CN111139281A - 一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法 - Google Patents

一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细菌检测技术领域，具体公开了一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法。所述方法是将菌液利用微流控技术，形成微液滴。将生成的微滴培养后拍照，再通过人工计数或借助计算机技术等，将其计数，得到特殊状态菌的数量。同时，可对特殊状态菌进行分选和富集。相比较于现有的平板法计数，或只对膜完整的活菌进行计数，本发明准确性大大提升，突破了现有的对特殊状态菌的计数方式，能够及时有效地判断食品卫生状况，是消除食源性致病菌隐性残留造成食源性疾病的有效手段。同时，本发明方法能够对特殊状态菌进行富集和分选，降低研究过程中细胞异质性带来的结果误差，对研究细胞变化机制和研究菌的生长活动有较大的价值。

Description

一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富 集的方法
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，更具体地，涉及一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法。
背景技术
细菌的特殊状态是细菌在受到外界环境影响时，细菌为了生存而产生的一种反应。如细菌“活的非可培养”状态（viable but non- culturable state,VBNC）以及在抗生素作用下产生的耐药菌。
VBNC状态是细菌在受到外界不良环境的胁迫时，通过调整自身的代谢途径，进入的一种自我保护状态。在这个过程中，细菌的形态逐渐发生改变并且不能够在平板上生长繁殖，因此，常规的平板检测法不能检测到VBNC状态的细菌。但是，当外界的环境变得适宜时，VBNC状态的细菌可能会进行复苏，恢复可培养的能力。对于一些致病菌来说，VBNC状态下的致病菌通常不具备致病性，但致病菌的致病性能够随着VBNC状态的复苏而恢复，仍然会引起人类疾病。因此，能够准确识别VBNC的存在利于及时有效地判断食品卫生状况，是消除食源性致病菌隐性残留造成食源性疾病的有效手段，从而防止食品安全问题的发生。同时，对于加强我全省对该特殊状态食源致病菌的快速识别能力，提高市场监管及进出口商品检验的效率，提高企业的产品质量监控水平，降低企业经营风险具有重大意义。
VBNC状态的致病菌的计数，常用DNA修饰染料如叠氮溴化丙锭（PMA）和分子检测方法如荧光定量PCR（qPCR）以及荧光环介导等温DNA扩增相结合的方法，当可培养数降为0，而活菌数不为0时，认为此时的活菌处于VBNC状态。但采用DNA修饰染料结合分子检测方法只能评估膜完整的活菌数量，无法直观准确区分活菌样本中的其他表型如VBNC表型。除此之外，上述方法依赖平板检测法测定值的准确程度，属于相对定量的检测方法，并不能准确定量。
耐药菌是抗菌药物与细菌长期、广泛对峙的结果，或者说是细菌在药物的压迫或刺激下，为了生存而产生的一种反应。当耐药菌定值到人体中时，抗菌药物的滥用会杀死敏感细菌而使得耐药菌处于优势，并在绝对优势下进一步生长繁殖，从而引发严重感染。
目前，无论是对于特殊状态如VBNC状态菌的计数，还是对耐药菌形成机理的研究，都是基于群体层面。对于VBNC状态菌的计数，建立在平板培养法以及膜完整原则之上，造成结果误差较大。对于耐药菌来说，在研究其形成机制时，因为无法准确区分不同状态菌而将其混在一起进行研究。但是，不同状态菌会在细胞水平和分子水平上存在明显的细胞间异质性，结果只能给出多种特殊状态形成结果的一个平均值，无法针对某种状态形成原因进行准确的了解其形成机制，更无法具有针对性的进行防控。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术中不能精准定量特殊状态菌的数量的问题，提供了一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法。
通过该发明方法，能够从单细胞角度观察每个细菌在受到外界环境胁迫时的状态变化，并通过人工计数或借助计算机算法准确计数细菌不同表型的数量。
同时，通过精准定量，进一步能够实现精准的分选和富集。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，将菌液利用微流控技术，形成微液滴，然后将菌液培养后进行计数。
优选地，微液滴为单一均匀的微液滴。
优选地，生成的微滴数大于菌体数量，并且单个微液滴中包含零个或单个菌。
更优选地，菌液中菌体个数低于微液滴数的80%。最优选地，菌液中菌体个数为微液滴数的80%。本数据依据于泊松理论，即在80%的比例下，能够实现最佳的分散性，即单个菌体分步在单个微液滴中，低于该比例，空泡数增多，不便于观察和计数；高于该比例，单个微液滴中包含多个菌体的概率增加，计数的精准度降低。
本发明结合微流控技术，微流控技术又称“芯片上的实验室(LoC)”，集成了所有必要的分析程序，包括样品预处理和最终检测到一个芯片，能够在宽度/深度为微米的通道中操纵少量液体。与传统的宏观仪器相比，微流控装置具有用量少、效率高、过程控制精确、便携等优点。液滴微流控技术是微流控领域的一个重要分支，可以生成高度均一的液滴，并且可以自动化的在液滴中进行生物生化反应。
优选地，菌液中还包括有特定培养基。其中，特定培养基的含义是指根据菌液中特殊状态菌的需求进行繁殖所需要的培养基。
本发明结合微流控技术，将单个细菌和液体培养基同时包裹在微滴中，在所包菌的生长条件下进行培养，利用数学统计学方法，对培养后的微滴随机取样进行显微拍照，利用人工或者设计计算机软件算法，将所得照片通过计算机算法直接读出未出现生长繁殖微滴数在总微滴中的比例，进一步计算出原样本中处于特殊状态如“不可培养状态”细菌的总量。
优选地，微液滴的培养条件为微液滴所包菌的特定培养条件。其中，特定培养条件的含义是指菌液所含培养基与菌体的生长繁殖所需培养条件。
优选地，在所包裹菌的培养条件下，将单个微液滴进行培养，通过显微镜观察微液滴中菌体繁殖情况，并进行拍照。
更优选地，通过显微拍照所得照片，利用人工或借助计算机技术，基于统计学原理计算，将特殊状态菌和其他状态的菌进行区别，计算特殊状态菌的数量。特殊状态菌为VBNC表型、耐药菌株等等。
以VBNC表型精准计数为例，本发明方法具体可以包括如下步骤：
采用微流控芯片生成包裹特定培养基和细菌的微滴，通过细菌在培养基中的繁殖情况直观反映出不同细菌表型的数量。该发明首先需要确定每个微滴中包含单个细菌，方法如下：控制微滴生成数量一定，梯度稀释菌液后，用数字PCR精确测定稀释液中所含细菌拷贝数，根据测定值调整细菌浓度，使其所含细菌个数是微滴总数的80%。调整水油两项生成速率生成微滴，并将微滴经过培养后，使得出现生长繁殖的微滴占总微滴的80%，此条件下所生成的微滴中，每个微滴内包含了一个细菌。该发明排除了空液滴的干扰。将细菌能单分散到每个液滴中，置于37℃培养18小时，通过显微拍照及计算，得出此时未出现生长繁殖的微滴数量，即空微滴数量。该发明方法基于特殊状态细菌如VBNC状态在一定时间内无法在LB肉汤中繁殖这一特点，将生成的微滴放置于培养箱中一定时间，正常状态细菌则会开始繁殖。将微滴置于显微镜下观察，包裹正常状态和VBNC状态的微滴会有明显的色度区分，常规设计计算机软件算法，对这些具有明暗区分的液滴进行计数，根据数学抽样原则，计算出VBNC表型占总菌数的比例，同时除去空微滴数量，即可得到VBNC表型数量。本发明主要目的及优势在于，能够进准定量细菌的特殊状态。在定量特殊状态的同时，可以再后续根据微滴的明暗程度对微滴进行分选，能够富集到特殊状态的细菌进行组学分析，研究其形成的调控机制。
本发明同时提供一种特殊状态菌的分选富集方法，将菌液分散在培养基中，利用微流控技术，形成微液滴，通过区分特殊状态菌并进行富集，并进一步用于单细胞测序和转录组学分析等检测。
通过该发明方法，能够对特定某种状态的菌进行分选和富集，并能够将富集到的菌进行进一步分析检测，降低细胞之间的异质性带来的影响。分选和富集基于上述实验，经过培养，出现繁殖的微滴和未出现繁殖的微滴之间有明显的灰度差别，根据灰度不同进行分选并将其富集。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明基于液滴微流控技术，提出一种能够准确定量特殊状态数量的方法。本方法利用微流控系统，优选将单个细菌和特定液体培养基同时包裹在微滴中，在所包裹菌的培养条件下进行培养，利用数学统计学方法，对培养后的微滴进行显微拍照，设计计算机软件算法，将所得照片通过计算机算法直接读出未出现生长繁殖微滴数在总微滴中的比例，进一步计算出原样本中处于特殊状态菌的总量。同时，通过培养后液滴之间的灰度差异，进行液滴的分选和富集，能够获得单一状态菌。通过该发明方法，能够从单细胞角度观察每个细菌在受到外界环境胁迫时的状态变化，通过计算机算法准确计数细菌不同状态的数量，并能大量收集单一状态菌，进一步进行分析检测。
相比较于现有的平板法计数，或只对膜完整的活菌进行计数，本发明提供的方法准确性大大提升，突破了现有的对菌的计数方式，因而能够精准的获知不同状态的菌的数量，及时有效地判断食品卫生状况，是消除食源性致病菌隐性残留造成食源性疾病的有效手段，从而防止食品安全问题的发生。同时，该发明方法能够对特殊状态菌进行富集和分选，降低研究过程中细胞异质性带来的结果误差，对进一步研究细胞变化机制和研究菌的生长活动有较大的价值。
附图说明
图1是 起始样本拷贝数微滴分布图。
图2是 单细胞液滴繁殖显微观测图。
图3是 液滴理论分散分布图。
图4是 计算机识别微滴图。
图5是 耐药菌筛选图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
除特殊说明，本实施例以及实验例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。
实施例1：
本发明获得单个液滴包裹单细胞的具体操作步骤如下：
1、将储存在-80℃甘油管中的细菌在LB平板上划线，并放置于37℃下恒温培养18-24h。挑取平板上的单菌落接种于LB肉汤中，37℃下培养12h。
用无菌生理盐水梯度稀释菌液，选取合适梯度菌液作为水相，用微流控装置形成微滴，使用数字PCR仪对起始样本拷贝数进行测定。如图1所示，测得起始菌液浓度为5.4545×104CFU/mL。取880μL菌液重悬于1mL生理盐水中，得菌液浓度为4.8×104CFU/mL的样本溶液，并用LB肉汤进行重悬，使样本中菌体个数占微滴总数80%。样本经涡旋后利用微流控装置生成60000个微滴。
3、将生成的微滴在37℃下进行恒温培养18-24h，在显微镜下能够直观的观察每个微滴中包裹的菌体生长情况。按照样本抽样原则，随机抽取相应数量的菌液进行显微拍照，计算出出现生长繁殖的液滴占总液滴比例的80%（如果计算比例不为80%，则调整微滴生成参数，使得出现生长繁殖的微滴是总微滴数的80%），此时表示每个细菌被单个分散到微滴中，同时，有20%的液滴量是空液滴（无内容物）。如图2可见，当培养时间为0时，单个液滴中包裹0个或者1个细菌，随着培养时间的增加，细菌在微滴中出现繁殖，包裹到细菌的微滴和未包裹的细菌出现明显的灰度差别。
4、每个液滴理论分散的个数和样本中菌体个数占微滴总数比例关系为：Y=-In(1-X/N)，其中Y为每个液滴理论分散菌体个数（单个液滴拷贝数），X/N为菌体个数占液滴总数的比例（阳性液滴系数占总微滴数的比例），如图3所示。
从图1可以看出，随着反应阳性体系数(X)的增加，体系中目标分子的拷贝数相对于X会有较大的差距，当X/N增长超过0.8时，菌体分散结果的不确定度大大提高，总体来说，样本菌液中的菌体个数不得超过液滴生成总数80%。另个方面，N的划分数量越大（微滴数越多），能够使测量结果的线性范围越大，有利于提高反应的灵敏度、稳定性以及可重复性。因此，为了保证菌液的单分散性，初始的菌液浓度和微滴总数的比值要低于80%。
实施例2：
以VBNC状态阪崎克罗诺杆菌为例——特殊状态菌的计数和分选富集：
1、将储存在-80℃甘油管中的细菌在LB平板上划线，并放置于37℃下恒温培养18-24h。挑取平板上的单菌落接种于LB肉汤中，37℃下培养6-7h。
2、取30mL对数期的菌液（约108CFU/mL）离心，将沉淀转移到300mL无菌生理盐水中，并在生理盐水中加入120mg氨苄青霉素，置于室温中进行诱导。
3、取1mL诱导过程中的菌液，加入5μLPMAxx染料，放置于暗中孵育15min后，在核酸曝光装置中进行曝光15min，采用DNA提取试剂盒的方法提取DNA进行数字PCR检测。利用拷贝数确定此时活菌数的菌液浓度。
3、根据检测的活菌的菌液浓度将菌液进行富集或稀释，使活菌终浓度为4.8×104CFU/mL，用1mLLB肉汤重悬菌液作为水相，用微流控芯片生成相应数量微滴。
4、将生成的微滴转移至八连管中，密封后放置37℃下培养18h。
5、根据数学抽样原理，随机抽出一定数量的液滴进行显微拍照，利用设计的计算机软件程序，对所得照片中微滴进行读取，如图4所示为计算机识别微滴图，计算机软件能够通过液滴之间的灰度不同对其进行识别，将图片中未出现繁殖的微滴判定为1，出现繁殖的判定为0，能够直接计算出未出现生长繁殖的微滴的比例，排除空微滴个数后，即为VBNC状态的阪崎克罗诺杆菌的数量。
6、设置计算机程序识别微滴之间的灰度差别，对培养后的液滴进行识别和分选，用1.5mL离心管收集未出现生长繁殖的液滴，所得全部为VBNC状态的阪崎克罗诺杆菌。
7、收集未出现生长繁殖的微滴，即为VBNC状态阪崎克罗诺杆菌。
8、将收集到的VBNC状态菌进行转录组学分析，研究调控VBNC状态菌形成的调控机制。
实施例3：
以金黄色葡萄球菌为例——抗生素耐药菌株的筛选。
1、将储存在-80℃甘油管中的金黄色葡萄球在LB平板上划线，并放置于37℃下恒温培养18-24h。挑取平板上的单菌落接种于LB肉汤中，37℃下培养12h。
2、用无菌生理盐水梯度稀释菌液，利用数字PCR测定样本中菌液浓度，并根据拷贝数调整菌液浓度为4.8×104CFU/mL。
4、将4.8×104CFU/mL的菌液重悬于加入含有青霉素的LB液体培养基中作为水相，生成液滴，将生成的液滴转移至八连管中并在37℃下进行恒温培养18h，可以耐抗生素的金黄色葡萄球菌在培养过程中能够进行繁殖。
5、在培养18h后，包裹了可生长繁殖细菌的液滴和不可生长繁殖细菌的液滴之前出现明显的灰度差别，如图5所示，图中微滴中的黑点（可视为一个菌体）即为耐抗生素的金黄色葡萄球菌，在抗生素存在的培养基中依然生长繁殖，菌体在显微镜下形成肉眼可见的聚集。设置计算机程序通过灰度差别对这两种液滴进行识别和分选。
6、收集出现生长繁殖的微滴，即为耐青霉素的金黄色葡萄球菌耐药菌株。
7、将收集到的耐药菌进行转录组学分析，进一步研究金黄色葡萄球菌耐药形成的调控机制。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，将菌液利用微流控技术，形成微液滴，然后将菌液培养后进行计数。
2.根据权利要求1所述基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，微液滴为单一均匀的微液滴。
3.根据权利要求1或2所述基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，生成的微液滴数大于菌体个数，并且单个微液滴中包含零个或单个菌。
4.根据权利要求3所述基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，菌液中菌体个数低于微液滴数的80%。
5.根据权利要求1所述基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，菌液中还包括有特定培养基。
6.根据权利要求5所述基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，微液滴的培养条件为微液滴所包菌的特定培养条件。
7.根据权利要求5所述基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，在所包裹菌的培养条件下，将单个微液滴进行培养，通过显微镜观察微液滴中菌体繁殖情况，并进行拍照。
8.根据权利要求5所述基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，其特征在于，通过显微拍照所得照片，利用人工或借助计算机技术，基于统计学原理计算，将特殊状态菌和其他状态的菌进行区别，计算特殊状态菌的数量。
9.一种特殊状态菌的分选富集方法，其特征在于，将菌液分散在培养基中，利用微流控技术，形成微液滴，通过区分特殊状态菌并进行富集，并进一步用于单细胞测序和转录组学分析等检测。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021262098A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 National University Of Singapore Method and system for colony picking
CN114669337A (zh) * 2022-03-25 2022-06-28 天津大学 一种微流控装置及其在分离细菌中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006112713A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Dsm Ip Assets B.V. High throughput screening method for assessing heterogeneity of microorganisms
CN104593253A (zh) * 2015-01-19 2015-05-06 清华大学 一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片
CN104877899A (zh) * 2014-02-28 2015-09-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种基于液滴的微生物快速直接绝对定量检测系统和方法
CN106148159A (zh) * 2015-03-23 2016-11-23 西南大学 一种快速生长微藻藻株高通量筛选系统和方法
CN106148177A (zh) * 2015-03-27 2016-11-23 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种基于微流芯片与智能手机的快速活菌计数系统
CN109735481A (zh) * 2018-12-24 2019-05-10 华南农业大学 一种vbnc状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006112713A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Dsm Ip Assets B.V. High throughput screening method for assessing heterogeneity of microorganisms
CN104877899A (zh) * 2014-02-28 2015-09-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种基于液滴的微生物快速直接绝对定量检测系统和方法
CN104593253A (zh) * 2015-01-19 2015-05-06 清华大学 一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片
CN106148159A (zh) * 2015-03-23 2016-11-23 西南大学 一种快速生长微藻藻株高通量筛选系统和方法
CN106148177A (zh) * 2015-03-27 2016-11-23 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种基于微流芯片与智能手机的快速活菌计数系统
CN109735481A (zh) * 2018-12-24 2019-05-10 华南农业大学 一种vbnc状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIULIA MANINA等: "A Single-Cell Perspective on Non-Growing but Metabolically Active (NGMA) Bacteria", 《PATHOGENESIS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AND ITS INTERACTION WITH THE HOST ORGANISM》 *
ROSEMARY A. BAMFORD等: "Investigating the physiology of viable but non-culturable bacteria by microfluidics and time-lapse microscopy", 《BMC BIOLOGY》 *
陈超: "《新技术与精准医学》", 31 December 2017 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021262098A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 National University Of Singapore Method and system for colony picking
CN115702240A (zh) * 2020-06-24 2023-02-14 新加坡国立大学 用于菌落挑取的方法和系统
CN114669337A (zh) * 2022-03-25 2022-06-28 天津大学 一种微流控装置及其在分离细菌中的应用

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