CN104726534B

CN104726534B - 一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法

Info

Publication number: CN104726534B
Application number: CN201510195909.1A
Authority: CN
Inventors: 王法云; 朱海华; 王雪竹; 尹红娜; 周莉; 章建军; 谭静; 平洋; 王永; 王慧
Original assignee: HENAN INSTITUTE OF BUSINESS SCIENCE
Current assignee: HENAN INSTITUTE OF BUSINESS SCIENCE
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2035-04-23
Also published as: CN104726534A

Abstract

一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，属于微生物检测技术领域，包括以下步骤：将鲜乳样品加入到缓冲液中得到鲜乳混合液，所述缓冲液中含有去除蛋白质和脂肪的试剂；对鲜乳混合液进行滤纸过滤，取滤液进行微孔滤膜抽滤；将过滤后的微孔滤膜剪碎，添加四硫磺酸钠煌绿增菌液和磷酸盐缓冲液进行冲洗浸泡，得到菌悬液；向菌悬液中添加沙门氏菌免疫磁珠进行混合，振荡、静置磁力架上分层，弃上清；取下层溶液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，静置磁力架上分层，弃上清，得到浓缩待测液；采用Elisa检测法进行检测即可。本发明方法检测鲜乳中沙门氏菌的时间总共约为50min，与国标方法相比，检测时间大大缩短。

Description

一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法。

背景技术

食品安全关系国计民生，食源性疾病和食品污染仍然是危害公众健康的重要因素，是当今世界最为关注的公共安全问题，据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。对2001-2010年中国食源性疾病暴发情况进行统计分析表明，微生物污染引发的食源性疾病占总体的56.39%，沙门氏菌引发的食源性疾病占总体的10%。沙门氏菌属(Salmonella）是一群抗原构造、生化性状相似的革兰氏阴性杆菌，由沙门氏菌引起的中毒主要以急性肠胃炎为主，潜伏期一般为4～48小时，主要症状有呕吐、腹泻、腹疼、惊厥、抽搐和昏迷。

鲜乳是人们喜欢的食用营养品，营养丰富，是人体钙的最佳来源，但鲜乳极容易受沙门氏菌污染而变质，污染来源于乳畜本身及生产加工的各个环节，从而影响消费者饮食安全和健康。

目前鲜乳中沙门氏菌的检测方法，还主要依赖于传统的微生物学检测方法。传统的沙门氏菌检测法需要经过前增菌、增菌、分离培养、生化试验确认等试验步骤，至少4-7天才能得出明确的诊断结果，操作步骤繁琐、费时，而且只能检测25g/ml样品中存活的沙门氏菌，检出率较实际样品中的沙门氏菌低，极易出现假阴性结果，危害广大消费者安全。

发明内容

本发明的目的在于针对鲜乳中的沙门氏菌提供了一种快速检测方法。

基于以上目的，本发明采取了以下技术方案：

一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

1）将鲜乳样品加入到缓冲液中得到鲜乳混合液，所述缓冲液中含有去除蛋白质和脂肪的试剂，初步去除鲜乳样品中的蛋白质和脂肪；

2）对鲜乳混合液进行滤纸过滤，再次去除鲜乳混合液中的蛋白质和脂肪，增加流动性，均匀分散滤液，取滤液进行微孔滤膜抽滤，分离微生物；

3）将步骤2）中过滤后的微孔滤膜剪碎，添加四硫磺酸钠煌绿增菌液和磷酸盐缓冲液进行冲洗浸泡，得到菌悬液；

4）向菌悬液中添加沙门氏菌免疫磁珠进行混合，振荡、静置磁力架上分层，弃上清；

5）取下层溶液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，静置磁力架上分层，弃上清，得到浓缩待测液；

6）采用Elisa检测法进行检测即可。

步骤2）中对鲜乳混合液进行滤纸过滤后，取滤液进行离心，收集下清液，微孔滤膜抽滤。

步骤1）中所述试剂为纤维素树脂。

步骤1）中所述缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）。

所述微孔滤膜孔径为0.22μm。

步骤3）中所述冲洗浸泡时间≤2min，所述四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB增菌液）和磷酸盐缓冲液体积比为1：1。

步骤4）中振荡温度为37℃，振速为40rpm，振荡时间为30min，使菌悬液中的沙门氏菌与沙门氏菌免疫磁珠结合。

步骤4）中所述静置时间为3min。

步骤5）中加入的磷酸盐缓冲液与菌悬液体积比为1：1。

本发明有益效果：

1、本发明采用含有纤维素树脂的PBS缓冲液处理鲜乳样品，能够温和去除鲜乳中的蛋白质和脂肪同时，有效保护沙门氏菌；

2、采用滤纸初过滤和微孔滤膜抽滤相结合，去除鲜乳样品中的脂肪和蛋白质后，将鲜乳样品中的沙门氏菌等细菌富集到微孔滤膜上，增大了沙门氏菌的检出率，解决了低水平的病原微生物的检测问题；

3、采用TTB增菌液和PBS缓冲液作为洗脱缓冲液，TTB增菌液可有效的选择性保护沙门氏菌，有利于沙门氏菌被洗脱后在少量溶液的环境中保存和生长；

4、鲜乳样品前处理后，采用免疫磁珠富集分离方法和Elisa检测法相结合，检测鲜乳中沙门氏菌的时间总共约为50min，而国标方法所需检测时间4-7，与国标方法相比，本发明检测时间大大缩短。

具体实施方式

实施例1 筛选试验

1.1鲜乳样品缓冲液的选择

取25mL鲜乳沙门氏菌阳性样品4份，分别加入装有225mL缓冲液的均质袋中，均质袋中缓冲液分别为：ddH₂O、0.01mol/L PBS缓冲液（pH7.4，下同）、碳酸盐缓冲液、缓冲蛋白胨水（BPW）。然后按照传统的沙门氏菌检测方法，对上述鲜乳混合液进行增菌、划线分离、生化试验等，试验结果如表1所示。

由表1可知，BPW和0.01mol/L PBS均能有效地保护样品中的沙门氏菌，但BPW成本较高，因此选择0.01mol/L PBS作为前处理缓冲液。

1.2双过滤法与国标法检出率的对比

取鲜乳阳性样品25mL，加入装有225mL0.01mol/L PBS缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min后，用200mL PBS缓冲液边冲洗边用滤纸快速过滤，取滤液在离心温度４℃、离心转速6000r/min下离心10min，收集下清液， 0.22μm微孔滤膜抽滤，将微生物富集于微孔滤膜上，将微孔滤膜用无菌剪刀剪碎，用10ml PBS缓冲液冲洗浸泡2min，即得浓缩菌悬液，在XLD和BS平皿上划线分离沙门氏菌。同时，用25mL鲜乳阳性样品采用国标方法检测沙门氏菌，试验结果如表2所示。

由表2可知，双过滤法增大了沙门氏菌的检出率。

1.3滤膜洗脱液的选择

考虑富集在微孔滤膜上的沙门氏菌，暴露在空气中时间越长越容易失活，且不容易洗脱下拉，因此选择不同的洗脱液对比洗脱效果，试验结果如表3所示。

由表3可知，仅使用TTB增菌液虽然有利于沙门氏菌的保护和培养，但对于滤膜中的沙门氏菌洗脱效果并不佳，而选用5 mL PBS缓冲液和5 mL TTB增菌液的混合溶液，洗脱效果好，又可以保护沙门氏菌。

1.4沙门氏菌免疫磁珠分离沙门氏菌敏感性试验

将浓度为1×10⁹CFU/mL的沙门氏菌菌液，按一定梯度进行倍比稀释，每一梯度均进行传统平板培养计数，另取100μL 5mg/mL沙门氏菌免疫磁珠（购自北京市理化分析测试中心），分别加入到1mL的沙门氏菌稀释液中，充分混匀后，振荡温度37 ℃、振速 40 rpm下，振荡吸附30min，静置磁力架上3min，弃上清，取下层溶液加入1mL 0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，充分混匀，静置磁力架上3min，弃上清，取下层溶液重复洗涤2次，加入100μL 0.01mol/LPBS缓冲液振荡，吸取100μL涂于XLD平板，37℃培养18-24h观察菌落并计数，结果如表4所示。

由表4可知，利用沙门氏菌免疫磁珠富集分离，提高了沙门氏菌菌液中沙门氏菌的检出率。

1.5免疫磁珠分离沙门氏菌的特异性试验

取1mL鼠伤寒沙门氏菌、乙型溶血性链球菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌，分别加入100μL免疫磁珠，充分混匀后，在振荡温度37 ℃、振速 40 rpm下，振荡吸附30min，静置磁力架上3min，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清，取下层溶液，加入1mL0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，重复洗涤2次，加入1mL 0.01mol/L PBS缓冲液振荡重悬磁珠，吸取100μL涂于营养琼脂平板，同时直接吸取各菌培养液100μL涂于营养琼脂平板，37℃下培养18-24h观察菌落并计数。

经过检测培养、生化鉴定后发现鼠伤寒沙门氏菌平板菌落较多，与直接涂布较为接近，其它菌经免疫磁珠富集分离后涂布平板相对直接涂布则较少或未生长，说明沙门氏菌免疫磁珠吸附富集沙门氏菌特异性良好。

实施例2

一种鲜乳中沙门氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：

1）无菌取鲜乳样品25mL，加入装有含有2g纤维素树脂的25 mL磷酸缓冲盐溶液的无菌均质袋中，制备成50mL的鲜乳混合溶液，鲜乳混合溶液用拍击式均质器拍打2min；

2）将鲜乳混合溶液用200mL PBS边冲洗边用滤纸快速过滤到容器中，将滤液在离心转速6000r/min、离心温度4℃下离心10min，0.22μm微孔滤膜抽滤下清液，将微生物富集于微孔滤膜上；

3）将微孔滤膜用无菌剪刀剪碎，用5mlTTB增菌液与5ml PBS缓冲液混合液冲洗浸泡2min，得到浓缩菌悬液；

4）取100μL沙门氏菌免疫磁珠与1mL浓缩菌悬液均匀混合，振荡温度37 ℃、振速40 rpm下，振荡吸附30min，静置磁力架上3min分层，弃上清；

5）取下层溶液，加入1mL 0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，充分混匀，静置磁力架上3min分层，弃上清，取下层溶液重复洗涤2次，加入1mL 0.01mol/L PBS缓冲液振荡重悬磁珠，得到浓缩待测液；

6）采用Elisa检测法进行检测。

根据沙门氏菌Elisa试剂盒，配置500μg/mL标准溶液，分别配制成0、7.5、15、30、60μg/mL的标准溶液，在OD₄₅₀处测其吸光值，根据标准溶液浓度与吸光值，得到蛋白含量与吸光值的标准曲线。再测浓缩待测液OD₄₅₀处的吸光度值，吸光度值代入标准曲线公式，得到样品浓缩液浓度值，根据鲜乳样品浓缩倍数，即得鲜乳样品检测值。

实施例3 对比试验

将浓度为1×10⁹CFU/mL的沙门氏菌菌液，按一定梯度进行倍比稀释，分别取1mL稀释液加入到25mL的鲜乳样品中，制备成鲜乳阳性样品。按照实施例2所述的方法检测，同时采用《GB 4789.4-2010》国标方法检测进行对比，检测鲜乳阳性样品和鲜乳样品，对比检测结果如表5所示。

由表5可知，与国标方法相比，本发明的检测方法灵敏度更高，大幅度提升了鲜乳样品中沙门氏菌的检出率。此外，对于本组试验，国标方法每检测一个样品总耗时4-7天，本发明的方法每检测一个样品总耗时50min ，后者较前者大大缩短了检测时间。

Claims

1.一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将鲜乳样品加入到缓冲液中得到鲜乳混合液，所述缓冲液中含有去除蛋白质和脂肪的试剂；

2）对鲜乳混合液进行滤纸过滤，取滤液进行微孔滤膜抽滤；

6）采用Elisa检测法进行检测即可；

步骤2）中对鲜乳混合液进行滤纸过滤后，取滤液进行离心，收集下清液，微孔滤膜抽滤；所述微孔滤膜孔径为0.22μm；

步骤1）中所述试剂为纤维素树脂；

步骤1）中所述缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液；

步骤3）中所述冲洗浸泡时间≤2min，所述四硫磺酸钠煌绿增菌液和磷酸盐缓冲液体积比为1：1。

2.根据权利要求1所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤4）中振荡温度为37℃，振速为40rpm，振荡时间为30min。

3.根据权利要求2所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤4）中所述静置时间为3min。