CN111087477B - GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111087477B
CN111087477B CN202010005424.2A CN202010005424A CN111087477B CN 111087477 B CN111087477 B CN 111087477B CN 202010005424 A CN202010005424 A CN 202010005424A CN 111087477 B CN111087477 B CN 111087477B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpha
gbm
fusion protein
nucleotide fragment
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010005424.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111087477A (zh
Inventor
杨滨
王丽
高雪丹
黄卓春
张君龙
胡静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
West China Hospital of Sichuan University
Original Assignee
West China Hospital of Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by West China Hospital of Sichuan University filed Critical West China Hospital of Sichuan University
Priority to CN202010005424.2A priority Critical patent/CN111087477B/zh
Publication of CN111087477A publication Critical patent/CN111087477A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111087477B publication Critical patent/CN111087477B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
    • C12N2800/105—Plasmid DNA for invertebrates for insects

Abstract

本发明涉及抗原制备领域，具体而言，提供了一种GBM‑7S(α1)‑NC1(α3)融合蛋白及其制备方法。本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的GBM‑7S(α1)‑NC1(α3)融合蛋白。该融合蛋白的抗原性好，可以有效被人GBM抗体识别反应。本发明提供的GBM‑7S(α1)‑NC1(α3)融合蛋白的制备方法，将载体与本发明提供的核苷酸片段构建的重组载体，转染昆虫细胞后进行蛋白表达，得到GBM‑7S(α1)‑NC1(α3)融合蛋白。该方法使得利用昆虫细胞即可大量稳定地表达得到抗原性好的GBM抗原，该方法简单易操作，整个流程中得到的生物模块均可独立保藏和应用。

Description

GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗原制备领域，具体而言，涉及一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法。
背景技术
球状基底膜蛋白(glomerular basement membranes，GBM)是抗GBM抗体的靶抗原，其主要抗原位点位于肾小球基底膜的Ⅳ型蛋白α3链(Collagen alpha-3(IV)chain，下称COL4α3)中的NC1结构域。获取天然的GBM蛋白需要从肾脏中提取，提取的难度很高且产量较低，因此重组GBM蛋白的表达很有价值。
人的球状基底膜(GBM)Ⅳ型蛋白主要由6个亚型，分别为：α1、α2、α3、α4、α5和α6六种亚型。其主要抗原位点位于α3亚型中的NC1结构域。GBM蛋白主要由N端的7s结构域、C端的NC1结构域和位于两者之间的三重螺旋结构域，其中NC1结构域是主要的抗原位点。现有技术中用大肠杆菌表达的GBM蛋白的NC1结构域(下称GBM-NC1)溶解性较差且不能被人GBM抗体识别反应；在昆虫细胞中单独表达GBM-NC1结构域，蛋白亦不表达。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白，以缓解现有技术中GBM抗原抗原性差从而急需新抗原的问题。
本发明的第二目的在于提供一种编码上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的核苷酸片段，含有该核苷酸片段的重组载体或细胞系，这些生物模块均可稳定保存GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的序列，随时快速得到GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白。
本发明的第三目的在于提供上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及相关生物模块在制备抗GBM抗体中的应用，以及制备得到的抗GBM抗体。
本发明的第四目的在于提供上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的制备方法，以缓解现有技术中在昆虫细胞表达体系中无法制备GBM抗原的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码上述所述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的核苷酸片段。
进一步地，所述核苷酸片段还包括信号肽序列；
优选地，所述信号肽序列包括GP67信号肽序列，所述GP67信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述核苷酸片段还包括蛋白标签；
优选地，所述蛋白标签包括6his-tag标签。
含有上述核苷酸片段的重组载体；
优选地，所述重组载体包括克隆载体或表达载体。
含有上述核苷酸片段的细胞系；
优选地，所述细胞系包括昆虫细胞，进一步优选为sf9细胞或High Five细胞。
上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白或核苷酸片段或重组载体或细胞系在制备抗GBM抗体中的应用。
应用上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白或核苷酸片段或重组载体或细胞系制备得到的抗GBM抗体。
一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的制备方法，将载体与上述核苷酸片段构建得到的重组载体，转染昆虫细胞后进行蛋白表达，得到GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白。
进一步地，所述核苷酸片段的制备方法包括：
(a)对人COL4α1基因的7S结构域进行PCR扩增得到PCR产物；
(b)对人COL4α3基因的NC1结构域进行PCR扩增得到PCR产物；
(c)将(a)中的PCR产物与(b)中的PCR产物连接得到核苷酸片段；
优选地，所述(a)中PCR产物去除氨基酸1-27位的信号肽，在5’端加上GP67信号肽；
优选地，所述(b)中PCR产物，在3’端加上6his-tag标签。
进一步地，所述载体包括表达载体，优选为pFastBac1质粒；
优选地，所述昆虫细胞包括sf9细胞或High Five细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白。发明人将COL4α1的7S结构域与COL4α3的NC1结构域连接，得到融合蛋白，使得该融合蛋白可以通过昆虫细胞表达体系稳定大量表达得到，融合蛋白的抗原性好，可以有效被人GBM抗体识别反应。
本发明提供的编码上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的核苷酸片段，含有该核苷酸片段的重组载体或细胞系，这些生物模块从不同水平均可稳定保存GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的序列，可以随时快速得到GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白。
本发明提供的GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的制备方法，将载体与本发明提供的上述核苷酸片段构建的重组载体，转染昆虫细胞后进行蛋白表达，得到GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白。该方法填补了现有技术中缺少在昆虫细胞表达体系中制备GBM抗原的技术空白，使得利用昆虫细胞即可大量稳定地表达得到抗原性好的GBM抗原，该方法简单易操作，整个流程中得到的生物模块均可独立保藏和应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例5中纯化蛋白的SDS-PAGE验证结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。发明人将COL4α1的7S结构域与COL4α3的NC1结构域连接，得到GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白，使得该融合蛋白可以通过昆虫细胞表达体系稳定大量表达得到，融合蛋白的抗原性好，可以有效被人GBM抗体识别反应。
GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的氨基酸序列：
KGGCAGSGCGKCDCHGVKGQKGERGLPGLQGVIGFPGMQGPEGPQGPPGQKGDTGEPGLPGTKGTRGPPGASGYPGNPGLPGIPGQDGPPGPPGIPGCNGTKGERGPLGPPGLPGFAGNPGPPGLPGMKGDPGEILGHVPGMLLKATWTTRGFVFTRHSQTTAIPSCPEGTVPLYSGFSFLFVQGNQRAHGQDLGTLGSCLQRFTTMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWLSTPALMPMNMAPITGRALEPYISRCTVCEGPAIAIAVHSQTTDIPPCPHGWISLWKGFSFIMFTSAGSEGTGQALASPGSCLEEFRASPFLECHGRGTCNYYSNSYSFWLASLNPERMFRKPIPSTVKAGELEKIISRCQVCMKKRH
(SEQ ID NO.1)。
本发明又提供编码上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的核苷酸片段，含有该核苷酸片段的重组载体或细胞系，这些生物模块从不同水平均可稳定保存GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的序列，可以随时快速得到GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白。
在优选地实施方式中，核苷酸片段还包括信号肽序列，信号肽有利于GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白在表达系统中向分泌通路转移。信号肽序列优选为GP67信号肽序列等，GP67信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在优选地实施方式中，核苷酸片段还包括蛋白标签，蛋白标签有利于GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的纯化。蛋白标签优选为6his-tag标签等。
在优选地实施方式中，重组载体包括克隆载体或表达载体。
在优选地实施方式中，细胞系包括昆虫细胞，进一步优选为sf9细胞或High Five细胞。
本发明提供上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白或核苷酸片段或重组载体或细胞系在制备抗GBM抗体中的应用。
应用上述GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白或核苷酸片段或重组载体或细胞系制备得到的抗GBM抗体。
一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的制备方法，将载体与本发明提供的核苷酸片段构建的重组载体，转染昆虫细胞后进行蛋白表达，得到GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白。该方法填补了现有技术中缺少在昆虫细胞表达体系中制备GBM抗原的技术空白，使得利用昆虫细胞即可大量稳定地表达得到抗原性好的GBM抗原，该方法简单易操作，整个流程中得到的生物模块均可独立保藏和应用。
在优选地实施方式中，核苷酸片段的制备方法包括：
(a)对人COL4α1基因的7S结构域进行PCR扩增得到PCR产物；
(b)对人COL4α3基因的NC1结构域进行PCR扩增得到PCR产物；
(c)将(a)中的PCR产物与(b)中的PCR产物连接得到核苷酸片段。
在优选地实施方式中，(a)中PCR产物去除氨基酸1-27位的信号肽，在5’端加上GP67信号肽。优化信号肽有利于融合蛋白的分泌，有利于后续的蛋白纯化。
在优选地实施方式中，(b)中PCR产物，在3’端加上6his-tag标签。将融合蛋白添加蛋白标签，有利于后续的蛋白纯化。
在优选地实施方式中，载体包括表达载体，优选为pFastBac1质粒，昆虫细胞优选为sf9细胞或High Five细胞。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的分泌表达方法
(1)对人COL4α1基因的7S结构域进行PCR扩增得到PCR产物，去除氨基酸1-27位的信号肽，在5’端加上GP67信号肽，GP67信号肽的氨基酸序列如下：MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFA(SEQ ID NO.2)；
(2)对人COL4α3基因的NC1结构域进行PCR扩增。5’端引物为ggctttgtcttcacccgac(SEQ ID NO.3)，3’端引物为tcttttcttcatgcac(SEQ ID NO.4)。得到PCR产物；
(3)把上述两个基因片段依次连接并插入载体pFastBac1的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，并在3’端加上6his-tag标签，重组片段为GP67-7S(α1)-NC1(α3)-6histag，构建表达质粒GP67-7S(α1)-NC1(α3)-6histag；
(4)将上述表达质粒热激法转化入E.coli DH10Bac感受态细胞中，并于LB琼脂培养平板(含50μg/mL Kana，7μg/mL Gentamicin，10μg/mL tetracycline，40μg/mL X-Gal，40μg/mL IPTG)上培养，37℃培养2d挑取显色为白色的阳性菌落进行菌落PCR验证，验证为阳性后扩大培养并提取GP67-7S(α1)-NC1(α3)-6histag Bacmid DNA(下称Bacmid DNA)。
实施例2P1代病毒的制备
(1)六孔板中接种约90万个Sf9细胞(处于对数生长期且活率大于95％)，27℃培养1小时，使细胞贴壁。
(2)待细胞完全贴壁后吸出培养基，用1.5ml培养基(SF900-III，无抗生素无血清)清洗细胞去除残留的抗生素。
(3)加入1.5ml培养基(SF900-III，无抗生素无血清)继续培养，待转染。
(4)Bacmid DNA与转染试剂混合物准备。
①取一个1.5ml无菌离心管，将16μg Bacmid DNA稀释进入100μl SF900-III培养基(无抗生素无血清)中，用枪轻轻吹打混匀，室温静置约2-5min；
②另取一个1.5ml无菌离心管，吸取8μl转染试剂稀释进100μl SF900-III培养基(无抗生素无血清)中，用枪轻轻吹打均匀，室温静置约2-5min；
③将稀释的Bacmid DNA用移液器轻轻加入到稀释的转染试剂中，用枪轻轻吹打混匀，室温静置20min。
(5)200μl Bacmid DNA与转染试剂混合物均匀滴加到细胞孔中，轻轻晃动混匀。
(6)27℃培养4h后，更换新鲜培养基(SF900-III，2％FBS，1％青链霉素)继续培养5d后离心收集上清，即为P1代病毒，避光保存。
实施例3P2代病毒的制备
(1)250mL摇瓶中加入40ml密度为2×106/ml的Sf9细胞(处于对数生长期且活率大于95％)，培养基SF900-III(2％FBS，1％青链霉素)。
(2)加入500μl P1病毒，27℃、转速100rpm避光继续培养，每天检测细胞密度及直径大小变化。
(3)感染后培养4d后，离心收集上清，即为P2代病毒，4℃避光暂存。
实施例4蛋白表达
(1)1个1000ml摇瓶中，加入400ml密度约为1.5×106/ml的High Five细胞(处于对数生长期且活率大于95％)。
(2)加入6ml P2病毒，27℃避光培养，转速为100rpm/min。加入病毒后24h、48h和72h进行细胞计数，观察细胞数量、细胞活率和直径。
(3)感染后培养72h后，离心收集培养基上清。
实施例5蛋白纯化：
(1)Ni柱亲和层析:收集的培养基上清上样已平衡好的Ni HiTrap柱子，分别用50mM、100mM、200mM和500mM浓度的咪唑溶液洗脱并收集洗脱峰。
(2)离子交换层析:上样已平衡好的SP HiTrap柱子，低盐buffer冲洗10个CV，然后高盐洗脱收集，SDS-PAGE胶验证蛋白的纯度如图1。
效果例抗原验证
采用免疫荧光法验证抗原，其原理是将荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与对应的抗原(或抗体)反应后，在荧光判读仪下测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
在本验证中，将待验证重组GBM-7S(α1)-NC1(α3)抗原包被Elisa板，然后加入已知阴性或阳性的血清样本与之反应，然后封闭和洗涤，最后用带有荧光素枣红蛋白(PE)的二抗孵育，再次洗涤后在荧光判读仪下检测对应的荧光值，重组GBM-7S(α1)-NC1(α3)蛋白的验证数据如表1所示，从表1可以看出，阳性样本的荧光值显著高于阴性样本，重组蛋白的抗原性良好。
表1
Figure BDA0002355096140000091
Figure BDA0002355096140000101
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Gly Gly Cys Ala Gly Ser Gly Cys Gly Lys Cys Asp Cys His Gly
1 5 10 15
Val Lys Gly Gln Lys Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Leu Gln Gly Val
20 25 30
Ile Gly Phe Pro Gly Met Gln Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Pro Pro
35 40 45
Gly Gln Lys Gly Asp Thr Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Thr Lys Gly
50 55 60
Thr Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Asn Pro Gly Leu
65 70 75 80
Pro Gly Ile Pro Gly Gln Asp Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ile Pro
85 90 95
Gly Cys Asn Gly Thr Lys Gly Glu Arg Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly
100 105 110
Leu Pro Gly Phe Ala Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Met
115 120 125
Lys Gly Asp Pro Gly Glu Ile Leu Gly His Val Pro Gly Met Leu Leu
130 135 140
Lys Ala Thr Trp Thr Thr Arg Gly Phe Val Phe Thr Arg His Ser Gln
145 150 155 160
Thr Thr Ala Ile Pro Ser Cys Pro Glu Gly Thr Val Pro Leu Tyr Ser
165 170 175
Gly Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln
180 185 190
Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro
195 200 205
Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn
210 215 220
Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met
225 230 235 240
Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr
245 250 255
Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala Ile Ala Val His Ser Gln Thr Thr
260 265 270
Asp Ile Pro Pro Cys Pro His Gly Trp Ile Ser Leu Trp Lys Gly Phe
275 280 285
Ser Phe Ile Met Phe Thr Ser Ala Gly Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala
290 295 300
Leu Ala Ser Pro Gly Ser Cys Leu Glu Glu Phe Arg Ala Ser Pro Phe
305 310 315 320
Leu Glu Cys His Gly Arg Gly Thr Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr
325 330 335
Ser Phe Trp Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Arg Met Phe Arg Lys Pro
340 345 350
Ile Pro Ser Thr Val Lys Ala Gly Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Arg
355 360 365
Cys Gln Val Cys Met Lys Lys Arg His
370 375
<210> 2
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala
35
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggctttgtct tcacccgac 19
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcttttcttc atgcac 16

Claims (18)

1.一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的核苷酸片段。
3.根据权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段还包括编码信号肽序列的核苷酸片段。
4.根据权利要求3所述的核苷酸片段，其特征在于，所述信号肽序列为GP67信号肽序列，所述GP67信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求2-4任一项所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段还包括编码蛋白标签的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的核苷酸片段，其特征在于，所述蛋白标签为6his-tag标签。
7.含有权利要求2-6任一项所述的核苷酸片段的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为克隆载体或表达载体。
9.含有权利要求2-6任一项所述的核苷酸片段的细胞系。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为昆虫细胞。
11.根据权利要求10所述的细胞系，其特征在于，所述昆虫细胞为sf9细胞或High Five细胞。
12.一种GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白的制备方法，其特征在于，将载体与权利要求2-6任一项所述的核苷酸片段构建得到的重组载体，转染昆虫细胞后进行蛋白表达，得到GBM-7S(α1)-NC1 (α3)融合蛋白。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述核苷酸片段的制备方法包括：
（a）对人COL4α1基因的7S结构域进行PCR扩增得到PCR产物；
（b）对人COL4α3基因的NC1结构域进行PCR扩增得到PCR产物；
（c）将（a）中的PCR产物与（b）中的PCR产物连接得到核苷酸片段。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述（a）中PCR产物去除编码氨基酸1-27位的信号肽的核苷酸序列，在5’端加上编码GP67信号肽的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述（b）中PCR产物，在3’端加上编码6his-tag标签的核苷酸序列。
16.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述载体为表达载体。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述载体为pFastBac1质粒。
18.根据权利要求12-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞为sf9细胞或High Five细胞。
CN202010005424.2A 2020-01-03 2020-01-03 GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法 Active CN111087477B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010005424.2A CN111087477B (zh) 2020-01-03 2020-01-03 GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010005424.2A CN111087477B (zh) 2020-01-03 2020-01-03 GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111087477A CN111087477A (zh) 2020-05-01
CN111087477B true CN111087477B (zh) 2021-10-08

Family

ID=70399576

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010005424.2A Active CN111087477B (zh) 2020-01-03 2020-01-03 GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111087477B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111087477B (zh) * 2020-01-03 2021-10-08 四川大学华西医院 GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999065940A1 (en) * 1998-06-17 1999-12-23 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
CN101466732A (zh) * 2006-06-12 2009-06-24 横山司甫 Iv型胶原样免疫反应性多肽
WO2016019036A2 (en) * 2014-07-29 2016-02-04 Vanderbilt University Recombinant collagen iv surrogates and uses thereof
CN111087477A (zh) * 2020-01-03 2020-05-01 四川大学华西医院 GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999065940A1 (en) * 1998-06-17 1999-12-23 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
CN1309663A (zh) * 1998-06-17 2001-08-22 贝斯以色列护理医疗中心 抗血管生成蛋白及其应用
CN101466732A (zh) * 2006-06-12 2009-06-24 横山司甫 Iv型胶原样免疫反应性多肽
WO2016019036A2 (en) * 2014-07-29 2016-02-04 Vanderbilt University Recombinant collagen iv surrogates and uses thereof
CN111087477A (zh) * 2020-01-03 2020-05-01 四川大学华西医院 GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Epitope recognized by anti-glomerular basement membrane (GBM) antibody in a patient with repeated relapse of anti-GBM disease;Yuka Nishibata等;《Expreimental and Molecular Pathology》;20190225;第107卷;第166页左栏第4段-第169页左栏第2段 *
Yuka Nishibata等.Epitope recognized by anti-glomerular basement membrane (GBM) antibody in a patient with repeated relapse of anti-GBM disease.《Expreimental and Molecular Pathology》.2019,第107卷第165-170页. *
丁焦生等.抗肾小球基底膜抗体及其靶抗原的研究进展.《国外医学 泌尿系统分册》.2001,第2卷 *
抗肾小球基底膜抗体及其靶抗原的研究进展;丁焦生等;《国外医学 泌尿系统分册》;20010325;第2卷;摘要，第49页左栏第1段-第50页右栏第2段 *
抗肾小球基底膜抗体在各类肾小球疾病中的检测及其致病性研究;吕红;《中华肾脏病杂志》;19951231;第3卷;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111087477A (zh) 2020-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023521531A (ja) 組換えヒトｘｖｉｉ型コラーゲン、調製方法、及び使用
WO2023098523A1 (zh) 重组胶原蛋白、制备方法及其应用
CN111087477B (zh) GBM-7S(α1)-NC1(α3)融合蛋白及其制备方法
NL2025015B1 (en) Method for Efficiently Expressing PCV2 Cap and PCV3 Cap Fusion Protein
CN107664697B (zh) 表达载体及其制备方法、pedv-s1蛋白及包含该蛋白的间接elisa检测试剂盒
CN104725517A (zh) 一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法
CN111875676A (zh) 非洲猪瘟病毒免疫原的p49突变蛋白、重组载体、大肠杆菌基因工程菌及制备方法和应用
CN111575308A (zh) 梅毒螺旋体重组嵌合抗原及其制备方法、用途
CN113355343A (zh) 一种基于自组装的表面展示氟化酶的方法
CN111088241B (zh) 基因工程改造的人溶菌酶
CN106834324B (zh) 一种能促进蛋白可溶性表达及提高表达量的重组表达载体
CN111019926B (zh) Tev蛋白酶变体、其融合蛋白及制备方法和用途
CN108588084B (zh) 一种基因工程鲎血g因子及其制备方法和应用
CN112225781B (zh) 一种表达新型冠状病毒n蛋白的方法
CN114181973A (zh) 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法
CN109957559A (zh) 一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用
CN110261599B (zh) 一种检测a、b亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒及其应用
CN102174104A (zh) 鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用
CN102154260A (zh) 一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法
CN114736273B (zh) 一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用
WO2023045470A1 (zh) 一种重组促甲状腺激素受体蛋白、制备方法及应用
CN106867966B (zh) 稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法
WO2024087784A1 (zh) 酵母重组xvii型人源化胶原蛋白及其制备方法
CN114317504B (zh) 一种鲎因子c截短蛋白及其制备方法和应用
CN115261333B (zh) NT-proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant