发明内容
本发明的目的之一在于提供一种突变噬菌体E基因;
本发明的目的之二在于提供上述突变噬菌体E基因的制备方法;
本发明的目的之三在于提供含上述突变噬菌体E基因的打孔载体;
本发明的目的之四在于构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法;
本发明的目的之五在于将上述突变噬菌体E基因应用于制备禽沙门氏菌菌脱疫苗。
本发明是通过以下技术方案来实现的:
一种突变噬菌体E基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。该突变噬菌体E基因相对于PhiX174噬菌体E基因在禽少门氏菌中的表达量大大提高。
一种突变噬菌体E基因的制备方法,其特征在于顺次包括以下步骤:
1)通过引物1(SEQ ID NO:3)和引物2(SEQ ID NO:4)进行PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序,其序列为SEQ ID NO:2所示;
2)对序列为SEQ ID NO:2所示的E基因进行点突变,E基因点突变后的序列为SEQ ID NO:1所示。
将本发明的突变噬菌体E基因与pMD18-T等可操作性载体连接,即可得到打孔载体。
具体地,一种构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法,使用引物3(SEQ ID NO:5)和引物4(SEQ ID NO:6)将上述的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接。
一种制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)在含氨苄青霉素的LB中接种含权上述突变噬菌体E基因的打孔载体的基因工程大肠杆菌,培养后提取表达载体质粒;
2)使用电极仪或者氯化钙转化法把表达载体质粒转入禽沙门氏菌中,在含氨苄青霉素的LB固体培养板中培养,通过PCR鉴定并挑取含表达载体质粒的阳性禽沙门氏菌;
3)诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达;
4)收集溶菌结束后形成的禽沙门氏菌菌脱,用纯水洗涤,-20℃保存。
优选地,步骤1)所述表达载体质粒通过如下方法获得:把突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接,然后转入Top感受态细胞,并取100ul该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素100ug/mL的LB琼脂平板上,放入37℃培养箱;等培养板干了之后,倒置培养10-14h,挑白色单菌落进行扩大培养,并提取质粒;使用Sac I和BamH I对含有突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切;突变噬菌体E基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体或温控型表达载体连接在一起,然后转入Top感受态细胸,挑取阳性菌落,扩大培养后提取质粒,即获得化学诱导型表达载体质粒或温控型表达载本质粒。
优选地,步骤3)诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达可通过下面两种方法进行:
a)化学诱导型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达:当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时,加入0.5M的IPTG在37℃的温度下进行诱导培养;
b)温控型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达:当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时,在42℃的温度下进行诱导培养。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明的突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中的表达量大大高于现有噬菌体E基因在禽沙门氏菌中的表达量;本发明的突变噬菌E基因相对于现有噬菌体E基因对禽少门氏菌的裂解率提高了30-70%,增加了禽沙门氏菌的菌脱可作为候选疫苗的可能性。
具体实施方式
下面通过具体实施例子对本发明作进一步详细说明。
实施例1突变PhiX174噬菌体E基因的制备方法
首先,通过引物1E 1S:ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGA 3′(SEQ ID NO:3)和引物2E 1A:TCACTCCTTCCGCACGTAATTTTTG 3′(SEQ ID NO:4)PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序,其序列如SEQ ID NO:2所示:
ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA
然后对上述PhiX174噬菌体E基因进行点突变,突变后的序列如SEQ IDNO:1所示:
ATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGCTTATTGCTGCCGTCGTTGCTGATTATGTTCATCCCGTCGACGTTCAAACGCCCGGTCTCGTCGTGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGCTTAAAACCGCTGAATTGCTCGCGTTTACCGTGCGTGTATGCGCAGGAAACGCTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACATGCGTCAAAAATTATGTGCGCAAAGAGTGA
实施例2构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法
使用引物3(SEQ ID NO:5)和引物4(SEQ ID NO:6)将实施例1的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接。
实施例3制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法
一种制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法,其包括以下步骤:
1)在含氨苄青霉素的LB中接种含实施例1的突变噬菌体E基因的打孔载体的基因工程大肠杆菌,培养后提取表达载体质粒,具体是:
把突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接,然后转入Top感受态细胞,并取100ul该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素100ug/mL的LB琼脂平板上,放入37℃培养箱;等培养板干了之后,倒置培养10-14h,挑白色单菌落进行扩大培养,并提取质粒;使用Sac I和BamH I对含有突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切;突变噬菌体E基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体或温控型表达载体连接在一起,然后转入Top感受态细胸,挑取阳性菌落,扩大培养后提取质粒,即获得化学诱导型表达载体质粒或温控型表达载本质粒。优选方案中,所述化学诱导型表达载体为pET表达载体,所述温控型表达载体为pEAS-1a表达载体。
2)使用电极仪或者氯化钙转化法把表达载体质粒转入禽沙门氏菌中,在含氨苄青霉素的LB固体培养板中培养,通过PCR鉴定并挑取含表达载体质粒的阳性禽沙门氏菌;
3)诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达,具体是:
a)化学诱导型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达:当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时,加入0.5M的IPTG在37℃的温度下进行诱导培养;
b)温控型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达:当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时,在42℃的温度下进行诱导培养。
4)收集溶菌结束后形成的禽沙门氏菌菌脱,用纯水洗涤,-20℃保存。
实施例4噬菌体E基因突变前后在禽沙门氏菌中的表达
首先,通过引物1E 1S:ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGA 3′(SEQ ID NO:3)和引物2E 1A:TCACTCCTTCCGCACGTAATTTTTG 3′(SEQ ID NO:4)PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序,其序列如SEQ ID NO:2所示:
ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA
然后对上述PhiX174噬菌体E基因进行点突变,突变后的序列如SEQ IDNO:1所示:
ATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGCTTATTGCTGCCGTCGTTGCTGATTATGTTCATCCCGTCGACGTTCAAACGCCCGGTCTCGTCGTGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGCTTAAAACCGCTGAATTGCTCGCGTTTACCGTGCGTGTATGCGCAGGAAACGCTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACATGCGTCAAAAATTATGTGCGCAAAGAGTGA
然后使用引物3E 2S:(Sac I)5′GGGC
ATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGA(SEQ ID NO:5)和引物4E 2A:(BamH I)5′GGGC
TCACTCTTTGCGCACATAATTTTTG把PCR扩增的PhiX174噬菌体E基因和突变噬菌体E基因分别与pMD18-T载体相连接;转入Top10感受态细胞,并取取100μl该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上;放入37℃培养箱,等培养板干了之后,倒置培养10~14h;挑白色单菌落进行扩大培养,并提取质粒。使用Sac I和BamH I分别对含有PhiX174噬菌体E基因和突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切。PhiX174噬菌体E基因和突变噬菌体E基因的双酶切产物分别与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体和温控型表达载体连接在一起,然后转入Top10感受态细胞,挑取阳性菌落,扩大培养后提取质粒,即获得表达载体质粒。把表达载体质粒分别转入同一株沙门氏菌中,同时进行诱导表达。
取1ml相同OD的含有表达质粒的禽沙门氏菌加入100ml含有氨苄青霉素(200μg/mL)的LB中进行培养,培养条件为28℃,150转/分。培养5-8小时后,含有化学诱导型表达载体质粒的禽沙门氏菌就加入IPTG至终浓度为1mmol/L,进行37℃诱导表达,同时设定非诱导对照组。培养5-8小时后,含有温控型表达载体质粒的禽沙门氏菌调节培养温度为37℃进行诱导表达,同时设定非诱导对照组。
在加入诱导后的2h、4h时分别对诱导组和4h对照组取样1ml然后离心收集菌液,直接煮沸变性后(5min,100℃),用12%十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析重组蛋白的表达产物,其结果如图1和2。其表明突变噬菌体E基因不论在温控型表达载体还是在化学诱导型表达载体中,其在沙门氏菌中的表达量都显著提高。
实施例5噬菌体E基因突变前后对野生沙门氏菌的裂解效果比较
一、在温控型表达载体pEAS-1a中突变前后噬菌体E基因对禽沙门氏菌的裂解程序
1)把含目的质粒的禽沙门氏菌在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上涂板并且培养10-14小时后,挑取单菌落的禽沙门氏菌,同时进行PCR鉴定;PCR鉴定为阳性菌时,把该禽沙门氏菌转入含氨苄青霉素的LB液体培养基28℃培养10-16小时;当沙门氏菌浓度OD值达到0.4时,按照1:100的比例把培养后的禽沙门氏菌加入到新的氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养。
2)当沙门氏菌OD值到达0.3时,培养物分成2份,一份在26-30℃继续培养,另外一份在42℃诱导培养。
3)培养2-4小时后,同时取28℃和42℃培养的沙门氏菌各10μl适当稀释后涂LB平板进行活菌CFU检测。
4)禽沙门氏菌裂解结束后形成的菌脱,使用纯水洗涤3-4次,-20℃保存。
二、在化学诱导表达型表达载体pET中突变前后噬菌体E基因对禽沙门氏菌的裂解程序
1)把含目的质粒的禽沙门氏菌在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上涂板并且培养10-14小时后,挑取单菌落的禽沙门氏菌,同时进行PCR鉴定;PCR鉴定为阳性菌时,把该禽沙门氏菌转入含氨苄青霉素的LB液体培养基37℃培养10-16小时;当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.4时,按照1:100的比例把培养后的禽沙门氏菌加入到新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养。
2)当沙门氏菌OD值到达0.3时,培养物分成2份,一份在37℃继续培养,另外一份在37℃诱导培养的同时加入0.5M的IPTG进行诱导培养。
3)培养2-4小时后,同时取加入IPTG诱导的和非诱导的沙门氏菌各10μl,适当稀释后涂LB平板进行活菌CFU检测。
4)禽沙门氏菌裂解结束后形成的菌脱,使用纯水洗涤3-4次,-20℃保存。
实验结果见以下表1
实施例6噬菌体E基因突变前后裂解禽沙门氏菌菌脱的透射电镜检测
将实施例2获得的菌脱,以2.5%戊二醛固定细菌,置4℃下4h,0.02mol/L的PBS洗涤3次,离心后经过四氧化锇再固定、乙醇逐级脱水、包埋等步骤处理后进行电镜观察,电镜检测结果见图3。
〈110〉广东大华农动物保健品股份有限公司
〈120〉突变噬菌体E基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用
〈160〉6
〈210〉1
〈211〉276
〈212〉DNA
〈213〉phage
〈400〉1
ATGGTGCGCT GGACGTTGTG GGATACCCTC GCTTTCCTGC TCCTGTTGAG 50
CTTATTGCTG CCGTCGTTGC TGATTATGTT CATCCCGTCGACGTTCAAAC 100
GCCCGGTCTC GTCGTGGAAG GCGCTGAATT TACGGAAAAC ATTATTAATG 150
GCGTCGAGCG TCCGCTTAAAACCGCTGAAT TGCTCGCGTT TACCGTGCGT 200
GTATGCGCAG GAAACGCTGA CGTTCTTACT GACGCAGAAG AAAACATGCG 250
TCAAAAATTA TGTGCGCAAA GAGTGA 276
〈210〉2
〈211〉276
〈212〉DNA
〈213〉phage
〈400〉2
ATGGTACGCT GGACTTTGTG GGATACCCTC GCTTTCCTGC TCCTGTTGAG 50
TTTATTGCTG CCGTCATTGC TTATTATGTT CATCCCGTCAACATTCAAAC 100
GGCCTGTCTCATCATGGAAG GCGCTGAATT TACGGAAAAC ATTATTAATG 150
GCGTCGAGCG TCCGGTTAAAGCCGCTGAAT TGTTCGCGTT TACCTTGCGT 200
GTACGCGCAG GAAACACTGA CGTTCTTACT GACGCAGAAG AAAACGTGCG 250
TCAAAAATTA CGTGCGGAAG GAGTGA 276
〈210〉3
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉artifical
〈400〉3
ATGGTACGCT GGACTTTGTG GGA 23
〈210〉4
〈211〉25
〈212〉DNA
〈213〉artifical
〈400〉4
TCACTCCTTC CGCACGTAAT TTTTG 25
〈210〉5
〈211〉33
〈212〉DNA
〈213〉artifical
〈400〉5
GGGCGAGCTC ATGGTGCGCT GGACGTTGTG GGA 33
〈210〉6
〈211〉35
〈212〉DNA
〈213〉artifical
〈400〉6
GGGCGGATCC TCACTCTTTG CGCACATAAT TTTTG 35