CN112608934A - 一种大肠杆菌菌影的高效制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,步骤是:制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞;构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组质粒pET21a‑EW和pET21a‑EM,再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选,得到重组大肠杆菌;通过优化诱导物IPTG浓度,可以实现在低成本下制备高产量的大肠杆菌菌影,收集菌影、冻干保存。本发明为大规模发酵制备大肠杆菌菌影提供可能,并为其他细菌菌影的研究及制备奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物学和基因工程领域,具体涉及一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。
背景技术
菌影(Bacterial ghost)是不含核酸、蛋白质等细胞内容物的完整细菌空壳,菌影保留了细胞壁表面和内膜结构的完整性,其表面的脂多糖等可以作为抗原有效的刺激机体发生体液免疫、细胞免疫以及局部黏膜免疫应答。除此之外,不含细胞内容物的菌影也是良好的递承载体及疫苗佐剂,可以装载大量药物、核酸、抗原等物质,具有良好的应用前景。
菌影是通过在革兰氏阴性细菌中诱导表达噬菌体裂解基因E的方式制备形成。基因E的裂解功能是在1966年在噬菌体感染大肠杆菌中的一次实验中发现的,之后的研究证明基因E在大肠杆菌中的唯一表达就可以引起大肠杆菌的后续裂解。研究表明,基因E编码一种含91个氨基酸的膜蛋白,其N端的疏水性氨基酸能插入到多种革兰氏阴性菌的细胞膜和细胞壁上,聚集形成40-200nm的特异性跨膜通道。在高/低渗透压的作用下,细胞内容物则通过该特异性通道排出。在电镜下观察,发现E蛋白介导的特异性通道并非在细胞膜上随机分布,而是有规律的集中在细菌细胞的两端或中间。
大肠杆菌BL21(DE3)是使用最广的用于高效表达目的基因的菌株,目的基因被克隆到含有噬菌体T7启动子的载体上,T7启动子由T7 RNA聚合酶识别并调节。调控T7 RNA聚合酶的基因位于染色体上,由lacUV5启动子调控。裂解基因E编码产生的裂解蛋白是一种膜蛋白,研究表明,膜蛋白的过量表达会对宿主菌产生毒性作用,因此影响菌影制备的产量。在众多研究中,许多研究者将裂解基因E克隆在pBV220等其他温控载体,然而,其表达产生的菌影产量低一直是困扰研究者的一个问题。
发明内容
本发明旨在解决传统制备方法产量低的不足,提供一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,包括以下步骤:
(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞;
(2)构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组表达质粒pET21a-EW和pET21a-EM,再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选,得到重组大肠杆菌;
(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,在37℃、220rpm下震荡培养;次日按体积比1:100转接到新鲜的LB培养基中,加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解;
(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数,检测裂解效率最高达99.99%时,收集菌影;
(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥,用场发射扫描电子显微镜观察;
(6)将收集的菌影洗涤,再用3%磷钨酸染色,透射电子显微镜观察。
优选的,步骤(1)中,采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。
更优选的,步骤(1)中,所述大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的制备方法如下:挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌单菌落,接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震荡培养14h;取2mL种子液加入100mL新鲜LB培养基,扩大培养2-3h,测OD600的值,当OD600约0.4-0.5时停止培养;菌液冰上放置30min,无菌条件下移入50ml离心管中,4℃、4000rpm离心10min;弃上清,在冰上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮,冰浴30min;4℃、3500rpm离心5min,弃上清,用1ml预冷的无菌CaCl2重浮细菌,分装到预冷的无菌EP管中,每管100μL,-80℃保存备用。
优选的,步骤(2)中,所述重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建方法如下:
(2.1)从NCBI上下载得到噬菌体裂解基因E,即野生型裂解基因EW;根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选,同时将第89位精氨酸突变成谷氨酰胺得到突变型裂解基因EM;根据裂解基因EW和EM以及质粒pET21a的序列,结合RF克隆的方法,设计上下游引物,引物序列如下:
(2.2)配制PCR体系,以合成的EW和EM基因为模板进行基因扩增,PCR体系及程序如下:
取3μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析;再用通用型DNA纯化回收试剂盒回收上述PCR产物,得到目的基因;
采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板,以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增,配置的PCR反应体系如下:
线性扩增反应完成后,用Dpn I酶消化体系中未甲基化的模板质粒,程序如下:
体系配置完成后,在37℃条件下,酶切1h;
(2.3)将反应完成的产物立即采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态中,以氨苄青霉素抗性筛选;次日,挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后,将阳性克隆子送至生工生物(上海)有限公司测序;经过序列比对,正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒,命名为pET21a-EW和pET21a-EM。
优选的,步骤(2.3)中,将产物转化至DH5α感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
优选的,步骤(2)中,将重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
优选的,步骤(3)中,诱导菌体裂解的步骤是:取1%的种子液到新鲜培养液中,37℃、220rpm培养;当OD600达到2.0时,加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导,每30min取样,测定OD600值,直到OD600值趋于平稳。
优选的,步骤(5)中,电镜观察到裂解后细菌仍然保留原有形态结构,在赤道和两极形成十分明显的孔道,即为大肠杆菌菌影。
优选的,步骤(6)中,电镜观察到裂解后细菌呈现浅色透明状态,即为不含内容物的菌影。
与现有技术相比,本发明提供了一种可以高效制备菌影的大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)pLysS。BL21(DE3)pLysS菌株是BL21(DE3)的衍生菌株,该菌株同样为T7可控表达菌株,专为表达膜蛋白及问题蛋白设计而成。目的基因的表达依赖于T7 RNA聚合酶的活性,BL21(DE3)pLysS中含有一个可以编码T7溶菌酶(lysozyme,lys)的质粒pLysS。该质粒含有T7噬菌体基因3.5,其基因在T7 RNA聚合酶弱启动子Φ3.8调控下产生T7溶菌酶。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的天然抑制剂,可以调控目的基因的过表达及泄漏表达。本发明以BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS为宿主菌,相比较而言,BL21(DE3)pLysS极大地提高了菌影的产量,当OD600值达到2.0时,其CFU值为1012/ml,用IPTG诱导后,OD600值降低到0.4,其相应的最终活菌数CFU值为105/ml。本发明制备得到的菌影数量大大提高,为大规模发酵生产菌影提供新策略。
附图说明
图1为含有裂解基因的重组菌落PCR图;
其中,M为DL 2000DNA Maker,泳道1、2是重组质粒pET21a-EW菌落PCR扩增图,泳道3、4是重组质粒pET21a-EM菌落PCR扩增图。
图2为加入IPTG诱导后,携带pET21a-EW和pET21a-EM质粒的BL21(DE3)菌株的生长和裂解曲线。
图3为加入IPTG诱导后,携带pET21a-EM质粒的BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS菌株的生长和裂解曲线。
图4为加入IPTG诱导后,携带pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS菌株生长和裂解的曲线。
图5为不同起始OD600值加入IPTG诱导前后的平板菌落计数图,Start为诱导前,End为诱导结束后。
图6为pLysS质粒和pET21a-EM质粒同时转化至BL21(DE3)菌株中,加入IPTG诱导后的生长及裂解曲线。
图7为大肠杆菌菌影的扫描电子显微镜图:7A为形成的菌影,裂解孔道位于赤道;7B为形成的菌影,裂解孔道位于两极;7C为未形成菌影的完整细菌;7D为形成的菌影,裂解孔道位于赤道或两极。
图8为大肠杆菌菌影的透射电子显微镜图:8A中颜色较深的为完整细菌,颜色相对较浅的为形成的菌影;8B为形成的菌影。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更清晰的了解本发明的核心技术,下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。下述方法中,若无特殊说明,则为常规方法。
实验材料:大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态均购于上海唯地生物技术有限公司;BL21(DE3)pLysS菌株由德国法兰克福大学Volker教授馈赠;所使用的pET21a质粒购于Takara公司。
主要试剂:DL 2000DNA Maker购于Takara公司;质粒提取试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司;氨苄青霉素、氯霉素、β-异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、均购于生工生物(上海)有限公司;甲醇、乙醇均购于天津市致远化学试剂有限公司。
实施例1:大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS重组菌株的制备
1.1大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌感受态的制备
挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌单菌落,接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震荡培养14h;取2ml种子液加入100mL新鲜LB培养基,扩大培养约2-3h,测OD600的值,当OD600约0.4-0.5时停止培养;菌液冰上放置30min,无菌条件下移入50mL离心管中,4℃、4000rpm离心10min;弃上清,在冰浴上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮,冰上放置30min;4℃、3500rpm离心5min,弃上清,用1mL预冷的无菌CaCl2重浮细菌,分装到预冷的无菌EP管中,每管100μL,-80℃保存备用。
1.2裂解质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建和转化
从NCBI上下载得到噬菌体裂解基因E,即野生型裂解基因EW。根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选,得到突变型裂解基因EM。将裂解基因EW和EM均送至华大基因合成,根据裂解基因EW和EM以及质粒pET21a的序列,结合RF克隆的方法,设计上下游引物。引物序列如下:
表1裂解基因E扩增所用引物
配制PCR体系,以合成的EW和EM基因为模板进行基因扩增,PCR体系及程序如下:
表2裂解基因E扩增所需PCR扩增体系及反应程序
取3μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析,如图1电泳结果显示目的基因扩增成功。再用通用型DNA纯化回收试剂盒回收上述PCR产物,得到目的基因300ng/μL。
采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板,以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增,配置的PCR反应体系如下:
表3RF线性扩增反应构建pET21a-EW/M所需体系及反应程序
线性扩增反应完成后,用Dpn I酶消化体系中未甲基化的模板质粒。程序如下:
表4Dpn I酶切体系
体系配置完成后,在37℃条件下,酶切1h。
将反应完成的产物立即采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态中,以氨苄青霉素抗性筛选。次日,挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后,将阳性克隆子送至生工生物(上海)有限公司测序。经过序列比对,正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒,命名为pET21a-EW和pET21a-EM。再通过热激法将重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS感受态中,BL21(DE3)以氨苄青霉素为抗性筛选、BL21(DE3)pLysS以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选,得到重组菌株。
实施例2:大肠杆菌菌影高效裂解体系的优化
2.1筛选大肠杆菌BL21(DE3)最佳裂解体系
将实施例1中得到的重组E.coli BL21(DE3)单克隆菌株加到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、220rpm震荡培养14h。随后按照1:100的比例转接到新鲜LB培养基中,37℃、220rpm震荡培养2h左右,测定OD600值,使其分别达到0.3、0.4、0.5,加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导,比较裂解酶EW和EM的裂解效率,筛选能够发生裂解作用的最高起始浓度。同时,筛选能够发生有效诱导的最低IPTG浓度。多次重复实验表明,IPTG终浓度对裂解效果并没有显著影响。
在诱导前及诱导后每30min测定OD600值,直到OD600值趋于平稳。观察菌体的裂解情况,绘制菌液生长和裂解曲线。并分别取出菌液100μL放4℃备用,将诱导前的菌液和OD600值最低点的菌液梯度稀释涂氨苄抗性LB平板,放入37℃培养箱过夜培养。将诱导前和诱导后OD600最低点的菌液用无菌的LB液体培养基稀释到相应倍数,然后均匀的涂布到相应抗性的LB平板上面,每个平板涂布100μL菌液,将平板放在37℃生化培养箱过夜培养14h,统计各平板的菌落数。细菌裂解效率=(诱导前CFU-诱导后CFU)/诱导前CFU×100%,经统计计算得裂解酶EW的裂解效率为63.5%,裂解酶EM的裂解效率为93.5%。如图2,在E.coli BL21(DE3)中,当OD600值达到0.4时,裂解酶EW的裂解效果不佳,裂解酶EM发生裂解,但作用时间不长。可见,经过密码子优化且第89位氨基酸突变后的裂解酶EM其裂解效果更佳。然而,总体来说,在E.coli BL21(DE3)中,当OD600升高后加入IPTG诱导时,裂解酶裂解效果降低,甚至不发挥裂解作用,这与众多研究者研究结果一致。因此,在传统的制备菌影中,通过噬菌体裂解基因E得到的菌影往往面临培养基利用不完全、菌影产量低等问题。
2.2筛选大肠杆菌BL21(DE3)pLysS最佳裂解体系
将裂解质粒pET21a-EM转入E.coli BL21(DE3)pLysS菌株中,比较裂解酶EM在BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS菌株中的裂解效果。同上述2.1,接种含有pET21a-EM的BL21(DE3)单克隆菌株的种子液,次日按照1:100转接至新鲜培养基中,37℃、220rpm震荡培养至OD600值达到1.0,加入IPTG诱导裂解酶EM表达,制备菌液的生长和裂解曲线。同时,将含有pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS单克隆菌株加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,37℃、220rpm震荡培养14h。随后将种子液按照1:100的比例转接到新鲜LB培养基中,37℃、220rpm震荡培养至OD600值达到1.0,加入IPTG诱导裂解酶EM表达,制备菌液的生长和裂解曲线。如图3,裂解酶EM在E.coli BL21(DE3)pLysS中有较好的裂解效果,裂解效率达到99.99%。可见,相比于E.coli BL21(DE3),E.coli BL21(DE3)pLysS是更加适合于制备菌影的宿主菌。
优化含有pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS宿主菌的裂解条件,同上所述,将转接了种子液的新鲜培养基继续37℃、220rpm震荡培养,使其OD600值分别达到0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0等更高值,在上述不同起始浓度下加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导,筛选能够发生裂解作用的最高起始浓度。
同上述2.1,在诱导前及诱导后每30min测定OD600值,直到OD600值趋于平稳。观察菌体的裂解情况,绘制菌液生长和裂解曲线。并每30min取出菌液100μL放4℃备用,将诱导前的菌液和OD600值最低点的菌液梯度稀释涂LB平板进行菌落计数。统计诱导前后的活菌数,计算裂解效率。
如图4,不断提高含有pET21a-EM质粒的BL21(DE3)pLysS菌液的IPTG的诱导起始浓度,菌液OD600值仍然持续下降,裂解酶EM仍然能发挥很好的裂解效果。如图5,比较不同诱导起始OD600值,随着诱导浓度增加,诱导起始的活菌数不断增加,而裂解完成后残留的活菌数维持在同一数量级。由此可见,当提高诱导浓度时,菌影产量大大增加。
2.3pLysS质粒上溶菌酶对裂解酶功能的探讨
用质粒小提试剂盒(天根,北京)提取E.coli BL21(DE3)pLysS的质粒,将pLysS质粒和带有裂解酶的质粒同时导入E.coli BL21(DE3)中,用氯霉素和氨苄青霉素双抗性作为筛选,挑取阳性克隆子。同上2.1、2.2所述,挑取单克隆至5ml含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、220rpm摇床培养过夜。次日按体积比1:100转接到新鲜的培养基中,37℃、220rpm培养。当OD600达到1.0时,加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导,每30min取样,测定OD600值,观察菌液生长状况。经过诱导后,菌液肉眼可见的由浑浊变澄清。如图6,加入IPTG诱导后,菌液OD600值立马下降。可见,pLysS质粒上面的溶菌酶调节了菌体里面T7RNApolymerase的表达水平,从而调控裂解酶EM的表达水平,使之发挥裂解作用,对大规模生产菌影具有重要的作用。
实施例3:大肠杆菌菌影的扫描电子显微镜观察
取诱导后的菌液15mL,4000g、4℃离心15min,弃上清;用PBS洗涤3次,每次4000g、4℃离心15min,充分洗去培养基;再加入5mL 2.5%戊二醛电镜专用固定液4℃固定8h以上;4000g、4℃离心15min,弃上清,去除固定液;用5mL去离子水浸泡菌液5min,再4000g、4℃离心15min弃上清,重复3次;用1mL去离子水重悬菌体,滴加到干燥盖玻片上,包埋在滤纸片中,使其依次浸泡在70%、85%、95%的乙醇中15min,最后再浸泡在100%乙醇中15min(此步重复3次),逐级脱水,保证充分去除水分;将样品及滤纸片一起放入临界点干燥仪器中干燥,干燥完成后,取出滤纸片中的盖玻片,放在喷金仪器中喷金处理;最后,在场发射扫描电子显微镜下观察菌影形态。如图7A在细菌表面的赤道形成裂解孔道,图7B在细菌表面的两极形成裂解孔道,图7C为对照,未形成菌影的完整细菌,图7D为形成的较多的菌影。
实施例4:大肠杆菌菌影的透射电子显微镜观察
取裂解完成的菌液,4000rpm离心15min,弃上清,收集菌体。将菌体用PBS重悬,4000rpm离心15min,重复3次。将洗涤好的菌体蘸取少量置于事先备好的碳膜铜网上,室温静置5-10min,用吸水纸吸走周围多余的水份。用移液枪吸取适量3%磷钨酸染液覆盖于附有菌体的碳膜铜网上,静置5min,吸水纸吸取多余染液。吸取适量双蒸水置于碳膜铜网上,洗掉未结合的染液,重复操作2次。最后,室温静置待水份蒸干,置于透射电子显微镜下观察,由于菌影及完整细菌的透光度不一,因此视野中观察到颜色深浅不一的菌体。如图8A,视野中菌体颜色较深的为未发生裂解的完整细菌,菌体颜色较浅的为菌影。如图8B,形成的菌影由于不含有内容物,其空壳在透射电子显微镜下面,菌体颜色相对较浅,为浅色透明状态。
上述实验表明,本发明所提供的大肠杆菌菌影制备新方法,将编码T7溶菌酶的质粒pLysS与由T7启动子调控的裂解质粒结合,能够大大提高菌影产量,提高了菌影制备的效率和培养基利用率。同时,为制备其他T7可调控菌株的菌影奠定了基础。
对于所有公开的具体实施的上述说明,帮助本领域人员理解或实现本发明,不用作对保护范围的限定。
序列表
<110> 华南理工大学
深圳百纳心致生命科学有限公司
<120> 一种大肠杆菌菌影的高效制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaactttaa gaaggagata tacatatggt acgctggact ttgt 44
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttagcagc cggatctcat cagtggtggt ggtggtgg 38
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaactttaa gaaggagata tacatatggt gcgttggact ttat 44
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgttagcagc cggatctcat cactctttct ggacataa 38
Claims (9)
1.一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞;
(2)构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM,再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选,得到重组大肠杆菌;
(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,在37℃、220rpm下震荡培养;次日按体积比1:100转接到新鲜的LB培养基中,加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解;
(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数,检测裂解效率最高达99.99%时,收集菌影;
(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥,用场发射扫描电子显微镜观察;
(6)将收集的菌影洗涤、磷钨酸染色,透射电子显微镜观察。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(1)中,采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。
3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(1)中,采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的步骤是:挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS单菌落,接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震荡培养14h;取2mL种子液加入100mL新鲜LB培养基,扩大培养2-3h,测OD600的值,当OD600约0.4-0.5时停止培养;菌液冰上放置30min,无菌条件下移入预冷的50ml离心管中,4℃、4000rpm离心10min;弃上清,在冰上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮,冰浴30min;4℃、3500rpm离心5min,弃上清,用1mL预冷的无菌CaCl2重浮细菌,分装到预冷的无菌EP管中,每管100μL,-80℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建方法如下:
(2.1)从NCBI上下载得到噬菌体裂解基因E,即野生型裂解基因EW;根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选,得到突变型裂解基因EM;根据裂解基因EW和EM以及质粒pET21a的序列,结合RF克隆的方法,设计上下游引物,引物序列如下:
(2.2)配制PCR体系,以合成的EW和EM基因为模板进行基因扩增,PCR体系及程序如下:
取3μL PCR扩增产物进行电泳分析;纯化回收,得到目的基因;
采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板,以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增,PCR反应体系如下:
线性扩增反应完成后,用Dpn I酶消化体系中未甲基化的模板质粒,程序如下:
体系配制完成后,在37℃条件下,酶切1h;
(2.3)将反应完成的产物立即转化到大肠杆菌DH5α感受态中,以氨苄青霉素作为抗性筛选;次日,挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后,将阳性克隆子测序;经过序列比对,正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒,命名为pET21a-EW和pET21a-EM。
5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(2.3)中,将产物转化至DH5α感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
6.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(2)中,将重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞时采用的转化方法为热激法。
7.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(3)中,诱导菌体裂解的步骤是:取1%的种子液到新鲜培养液中,37℃、220rpm培养;当OD600达到2.0时,加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导,每30min取样,测定OD600值,直到OD600值趋于平稳。
8.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(5)中,电镜观察到裂解后细菌仍然保留原有形态结构,在赤道和两极形成十分明显的孔道,即为大肠杆菌菌影。
9.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法,其特征在于,步骤(6)中,电镜观察到裂解后细菌呈现浅色透明状态,即为不含内容物的菌影。
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