲和层析工艺一：采用GE 公司的IgG- sepharose-fast flow column (GEHealthcare), 首先用3个柱体积的50 mM Tris, pH 7.5,150 mM NaCI的缓冲液平衡柱子，然后用将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱，用1倍体积上述缓冲液洗然后用5mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液洗去未结合的杂质，接着用500mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，收集、浓缩，用足量的20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6 透析12小时。准备酶水解。

肠激酶处理：

1 μl的重组牛肠激酶轻链亚基在20℃，20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6的条件下8h可以完全切割融合蛋白。

亲和层析工艺二：将上述处理过的重组Exendin-4结合在镍柱上，先用起始缓冲液冲洗脱磷酸盐缓冲液（50mM, pH=7），保留洗脱组分，浓缩，冷冻干燥，得到重组的艾塞那肽。上述处理完以后采用增加缓冲液中咪唑浓度（0.1-0.5M）的方法将结合在柱子上的组蛋白-GB1融合蛋白洗脱出来，清洗柱子并对其按照说明书再生。

除盐和肠激酶杂质：

除盐工艺1：

根据Exendin-4蛋白的分子量在～4.2 KD的特点，将洗脱得到的目标组分浓缩，上柱, 采用GE Healthcare life science 分子筛 Sephadex G-25 medium 进一步分离，利用磷酸盐缓冲液（50mM, pH=7）进行缓冲液，除盐。

除盐工艺2：

采取切相流超滤的方式进行除盐。Exendin-4蛋白的分子量在～4.2 KD, 比较适合用超滤除盐和浓缩，与一般超滤过程相似。主要考察操作压力、操作时间及料液流速对超滤过程的影响，为生产过程提供技术工艺参数

Exendin-4含量的测定：

采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)（Thermo ScientificPierce ，美国），按照说明书操作步骤进行蛋白含量的测定。结果显示，产量1. BCA 工作液配制:根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA

工作液，充分混匀。

2. 根据需要取适量BSA蛋白标准，加入去离子水稀释成1mg/ml（原液5mg/ml），并混匀。

注意：原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用

去离子水、0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的蛋白标准品也可以-20℃长期保存。以下步骤中均默认采用去离子水，可以根据条件选择使用稀释液。

3. 标准曲线绘制：取8个比色皿分别编号为A-H，按以下表格数据加入试剂：（此方案工作线性范围为50-1000ug/ml。）

孔号	A	B	C	D	E	F	G	H
									蛋白标(1)	0	5	10	20	40	60	80	100
去离子水(1)	100	95	90	80	60	40	20	0
									BCA工作液(1)	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000	1000
对应的蛋白含量(g)	0	5	10	20	40	60	80	100

最终体积 1200ul

4. 振荡混匀后，37℃放置30 分钟。

5. 用分光光度计测定 562nm 处的吸光值，以不含 BSA 的光吸收值为空白对照。

6. 以蛋白含量（μ g）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。

7. 样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取 100μ l 样品，加入 1000μ l BCA

工作液，混匀后 37℃放置 30 分钟，然后以 A 号比色皿为对照，测定样品吸收值A562。

8. 根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。

艾塞那肽的产率约为500mg/L 发酵液。

在本实施例中，还对Exendin-4 进行酰胺化处理：

利用非水酶催化合成的原理，将磁珠固定化的1.0mM的羧肽酶Y，或者1.0 m的羧肽酶A溶于N-苯丙氨酸甲酯中， 加入25毫升的氨水和 0.4M 的重组艾塞那肽， 5mM的 EDTA ,反应体系总体积共计500毫升， 在75℃ 下反应20个小时，8000 rpm 离心5分钟，氨化后的重组艾塞那肽，用HPLC进行纯化, 用10%-100% 甲醇或者乙腈溶液进行洗脱，收集样品， 所得样品利用减压蒸发除去有机溶剂，重溶于醋酸盐缓冲液中，然后真空干燥得到白色粉末状艾塞那肽，并于-20℃保存。

在传统的高密度发酵技术中，若环境未优化好，最后只能生产大量的菌体，而目的蛋白的表达则受到限制，或者出现目的蛋白正常表达而未达到高密度发酵的目的，总体的蛋白表达量也大大降低。本发明则对发酵条件进行了优化，最终确定了上述优化后的发酵条件，另外，本发明采用了低温高压破碎系统，类似于美国的French Press，在保持低温的同时细胞破碎的效率达到了99.99%，镜检结果显示没有任何完整细胞，既能使蛋白保持活性，又能提高收率。

<110> 东莞市麦亘生物科技有限公司

<120>一种生产重组艾塞那肽的生产工艺

<160> 3

<210> 1

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<222> （1）…（117）

<400> 1

catggcgaag gtaccttcac gagcgatctg tctaaacaaa tggaagaaga agcggttcgt 60

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<210> 2

<211> 394

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<222> （1）…（394）

<400>2

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<210> 3

<211>

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<222> （1）…（204）

<400>3

atgcaccatc atcatcatca catgcagtac aaggtcatcc tgaacggcaa gacgctgaaa 60

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gtgacggaag atgacgatga caag 204

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；

其中，构建工程菌的步骤包括：

（1）重组艾塞那肽多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码艾塞那肽的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的目的基因；

（2）MAG2010质粒：取pET-31b(+)质粒，将pET-31b(+)中的KSI融合基因序列完全删除，同时删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和3’端组氨酸标记以及终止子，在删除的位置，取代以蛋氨酸-6X组氨酸-GB1标签序列-肠激酶裂解位点序列，将改造的pET-31b(+)形成的新质粒重新命名为Mag2010；

（3）工程菌的构建：将艾塞那肽基因序列切割并纯化，然后克隆到改造好的Mag2010质粒中的肠激酶裂解位点序列，目的基因3’端添加有双重终止子，得到重组质粒pET-31 b(+)-艾塞那肽，将重组质粒pET-31 b (+)-艾塞那肽以CaCl₂法转化受菌体BL21(DE3)plays，在37℃下在LB培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组艾塞那肽融合表达的工程菌；

发酵表达的步骤包括：

（1）挑单菌落到30 mL 目标培养基中，31℃，200rpm活化过夜；

（2）将30mL菌液接到200 mL 2XYT培养基中，32℃，200rpm 培养约2.6 hr；

（3）以10％的接种量，接到5 L MMBL培养基中，32℃，240rpm培养约3 hr；

（4）接到60 L发酵培养基中；

（5）控制生长期pH为6.8；用搅拌速度及通气量使DO≥10% ；待培养基中葡萄糖的浓度降至0.2g/L时开始补料；当OD550达到10左右时加入13 mL 1M IPTG诱导，终浓度为0.2mM，把pH缓慢调至7.00，继续培养10 小时后结束；

纯化目的蛋白的步骤采用离子交换层析-Sephadex G-50凝胶过滤层析-三明治型的亲和层析进行分离和纯化；该工程菌经过发酵、纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产率；

其特征在于，对艾塞那肽进行酰胺化处理；

所述酰胺化处理包括：

将磁珠固定化的体系终浓度为1.0mM的羧肽酶Y，或者体系终浓度为1.0mM的羧肽酶A溶于N-苯丙氨酸甲酯中，加入25毫升的氨水和体系终 浓度为0.4M的重组艾塞那肽，体系终浓度为5mM的 EDTA , 反应体系总体积共计500毫升， 在75℃下反应20个小时，8000rpm 离心5分钟，酰胺化的重组艾塞那肽，用HPLC进行纯化, 用10%-100%甲醇或者乙腈溶液进行洗脱，收集样品，所得样品利用减压蒸发除去有机溶剂，重溶于醋酸盐缓冲液中，然后真空干燥得到白色粉末状酰胺化艾塞那肽，并于-20℃保存；

所述三明治型的亲和层析包括亲和层析一、酶裂解和亲和层析二，具体步骤如下：

（1）亲和层析一：采用GE 公司的IgG- sepharose-fast flow column,首先用3个柱体积的50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCI的缓冲液平衡柱子，然后将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱，用1倍体积上述缓冲液洗然后用5mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液洗去未结合的杂质，接着用500mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，收集、浓缩，用足量的20mMTris-HCl，100mM NaCl，pH7.6 透析12小时；

（2）肠激酶处理：1 μl的重组牛肠激酶轻链亚基在20℃，20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6的条件下8h可以完全切割融合蛋白；

（3）亲和层析二：将上述处理过的重组艾塞那肽结合在镍柱上，先用起始缓冲液洗脱磷酸盐缓冲液，保留洗脱组分，浓缩，冷冻干燥，得到重组的艾塞那肽。