CN112608934A - 一种大肠杆菌菌影的高效制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，步骤是：制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组质粒pET21a‑EW和pET21a‑EM，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；通过优化诱导物IPTG浓度，可以实现在低成本下制备高产量的大肠杆菌菌影，收集菌影、冻干保存。本发明为大规模发酵制备大肠杆菌菌影提供可能，并为其他细菌菌影的研究及制备奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物学和基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。
背景技术
菌影(Bacterial ghost)是不含核酸、蛋白质等细胞内容物的完整细菌空壳，菌影保留了细胞壁表面和内膜结构的完整性，其表面的脂多糖等可以作为抗原有效的刺激机体发生体液免疫、细胞免疫以及局部黏膜免疫应答。除此之外，不含细胞内容物的菌影也是良好的递承载体及疫苗佐剂，可以装载大量药物、核酸、抗原等物质，具有良好的应用前景。
菌影是通过在革兰氏阴性细菌中诱导表达噬菌体
裂解基因E的方式制备形成。基因E的裂解功能是在1966年在噬菌体
感染大肠杆菌中的一次实验中发现的，之后的研究证明基因E在大肠杆菌中的唯一表达就可以引起大肠杆菌的后续裂解。研究表明，基因E编码一种含91个氨基酸的膜蛋白，其N端的疏水性氨基酸能插入到多种革兰氏阴性菌的细胞膜和细胞壁上，聚集形成40-200nm的特异性跨膜通道。在高/低渗透压的作用下，细胞内容物则通过该特异性通道排出。在电镜下观察，发现E蛋白介导的特异性通道并非在细胞膜上随机分布，而是有规律的集中在细菌细胞的两端或中间。
大肠杆菌BL21(DE3)是使用最广的用于高效表达目的基因的菌株，目的基因被克隆到含有噬菌体T7启动子的载体上，T7启动子由T7 RNA聚合酶识别并调节。调控T7 RNA聚合酶的基因位于染色体上，由lacUV5启动子调控。裂解基因E编码产生的裂解蛋白是一种膜蛋白，研究表明，膜蛋白的过量表达会对宿主菌产生毒性作用，因此影响菌影制备的产量。在众多研究中，许多研究者将裂解基因E克隆在pBV220等其他温控载体，然而，其表达产生的菌影产量低一直是困扰研究者的一个问题。
发明内容
本发明旨在解决传统制备方法产量低的不足，提供一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，包括以下步骤：
(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；
(2)构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组表达质粒pET21a-EW和pET21a-EM，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；
(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下震荡培养；次日按体积比1：100转接到新鲜的LB培养基中，加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解；
(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，检测裂解效率最高达99.99％时，收集菌影；
(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥，用场发射扫描电子显微镜观察；
(6)将收集的菌影洗涤，再用3％磷钨酸染色，透射电子显微镜观察。
优选的，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。
更优选的，步骤(1)中，所述大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的制备方法如下：挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌单菌落，接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养14h；取2mL种子液加入100mL新鲜LB培养基，扩大培养2-3h，测OD600的值，当OD600约0.4-0.5时停止培养；菌液冰上放置30min，无菌条件下移入50ml离心管中，4℃、4000rpm离心10min；弃上清，在冰上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮，冰浴30min；4℃、3500rpm离心5min，弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2重浮细菌，分装到预冷的无菌EP管中，每管100μL，-80℃保存备用。
优选的，步骤(2)中，所述重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建方法如下：
(2.1)从NCBI上下载得到噬菌体
裂解基因E，即野生型裂解基因EW；根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选，同时将第89位精氨酸突变成谷氨酰胺得到突变型裂解基因EM；根据裂解基因EW和EM以及质粒pET21a的序列，结合RF克隆的方法，设计上下游引物，引物序列如下：
(2.2)配制PCR体系，以合成的EW和EM基因为模板进行基因扩增，PCR体系及程序如下：
取3μL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析；再用通用型DNA纯化回收试剂盒回收上述PCR产物，得到目的基因；
采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板，以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增，配置的PCR反应体系如下：
线性扩增反应完成后，用Dpn I酶消化体系中未甲基化的模板质粒，程序如下：
体系配置完成后，在37℃条件下，酶切1h；
(2.3)将反应完成的产物立即采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态中，以氨苄青霉素抗性筛选；次日，挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后，将阳性克隆子送至生工生物(上海)有限公司测序；经过序列比对，正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒，命名为pET21a-EW和pET21a-EM。
优选的，步骤(2.3)中，将产物转化至DH5α感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
优选的，步骤(2)中，将重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
优选的，步骤(3)中，诱导菌体裂解的步骤是：取1％的种子液到新鲜培养液中，37℃、220rpm培养；当OD600达到2.0时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，每30min取样，测定OD600值，直到OD600值趋于平稳。
优选的，步骤(5)中，电镜观察到裂解后细菌仍然保留原有形态结构，在赤道和两极形成十分明显的孔道，即为大肠杆菌菌影。
优选的，步骤(6)中，电镜观察到裂解后细菌呈现浅色透明状态，即为不含内容物的菌影。
与现有技术相比，本发明提供了一种可以高效制备菌影的大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)pLysS。BL21(DE3)pLysS菌株是BL21(DE3)的衍生菌株，该菌株同样为T7可控表达菌株，专为表达膜蛋白及问题蛋白设计而成。目的基因的表达依赖于T7 RNA聚合酶的活性，BL21(DE3)pLysS中含有一个可以编码T7溶菌酶(lysozyme，lys)的质粒pLysS。该质粒含有T7噬菌体基因3.5，其基因在T7 RNA聚合酶弱启动子Φ3.8调控下产生T7溶菌酶。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的天然抑制剂，可以调控目的基因的过表达及泄漏表达。本发明以BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS为宿主菌，相比较而言，BL21(DE3)pLysS极大地提高了菌影的产量，当OD600值达到2.0时，其CFU值为1012/ml，用IPTG诱导后，OD600值降低到0.4，其相应的最终活菌数CFU值为105/ml。本发明制备得到的菌影数量大大提高，为大规模发酵生产菌影提供新策略。
附图说明
图1为含有裂解基因的重组菌落PCR图；
其中，M为DL 2000DNA Maker，泳道1、2是重组质粒pET21a-EW菌落PCR扩增图，泳道3、4是重组质粒pET21a-EM菌落PCR扩增图。
图2为加入IPTG诱导后，携带pET21a-EW和pET21a-EM质粒的BL21(DE3)菌株的生长和裂解曲线。
图3为加入IPTG诱导后，携带pET21a-EM质粒的BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS菌株的生长和裂解曲线。
图4为加入IPTG诱导后，携带pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS菌株生长和裂解的曲线。
图5为不同起始OD600值加入IPTG诱导前后的平板菌落计数图，Start为诱导前，End为诱导结束后。
图6为pLysS质粒和pET21a-EM质粒同时转化至BL21(DE3)菌株中，加入IPTG诱导后的生长及裂解曲线。
图7为大肠杆菌菌影的扫描电子显微镜图：7A为形成的菌影，裂解孔道位于赤道；7B为形成的菌影，裂解孔道位于两极；7C为未形成菌影的完整细菌；7D为形成的菌影，裂解孔道位于赤道或两极。
图8为大肠杆菌菌影的透射电子显微镜图：8A中颜色较深的为完整细菌，颜色相对较浅的为形成的菌影；8B为形成的菌影。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更清晰的了解本发明的核心技术，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。下述方法中，若无特殊说明，则为常规方法。
实验材料：大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态均购于上海唯地生物技术有限公司；BL21(DE3)pLysS菌株由德国法兰克福大学Volker
教授馈赠；所使用的pET21a质粒购于Takara公司。
主要试剂：DL 2000DNA Maker购于Takara公司；质粒提取试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素、氯霉素、β-异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、均购于生工生物(上海)有限公司；甲醇、乙醇均购于天津市致远化学试剂有限公司。
实施例1：大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS重组菌株的制备
1.1大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌感受态的制备
挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌单菌落，接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养14h；取2ml种子液加入100mL新鲜LB培养基，扩大培养约2-3h，测OD600的值，当OD600约0.4-0.5时停止培养；菌液冰上放置30min，无菌条件下移入50mL离心管中，4℃、4000rpm离心10min；弃上清，在冰浴上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮，冰上放置30min；4℃、3500rpm离心5min，弃上清，用1mL预冷的无菌CaCl2重浮细菌，分装到预冷的无菌EP管中，每管100μL，-80℃保存备用。
1.2裂解质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建和转化
从NCBI上下载得到噬菌体
裂解基因E，即野生型裂解基因EW。根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选，得到突变型裂解基因EM。将裂解基因EW和EM均送至华大基因合成，根据裂解基因EW和EM以及质粒pET21a的序列，结合RF克隆的方法，设计上下游引物。引物序列如下：
表1裂解基因E扩增所用引物
配制PCR体系，以合成的EW和EM基因为模板进行基因扩增，PCR体系及程序如下：
表2裂解基因E扩增所需PCR扩增体系及反应程序
取3μL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，如图1电泳结果显示目的基因扩增成功。再用通用型DNA纯化回收试剂盒回收上述PCR产物，得到目的基因300ng/μL。
采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板，以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增，配置的PCR反应体系如下：
表3RF线性扩增反应构建pET21a-EW/M所需体系及反应程序
线性扩增反应完成后，用Dpn I酶消化体系中未甲基化的模板质粒。程序如下：
表4Dpn I酶切体系
体系配置完成后，在37℃条件下，酶切1h。
将反应完成的产物立即采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态中，以氨苄青霉素抗性筛选。次日，挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后，将阳性克隆子送至生工生物(上海)有限公司测序。经过序列比对，正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒，命名为pET21a-EW和pET21a-EM。再通过热激法将重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS感受态中，BL21(DE3)以氨苄青霉素为抗性筛选、BL21(DE3)pLysS以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组菌株。
实施例2：大肠杆菌菌影高效裂解体系的优化
2.1筛选大肠杆菌BL21(DE3)最佳裂解体系
将实施例1中得到的重组E.coli BL21(DE3)单克隆菌株加到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养14h。随后按照1：100的比例转接到新鲜LB培养基中，37℃、220rpm震荡培养2h左右，测定OD600值，使其分别达到0.3、0.4、0.5，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，比较裂解酶EW和EM的裂解效率，筛选能够发生裂解作用的最高起始浓度。同时，筛选能够发生有效诱导的最低IPTG浓度。多次重复实验表明，IPTG终浓度对裂解效果并没有显著影响。
在诱导前及诱导后每30min测定OD600值，直到OD600值趋于平稳。观察菌体的裂解情况，绘制菌液生长和裂解曲线。并分别取出菌液100μL放4℃备用，将诱导前的菌液和OD600值最低点的菌液梯度稀释涂氨苄抗性LB平板，放入37℃培养箱过夜培养。将诱导前和诱导后OD600最低点的菌液用无菌的LB液体培养基稀释到相应倍数，然后均匀的涂布到相应抗性的LB平板上面，每个平板涂布100μL菌液，将平板放在37℃生化培养箱过夜培养14h，统计各平板的菌落数。细菌裂解效率＝(诱导前CFU-诱导后CFU)/诱导前CFU×100％，经统计计算得裂解酶EW的裂解效率为63.5％，裂解酶EM的裂解效率为93.5％。如图2，在E.coli BL21(DE3)中，当OD600值达到0.4时，裂解酶EW的裂解效果不佳，裂解酶EM发生裂解，但作用时间不长。可见，经过密码子优化且第89位氨基酸突变后的裂解酶EM其裂解效果更佳。然而，总体来说，在E.coli BL21(DE3)中，当OD600升高后加入IPTG诱导时，裂解酶裂解效果降低，甚至不发挥裂解作用，这与众多研究者研究结果一致。因此，在传统的制备菌影中，通过噬菌体
裂解基因E得到的菌影往往面临培养基利用不完全、菌影产量低等问题。
2.2筛选大肠杆菌BL21(DE3)pLysS最佳裂解体系
将裂解质粒pET21a-EM转入E.coli BL21(DE3)pLysS菌株中，比较裂解酶EM在BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS菌株中的裂解效果。同上述2.1，接种含有pET21a-EM的BL21(DE3)单克隆菌株的种子液，次日按照1：100转接至新鲜培养基中，37℃、220rpm震荡培养至OD600值达到1.0，加入IPTG诱导裂解酶EM表达，制备菌液的生长和裂解曲线。同时，将含有pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS单克隆菌株加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养14h。随后将种子液按照1：100的比例转接到新鲜LB培养基中，37℃、220rpm震荡培养至OD600值达到1.0，加入IPTG诱导裂解酶EM表达，制备菌液的生长和裂解曲线。如图3，裂解酶EM在E.coli BL21(DE3)pLysS中有较好的裂解效果，裂解效率达到99.99％。可见，相比于E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS是更加适合于制备菌影的宿主菌。
优化含有pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS宿主菌的裂解条件，同上所述，将转接了种子液的新鲜培养基继续37℃、220rpm震荡培养，使其OD600值分别达到0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0等更高值，在上述不同起始浓度下加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，筛选能够发生裂解作用的最高起始浓度。
同上述2.1，在诱导前及诱导后每30min测定OD600值，直到OD600值趋于平稳。观察菌体的裂解情况，绘制菌液生长和裂解曲线。并每30min取出菌液100μL放4℃备用，将诱导前的菌液和OD600值最低点的菌液梯度稀释涂LB平板进行菌落计数。统计诱导前后的活菌数，计算裂解效率。
如图4，不断提高含有pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS菌液的IPTG的诱导起始浓度，菌液OD600值仍然持续下降，裂解酶EM仍然能发挥很好的裂解效果。如图5，比较不同诱导起始OD600值，随着诱导浓度增加，诱导起始的活菌数不断增加，而裂解完成后残留的活菌数维持在同一数量级。由此可见，当提高诱导浓度时，菌影产量大大增加。
2.3pLysS质粒上溶菌酶对裂解酶功能的探讨
用质粒小提试剂盒(天根，北京)提取E.coli BL21(DE3)pLysS的质粒，将pLysS质粒和带有裂解酶的质粒同时导入E.coli BL21(DE3)中，用氯霉素和氨苄青霉素双抗性作为筛选，挑取阳性克隆子。同上2.1、2.2所述，挑取单克隆至5ml含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养过夜。次日按体积比1：100转接到新鲜的培养基中，37℃、220rpm培养。当OD600达到1.0时，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，每30min取样，测定OD600值，观察菌液生长状况。经过诱导后，菌液肉眼可见的由浑浊变澄清。如图6，加入IPTG诱导后，菌液OD600值立马下降。可见，pLysS质粒上面的溶菌酶调节了菌体里面T7RNApolymerase的表达水平，从而调控裂解酶EM的表达水平，使之发挥裂解作用，对大规模生产菌影具有重要的作用。
实施例3：大肠杆菌菌影的扫描电子显微镜观察
取诱导后的菌液15mL，4000g、4℃离心15min，弃上清；用PBS洗涤3次，每次4000g、4℃离心15min，充分洗去培养基；再加入5mL 2.5％戊二醛电镜专用固定液4℃固定8h以上；4000g、4℃离心15min，弃上清，去除固定液；用5mL去离子水浸泡菌液5min，再4000g、4℃离心15min弃上清，重复3次；用1mL去离子水重悬菌体，滴加到干燥盖玻片上，包埋在滤纸片中，使其依次浸泡在70％、85％、95％的乙醇中15min，最后再浸泡在100％乙醇中15min(此步重复3次)，逐级脱水，保证充分去除水分；将样品及滤纸片一起放入临界点干燥仪器中干燥，干燥完成后，取出滤纸片中的盖玻片，放在喷金仪器中喷金处理；最后，在场发射扫描电子显微镜下观察菌影形态。如图7A在细菌表面的赤道形成裂解孔道，图7B在细菌表面的两极形成裂解孔道，图7C为对照，未形成菌影的完整细菌，图7D为形成的较多的菌影。
实施例4：大肠杆菌菌影的透射电子显微镜观察
取裂解完成的菌液，4000rpm离心15min，弃上清，收集菌体。将菌体用PBS重悬，4000rpm离心15min，重复3次。将洗涤好的菌体蘸取少量置于事先备好的碳膜铜网上，室温静置5-10min，用吸水纸吸走周围多余的水份。用移液枪吸取适量3％磷钨酸染液覆盖于附有菌体的碳膜铜网上，静置5min，吸水纸吸取多余染液。吸取适量双蒸水置于碳膜铜网上，洗掉未结合的染液，重复操作2次。最后，室温静置待水份蒸干，置于透射电子显微镜下观察，由于菌影及完整细菌的透光度不一，因此视野中观察到颜色深浅不一的菌体。如图8A，视野中菌体颜色较深的为未发生裂解的完整细菌，菌体颜色较浅的为菌影。如图8B，形成的菌影由于不含有内容物，其空壳在透射电子显微镜下面，菌体颜色相对较浅，为浅色透明状态。
上述实验表明，本发明所提供的大肠杆菌菌影制备新方法，将编码T7溶菌酶的质粒pLysS与由T7启动子调控的裂解质粒结合，能够大大提高菌影产量，提高了菌影制备的效率和培养基利用率。同时，为制备其他T7可调控菌株的菌影奠定了基础。
对于所有公开的具体实施的上述说明，帮助本领域人员理解或实现本发明，不用作对保护范围的限定。
序列表
<110> 华南理工大学
深圳百纳心致生命科学有限公司
<120> 一种大肠杆菌菌影的高效制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaactttaa gaaggagata tacatatggt acgctggact ttgt 44
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttagcagc cggatctcat cagtggtggt ggtggtgg 38
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaactttaa gaaggagata tacatatggt gcgttggact ttat 44
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgttagcagc cggatctcat cactctttct ggacataa 38
Claims (9)
1.一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；
(2)构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；
(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下震荡培养；次日按体积比1：100转接到新鲜的LB培养基中，加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解；
(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，检测裂解效率最高达99.99％时，收集菌影；
(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥，用场发射扫描电子显微镜观察；
(6)将收集的菌影洗涤、磷钨酸染色，透射电子显微镜观察。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。
3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的步骤是：挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS单菌落，接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养14h；取2mL种子液加入100mL新鲜LB培养基，扩大培养2-3h，测OD600的值，当OD600约0.4-0.5时停止培养；菌液冰上放置30min，无菌条件下移入预冷的50ml离心管中，4℃、4000rpm离心10min；弃上清，在冰上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮，冰浴30min；4℃、3500rpm离心5min，弃上清，用1mL预冷的无菌CaCl2重浮细菌，分装到预冷的无菌EP管中，每管100μL，-80℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建方法如下：
(2.1)从NCBI上下载得到噬菌体
裂解基因E，即野生型裂解基因EW；根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选，得到突变型裂解基因EM；根据裂解基因EW和EM以及质粒pET21a的序列，结合RF克隆的方法，设计上下游引物，引物序列如下：
(2.2)配制PCR体系，以合成的EW和EM基因为模板进行基因扩增，PCR体系及程序如下：
取3μL PCR扩增产物进行电泳分析；纯化回收，得到目的基因；
采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板，以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增，PCR反应体系如下：
线性扩增反应完成后，用Dpn I酶消化体系中未甲基化的模板质粒，程序如下：
体系配制完成后，在37℃条件下，酶切1h；
(2.3)将反应完成的产物立即转化到大肠杆菌DH5α感受态中，以氨苄青霉素作为抗性筛选；次日，挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后，将阳性克隆子测序；经过序列比对，正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒，命名为pET21a-EW和pET21a-EM。
5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(2.3)中，将产物转化至DH5α感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
6.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
7.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(3)中，诱导菌体裂解的步骤是：取1％的种子液到新鲜培养液中，37℃、220rpm培养；当OD600达到2.0时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，每30min取样，测定OD600值，直到OD600值趋于平稳。
8.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(5)中，电镜观察到裂解后细菌仍然保留原有形态结构，在赤道和两极形成十分明显的孔道，即为大肠杆菌菌影。
9.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(6)中，电镜观察到裂解后细菌呈现浅色透明状态，即为不含内容物的菌影。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114736273A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-07-12 | 华南理工大学 | 一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用 |
| CN115044598A (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-13 | 华南理工大学 | 一种肠杆菌科细菌菌影的高效制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302527A (zh) * | 2008-06-13 | 2008-11-12 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 重排噬菌体e基因、含有该基因的打孔质粒载体及其应用 |
| CN102586307A (zh) * | 2012-03-02 | 2012-07-18 | 山东师范大学 | 氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用 |
| CN103045614A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-04-17 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 突变噬菌体e基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用 |
| US20180066225A1 (en) * | 2016-04-15 | 2018-03-08 | Paichai University Industry-Academic Cooperation Foundation | Method of preparing bacterial ghosts from gram-positive bacteria by hydrochloric acid treatment |
-
2020
- 2020-12-16 CN CN202011484618.1A patent/CN112608934A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302527A (zh) * | 2008-06-13 | 2008-11-12 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 重排噬菌体e基因、含有该基因的打孔质粒载体及其应用 |
| CN102586307A (zh) * | 2012-03-02 | 2012-07-18 | 山东师范大学 | 氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用 |
| CN103045614A (zh) * | 2012-12-12 | 2013-04-17 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 突变噬菌体e基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用 |
| US20180066225A1 (en) * | 2016-04-15 | 2018-03-08 | Paichai University Industry-Academic Cooperation Foundation | Method of preparing bacterial ghosts from gram-positive bacteria by hydrochloric acid treatment |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| AMARA AA等: "Sponge-like: a new protocol for preparing bacterial ghosts", 《THE SCIENTIFIC WORLD JOURNAL》 * |
| W. HAIDINGER等: "Escherichia coli ghost production by expression of lysis gene E and Staphylococcal nuclease", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| 崔柳: "菌影高效制备体系的构建及其初步应用研究", 《万方学位论文》 * |
| 彭玮等: "大肠杆菌"菌影"的制备", 《东北农业大学学报》 * |
| 李艳: "猪链球菌噬菌体穿孔素(holin)的亚细胞定位及拓扑结构", 《万方学位论文》 * |
| 王丽哲等: "噬菌体裂解基因E原核表达载体构建及大肠杆菌菌影的制备", 《吉林农业大学学报》 * |
| 董靖: "黄芩苷对Ⅱ型核糖体失活蛋白活性的抑制作用和机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库（农业科技辑）》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114736273A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-07-12 | 华南理工大学 | 一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用 |
| CN114736273B (zh) * | 2022-03-15 | 2024-04-30 | 华南理工大学 | 一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用 |
| CN115044598A (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-13 | 华南理工大学 | 一种肠杆菌科细菌菌影的高效制备方法 |
| CN115044598B (zh) * | 2022-06-22 | 2023-08-18 | 华南理工大学 | 一种肠杆菌科细菌菌影的高效制备方法 |
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