CN109609398A - 艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法。通过分别制备特异性结合艾伯特埃希氏菌的O1～O7血清型的多克隆抗体并将多克隆抗体与磁珠偶联，制备了能够特异性吸附艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的免疫磁珠。艾伯特埃希氏菌免疫磁珠能够从肠道菌群中特异灵敏地吸附并分离艾伯特埃希氏菌。本发明还提供了基于免疫磁珠分离的艾伯特埃希氏菌的检测方法，利用免疫磁珠特异灵敏地分离和富集样品中的艾伯特埃希氏菌，再结合eae基因的PCR检测，与传统的分离检测方法相比，该方法能够显著提高艾伯特埃希氏菌的阳性检出率，且大大节省了物料、时间和人力成本，实现艾伯特埃希氏菌的快速准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法。
背景技术
艾伯特埃希氏菌(Escherichia albertii)是近年发现和命名的一个新的与人散发肠道感染及突发食源性腹泻有关的肠道致病菌。1991年，Albert等首次分离到艾伯特埃希氏菌。2003年，Huys等通过表型及基因型分析将其确定为埃希氏菌属中的一个新种，并命名为E.albertii(艾伯特埃希氏菌)。此外，国外学者也陆续从家禽家畜，野生动物，鸟类等动物宿主分离出艾伯特埃希氏菌。经多年研究，本申请发明人首次在中国的腹泻患者、健康人群、野生白鹭、家禽和动物源性食品中分别证实了艾伯特埃希氏菌的存在，并获得我国不同来源的艾伯特埃希氏菌分离株62株，这些菌株的多位点序列分析(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)型别具有明显的多样性。本申请发明人的监测研究结果提示艾伯特埃希氏菌在我国存在着较大的人间感染的风险。
在前期研究工作中，本申请发明人在62株国内艾伯特埃希氏菌分离株中首次发现了艾伯特埃希氏菌的7个血清型，命名为O1～O7血清型。由于艾伯特埃希氏菌与大肠杆菌同属于埃希氏菌属细菌，两者在生化和菌株培养特性上有很多相似性，传统的平板培养分离方法中，大肠杆菌的干扰和抑制使得艾伯特埃希氏菌的检出率大大降低。因此，开发艾伯特埃希氏菌的高效分离和检测方法具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法。
艾伯特埃希氏菌与大肠杆菌同属于埃希氏菌属细菌，两者在生化和菌株培养特性上有很多相似性，但大肠杆菌会明显抑制艾伯特埃希氏菌的生长，导致艾伯特埃希氏菌在微生物群落中成为弱势菌群，分离培养较为困难。发明人在对艾伯特埃希氏菌检测方法的研究过程中发现，在平板培养前，先利用免疫磁珠特异性地吸附艾伯特埃希氏菌，艾伯特埃希氏菌的分离和检测的效率大大提高。目前现有技术中没有关于艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠的研究，发明人发现利用发明人前期分离得到的7种血清型的艾伯特埃希氏菌的多克隆抗体，制备特异性结合艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠，能够实现不同血清型艾伯特埃希氏菌的有效分离。但是在保证抗艾伯特埃希氏菌的抗体效价的基础上，采用常用的其它细菌的免疫磁珠的制备方法并不能得到活性较好的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。在制备偶联抗艾伯特埃希氏菌抗体的免疫磁珠的过程中，抗艾伯特埃希氏菌的抗体与磁珠的质量比对于艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的吸附活性影响十分显著。
一方面，本发明提供一种艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的制备方法，为将抗艾伯特埃希氏菌的抗体与磁珠偶联，所述偶联为将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合。
具体地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备抗艾伯特埃希氏菌的抗体，所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体为抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型多克隆抗体中的一种或多种；
(2)将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合并进行偶联反应，优选地，所述质量比为每毫克磁珠加入25～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体；
(3)将步骤(2)得到的抗体偶联磁珠进行封闭与分离，即得艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。
优选地，所述偶联反应为在28～37℃条件下，反应12～20h。
优选地，所述艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的代表菌株为SP140089、SP150020、SP140724、D140513、T150248、T150072和ZG141049。
进一步地，本发明提供由所述制备方法制备得到的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠，以及包括所述艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的免疫磁珠检测试剂盒。
优选地，免疫磁珠检测试剂盒所述还包括用于PCR扩增艾伯特埃希氏菌eae基因的引物；更优选地，所述引物序列如下：
SEQ ID NO.1:eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG；
SEQ ID NO.2:eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC。
本申请提供的偶联抗艾伯特埃希氏菌抗体的免疫磁珠能够特异性地吸附艾伯特埃希氏菌，从而实现样品中艾伯特埃希氏菌的分离和富集，提高艾伯特埃希氏菌的检测的灵敏度和检出率。
因此，本发明提供所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒在分离和/或检测艾伯特埃希氏菌中的应用。
另一方面，本发明提供一种艾伯特埃希氏菌的分离或富集的方法，为利用本发明所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒进行艾伯特埃希氏菌的分离或富集。
优选地，所述艾伯特埃希氏菌的分离，为在每毫升菌液样品中等量加入100～1000μg的偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL；所述分离或富集为在室温条件下进行。
更优选地，所述艾伯特埃希氏菌的分离，为在每毫升菌液样品中等量加入250～600μg的偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL；所述分离或富集为在室温条件下进行。
本发明还提供一种艾伯特埃希氏菌的检测方法，其为利用本发明所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒，先进行艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离，再进行艾伯特埃希氏菌的检测。
具体地，所述艾伯特埃希氏菌的检测方法包括如下步骤：
(1)将样品进行增菌培养；
(2)对步骤(1)获得的菌液进行eae基因的PCR检测筛选；
(3)对于eae基因PCR检测为阳性的菌液样品，利用本发明所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒进行艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离；
(4)将免疫磁珠与菌液样品分离，将分离的磁珠重悬后，接种至麦康凯固体培养基进行培养；
(5)对培养获得的单菌落进行eae基因的PCR检测，和/或，clpX基因、lysP基因以及mdh基因的三重PCR检测。
优选地，在进行所述艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离时，每毫升菌液样品等量加入100～1000μg的偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL。
所述clpX基因、lysP基因以及mdh基因的三重PCR检测使用的引物序列如下：
clpX基因：
F:TGGCGTCGAGTTGGGCA(SEQ ID NO.3)
R:TCCTGCTGCGGATGTTTACG(SEQ ID NO.4)
lysP基因：
F:GGGCGCTGCTTTCATATATTCTT(SEQ ID NO.5)
R:TCCAGATCCAACCGGGAGTATCAGGA(SEQ ID NO.6)
mdh基因：
F:CTGGAAGGCGCAGATGTGGTACTGATT(SEQ ID NO.7)
R:CTTGCTGAACCAGATTCTTCACAATACCG(SEQ ID NO.8)
本领域技术人员应该理解，本发明提供的检测方法为艾伯特埃希氏菌的检测方法，本发明的目的在于利用免疫磁珠吸附分离来提高艾伯特埃希氏菌的检出率，在免疫磁珠吸附分离后，本发明提供的检测方法仅涉及eae基因的PCR检测以及clpX基因、lysP基因以及mdh基因三重PCR检测，本领域技术人员可以根据实际需要和不同的目的，在免疫磁珠特异地分离艾伯特埃希氏菌后，设计不同的辅助检测方法，如生化特性分析、MLST分型或16S rDNA序列分析等，这些基于艾伯特埃希氏菌免疫磁珠分离的检测方法均在本发明的保护范围内。
作为本申请的优选实施方式，所述检测方法包括如下步骤：
(1)如检测样品中加入EC增菌液，将上述样品增菌液在20℃培养16～20h，至菌液浓度为101～109cfu/mL；
(2)对步骤(1)培养得到的菌液进行eae基因PCR检测初筛阳性菌液；
(3)分别取1ml上述eae基因PCR检测为的阳性的菌液，加入7种分别偶联O1-O7血清型抗体的免疫磁珠各200～300μg，免疫磁珠吸附，最终将磁珠溶于PBS缓冲液中，接入MAC平板，37℃培养24h；(4)选择疑似艾伯特埃希氏菌的菌落，进行eae基因PCR检测；
(5)挑取eae基因PCR检测为阳性的单菌落于营养琼脂平板上进行纯培养后，进行阳性菌落的clpX基因、lysP基因以及mdh基因的三重PCR检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本申请提供的偶联艾伯特埃希氏菌抗体的免疫磁珠能够特异灵敏地吸附艾伯特埃希氏菌，实现在菌群成分复杂的菌液中，尤其是含有亲缘关系相近的埃希氏菌属肠道细菌干扰的环境中，特异地分离和富集艾伯特埃希氏菌，从而减少后续分离过程中的杂菌干扰，显著提高了艾伯特埃希氏菌的分离效率。
(2)免疫磁珠富集方法操作简单、快捷，无需昂贵的仪器设备，且免疫磁珠与细菌结合是通过非共价键结合，不会影响艾伯特埃希氏菌的生理和生化特性。
(3)艾伯特埃希氏菌在食品、动物内容物及粪便的菌群中不是优势菌群，而且与优势菌群大肠杆菌的培养特性十分相似，传统的PCR检测和生化特性分析鉴定艾伯特埃希氏菌极易发生漏检，检出率很低。利用本申请提供的基于免疫磁珠分离的艾伯特埃希氏菌的检测方法，能够在食品、动物内容物、粪便等多种样品中特异、灵敏地检测出艾伯特埃希氏菌，其检出率较传统方法提高了82.8％，表明艾伯特埃希氏菌免疫磁珠检测方法具有良好的应用前景。
(4)与传统分离方法相比较，免疫磁珠分离有效排除了杂菌的干扰，减少了一半需检测的可疑菌落，大大减少了工作量，降低了物料、时间和人力成本。
附图说明
图1为实施例4中艾伯特埃希氏菌免疫磁珠检测方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型特异免疫血清的制备
根据血清型分型、MLST分型、PFGE分型和菌株来源的不同，在四川省自贡市2014～2015年从多个来源分离的菌株中选取SP140089、SP150020、SP140724、D140513、T150248、T150072和ZG141049七个菌株分别作为O1～O7血清型的代表菌株(Hong Wang,Han Zheng,Qun Li，et al.Defining the Genetic Features of O-Antigen Biosynthesis GeneCluster and Performance of an O-Antigen Serotyping Scheme for Escherichiaalbertii.Frontiers in Microbiology,26 September 2017，https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01857)。
SP140089、SP150020、SP140724、D140513、T150248、T150072和ZG141049每个菌株均分别免疫三只新西兰白兔(雌性，体重1.5kg～2kg)，每只兔子免疫注射经100℃灭活2h的2.5×1010CFU/ml细菌，以同等剂量免疫四次。二次加强免疫在首次免疫后2周，第三次、第四次加强免疫时间分别为二次免疫后的第5天和第10天。末次免疫后的第5天采集兔血清，玻片凝集法检测血清效价。选择51株艾伯特埃希氏菌分离株和12株泸县艾伯特埃希氏菌分离株、艾伯特埃希氏菌日本分离株LMG20976、沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌100℃金属浴1h后分别与采集的O1～O7血清型免疫的7组血清进行玻片凝集试验，检测免疫血清的特异性和敏感性。
结果显示，O1～O7血清型的纯化抗体的免疫血清效价在640～1280之间，与不同血清型免疫菌株的交叉反应低(如表1所示)。64株艾伯特埃希氏菌分别与7组免疫血清进行凝集实验，其分型的结果与血清型多重PCR检测的分类结果完全吻合(如表2所示)。结果表明，所制备的艾伯特埃希氏菌的免疫血清具有较高的效价及特异性。
表1免疫血清的凝集效价及不同血清型之间的交叉反应
表2 64株伯特埃希氏菌的血清凝集结果与8重PCR检测结果比较
实施例2艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的制备
采用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化艾伯特埃希氏菌O1-O7血清型免疫血清，纯化获得的抗体用蛋白质测定仪测定其抗体浓度和纯度。最终测定O1-O7血清型纯化抗体的浓度范围为：5.19～13.76mg/ml，纯度>95％。
选择Invitrogen公司的M-280 Tosylactivated磁珠，采用纯化的O1-O7血清型的多克隆抗体标记免疫磁珠，具体步骤如下：
1、洗磁珠：
(1)混匀磁珠；
(2)5ml磁珠置于50ml离心管中放到磁架上，静置1min，吸出上清；
(3)加入5ml Buffer B(H3BO3 3.09g，加水至400ml，加2.2ml 10M NaOH至pH 9.5，定容至500ml，121℃15min高压灭菌)，混匀，磁架上静置1min，吸出上清；
(4)加入5ml Buffer A(0.1M Na-PB,Na2HPO4·12H2O 29g，NaH2PO4·2H2O 2.94g，加水至1000ml，pH 7.4，121℃15min高压灭菌)，混匀，磁架上静置1min，吸出上清。
2、抗体标记磁珠：
(1)在步骤1获得的磁珠中加入3ml Buffer A，混匀，移至无菌小三角烧瓶中，分别按每毫克磁珠加入15μg、20μg、25μg、30μg、35μg的O1-O7纯化抗体，混匀；
(2)37℃130rpm摇16h。
3、抗体标记磁珠的清洗和封闭：
(1)将步骤2获得的抗体标记磁珠移至50ml管，磁架上静置2min，吸出上清；
(2)加入5ml Buffer C(NaCl 0.88g加入0.01M Na-PB 95ml，pH调至7.4，定容至99ml，121℃15min高压灭菌，0.1g BSA溶于1ml 0.01M Na-PB，过滤器后加入到上述溶液中，使得BSA终浓度为0.1％)，混匀，冰浴5min，磁架上静置2min，吸出上清；
(3)重复步骤(2)一次；
(4)加入5ml Buffer D(2.42g Tris加入80ml H2O，pH调至8.5，定容至99ml，121℃15min高压灭菌，0.1g BSA溶于1ml H2O中，过滤器后加入到上述溶液中，使得BSA终浓度0.1％)，37℃作用4h(60rpm，37℃作用1h；80rpm，37℃作用1h；100rpm，37℃作用2h)封闭免疫磁珠；
(5)再用Buffer C洗一次；
(6)加入6ml Buffer C(含0.5％NaN3)，即1ml磁珠加入5μl 10％NaN3，摇匀后4℃保存，获得的免疫磁珠的终浓度为25mg/ml。
实施例3免疫磁珠的灵敏度、特异性和富集效果的验证
1、免疫磁珠的活性验证
取1ml O1～O7血清型菌株的菌液1×101cfu/ml与实施例2制备得到的免疫磁珠进行吸附反应，以验证磁珠是否与抗体成功偶联，具体步骤如下：
(1)1ml菌液中加入20μl免疫磁珠，室温下混匀10min；
(2)放置磁力架上，上下颠倒几次，静止3min，弃上清；
(3)加入1ml PBST(含0.05％(V/V)吐温-20的磷酸盐缓冲液)，混匀，放置磁力架上，上下颠倒几次，静止3min，弃上清；
(4)重复步骤(3)；
(5)加入100μl PBST，混匀，涂布于BHI平板上，37℃培养18-24h，观察结果。同时在BHI平板上做101CFU/ml平板涂布计数。结果显示在BHI平板上，目标菌落呈白色、突起、湿润，O1-O7血清型菌液吸附后菌落计数结果如表3所示。
表3使用不同艾伯特埃希菌抗体包被浓度制备的免疫磁珠对应的吸附菌落的生长情况
| O1 | O2 | O3 | O4 | O5 | O6 | O7 | |
| 原始计数 | 30 | 41 | 57 | 36 | 63 | 42 | 63 |
| 15μg/mg | 18 | 26 | 43 | 24 | 49 | 31 | 48 |
| 20μg/mg | 24 | 32 | 41 | 29 | 53 | 37 | 52 |
| 25μg/mg | 33 | 39 | 54 | 35 | 64 | 45 | 67 |
| 30μg/mg | 31 | 37 | 53 | 32 | 61 | 36 | 63 |
| 35μg/mg | 28 | 38 | 50 | 33 | 59 | 42 | 61 |
从表3中可看出，抗体包被量在25μg/mg时，O1-O7血清型菌液在进行免疫磁珠吸附后，其得到的菌落最多、最接近各血清型的实际计数，故在进行艾伯特埃希菌的免疫磁珠制备时，抗体的最佳包被量为25μg/mg。
2、免疫磁珠的灵敏度检测
将艾伯特埃希氏菌O1-O7血清型于37℃振荡培养至OD600＝0.6时(菌量约为1×108CFU/ml)，用0.85％NaCl生理盐水将菌液分别稀释至1×103cfu/ml、1×102cfu/ml、10cfu/ml，每个稀释度取1ml菌液分别加入20μl包被好的免疫磁珠，按照上述1中所述的方法进行免疫磁珠的富集。将富集的菌体涂布于麦康凯(MAC)平板上，37℃培养18～24h，观察结果。随机挑选白色菌落，使用引物eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行eae基因的PCR检测，验证是否为艾伯特埃希菌。在对照组菌液中同时加入大肠杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌等其他肠道杆菌作为对照。
结果显示，梯度稀释的菌液分别用免疫磁珠富集，在MAC平板培养，目标菌落呈白色、突起、湿润。加入20μl免疫磁珠可以在1×103cfu/ml、1×102cfu/ml、10cfu/ml的艾伯特埃希氏菌菌液中稳定地富集到目标菌，经PCR检测后为艾伯特埃希氏菌。而在对照组中，制备的免疫磁珠不能富集大肠杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌等其他肠道杆菌。结果表明制备艾伯特埃希氏菌免疫磁珠能够特异灵敏地富集艾伯特埃希氏菌，灵敏度为10cfu/ml。
3、免疫磁珠的富集效果检测
将艾伯特埃希氏菌O1-O7血清型于37℃振荡培养至OD600＝0.6，用0.85％NaCl生理盐水将菌液分别稀释至1×104cfu/ml、1×103cfu/ml、1×102cfu/ml，每个稀释度取100μl菌液分别加入1ml健康人的新鲜粪便(eae基因PCR检测为阴性)增菌液中，制备模拟粪便标本。按照上述1中所述的方法进行免疫磁珠的富集。将富集的菌液涂布于MAC平板上，37℃培养18～24h，观察结果。并随机挑选白色菌落进行PCR检测是否为艾伯特埃希菌。
在模拟粪便标本与免疫磁珠吸附后涂布MAC平板，当艾伯特埃希氏菌O1-O7血清型的菌液在10cfu、1×102cfu、1×103cfu含量时，在MAC上均能长出白色菌落，经PCR检测后为艾伯特埃希菌。结果表明，所制备的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠能够在包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺杆菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等众多的肠道细菌中特异性地富集艾伯特埃希菌，并且具有较好的富集效果。
实施例4艾伯特埃希氏菌免疫磁珠检测方法的建立
在建立的免疫磁珠富集艾伯特埃希氏菌的方法的基础上，联合艾伯特埃希氏菌的检测，建立艾伯特埃希氏菌免疫磁珠检测方法，检测程序如图1所示，检测方法的具体步骤如下：
(1)如样品为不同种类的食品，25g食品样品中加入225ml EC增菌液(按照1:10的比例)；如样品为腹泻患者、家禽家畜、野生鸟类粪便标本，则在2ml稀大便或2g干粪便中加入3ml脑心-甘油肉汤保存液(含30％甘油的脑心肉汤)，再在得到的混合液中加入9ml EC增菌液。将上述样品增菌液在20℃培养16～20h，菌体浓度为109cfu/mL；
(2)对上述EC增菌液进行eae基因PCR检测初筛阳性菌液；
(3)分别取1ml上述eae基因PCR检测为的阳性的菌液，加入O1-O7血清型免疫磁珠各10μl，免疫磁珠吸附，洗涤后，最终将磁珠溶于20μl PBS缓冲液中，将上述菌液全部接入MAC平板，37℃培养24h；
(4)选择10～20个疑似艾伯特埃希氏菌的白色菌落，进行eae基因PCR检测；
(5)挑取eae基因PCR检测为阳性的单菌落于营养琼脂平板上进行纯培养后，进一步进行初步生化反应和后续的诊断性三重PCR鉴定。初步生化反应和后续的诊断性三重PCR的具体方法如CN201710513733.9所述。
初步生化反应为：接种eae阳性单菌落于营养琼脂平板36℃纯培养24h，纯培养物分别接种于木糖和乳糖发酵管，并用软琼脂检测动力，36℃培养，24h后观察结果。
诊断性三重PCR鉴定具体为：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysP和mdh建立的三重PCR检测方法，如3个基因均阳性，可确认为艾伯特埃希菌；诊断性三重PCR所用的引物见表4所示。
表4诊断性三重PCR所用的引物
诊断性三重PCR的反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水18μl；
反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，35次循环，最后72℃延伸5min，每次扩增均设有阴、阳性对照；取上述PCR产物5μl，以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳。
按照上述程序，验证艾伯特埃希氏菌免疫磁珠检测方法的应用效果。
在山东省聊城市的推广应用中，共采集鸡鸭肠内容物243份，剪碎后按1:10的比例加入EC肉汤，20℃培养18h后，PCR扩增eae基因，初筛出阳性样品后，分别采用实施例4建立的免疫磁珠分离方法和传统方法进行艾伯特埃希氏菌的分离，比较两种方法的分离率。结果显示，243份鸡鸭肠内容物样品用EC肉汤20℃培养18h一次增菌后，其中eae基因PCR检测阳性的样品114份。采用传统方法分离艾伯特埃希菌(结合基于eae基因PCR初筛、乳糖不发酵等生化特点分析以及诊断性三重PCR的艾伯特埃希菌的鉴定程序)，每个样品需要划线培养3个MAC平板，才能通过培养获得足够数量的用于后续检测的疑似艾伯特埃希氏菌菌落(约1～4个)，平均每个样品一般需要至少挑取30个白色菌落进行后续的PCR检测(eae基因检测及后续的三重PCR检测)。而使用免疫磁珠分离法，每个样品仅需划线培养1个MAC平板，就能培养获得约5-10个疑似艾伯特埃希氏菌的菌落，用于后续PCR检测，平均每个样品挑取10～20个白色菌落进行后续的PCR检测，从而大大降低了实验成本，检测时间缩短了2/3。O1-O7血清型免疫磁珠分离方法和传统方法的分离率的比较结果如表5所示。结果表明，使用免疫磁珠分离方法额外分离到了20株用传统方法未能分离的艾伯特埃希氏菌，免疫磁珠分离方法的阳性样品检出率(18.1％)比传统方法(9.9％)提高82.8％。
表5传统方法与免疫磁珠富集法分离率对比结果
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 自贡市疾病预防控制中心
<120> 艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法
<130> KHP181113268.1
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggatcgcc ttttttatac g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctgcagat taacctctgc 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcgtcgag ttgggca 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcctgctgcg gatgtttacg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcgctgct ttcatatatt ctt 23
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccagatcca accgggagta tcagga 26
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctggaaggcg cagatgtggt actgatt 27
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttgctgaac cagattcttc acaataccg 29
Claims (10)
1.一种艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的制备方法，其特征在于，为将抗艾伯特埃希氏菌的抗体与磁珠偶联，所述偶联为将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备抗艾伯特埃希氏菌的抗体，所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体为抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型多克隆抗体中的一种或多种；
(2)将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合并进行偶联反应，优选地，所述质量比为每毫克磁珠加入25～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体；
(3)将步骤(2)得到的抗体偶联磁珠进行封闭与分离，即得艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。
3.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。
4.一种艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR扩增艾伯特埃希氏菌eae基因的引物；
优选地，所述引物序列如下：
SEQ ID NO.1:eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG；
SEQ ID NO.2:eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC。
6.权利要求3所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或权利要求4或5所述的检测试剂盒在分离和/或检测艾伯特埃希氏菌中的应用。
7.一种艾伯特埃希氏菌的分离或富集的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或权利要求4或5所述的检测试剂盒进行艾伯特埃希氏菌的分离或富集；
优选地，所述分离或富集为在每毫升菌液样品中等量加入100～1000μg偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL。
8.一种艾伯特埃希氏菌的检测方法，其特征在于，其为利用权利要求3所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或权利要求4或5所述的检测试剂盒，先进行艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离，再进行艾伯特埃希氏菌的检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将样品进行增菌培养；
(2)对步骤(1)获得的菌液进行eae基因的PCR检测筛选；
(3)对于eae基因PCR检测为阳性的菌液样品，利用权利要求3所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或权利要求4或5所述的检测试剂盒进行艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离；
(4)将免疫磁珠与菌液样品分离，将分离的免疫磁珠重悬后，接种至麦康凯固体培养基进行培养；
(5)对培养获得的单菌落进行eae基因的PCR检测，和/或，clpX基因、lysP基因以及mdh基因的三重PCR检测。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，在进行所述艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离时，每毫升菌液样品等量加入100～1000μg偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811352774.5A CN109609398A (zh) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | 艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法 |
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2018
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