CN109735481A - 一种vbnc状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，首先将阪崎肠杆菌接种后培养至对数期，得到培养液；然后使用抗生素与上述培养液进行诱导培养，诱导培养的操作为：取培养液离心，取沉淀，重悬，诱导培养浓度至10⁸CFU/mL以下；其中，抗生素为氨苄青霉素，抗生素在诱导培养后的培养液中浓度为50~1600μg/mL。本发明提供的方法能够快速地诱导阪崎肠杆菌进入VBNC状态，同时采取常规培养复苏方法验证VBNC状态阪崎肠杆菌能够复苏，可恢复致病性。因此，本发明可为提高乳制品中阪崎肠杆菌检测的准确性奠定基础，有效地避免VBNC状态阪崎肠杆菌的存在而造成的潜在隐患。

Description

一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法

技术领域

本发明属于微生物培养及检测技术领域，更具体地，涉及一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法。

背景技术

细菌“活的非可培养”状态（viable but non- culturable state,VBNC）是细菌在受到外界不良环境的胁迫时，通过调整自身的代谢途径，进入的一种自我保护状态。在这个过程中，细菌的形态逐渐发生改变并且不能够在平板上生长繁殖，因此，常规的平板检测法不能检测到VBNC状态的细菌。但是，当外界的不良环境撤去后，VBNC状态的细菌会进行复苏，恢复可培养的能力。对于一些致病菌来说，VBNC状态下的致病菌通常不具备致病性，但致病菌的致病性能够随着VBNC状态的复苏而恢复，仍然会引起人类疾病。诱导致病菌进入VBNC状态的原因有很多种，极端温度、消毒剂和防腐剂的使用、抗生素的滥用以及低水分含量等因素都能够诱导其进入VBNC状态。而致病菌一旦进入VBNC状态，常规平板检测法很难将其检出，给食品安全带来了极大的隐患。

阪崎肠杆菌是近几年来乳制品中新出现的致病菌。新生儿的免疫功能不够完善，抵抗力较差，很容易误食被阪崎肠杆菌污染的奶粉而患上新生儿脑膜炎、小肠结肠炎等疾病。而进入VBNC状态的阪崎肠杆菌不仅常规平板检测方法无法检出，而且能通过复苏引起婴幼儿疾病，为婴儿饮食安全带来巨大隐患。因此，通过对阪崎肠杆菌进入VBNC状态诱导因素的研究，能够提高检测的准确性和效率，对降低食品安全问题起到了巨大作用。

发明内容

本发明针对于现有技术的不足，提供一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法。

本发明采用以下技术方案实现上述技术目的：

一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，包括如下步骤：

S1.阪崎肠杆菌的增菌培养：将阪崎肠杆菌接种后，培养至对数期，得到培养液；

S2.阪崎肠杆菌VBNC状态的诱导：使用抗生素与步骤S1中的培养液进行诱导培养，诱导培养的操作为：取步骤S1中的培养液离心，取沉淀，重悬，诱导培养浓度至10⁸ CFU/mL以下；

其中，抗生素为氨苄青霉素，抗生素在诱导培养后的培养液中浓度为50~1600 μg/mL。

作为本发明的一种优选方案，步骤S1中增菌所用培养基为LB肉汤培养基、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素或肠道菌增菌肉汤。

作为本发明的一种优选方案，改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素配置方法如下：取30~35g氯化钠，18~22g胰蛋白胨，3~6g乳糖，2~3g磷酸二氢钾，2~3g磷酸氢二钾，0.05~0.15g十二烷基硫酸钠溶于1L水，得到mLST溶液，加热搅拌，调节pH至6.8±0.2；8~12mg万古霉素溶解于10mL水中配置成万古霉素溶液；mLST溶液与万古霉素溶液的混合体积比为（50~200）：1。

选用LB肉汤培养基配置方法如下：取10g胰蛋白胨，5~7g酵母提取物、8~10g氯化钠，加双蒸水完全溶解后，用5mol/L的氢氧化钠调节pH至7.0~7.5，定容至1L，高压灭菌。

肠道菌增菌肉汤（EE）配置方法如下：取10g蛋白胨，5g葡萄糖，20g牛胆盐，2g磷酸二氢钾，8g磷酸氢二钠，0.015g煌绿溶于1L水中，调节平pH至7.2±0.2。

作为本发明的一种优选方案，步骤S2中经过诱导后进行常规定量和/或定性分析。

作为本发明的一种优选方案，步骤S1中首先将阪崎肠杆菌单菌落接种，然后加入培养基，培养条件如下：37±1℃下恒温培养18~24h，再挑取单菌落接种于培养基中，37±1℃下培养12~18h。

作为本发明的一种优选方案，诱导培养浓度至10⁶~10⁷ CFU/mL。

作为本发明的一种优选方案，步骤S2中抗生素进行诱导的环境条件为：温度20~25℃，湿度70~85％。

作为本发明的一种优选方案，步骤S2中，将阪崎肠杆菌诱导至VBNC状态后，进行复苏。

作为本发明的一种优选方案，复苏的操作为营养复苏和/或无营养复苏。例如，营养复苏可以加入常规培养基进行培养，无营养复苏可以利用升温孵育等进行。

作为本发明的一种优选方案，步骤S2中将培养液在8000~12000 rpm/min下离心5~10分钟。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

本发明提供的方法能够快速地诱导阪崎肠杆菌进入VBNC状态，同时采取了营养肉汤培养和无营养孵育、添加有机物、升温等复苏方法，使其恢复致病性。因此，本发明可为提高乳制品中阪崎肠杆菌检测的准确性奠定基础，有效地避免VBNC状态阪崎肠杆菌的存在而造成的潜在隐患。

附图说明

图1为不同时间下平板定量结果。

图2为正常状态下和VBNC状态下阪崎肠杆菌的电镜扫面图。

图3为荧光显微镜观测图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1：

本发明的VBNC状态下阪崎肠杆菌的诱导具体步骤如下：

1、阪崎肠杆菌的增菌培养

在无菌条件下，用接种环挑去平板上的单菌落，接种于LB肉汤培养基中并放置于37℃下恒温培养18~24h。挑取平板上的单菌落接种于LB肉汤中，37℃下培养12h。

2、VBNC状态阪崎肠杆菌的诱导

（1）氨苄青霉素的诱导

取步骤1中培养得到的菌液1mL放入离心机离心2分钟，弃去上清液，在沉淀中加入生理盐水进行涡旋。将重旋好的菌液稀释100倍，选择10⁷ CFU/mL浓度细菌进行诱导，诱导的条件为：温度24℃，湿度80％。在不同的离心管中添加氨苄青霉素使其终浓度达到0、50、100、400、1600 μg/mL。

（2）平板计数法定量检测

将添加了抗生素的离心管置于室温下，分别选取第0、1、3、7、10、14、20、30天进行定量测定。取1mL菌悬液，与1mL生理盐水配平后，于12000 rpm/min离心3 min，迅速弃去上清液，并将此过程进行三个重复。最后用1mL生理盐水重悬沉淀。取100μL，稀释合适倍数后进行涂布计数。

（3）荧光显微镜观察

参照LIVE/DEAD BacLight试剂盒的步骤分别进行处理活的阪崎肠杆菌、热致死的阪崎肠杆菌以及VBNC状态下的阪崎肠杆菌，观察其发出的荧光从而进行定性分析。

（4）VBNC状态菌的复苏

①营养培养复苏

取3mL VBNC状态阪崎肠杆菌加入到10mL无菌离心管中，采取离心方式将抗生素洗脱，洗脱后将其用生理盐水重悬并接种于营养肉汤中，置于36℃下培养18h。在无菌条件下，用移液枪移取100 μL培养液接种于平板培养基上，倒置于37℃很稳培养箱中培养24h。观察平板上有黄色圆形的菌落出现，表明复苏成功。

②无营养升温孵育复苏

取3mLVBNC状态阪崎肠杆菌加入到10mL无菌离心管中，采取离心方式将抗生素洗脱，洗脱后将其用生理盐水重悬置于37℃下孵育后进行涂布培养。或将其放置于25~28℃下培养18~24h后再置于37℃下孵育后进行涂布培养。观察平板上有黄色圆形的菌落出现，表明复苏成功。

③添加有机物复苏

取3mLVBNC状态阪崎肠杆菌加入到10mL无菌离心管中，采取离心方式将抗生素洗脱，加入4~8 %的吐温20放置于28℃~37℃下孵育后进行涂布培养。观察平板上有黄色圆形的菌落出现，表明复苏成功。

④添加营养物质复苏

取3mLVBNC状态阪崎肠杆菌加入到10mL无菌离心管中，采取离心方式将抗生素洗脱，加入体积分数为25%无菌酵母浸膏，放置于25℃~37℃下孵育后进行涂布培养。观察平板上有黄色圆形的菌落出现，表明复苏成功。

结果如下：

如图1所示：分别是100、400、1600 μg/mL Amp对阪崎肠杆菌处理后可培养数随着时间的变化趋势。细菌在400 μg/mL处理浓度下，10天后完全进入VBNC状态，1600 μg/mL的Amp处理下，7天后完全进入VBNC状态。而在400 μg/mL Amp处理下，诱导四天的时间后，可培养数的已经降至10²以下，细菌绝大多数进入VBNC状态。由此可知，处于正常状态下的细菌在受到外界抗生素的胁迫时，逐渐开始进入VBNC状态，在这个过程中，随着诱导时间的进行，平板可培养数越来越少。在抗生素使用达到一定剂量时，正常状态下的阪崎肠杆菌会随着时间推移进入到VBNC状态。由400 μg/mL Amp处理下所得VBNC状态阪崎肠杆菌的百分比为88%，1600 μg/mL的Amp处理下所得VBNC状态阪崎肠杆菌百分比为74%，400 μg/mL Amp处理效果相对更好，上述处理不仅节约了抗生素节成本，且能得到更多VBNC状态阪崎肠杆菌，有利于后续实验研究的进行。

如图2所示，左边为正常状态下的阪崎肠杆菌，右边是VBNC状态的阪崎肠杆菌。正常状态的阪崎肠杆菌在受到抗生素胁迫时，会通过自身调节进入到VBNC状态，这个过程中阪崎肠杆菌的形态会发生变化，由长杆状逐渐变为球形或者是椭球形。

如图3所示，活菌在荧光显微镜下呈现绿色状态，死菌在荧光显微镜下呈现红色状态。

综上，本发明提供了一种简便、快速的阪崎肠杆菌VBNC状态的诱导和复苏方法。通过在正常菌液中加入适量的抗生素成功的诱导阪崎肠杆菌进入到VBNC状态，并且能够在适宜的条件下恢复可培养性。本发明中提供的抗生素诱导阪崎肠杆菌进入VBNC的方法能够对奶粉生产环节微生物的防控以及研究阪崎肠杆菌VBNC状态的进入机制提供了有意义的参考。并且提高检测过程中准确性，避免VBNC状态的不可培养性造成的检测误差，规避了由VBNC状态的阪崎肠杆菌带来的食品安全隐患。

Claims (9)

1.一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.阪崎肠杆菌的增菌培养：将阪崎肠杆菌接种后，培养至对数期，得到培养液；

S2.阪崎肠杆菌VBNC状态的诱导：使用抗生素与步骤S1中的培养液进行诱导培养，诱导培养的操作为：取步骤S1中的培养液离心，取沉淀，重悬，诱导培养浓度至10⁸ CFU/mL以下；

其中，抗生素为氨苄青霉素，抗生素在诱导培养后的培养液中浓度为50~1600 μg/mL。

2.根据权利要求1所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，步骤S1中增菌所用培养基为LB肉汤培养基、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素或肠道菌增菌肉汤。

3.根据权利要求2所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，步骤S2中经过诱导后进行常规定量和/或定性分析。

4.根据权利要求1所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，步骤S1中首先将阪崎肠杆菌单菌落接种，然后加入培养基，培养条件如下：37±1℃下恒温培养18~24h，再挑取单菌落接种于培养基中，37±1℃下培养12~18h。

5.根据权利要求1所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，诱导培养浓度至10⁶~10⁷ CFU/mL。

6.根据权利要求1所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，步骤S2中抗生素进行诱导的环境条件为：温度20~25℃，湿度70~85％。

7.根据权利要求1所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，步骤S2中，将阪崎肠杆菌诱导至VBNC状态后，进行复苏。

8.根据权利要求7所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，复苏的操作为营养复苏和/或无营养复苏。

9.根据权利要求1所述VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，其特征在于，步骤S2中将培养液在8000~12000rpm/min下离心5~10分钟。