CN114736273B - 一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用 - Google Patents

一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用，所述裂解蛋白E与噬菌体phiX174的裂解蛋白一样拥有一个保守的跨膜区，能有效抑制大肠杆菌的生长，该裂解蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，编码该裂解蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过将噬菌体alpha3的裂解蛋白E的基因克隆到表达载体上，进而得到可高效表达裂解基因E的重组大肠杆菌。实验证明，所述裂解蛋白E可以有效在大肠杆菌表面形成孔道，起始诱导OD高，裂解持续时间长，裂解效率可达99.99％，为进一步大规模制备大肠杆菌菌影提供基础。

Description

一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种大肠杆菌噬菌体裂解蛋白应用。
背景技术
单链DNA噬菌体phiX174等小噬菌体只编码跨膜孔形成蛋白(即穿孔素蛋白)单一裂解基因，这类噬菌体并不导致宿主细胞完全裂解，而是引起细胞膜出现孔道造成细胞内容物流失，形成细胞壁几乎完好无损的细菌空壳——即菌影。菌影内部虽然没有细胞成分，但其保留了天然活菌原有的细胞形态，包括菌毛、纤毛、脂多糖、肽聚糖和脂质A等天然免疫刺激复合物，是最接近活细菌形态的一类细菌衍生物递送系统。也因为菌影与吞噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞具有良好的结合能力，能够被抗原递呈细胞有效利用，尤其是通过口服、滴鼻、点眼等途径进行免疫，可诱导强烈的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答，常被开发用于佐剂、疫苗等领域。此外，菌影的空腔结构还可以接收大量外源物质，包括亲疏水性药物，蛋白质抗原、核酸等，作为递送载体，菌影对提高物质的稳定性和溶解度，减少药物的剂量和毒副作用具有极大的意义。
目前普遍认为菌影是通过调控噬菌体phiX174裂解基因E的表达而形成的，该基因编码的裂解蛋白由91个氨基酸残基组成，通过裂解蛋白E在细胞内膜聚集和构象改变从而促进细胞内外膜融合，裂解的孔道一般大小为40～200nm。跨膜孔道的形成过程一般有以下几个阶段：阶段一表达裂解蛋白E并整合到细菌细胞内膜，此时其C末端面向细胞质；阶段二裂解蛋白E的第21位脯氨酸残基发生顺反异构使得裂解蛋白E整合到外膜，并形成寡聚体，此时裂解蛋白的C末端穿出内膜，在周质腔中；阶段三细菌细胞内外膜进行融合，膜电位崩溃，并形成跨膜孔道，此时裂解蛋白的C端穿出外膜。
传统的使用噬菌体phiX174裂解蛋白制备菌影有许多不足之处，如细菌裂解的发生与细菌的生长时期有关，通常细菌裂解起始OD值被限制在0.2-0.6，因而产率较低且裂解持续时间短，易出现抗裂解突变株，为了解决这些关键的问题，常需要串联表达金黄色葡萄球菌核酸酶A，但起始诱导OD也仅提高至为1.2，若使用双质粒表达系统则需考虑质粒的兼容性及质粒在菌株中的稳定性，这也成为制约了菌影推广应用的因素之一，因此有必要为高效制备大肠杆菌菌影探索新的方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种源自噬菌体alpha3的裂解蛋白，其与噬菌体phiX174的裂解蛋白一样拥有一个保守的跨膜区，能有效抑制大肠杆菌的生长，该裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码该裂解蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的目的之二在于所述源自噬菌体alpha3裂解蛋白可用于高效制备大肠杆菌菌影。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种噬菌体alpha3裂解蛋白E，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
编码上述噬菌体alpha3裂解蛋白E的基因，其核苷酸序列如SEQID No：1所示。
所述噬菌体alpha3裂解蛋白E在高效制备大肠杆菌菌影的应用，包括以下步骤：
(1)将所述噬菌体alpha3裂解蛋白E的基因与载体连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌；
(2)将步骤(1)得到的重组大肠杆菌加到含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养；转接到新鲜的LB培养基中振荡培养，当菌液OD600值达到1.0～2.2时，加入诱导剂IPTG诱导裂解蛋白的表达；最后收集诱导表达后的菌影。
优选地，步骤(2)所述卡那霉素的浓度为50±10μg/mL；培养条件为37±5℃、220±50rpm。
优选地，步骤(2)所述菌液OD600值为1.4～2.1，诱导裂解蛋白表达的时间为2～5h。
优选地，步骤(2)所述菌液OD600值为1.87～2.01，诱导裂解蛋白表达的时间为3～5h。
优选地，步骤(1)所述重组大肠杆菌的制备：构建含有噬菌体alpha3裂解蛋白E基因的重组质粒pET29a-E(α3)，将上述重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，以卡那霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的源自噬菌体alpha3的裂解蛋白，仅需表达单一蛋白便可达到优良的裂解效果，大大节省了人力物力，进一步提高蛋白在菌株中的表达稳定性。
(2)本发明利用在大肠杆菌中表达噬菌体alpha3裂解蛋白并成功制备大肠杆菌菌影，该裂解体系简单且稳定，产率高且裂解持续时间长，相对于现有源自噬菌体phiX174的裂解蛋白，源自噬菌体alpha3的裂解蛋白诱导大肠杆菌裂解的起始OD值可达2.0以上，裂解效率更高达99.99％，并且裂解持续时间更长。
(3)本发明不仅为寻找高密度发酵制备细菌菌影的方法提供了思路，同时也为其他新型裂解蛋白探索大规模制备细菌菌影方面的应用夯实了基础。
附图说明
图1为重组质粒的示意图；
图2为不同起始OD600值加入IPTG诱导后，带有pET29a-E(α3)质粒的大肠杆菌裂解生长曲线图；
图3为噬菌体alpha3在不同OD600值诱导形成大肠杆菌菌影的裂解效率图；
图4为大肠杆菌裂解前后的上清液遗传物质电泳分析图。M:15000bp DNA Marker；泳道1-3分别为OD600值为0.79时的菌液加入IPTG进行诱导前、诱导2h、诱导4h；泳道4-6分别为OD600值为1.48时的菌液加入IPTG进行诱导前、诱导2h、诱导4h；泳道7-9分别为OD600值为2.13时的菌液加入IPTG进行诱导前、诱导2h、诱导4h；
图5为Westernblot验证裂解蛋白在大肠杆菌中的表达；
图6为大肠杆菌菌影的扫描电子显微镜图；A为对照，未形成菌影的完整细菌图，B为细菌表面形成裂解孔道的菌影图片，C为较大范围的菌影图片；扫描电镜观察到裂解后细菌基本保留原有的形貌结构，大多数在细菌的顶端形成明显的孔道。
图7为大肠杆菌菌影的透射电子显微镜图。A为对照，未形成菌影的完整细菌，B为内容物流出的菌影图，C为较大范围的菌影图片；透射电镜观察到裂解后的细菌由于细菌内容物的流出，菌体整体呈现偏透明状态，形成了细菌空壳。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更清晰的了解本发明的核心技术，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施案例中所使用的的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
1、主要实验材料及来源：
(1)大肠杆菌BL21(DE3)感受态均购于天根生化科技(北京)有限公司，噬菌体alpha3裂解蛋白基因由金唯智生物科技有限公司合成。
(2)主要试剂：酵母粉、蛋白胨均购自Oxoid；琼脂糖购自Invitrogen；2×PrimeSTAR HS(Premix)购自TaKaRa，DL 2000DNA Maker、DL 15000DNA Maker购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司；尿素、丙烯酰胺、过硫酸酰胺(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、10×Western Transfer Buffer、10×TBST Buffer购自生工生物工程(上海)股份有限公司；26616Protein Marker、Super Signal West Pico化学发光底物购自Thermo FisherScientific；Anti-Strep-TagII Monoclonal Antibody购自Abbkine；山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)购自Abcam；卡那霉素、β-异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均购于Aladdin；琼脂粉、NaCl、甲醇、乙醇购自天津致远化学试剂公司。
实施例1：大肠杆菌BL21(DE3)重组菌株的制备
从NCBI上下载得到噬菌体alpha3裂解蛋白氨基酸序列，根据密码子的偏好性，将其翻译成核苷酸序列，即得到裂解基因E(α3)，并合成克隆到pET29a载体上，并使用热激法将重组质粒导入进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将重组质粒以卡那霉素作为抗性筛选，得到重组菌株。
实施例2：大肠杆菌BL21(DE3)裂解体系及其裂解效率的测定
将实施例1中得到的重组E.coli BL21(DE3)单克隆菌株加到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm条件下过夜培养。随后按照1：100的比例转接到50mL新鲜LB培养基中，37℃、220rpm条件下继续培养，测定OD600值，使其分别达到0.739、1.37、1.87、2.01、2.30，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，每隔一小时取样测定菌液的OD600值，绘制裂解生长曲线，如图2。通过曲线可知，在菌液OD600值达到0.739时，加入IPTG诱导后，发现噬菌体alpha3裂解蛋白持续稳定裂解3h，其菌液OD600值降到0.216左右，随后菌液OD600值开始缓慢上升，可能是因为此时菌液整体正处于对数生长期，适合进行蛋白的诱导表达，但也容易使菌体对裂解蛋白产生耐受性导致菌液整体呈现继续往上生长的趋势；当菌液OD600值超过0.8而在2.0以下时，噬菌体alpha3裂解蛋白依然有较好的效果，大肠杆菌能有效裂解排出细菌内容物，OD600值显著下降；然而当菌液OD600值超过2.3进行诱导时，可看到噬菌体alpha3裂解蛋白对大肠杆菌也有裂解作用，但此时的菌液OD600值偏高，可能是体系中未裂解的死菌和细菌空壳变多，从而导致OD600值变高或者是菌体的生长状态影响了裂解蛋白的表达，体系中存在较多的活细菌。
另外取不同OD600值的菌液进行平板计数，收集诱导前的菌影于4℃冰箱保存，待诱导结束后，取100μL诱导前及诱导后的菌液用无菌的1×PBS缓冲液做梯度稀释，最后取100μL稀释后的菌液均匀地涂布到卡那霉素的LB平板上面，将平板放在37℃生化培养箱过夜培养，统计各平板的菌落数。细菌裂解效率＝(诱导前CFU-诱导后CFU)/诱导前CFU×100％。经计算得菌液OD600值为0.628时噬菌体alpha3裂解蛋白的裂解效率为99.63％、菌液OD600值为1.482时噬菌体alpha3裂解蛋白的裂解效率为99.99％、菌液OD600值为1.935时噬菌体alpha3裂解蛋白的裂解效率为99.97％，由此可见噬菌体alpha3裂解蛋白更适合在高密度的菌液中进行表达。当想要得到较高裂解效果的所需菌影时，推荐诱导的菌液OD600值为2.0左右。
实施例2：电泳分析大肠杆菌裂解前后的基因组情况
取不同OD600值的重组大肠杆菌菌液加入IPTG进行诱导，对裂解前后的上清液遗传物质电泳分析，若菌体出现裂解，细菌内容物流出，则可在上清看到基因组条带。进行诱导前，收集不同OD600值的重组大肠杆菌菌液的4℃保存，6000rpm离心5min，取上清液进行1％琼脂糖凝胶电泳，参数调节为120V，20min。如图4所示，菌体在裂解前，几乎检测不到基因组，裂解2h后可见较明显的基因条带，可知以细菌基因组为代表的细菌内容物确实随着裂解孔道的形成而排出。裂解4h后，条带变模糊，推测是因为菌体较多的时候，细菌内容物流出比较完全且量多，体系中的核酸酶等物质导致基因组发生了降解。
实施例3：Westernblot实验验证噬菌体alpha3裂解蛋白的表达情况
同上挑取单克隆菌落于5mL含卡那霉素的LB培养基中过夜培养，条件为37℃，220rpm。次日以1:100的比例进行转接，待菌液长到0.6-0.8时加入IPTG进行诱导，收集不同裂解时间的样品，进行超声破碎，70W，5min，3s开，3s关，加入5×proteinloading，煮沸10min，同时制备Tricine SDS-PAGE凝胶，具体配方如下：
上样前蛋白样品做12000rpm离心2min处理，根据实验情况，分别调节30V恒压30min、100V恒压60min、200V恒压至溴酚兰指示剂刚跑出凝胶。随后取出凝胶进行转膜，设置电压80V恒压湿转45-60min，TBST缓冲液润洗两次，加入5％脱脂奶粉室温封闭1h，TBST缓冲液继续清洗，按照1:3000的稀释比例加入Anti-Strep-TagII Monoclonal Antibody，TBST缓冲液继续清洗，再加入山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)，TBST缓冲液继续清洗，最后加入化学发光液，在化学发光仪上进行曝光。从图5可以看到，由于pET质粒载体的特点，诱导前可能会存在泄露表达的情况。加入IPTG诱导15min后即可检测到蛋白的表达，但由于裂解蛋白属于毒性蛋白，细菌本身可能会调控其表达，所以随诱导时间的增加，裂解蛋白的表达量差别不大。
实施例4：利用扫描电镜对大肠杆菌菌影进行观察
取诱导后的大肠杆菌菌液冷冻离心弃上清，每次4000g离心15min，并结合用1×PBS洗涤3次，以充分洗去培养。再加入适量2.5％戊二醛电镜专用固定液4℃固定过夜，次日4000g离心以去除固定液，随后用1mL去离子水充分洗涤菌体，重悬后滴加到干燥盖玻片上，包埋在滤纸片中。依次浸泡在70％、85％、95％梯度的乙醇中作逐级脱水处理，每次15min，重复三次，最后再浸泡在100％乙醇中15min，备用。将处理好的样品放入临界点干燥仪器中进行干燥，程序结束后，取出样品进行喷金处理；最后，在场发射扫描电子显微镜下观察菌影形态。如图6所示，可见噬菌体alpha3裂解蛋白可以在细菌表面有效形成裂解孔道，且裂解孔道多数形成于细菌的顶端。
实施例5：利用透射电镜对大肠杆菌菌影进行观察。
取诱导后的大肠杆菌液冷冻离心弃上清，每次4000g离心15min，并结合用1×PBS洗涤3次，以充分洗去培养，最后用适量去离子水再次洗涤菌影沉淀并重悬。用移液枪吸取10μL重悬后的菌影沉淀滴在碳膜铜网上，静置10-15min。随后用移液枪将表面的液体吸走，并移取适量3％磷钨酸染液于铜网上，静置5min，吸走3％磷钨酸染液，再取去离子水滴加在铜网上用以洗去未结合的染液。室温静置挥发水分，并于透射电镜下进行观察。由于细菌内容物的流出，裂解后的细菌与完整的细菌透光度有所区别，如图7所示AB所示，菌体颜色较深，形状规整平滑为完整的细菌，透光度较高的、颜色深浅不一的为细菌空壳，值得注意的是可能有部分残留内容物未完全流出或由于内容物的流出，细菌空壳容易产生重叠会影响吸光度的变化。
上述实验表明，本发明所提供的噬菌体alpha3裂解蛋白可以在细菌表面形成明显的裂解孔道，并导致细菌内容物的流出，更为突出的是当菌液起始OD600值较高时依然能有效裂解细菌，OD600值为2.0左右时进行诱导菌液下降的OD600值可达到1.0以上，具有一定的应用前景。
上述实施案例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施案例的限制，对于所有公开的具体实施的上述说明，帮助本领域人员理解或实现本发明，不用作对保护范围的限定。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaacgct ggaccttact ggatattctg gcgtttctgc ttctgcttag cctgcttctg 60
ccgagcctgc tgattatgtt tattccgagc atgtataaac agcatgcgag cctgtggaaa 120
gcgcgcagcc tggcgaaaac cctgagcatg gcgagcagcg cgcgcctgac cccgctgagc 180
agctctcgca ccccgtgcgt gctgaaacag gatagcaaaa aactgggtac tggcggttgg 240
tctcatccgc agtttgaaaa ata 263
<210> 2
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Arg Trp Thr Leu Leu Asp Ile Leu Ala Phe Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu Ile Met Phe Ile Pro Ser Met Tyr
20 25 30
Lys Gln His Ala Ser Leu Trp Lys Ala Arg Ser Leu Ala Lys Thr Leu
35 40 45
Ser Met Ala Ser Ser Ala Arg Leu Thr Pro Leu Ser Ser Ser Arg Thr
50 55 60
Pro Cys Val Leu Lys Gln Asp Ser Lys Lys Leu Gly Thr Gly Gly Trp
65 70 75 80
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
85

Claims (7)

1.一种噬菌体alpha3裂解蛋白E在高效制备大肠杆菌菌影的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码噬菌体alpha3裂解蛋白E的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
3.根据权利要求2所述噬菌体alpha3裂解蛋白E的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述噬菌体alpha3裂解蛋白E的基因与载体连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌；
(2)将步骤(1)得到的重组大肠杆菌加到含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养；转接到新鲜的LB培养基中振荡培养，当菌液OD600值达到1.0～2.2时，加入诱导剂IPTG诱导裂解蛋白的表达；最后收集诱导表达后的菌影。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述卡那霉素的浓度为50±10μg/mL；培养条件为37±5℃、220±50rpm。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述菌液OD600值为1.4～2.1，诱导裂解蛋白表达的时间为2～5h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述菌液OD600值为1.87～2.01，诱导裂解蛋白表达的时间为3～5h。
7.根据权利要求3或4或5或6所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述重组大肠杆菌的制备：构建含有噬菌体alpha3裂解蛋白E基因的重组质粒pET29a-E(α3)，将上述重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，以卡那霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌。
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Ken-Ichi Kodaira等."Nucleotide sequence of the genome of the bacteriophage α3: interrelationship of the genome structure and the gene products with those of the phages, θX174, G4 and θK".Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression.1992,第第1130卷卷(第第3期期),第277-288页. *
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