CN107058606A - 一种艾伯特埃希菌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种艾伯特埃希菌的检测方法，所述方法包括基于eae基因PCR初筛、乳糖不发酵等特点的艾伯特埃希菌分离培养初筛程序；诊断性三重PCR、基于16S rDNA序列分析、MLST分析的艾伯特埃希菌的鉴定程序。本发明利用了艾伯特埃希菌在低温时仍能生长的特性，通过降低一次增菌的温度至20℃，抑制了大肠杆菌的生长，此时艾伯特埃希菌成为该温度下生长的优势菌，进而使得艾伯特埃希菌一次增菌中的菌体浓度提高6个滴度(106)，以大大提高艾伯特埃希菌一次增菌的效率以及艾伯特埃希菌的检出率，这为艾伯特埃希菌鉴定程序的建立打下基础。

Description

一种艾伯特埃希菌的检测方法
技术领域
本发明涉及细菌检测领域，具体涉及一种艾伯特埃希菌的检测方法。
背景技术
艾伯特埃希菌(Escherichia albertii)是近年来发现和命名的一个新种，为与人散发肠道感染及突发食源性腹泻事件有关的肠道致病菌。由于食品或人的粪便样品中含有的细菌种类多样，其中大肠杆菌无处不在，艾伯特埃希菌与大肠杆菌同属于埃希氏菌属，在生化和菌株培养特性上有很多相似性，在37℃培养时以大肠杆菌生长最为旺盛，抑制了艾伯特埃希菌的生长，使得艾伯特埃希菌的检出率大大降低。目前国外有12个国家开展了此菌的研究，而国内只有自贡市疾病预防控制中心开展了此菌的研究。
目前现有技术中有两种艾伯特埃希菌的培养方法，1)含有艾伯特埃希菌的动物样品(鸡肉与内脏、野生家养鸟肠内容物或粪便)在BPW或MAC培养基或者EC肉汤中35℃或42℃培养18h或24h，进行一次增菌；2)含有艾伯特埃希菌的病人样品(粪便)在TSB或DHL培养基中37℃培养18h～24h进行一次增菌。但上述两种方法在实验过程中以发酵乳糖的优势大肠杆菌增菌为主，MAC平板上不发酵乳糖的无色菌落很少(95％以上的艾伯特埃希菌株不发酵乳糖)，这说明在35℃～42℃增菌液中以大肠杆菌生长最为旺盛。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种艾伯特埃希菌的培养方法。
为了达成上述的目的，本发明提供了艾伯特埃希菌的培养方法，包括以下步骤：
1)按照1:10的重量百分比采集25g食品+225ml EC肉汤增菌液；3ml脑心-甘油肉汤保存液+2ml稀大便或2g干粪便的混合液+9ml EC肉汤增菌液，于20℃培养18-36h；
2)取1ml上述EC肉汤增菌液，8000rpm离心3min集菌，弃上清；用150μl裂解液悬菌，振荡使沉淀充分混匀，水煮10min；12000rpm离心5min，取上清即为PCR反应模板；eae基因PCR初筛引物为eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行PCR初筛；PCR反应体系为：在20μl体系中，2×Taq MasterMix 10μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水7μl；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，30次循环，最后延伸72℃5min，每次实验均设有阴、阳性对照；PCR产物以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳检测；
3)用接种环挑取3环上述初筛eae阳性增菌保存液，分离划线于3个麦康凯平板上，36℃，24h；可疑菌落为在平板上呈凸起、边缘整齐、无色的较大菌落；然后挑出不少于30个的可疑无色菌落，每一个单个可疑无色菌落的二分之一作为PCR反应模板检测eae基因；且每一个单个可疑无色菌落的另二分之一用于后续纯培养；
4)接种eae阳性单菌落于营养琼脂平板36℃纯培养24h，纯培养物分别接种于木糖和乳糖发酵管，并用软琼脂检测动力，36℃培养，24h后观察结果；
5)将上述eae基因阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖、动力阴性的菌落作为疑似艾伯特埃希菌；无菌接种环挑取少量纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min，取上清液做PCR模板，用于后续的诊断性三重PCR鉴定、16SrDNA序列分析及MLST分析。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤1)中，所述食品选自生牛肉、生猪肉、生羊肉、生鸡肉、生鸭肉、新鲜鸡肠或新鲜鸭肠；所述家禽家畜选自鸡、鸭或家养鸽子；所述野生鸟类选自白鹭、麻雀或燕子；所述2ml稀大便或2g干粪便来自腹泻患者、家禽家畜、野生鸟类粪便标本。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤2)中，所述裂解液的配方为：100mMNaCl，10mM Tris-HCl[pH8.3]，1mM EDTA[pH9.0]，1wt％Triton X-100。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤5)中，用10μl一次性无菌接种环挑取15mm纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤5)中，所述诊断性三重PCR鉴定具体为：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysP和mdh建立的三重PCR检测方法，如3个基因均阳性，可初步确认为艾伯特埃希菌；其中诊断性三重PCR所用的引物见下表1：
表1诊断性三重PCR所用的引物
PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水18μl；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，35次循环，最后72℃延伸5min，每次扩增均设有阴、阳性对照；取上述PCR产物5μl，以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤5)中，所述16S rDNA序列分析具体为：
扩增艾伯特埃希菌16S rDNA的引物为EA16S-F:GGATCCAGACTTTGATYMTGGCTCAG和EA16S-R:CCGTCAATTCCTTTRAGTTT；其中PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix25μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板2μl，纯水19μl；PCR反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，45s，30次循环，最后72℃延伸7min，每次扩增均设有阳性和空白对照；
取PCR产物5μl以1.5wt％琼脂糖凝进行电泳，通过凝胶成像系统观察是否扩增出目的大小片段，PCR产物均纯化后进行测序；利用SeqMan软件对测序结果进行峰图查看，并在NCBI数据库中进行比对检索，初步判断结果；利用MEGA6.0软件，以NCBI上公布的大肠埃希菌、志贺氏菌、费格森埃希菌的16S rDNA序列为参考，采用Neighbor-joining法构建系统进化树，进行分类位置分析。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤5)中，所述MLST分析具体为：参照数据库http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_html提供的大肠埃希菌MLST分型方案，选择7个管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA，PCR引物序列、退火温度及产物大小见表2：
表2 7个管家基因的扩增引物序列及产物大小
PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板2μl，纯水19μl；PCR反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，各管家基因退火温度30s，延伸72℃，45s，30次循环，最后延伸7min，每次扩增均设空白和阳性对照；
取PCR产物5μl以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统观察其大小片段，PCR产物均纯化后进行测序；
利用SeqMan软件对PCR产物序列与数据库中的标准序列进行拼接和校正，校正后的序列上传至E.coli MLST数据库中，确定菌株的等位基因型和序列型；利用MEGA6.0软件Neighbor-joining法构建系统进化树，与国际数据库中已收录的大肠埃希菌、志贺菌、艾伯特埃希菌和伤寒沙门菌进行聚类分析，确定艾伯特埃希菌种的鉴定。
本发明具有以下有效效果：
本发明人在总结归纳国外研究者艾伯特埃希菌的鉴定程序的基础上，经过反复实验验证，建立了艾伯特埃希菌的鉴定程序，包括基于eae基因PCR初筛、乳糖不发酵等特点的艾伯特埃希菌分离培养初筛程序；诊断性三重PCR、基于16S rDNA序列分析、MLST分析的艾伯特埃希菌的鉴定程序以及毒力基因、PFGE和药物敏感性实验的生物学特性的研究分析程序。本发明利用了艾伯特埃希菌在低温时仍能生长的特性，通过降低一次增菌的温度至20℃，抑制了大肠杆菌的生长，此时艾伯特埃希菌成为该温度下生长的优势菌，进而使得艾伯特埃希菌一次增菌中的菌体浓度提高6个滴度(106)，以大大提高艾伯特埃希氏菌一次增菌的效率以及艾伯特埃希菌的检出率，这为艾伯特埃希菌鉴定程序的建立打下基础。
附图说明
图1显示了不同温度和不同稀释倍数下艾伯特埃希菌PCR(eae基因)检测结果，其中A:菌液生理盐水；B:42℃培养24h；C:37℃培养24h；D:25℃培养24h；E:20℃培养24h；F:18℃培养24h；Line 1：原液；Line 2～Line 11：10-1～10-10稀释浓度；阳性：艾伯特埃希菌阳性对照；阴性：不加DNA模板对照；
图2为艾伯特埃希菌的检测流程图；
图3显示了不同培养温度下艾伯特埃希菌各稀释度生长情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明人在总结归纳国外研究者艾伯特埃希菌的鉴定程序的基础上，经过反
复实验验证，建立了如下的艾伯特埃希菌的鉴定程序。
采集不同种类食品(生牛肉、生猪肉、生羊肉、生鸡肉、生鸭肉、新鲜鸡肠或新鲜鸭肠)25g+225mlEC肉汤增菌液(按照1:10的重量百分比)；腹泻患者、家禽家畜(鸡、鸭、家养鸽子)、野生鸟类(白鹭、麻雀、燕子)粪便标本(3ml脑心-甘油肉汤保存液+2ml稀大便或2g干粪便混合)以上混合液+9mlEC肉汤增菌液，于20℃培养18-26h。
取1ml上述EC肉汤增菌液，8000rpm离心3min集菌，弃上清；用150μl裂解液(100mMNaCl，10mM Tris-HCl[pH8.3]，1mM EDTA[pH9.0]，1％Triton X-100)悬菌，振荡使沉淀充分混匀，水煮10min；12000rpm离心5min，取上清即为PCR反应模板。其中eae基因PCR初筛引物为eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行PCR初筛；PCR反应体系为：在20μl体系中，2×Taq MasterMix 10μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水7μl；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，30次循环，最后延伸72℃5min，每次实验均设有阴、阳性对照。利用PCR技术检测各样品增菌液PCR反应模板中是否具有艾伯特埃希菌已知毒力基因eae(479bp)，PCR产物以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图1所示。从图1中可以看出，42℃，24h培养条件下，PCR检测阳性的最高稀释度是10-3，37℃，24h培养条件下阳性检出的最高稀释度为10-5，25℃，24h培养条件下阳性检出的最高稀释度为10-4，18℃，24h培养条件下阳性检出的最高稀释度为10-5，20℃，24h培养条件下阳性检出的最高稀释度为10-6。这说明20℃培养24h是艾伯特埃希菌的最佳一次增菌培养条件。且eae基因为阳性的样品，表明其样品增菌液中可能含有艾伯特埃希菌，吸取对应的EC肉汤增菌液2ml于2ml脑心-甘油肉汤保存液中，-80℃保存，以备后续进行菌株分离。
用接种环挑取3环上述初筛eae阳性增菌保存液，分离划线于3个麦康凯平板上，36℃，24h；可疑菌落为在平板上呈凸起、边缘整齐、无色(不发酵乳糖)的较大菌落。然后挑出不少于30个的可疑无色菌落，一部分作为PCR反应模板检测eae基因；另一部分用于后续纯培养。
接种eae阳性单菌落于营养琼脂平板36℃纯培养24h，纯培养物分别接种于木糖和乳糖发酵管，并用软琼脂检测动力，36℃培养，24h后观察结果。
上述eae基因阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖、动力阴性的菌落(eae基因阳性，是通过PCR检测的，就是看1.5％琼脂糖凝胶进行电泳有没有479bp那条带，如图1所示。不发酵乳糖、不发酵木糖就是接种了反应管不变色，由深紫色变成黄色。不发酵乳糖、不发酵木糖。动力阴性就是穿刺软琼脂没有往外发散)可作为疑似艾伯特埃希菌。用10μl一次性无菌接种环挑取15mm纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min，取上清液做PCR模板，用于后续分子生物学鉴定(诊断性三重PCR、MLST、16SrDNA)以及毒力基因、PFGE和药物敏感性实验的生物学特性的研究分析程序。如图2所示。
用艾伯特埃希菌标准菌株LMG20976(购自日本)接种脑心浸液琼脂平板(购自青岛海博)37℃培养18h，挑取单个菌落用10ml EC肉汤37℃培养18h作为原液。原液用生理盐水经10倍倍比稀释(10-1-10-10)，原液和每个稀释度菌液7ml+2.5g大便(检测不含艾伯特埃希菌)+63ml EC肉汤增菌液(每1000ml中含：胰蛋白胨20.0g、乳糖5.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾4.0g、磷酸二氢钾1.5g、三号胆盐1.5g、pH值6.9±0.1)，每个稀释度的稀释样品分别取10ml制成5个10-1-10-11的系列，在同等营养条件下分别放置于42℃、37℃、25℃、20℃和18℃中培养24h，模拟培养标本。模拟标本的制备方法如表1所示，培养结果如图3所示。
表1：模拟标本的制备
从图3中可以看出，艾伯特埃希菌在同等营养条件不同温度下培养24h后，42℃、37℃和25℃条件下能长出不发酵乳糖的艾伯特埃希菌(无色菌落)的最高滴度为10-3，在10-4这一滴度就以红色菌落为优势菌。而在稍低温度下，20℃条件下的滴度能达到10-10，18℃的滴度在10-8。挑取无色的菌落做后续的艾伯特埃希菌鉴定，鉴定结果为阳性。说明艾伯特埃希菌一次增菌的最适生长温度为20℃。
以下对后续分子生物学鉴定(诊断性三重PCR、MLST、16SrDNA)进行了详细说明。
诊断性三重PCR鉴定：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysP和mdh建立的三重PCR检测方法，如3个基因均阳性，可初步确认为艾伯特埃希菌。引物见表1。
表1诊断性三重PCR引物
PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水18μl。反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，35次循环，最后72℃延伸5min，每次扩增均设有阴、阳性对照。取上述PCR产物5μl，以1.5％琼脂糖凝胶(含万分之一核酸染料)进行电泳。
16S rDNA序列分析：扩增艾伯特埃希菌16S rDNA的引物为EA16S-F:GGATCCAGACTTTGATYMTGGCTCAG和EA16S-R:CCGTCAATTCCTTTRAGTTT。PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板2μl，纯水19μl。PCR反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，45s，30次循环，最后72℃延伸7min，每次扩增均设有阳性和空白对照。
取PCR产物5μl以1.5％琼脂糖凝胶(含万分之一核酸染料)进行电泳，通过凝胶成像系统观察是否扩增出目的大小片段，PCR产物均纯化后进行测序。利用SeqMan软件对测序结果进行峰图查看，并在NCBI数据库中进行比对检索，初步判断结果。利用MEGA6.0软件，以NCBI上公布的大肠埃希菌、志贺氏菌、费格森埃希菌等的16S rDNA序列为参考，采用Neighbor-joining法构建系统进化树，进行分类位置分析。
多位点序列分型(MLST)分析：参照数据库http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_html提供的大肠埃希菌MLST分型方案，选择7个管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA，PCR引物序列、退火温度及产物大小见表2。
表2 7个管家基因扩增引物序列及产物大小
PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板2μl，纯水19μl。PCR反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，各管家基因退火温度30s，延伸72℃，45s，30次循环，最后延伸7min，每次扩增均设空白和阳性对照。
取PCR产物5μl以1.5wt％琼脂糖凝胶(含万分之一核酸染料)进行电泳，通过凝胶成像系统观察其大小片段，PCR产物均纯化后进行测序。
利用SeqMan软件对PCR产物序列与数据库中的标准序列进行拼接和校正，校正后的序列上传至E.coli MLST数据库中，确定菌株的等位基因型和序列型。利用MEGA6.0软件Neighbor-joining法构建系统进化树，与国际数据库中已收录的大肠埃希菌、志贺菌、艾伯特埃希菌和伤寒沙门菌进行聚类分析，确定艾伯特埃希菌种的鉴定。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种艾伯特埃希菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)按照1:10的重量百分比采集25g食品+225ml EC肉汤增菌液；3ml脑心-甘油肉汤保存液+2ml稀大便或2g干粪便的混合液+9ml EC肉汤增菌液，于20℃培养18-36h；
2)取1ml上述EC肉汤增菌液，8000rpm离心3min集菌，弃上清；用150μl裂解液悬菌，振荡使沉淀充分混匀，水煮10min；12000rpm离心5min，取上清即为PCR反应模板；eae基因PCR初筛引物为eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行PCR初筛；PCR反应体系为：在20μl体系中，2×Taq MasterMix 10μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水7μl；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，30次循环，最后延伸72℃5min，每次实验均设有阴、阳性对照；PCR产物以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳检测；
3)用接种环挑取3环上述初筛eae阳性增菌保存液，分离划线于3个麦康凯平板上，36℃，24h；可疑菌落为在平板上呈凸起、边缘整齐、无色的较大菌落；然后挑出不少于30个的可疑无色菌落，每一个单个可疑无色菌落的二分之一作为PCR反应模板检测eae基因；且每一个单个可疑无色菌落的另二分之一用于后续纯培养；
4)接种eae阳性单菌落于营养琼脂平板36℃纯培养24h，纯培养物分别接种于木糖和乳糖发酵管，并用软琼脂检测动力，36℃培养，24h后观察结果；
5)将上述eae基因阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖、动力阴性的菌落作为疑似艾伯特埃希菌；无菌接种环挑取少量纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min，取上清液做PCR模板，用于后续的诊断性三重PCR鉴定、16SrDNA序列分析及MLST分析。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤1)中，所述食品选自生牛肉、生猪肉、生羊肉、生鸡肉、生鸭肉、新鲜鸡肠或新鲜鸭肠；所述家禽家畜选自鸡、鸭或家养鸽子；所述野生鸟类选自白鹭、麻雀或燕子；所述2ml稀大便或2g干粪便来自腹泻患者、家禽家畜、野生鸟类粪便标本。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述裂解液的配方为：100mM NaCl，10mM Tris-HCl[pH8.3]，1mM EDTA[pH9.0]，1wt％Triton X-100。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，用10μl一次性无菌接种环挑取15mm纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，所述诊断性三重PCR鉴定具体为：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysP和mdh建立的三重PCR检测方法，如3个基因均阳性，可初步确认为艾伯特埃希菌；其中诊断性三重PCR所用的引物见下表1：
表1诊断性三重PCR所用的引物
PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水18μl；反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，35次循环，最后72℃延伸5min，每次扩增均设有阴、阳性对照；取上述PCR产物5μl，以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，所述16S rDNA序列分析具体为：
扩增艾伯特埃希菌16S rDNA的引物为EA16S-F:GGATCCAGACTTTGATYMTGGCTCAG和EA16S-R:CCGTCAATTCCTTTRAGTTT；其中PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix25μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板2μl，纯水19μl；PCR反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，45s，30次循环，最后72℃延伸7min，每次扩增均设有阳性和空白对照；
取PCR产物5μl以1.5wt％琼脂糖凝进行电泳，通过凝胶成像系统观察是否扩增出目的大小片段，PCR产物均纯化后进行测序；利用SeqMan软件对测序结果进行峰图查看，并在NCBI数据库中进行比对检索，初步判断结果；利用MEGA6.0软件，以NCBI上公布的大肠埃希菌、志贺氏菌、费格森埃希菌的16SrDNA序列为参考，采用Neighbor-joining法构建系统进化树，进行分类位置分析。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，所述MLST分析具体为：参照数据库http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_html提供的大肠埃希菌MLST分型方案，选择7个管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA，PCR引物序列、退火温度及产物大小见表2：
表2 7个管家基因的扩增引物序列及产物大小
PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板2μl，纯水19μl；PCR反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，各管家基因退火温度30s，延伸72℃，45s，30次循环，最后延伸7min，每次扩增均设空白和阳性对照；
取PCR产物5μl以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统观察其大小片段，PCR产物均纯化后进行测序；
利用SeqMan软件对PCR产物序列与数据库中的标准序列进行拼接和校正，校正后的序列上传至E.coli MLST数据库中，确定菌株的等位基因型和序列型；利用MEGA6.0软件Neighbor-joining法构建系统进化树，与国际数据库中已收录的大肠埃希菌、志贺菌、艾伯特埃希菌和伤寒沙门菌进行聚类分析，确定艾伯特埃希菌种的鉴定。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609398A (zh) * 2018-11-14 2019-04-12 自贡市疾病预防控制中心 艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法
CN112458192A (zh) * 2020-11-20 2021-03-09 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种同时检测艾伯特埃希氏菌o8和o9血清型的试剂盒
CN112695111A (zh) * 2020-12-30 2021-04-23 徐州医科大学 一种同时检测多种食源性病原菌的pcr检测体系及构建方法
CN115976242A (zh) * 2023-01-05 2023-04-18 华道(上海)生物医药有限公司 一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544436A (zh) * 2016-11-24 2017-03-29 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种快速检测纺织品中沙门氏菌的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544436A (zh) * 2016-11-24 2017-03-29 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种快速检测纺织品中沙门氏菌的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘祥 等: "多位点序刘列分（MLST）在艾伯特埃希菌鉴定中的应用", 《中国人兽共患病学报》 *
王斌 等: "16S rDNA 序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用", 《疾病监测》 *
王红 等: "自贡地区艾伯特埃希菌的筛查及菌株特征分析", 《中华微生物学和免疫学杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609398A (zh) * 2018-11-14 2019-04-12 自贡市疾病预防控制中心 艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法
CN112458192A (zh) * 2020-11-20 2021-03-09 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种同时检测艾伯特埃希氏菌o8和o9血清型的试剂盒
CN112695111A (zh) * 2020-12-30 2021-04-23 徐州医科大学 一种同时检测多种食源性病原菌的pcr检测体系及构建方法
CN112695111B (zh) * 2020-12-30 2023-10-03 徐州医科大学 一种同时检测多种食源性病原菌的pcr检测体系及构建方法
CN115976242A (zh) * 2023-01-05 2023-04-18 华道(上海)生物医药有限公司 一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒

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