JP2023521531A - 組換えヒトｘｖｉｉ型コラーゲン、調製方法、及び使用 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを提供する。【解決手段】上記の組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列からなるか又は（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列が含まれ、ここで、Ａは、配列番号２に示される配列又は配列番号２に基づいてある程度アミノ酸修飾された配列又は配列番号２と８０％を超える相同性を有する配列であり、ここで、ｎは１以上の整数であり、ここで、各Ａは同じ又は異なるものであり、Ａを基本単位としてタンデムで繰り返し、同じ又は異なる各Ａのそれぞれは、ペプチド結合によって直接ライゲーションされている。本発明は、該コラーゲンがピキア酵母である真核生物宿主細胞におけるヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの高効率の分泌・可溶性発現を実現できるだけでなく、市販の天然ヒトコラーゲンよりも優れた細胞接着活性、細胞遊走促進活性を有し、優れた組織再生と毛包修復再生促進の生物学的活性も有し、工業的に生産できることが検証された。【選択図】図６

Description

本発明は、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン、調製方法、及び使用に関与し、遺伝子工学の技術分野に属する。

コラーゲンは、重要な天然生物タンパクとして化学工業、医薬、食品、化粧品などのさまざまな分野に広く適用でき、特にさまざまな生物器械の調製に適しており、最も理想的な生体材料源であり、幅広い適用の見通しがある。市販のコラーゲンは、主に動物の組織を酸、アルカリ、酵素分解法で処理して得られるコラーゲン抽出物である。該抽出物は、コラーゲンの自然な構造が処理中で基本的に破壊され、分解が深刻であるため、その生物学的活性が失い、抽出されたコラーゲンペプチドは、長さが異なり、特性が不均一で、品質が不安定で、ウィルス感染のリスクがある。そして、動物由来とヒト由来のコラーゲンは、アミノ酸配列がかなり異なり、免疫拒絶とアレルギー症状を引き起こす恐れがある。

ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、膜貫通型非線維芽細胞のコラーゲンであり、３つの同一のα１（ＸＶＩＩ）鎖で構成される均質な三量体であり、細胞内、膜貫通、細胞外の３種類のドメイン。ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、細胞内の半接着斑の成分の一つであり、上皮細胞と基底膜との相互作用において重要な役割を果たし、上皮細胞の接着、分離、発達分化を調節でき、角化細胞の分化と再生に重要な役割を果たす。ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、含有量が人体に非常に少なく、ＸＶＩＩ型コラーゲンも、その含有量が動物体において非常に少なく、抽出も非常に難しく、大量に生産することができず、動物由来コラーゲンの製品は、不可避的に免疫原性、潜在的なウィルス、流行病などの生物的な安全性の危険性があるため、広く適用されていない。法的及び倫理的制約によって制限され、ヒト由来ＸＶＩＩ型コラーゲンは科学研究にのみ適用できるため、ヒト又は他の動物由来の市販のＸＶＩＩ型コラーゲン製品は、市場に存在せず、その結果、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの研究と適用がさらに制限されていた。現在、そのような問題を解決する主な方法は、遺伝子工学などの生物学的技術によってコラーゲンを生産する。

既存の組換えタンパクは、主に原核（大腸菌）発現系、ピキア酵母発現系、哺乳動物細胞発現系、昆虫細胞（バキュロウイルス）発現系の４種類の発現系で生産されている。哺乳動物細胞がヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを発現することに関しては、あまり研究されておらず、いずれも実験的な研究段階にある。原核の発現（大腸菌、ｐＧＥＸ発現ベクター）の最初の使用は、非らせん領域ＮＣ１６配列の融合タンパクの生産であり、他の発現系、特にピキア酵母発現系には、まだヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが成功に発現された報告がない。

ここで、哺乳動物細胞は、発現コストが高く、収量が低く、主に高価値の薬用タンパクの発現と生産に使用される。哺乳動物細胞で発現するヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、一過性のトランスフェクションの発現や安定したトランスフェクション細胞株の発現にかかわらず、タンパク質の発現量が非常に低いと共に、使用される培地は高価で、科学研究における微量の使用にしか対応できない。昆虫細胞（バキュロウイルス）発現系は、コストが高く、収量が低く、翻訳された後でヒト細胞とは大きく異なり、コラーゲンの大量生産には一般的にこれらの２種類の方法が使用されない。原核発現（大腸菌発現系）によって得られたコラーゲンは、タンパク質に翻訳後の修飾がなく、大規模な増幅が見込まれる原核発現は、細胞内でのみ実現できるため、菌体の溶解を必要とし、標的タンパクと混合された不純物タンパクが大量に存在し、精製プロセスに対する要求が非常に高く、原核発現系が自然に含まれる（細菌の細胞壁成分）エンドトキシン、ペプチドグリカンを除去するには、複雑な精製プロセスが必要である。

上記のいくつかの発現系では、いずれも配列の単一性と生物学的活性の問題があり、配列の選択は比較的単一であり、コラーゲンペプチドは、すべて独立して発現などを行い、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲン細胞外ドメインの１０００個に近いアミノ酸（１５個のトリプルヘリカル領域、１５個の非トリプルヘリカル領域）の配列の豊富さと比べて、これらの２つはかけており、これも生物学的活性に直接影響しており、細胞接着活性は、コラーゲンの生物学的活性の最も基本的なものであり、残りの生物学的活性は関与していない。さらに、上記の哺乳動物細胞の発現であろうと、大腸菌の発現であろうとは、小規模の実験室レベルの培養や生産にとどまり、大規模な生産は計画されない。しかし、組換えコラーゲンの適用の前提としては、大規模、高密度、高発現された発酵生産と精製を行うことができることであり、一般的に５００Ｌの容量でパイロット発酵実験を検証した後で、工業規模、大規模な生産の可能性が生まれる。

ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、発現が困難で、膜貫通型のコラーゲンに属し、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインがある。一般的に、膜貫通タンパクは、真核細胞で発現する時に、ほとんど細胞外に分泌されず、細胞膜に固定されており、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、アミノ酸配列が長く（１４９７個のアミノ酸）、タンパク質の分子量が多く（１８０ｋＤａ）、理論的に細胞外に効果的に分泌されることが難しく、分解されやすく、発現を成功させるためには、関連する配列の選択を行う必要がある。同時に、現在のヒトＸＶＩＩ型コラーゲンのアミノ酸配列、構造、機能などに関する研究は、ほとんど知られていない。従って、ピキア酵母の発現系の利点（特に分泌発現）を維持することを前提に、生物学的機能を発揮できるようにアミノ酸配列を選択することは、顕著な困難であり、もちろん、他の発現系（包括大腸菌）でヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを発現することも困難である。

本発明の目的は、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン配列（非単一性）の最適化と選択、及びピキア酵母で高効率的に分泌発現され得ることを如何に実現するか、既存の組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが細胞接着活性しかなく、既存の組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが大規模に調製できないという先行技術に存在するいくつかの技術的問題を克服することにある。

そのため、本発明は、コラーゲン、該コラーゲンをコードするポリヌクレオチド、該コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、エンジニアリングバクテリア、該コラーゲンを調製する方法、該コラーゲンを含む組成物、該コラーゲンの使用を提供する。本発明において、該コラーゲンは、ピキア酵母である真核生物宿主細胞におけるヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの効率的な分泌・可溶性発現を実現できるだけではなく、市販の天然ヒトコラーゲンよりも優れた細胞接着活性も有し、細胞遊走促進活性、優れた組織再生、及び毛包修復再生促進の生物学的活性を有し、さらに工業的に適用することができる。

本発明は、細胞接着活性、細胞遊走促進活性、組織再生促進、及び毛包修復再生促進の生物学的活性を有するコラーゲンを提供する。

上記のコラーゲンは、（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列からなるか又は（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列を含み、ここで、
Ａは、配列番号２に示すアミノ酸配列又は配列番号２に基づいてある程度アミノ酸交換、挿入、置換、付加、欠失などにより修飾されたアミノ酸配列又は配列番号２アミノ酸配列と８０％を超える相同性を有するアミノ酸配列であり、ここで、ｎは１以上の整数であり、ここで、各Ａは同じ又は異なるものであり、Ａを基本単位としてタンデムで繰り返し、同じ又は異なる各Ａのそれぞれは、ペプチド結合によって直接ライゲーションされている。

さらに、本発明の一実施形態によれば、上記のコラーゲン（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列からなるか又は（Ａ）_ｎに示すアミノ酸配列を含み、ここで、Ａは、配列番号２に示すアミノ酸配列であり、ｎは１以上の整数であり、ここで、各Ａは相同かつＡを基本単位としてタンデムで繰り返し、各Ａのそれぞれは、ペプチド結合によって直接ライゲーションされている。

さらに、本発明の一実施形態によれば、上記のコラーゲン（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列からなるか、ｎが１であると、上記のコラーゲンのアミノ酸配列は配列番号２に示され、本発明では１７０８０１とし、ｎが２であると、上記のコラーゲンのアミノ酸配列は配列番号３に示され、本発明では１７０８０２とする。

さらに、本発明の記載によれば、本発明に記載のコラーゲン（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列からなるか又は（Ａ）ｎに示すアミノ酸配列を含み、ここで、Ａは、配列番号２に基づいてある程度アミノ酸挿入、置換、付加、欠失などにより修飾されたアミノ酸配列又は配列番号２アミノ酸配列と８０％を超える相同性を有するアミノ酸配列であり、ここで、ｎは１以上の整数であり、ここで、各Ａは同じ又は異なるものであり、Ａを基本単位としてタンデムで繰り返し、同じ又は異なる各Ａのそれぞれは、ペプチド結合によって直接ライゲーションされている。

本発明は、さらに上記コラーゲンをコードするポリヌクレオチド、具体的に上記（Ａ）_ｎに示されるコラーゲンをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、ピキア酵母を宿主細胞とすると、上記のポリヌクレオチドは、配列番号６又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むか又は配列番号６、配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなることが好ましい。

本発明の一実施形態によれば、上記のＡは、配列番号２であり、ｎが１であると、ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるヌクレオチド配列であり、本発明の一実施形態によれば、上記のＡは、配列番号２であり、ｎが２であると、上記（Ａ）ｎをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７に示されるヌクレオチド配列である。

本発明のコラーゲンは、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの１５目のらせん領域、カルボキシの末端領域、中間領域などの複数のらせん領域配列から最適なスクリーニングして選択された組み合わせ配列であり、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンアミノ酸配列の対応する部分と１００％相同であり、ピキア酵母である真核生物宿主細胞におけるヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの高効率の分泌・可溶性発現を実現できるだけではなく、市販の天然ヒトコラーゲンよりも優れた細胞接着活性、細胞遊走促進活性及び組織再生促進、及び毛包修復再生促進の生物学的活性を有し、そのような組み合わせ配列は、各領域の配列の機能を統合することを可能にし、別々に発現することではなく、全体として発現するため、組換えコラーゲンの配列単一性を回避する。

本発明は、さらに上記コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。

本発明の一実施形態によれば、本発明に記載の組換え発現ベクターの構築において、まず前記（Ａ）_ｎに示されるコラーゲンをコードするポリヌクレオチドを修飾し、コラーゲンアミノ酸配列のアミノ末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、二重特異性のアフィニティー精製タグが含まれるようにさせ、アフィニティークロマトグラフィー精製が可能になり、２種類のタグ配列に基づいて免疫抗体検出が可能になる。タグ付けされた配列を発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋにライゲーションし、組換え発現ベクター（実施例ではｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０１、ｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０２に示される）を構築する。

本発明は、さらに上記の組換え発現ベクターで構築されたエンジニアリングバクテリアを提供し、上記のエンジニアリングバクテリアの宿主細胞は、ピキア酵母であることが好ましい。上記のエンジニアリングバクテリアの寄託日は、２０２０年９月９日であり、寄託番号はそれぞれＣＧＭＣＣ ＮＯ．２０６２６、ＣＧＭＣＣ ＮＯ． ２０６２７であり、分類名はピキアパストリス酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、寄託機構は中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターであり、住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３号。

注意すべきは、宿主細胞が、真菌、酵母、植物細胞などの真核細胞、大腸菌のような腸内細菌科細菌などの原核細胞であり得、哺乳動物細胞ＣＨＯ系列細胞などの動物細胞、ＨＥＫ２９３系列細胞又は昆虫細胞であり得る。理解すべきは、当業者が上記のピキア酵母の代わりに他の発現宿主を発現宿主として使用することにより、同じアミノ酸配列を有するコラーゲンを発現させることができる。

本発明は、さらに以下の工程が含まれる上記のコラーゲンの調製方法を提供する。
エンジニアリングバクテリアの培養とスクリーニング

構築されたエンジニアリングバクテリアをスクリーニングした後、ＢＭＧＹ培地に接種して高発現されたエンジニアリングバクテリアを誘導発現してスクリーニングする。上記のスクリーニングされる発現量の多いエンジニアリングバクテリアは、ピキアパストリス酵母であり（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０６２６又はＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２０６２７である。
大規模な高密度発酵、培養、及びタンパク質の精製

５０Ｌ～５００Ｌの発酵槽でリンクバッチの流加発酵を行い、発酵上清を精製して高純度のコラーゲンを得る。

本発明の一実施形態によれば、本発明は、組換え発現ベクターをＳａｃ Ｉで線形化し、ピキア酵母のコンピテント細胞に電気形質転換し、エンジニアリングバクテリアを構築し、エンジニアリングバクテリアを一次スクリーニングのためにＭＤプレートに移してから、異なる濃度のＧ４１８を含むＹＰＤプレートスクリーニングによりコロニーを選別してＢＭＧＹ培地に接種し、ＢＭＭＹ培地で誘導発現させ、ポリクローナル菌種を選別し、発現量の多いエンジニアリングバクテリアを選択して後継ぎの実験を行う。本発明において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動、ウエスタンブロットにより発現タンパク質の予備同定を行い、その有効な分泌発現された能力を判断し、その結果、本発明の組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを高効率的に分泌発現できることが証明され、全長のヒトＸＶＩＩ型コラーゲンが主に細胞内に集中しており、細胞外に効果的に分泌できない。電気泳動によって得られた標的バンドについては、Ｎａｎｏ－ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ質量分析検出を行い、ペプチドセクションがヒトＸＶＩＩ型コラーゲン配列における最適に選択された領域に由来することが証明され、本発明の組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２は発現されることになる。

５０Ｌ～５００Ｌの発酵槽を使用して４８時間誘導発現する場合、本発明のコラーゲンの収量（ＵＶで定量）は、１２ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌに達することができる。

本発明において、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦを分子量の測定に使用して、１７０８０１コラーゲンの分子量は２３８１１．６７９７Ｄａ（理論値は２３８００Ｄａ）であり、１７０８０２コラーゲンの分子量は４５６８９．５７８１Ｄａ（理論値は４５４００Ｄａ）であり、ピキア酵母での発現後、翻訳後修飾と分子量の実験測定に系統的な誤差があるが、実際に発現したコラーゲンの分子量は理論値と一致している。コラーゲンに赤外スペクトルスキャンして、そのアミドＡ、アミドＢ、アミドＩ、アミドＩＩ、アミドＩＩＩの波数は、全て組換えコラーゲンの構造特性に適している。精製されたコラーゲン凍結乾燥スポンジは、電子顕微鏡で走査され、ラメラ構造を有しており、生体医学材料の分野で使用される可能性がある。

本発明の一実施形態によれば、得られたコラーゲンについて生物学的活性を検出し、その細胞接着活性、細胞遊走促進活性をインビトロ細胞実験で検証する。得られたコラーゲンについて、ウサギの耳の瘢痕治癒の効果的な促進、組織再生、特に非常に優れた毛包修復再生促進の活性を生物学的活性の動物実験、ウサギの耳の瘢痕モデルの実験で検証する。

これに基づいて、本発明は、さらに上記のコラーゲンの組織再生促進、毛包修復促進ための使用を提供する。

本発明は、さらに上記のコラーゲン又は上記方法で調製されたコラーゲンを含む組成物を提供する。

本発明は、さらに上記のコラーゲン又は上記方法で調製されたコラーゲン又は上記組成物を含む製品を提供する。上記の製品は、薬物、薬物組成物、医療機器、生体材料、組織工学製品、化粧品又は保健品などが含まれるが、これらに限定されない。

本発明は、さらに上記のコラーゲン、ポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、エンジニアリングバクテリア、組成物などの最終製品を調製ための使用を提供し、薬物、薬物組成物、医療機器、生体材料、組織工学製品、化粧品、保健品のための使用が含まれるが、これらに限定されない。

本発明は、さらに上記のコラーゲン、ポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、エンジニアリングバクテリア、又は組成物の瘢痕治癒、組織修復を促進する又は毛包修復を促進する製品を調製するための使用を提供する。本発明の一実施形態によれば、上記の製品は、外用薬であり、好ましくは外用塗り薬であり、好ましくはゲル剤である。

本発明は、以下の有益な効果を有する。

本発明は、ピキア酵母発現系を選択し、ピキア酵母は真核微生物であり、真核生物の完全な細胞小器官を有し、翻訳されたタンパク質に特定の翻訳後修飾（特にグリコシル化修飾）をし得て、タンパク質の生物学機能の実現を強力的に支援する。それにより発現系を樹立すると、微生物発現系の高密度の発酵生産可能、非常に低くの培養コスト、短いサイクル、高発現などの大規模な工業生産の利点を同時に有する。それは、細胞外に分泌され得る特性のため、菌体分解による不純物タンパクを完全に分解し得る。細胞壁の成分には、エンドトキシンとペプチドグリカンが含まれない。

本発明における組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンのために選択された配列は、スクリーニングされて最適化された配列を組み合わせることによって形成され、そのアミノ酸配列が天然コラーゲンアミノ酸配列の対応する部分との相同性は１００％であり、免疫原性がなく、医薬、医療器械、生体材料、組織工学、化粧品などの分野に幅広く適用できる。

本発明における組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、市販の天然人コラーゲンと同等又はそれ以外の細胞接着活性、細胞遊走促進活性、組織修復、及び毛包修復再生促進などの多種の生物学的活性を有し、実際に製品への適用の目的を達成できることが実験的に検証された。

本発明における組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、ピキア酵母発現系で高効率的に分泌されて発現され得、高純度のコラーゲンを精製して獲得しやすい。アミノ酸配列をコードする遺伝子ＤＮＡ配列は、構築されたエンジニアリングバクテリア株のタンパク発現量が非常に高く、高密度の発酵発現で高収量が得られるように最適に設計される。ピキア酵母は、高密度の発酵発現をしやすく、本発明によってスクリーニングされる菌種は、５００Ｌレベルのパイロット規模の高密度の高発現量発酵を実現でき、既に工業化された大規模な生産の条件を備えている。

本発明における宿主細胞であるピキア酵母は、発現された異種タンパクに対して、グリコシル化などの特定の翻訳後修飾を有する。

本発明において構築されたｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０１ベクターグラフである。 本発明において構築されたｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０２ベクターグラフである。 本発明において構築されたｐＰＩＣ９Ｋ－ｃｏｌ１７ａ１ベクターグラフである。 組換え全長ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンα１鎖の発現されたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果図であり、その見かけ分子量は約１８０ｋＤａである。 抗Ｈｉｓタグ抗体を使用した組換え全長ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンα１鎖のウエスタンブロット検出の結果である。 ２４時間の誘導後の１７０８０１、１７０８０２コラーゲンのエンジニアリングバクテリア発現された上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 抗Ｈｉｓタグ抗体を使用した２４時間の誘導後の１７０８０１、１７０８０２コラーゲンのエンジニアリングバクテリア発現上清のウエスタンブロット検出の結果である。 抗Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ タグ抗体を使用した２４時間の誘導後の１７０８０１、１７０８０２コラーゲンのエンジニアリングバクテリア発現上清のウエスタンブロット検出の結果である。 １７０８０１コラーゲンのＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの質量分析と天然ヒトＸＶＩＩ型コラーゲン配列のアラインメント結果である。 １７０８０２コラーゲンのＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの質量分析と天然ヒトＸＶＩＩ型コラーゲン配列のアラインメント結果である。 ５００Ｌ発酵槽での１７１８０１コラーゲンのエンジニアリングバクテリアのパイロット発酵菌増殖曲線とコラーゲン発現曲線である。 ５００Ｌ発酵槽での１７１８０２コラーゲンのエンジニアリングバクテリアのパイロット発酵菌増殖曲線とコラーゲン発現曲線である。 精製された１７０８０１コラーゲンのＨＰＬＣクロマトグラフである。 精製された１７０８０２コラーゲンのＨＰＬＣクロマトグラフである。 １７０８０１コラーゲンの分子量のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ検出の結果である。 １７０８０２コラーゲンの分子量のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ検出の結果である。 精製された１７０８０１、１７０８０２コラーゲンの赤外スペクトルである。 １７０８０１（左）、１７０８０２（右）コラーゲンの凍結乾燥スポンジサンプルのＳＥＭ画像（２００×）である。 １７０８０１、１７０８０２コラーゲンの細胞接着活性検出の結果である。 １７０８０１、１７０８０２コラーゲンと天然ヒトコラーゲンの細胞遊走状態の実際の比較結果である。 ２４時間、４８時間細胞遊走した後の１７０８０１、１７０８０２コラーゲンと天然ヒトコラーゲンの細胞遊走率である。 １７０８０１、１７０８０２コラーゲンがウサギの耳の瘢痕に６週間介入した後の瘢痕の全体写真とスライス図である。

当業者に本発明の技術的解決策をよりよく理解させるために、本発明の好ましい実施例を以下に詳細に説明するが、以下の実施例は、本発明の保護範囲を限定するものではない。

本発明の実施例では、記載されていないことはすべて従来の分子生物学実験方法によって行われ、実施例に含まれるＰＣＲ、酵素消化、ライゲーション、およびコドン最適化などのプロセスは、製品仕様または当技術分野の基礎知識に従って当業者によって理解および容易に実施することができるため、詳細には説明しない。

実施例１．組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの構築、発現と同定
（１）組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンアミノ酸配列の設計

本発明では、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲン配列の最適化に基づいて、上記のヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの具体的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＭＤ９－１配列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＵＭＤ９）とＮＣＢＩ参照配列Ｑ９ＵＭＤ９ ．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ ．ｎｃｂｉ ．ｎｌｍ ．ｎｉｈ ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｑ９ＵＭＤ９．３）を参照し、２つの配列が同一であり、具体的に配列番号１に示される。
配列番号１：
MDVTKKNKRDGTEVTERIVTETVTTRLTSLPPKGGTSNGYAKTASLGGGSRLEKQSLTHGSSGYINSTGSTRGHASTSSYRRAHSPASTLPNSPGSTFERKTHVTRHAYEGSSSGNSSPEYPRKEFASSSTRGRSQTRESEIRVRLQSASPSTRWTELDDVKRLLKGSRSASVSPTRNSSNTLPIPKKGTVETKIVTASSQSVSGTYDATILDANLPSHVWSSTLPAGSSMGTYHNNMTTQSSSLLNTNAYSAGSVFGVPNNMASCSPTLHPGLSTSSSVFGMQNNLAPSLTTLSHGTTTTSTAYGVKKNMPQSPAAVNTGVSTSAACTTSVQSDDLLHKDCKFLILEKDNTPAKKEMELLIMTKDSGKVFTASPASIAATSFSEDTLKKEKQAAYNADSGLKAEANGDLKTVSTKGKTTTADIHSYGSSGGGGSGGGGGVGGAGGGPWGPAPAWCPCGSCCSWWKWLLGLLLTWLLLLGLLFGLIALAEEVRKLKARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQEELWMFVRKKLMMEQENGNLRGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRGPPGEGLPGPPGPPGSFLSNSETFLSGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSTSGSSSFGLNLQGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPSGPSEGGSSSTMYVSGPPGPPGPPGPPGSISSSGQEIQQYISEYMQSDSIRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTITGETFDYSELASHVVSYLRTSGYGVSLFSSSISSEDILAVLQRDDVRQYLRQYLMGPRGPPGPPGASGDGSLLSLDYAELSSRILSYMSSSGISIGLPGPPGPPGLPGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDLSSYLHTAGLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRSFIVGPPGPPGPQGPPGDSRLLSTDASHSRGSSSSSHSSSVRRGSSYSSSMSTGGGGAGSLGAGGAFGEAAGDRGPYGTDIGPGGGYGAAAEGGMYAGNGGLLGADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQVYAGRRRRRSIAVKP

上記の配列番号１の太字で下線が引かれた部分は、本発明によって選択された配列であり、合計２３３個のアミノ酸を有する。本発明によって選択された配列は、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの１５目のらせん領域、カルボキシ末端領域、中間領域などの複数らせん領域配列から最適なスクリーニングして選択された組み合わせ配列であり、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンのピキア酵母である真核生物宿主細胞での高効率の分泌・可溶性発現を実現できるだけではなく、市販の天然ヒトコラーゲンよりも優れた細胞接着活性を有し、細胞遊走活性及び優れた組織再生、及び毛包修復再生促進の生物学的活性も有する。そのような組み合わせは、各領域の配列の機能を統合することを可能にし、別々に発現することではなく、全体として発現するため、組換えコラーゲンの配列単一性を回避しており、非常に革新的であり、本発明において１７０８０１と名付けられ、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの好ましい配列であり、具体的な配列は配列番号２に示される。

配列番号２：
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ

１７０８０１をコードするＤＮＡ配列は、配列番号６に示される。

配列番号６：
GGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTTTTCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCACCTGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCTAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGTGACAAGGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCTGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTCCTCCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACAAGGTCCTAAAGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCAGGTCCACCTGGTCAAAAAGGTGAAATGGGTACTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCACCTGGTCATCCTGGTCCACCAGGTCCAAGAGGTCATAAGGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAA

本発明におけるコラーゲンは、さらに１７０８０１を基本単位としてｎ回の縦列反復を行うことにより得られたアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは１以上の整数である。

１７０８０１を基本単位とし、ｎが２であると、１７０８０１を２回の縦列反復を行うことにより得られたアミノ酸配列は、合計４６６個のアミノ酸であり、１７０８０２と名付けられ、そのアミノ酸配列は配列番号３に示される。

配列番号３：
GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ

１７０８０２をコードするＤＮＡ配列は、配列番号７に示される。

配列番号７：
GGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTTTTCCAGGTACTCCAGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCTGGTGAAAAAGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCTCCAGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCTGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAAGGTGACAAAGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCTCCAGGTCCTCCTGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTGACAAGGGTGACCCTGGTGTTCCAGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCTCCAGGTCAAAAGGGTGAGATGGGTACTCCTGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCTCCTGGTCACCCAGGTCCTCCTGGTCCTAGAGGTCATAAAGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAAGGTTCTCCAGGTCCAAAGGGTGACATGGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACAGAGGTTTCCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCACCCAGGTCCACAAGGTCCAAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCAGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCAGGTCCTCATGGTCCACCAGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCAAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCTGGTGTTAAGGGTGACAAAGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCTAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACCTGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCAGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCACCAGGTCCTCAAGGTCCTAAGGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCACCTGGTCAAAAGGGTGAAATGGGTACTCCTGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTCCTGCTGGTCCACCTGGTCATCCAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACAAAGGTGAAAAGGGTGACAAGGGTGACCAA

タンパク質の機能は、そのアミノ酸残基を整然と配置することによってのみ実現でき、本発明における組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの革新的な生物活性は、すべて最適なスクリーニングによって選択されたアミノ酸配列に基づいており、限定された配列修飾又は特定の相同性の比率（８０％を超える）でも、同じまたは類似の生物学的活性を達成する可能性がある。

従って、本発明において、上記のコラーゲンは、さらに配列番号２に基づいてある程度アミノ酸の挿入、置換、付加、欠失などにより修飾されたアミノ酸配列又は配列番号２アミノ酸配列と８０％を超える相同性を有するアミノ酸配列を基本単元として、ｎ回の縦列反復を行うことにより得られたアミノ酸配列である。ここで、ｎは１以上の整数であり、各基本単元は、同じ又は異なる。

ここで、本発明に記載の相同性とは、配列の重複率を指し、部分的同一性および類似性のパーセンテージなどの２つの配列の直接的な定量的関係であり得る。同じ位置に同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基を持つ２つの配列の配列比率がさらに含まれる。共通の祖先から分岐進化してなる異なる配列である。従来のバイオインフォマティクス方法によって配列情報を整列させることによって取得できる。

上記のアミノ酸の挿入とは、上記のタンパクが１７０８０１、１７０８０２コラーゲンと類似の生物学的活性を有する限り、配列番号２又は配列番号３の配列などのアミノ酸配列の適切な位置にアミノ酸残基を挿入することを指し、挿入されたアミノ酸残基は互いに隣接していてもよく、又は挿入されたアミノ酸のいずれも互いに隣接していなくてもよく、細胞接着活性、細胞遊走促進活性、組織再生促進、及び毛包修復再生促進の活性が含まれる。

上記のアミノ酸の置換とは、上記のタンパクが１７０８０１、１７０８０２コラーゲンと類似の生物学的活性を有する限り、配列番号２又は配列番号３の配列などのアミノ酸配列のある位置の一つ又はいくつかのアミノ酸残基（いくつかの連続するアミノ酸残基又はいくつかの非連続のアミノ酸残基が含まれ）が他のアミノ酸残基に置換されることを指し、細胞接着活性、細胞遊走促進活性、組織再生促進、及び毛包修復再生促進の活性が含まれる。

上記のアミノ酸の付加とは、上記のタンパクが１７０８０１、１７０８０２コラーゲンと類似の生物学的活性を有する限り、配列番号２又は配列番号３の配列などのアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加することを指し、細胞接着活性、細胞遊走促進活性、組織再生促進、及び毛包修復再生促進の活性が含まれる。

上記のアミノ酸の欠失とは、上記のタンパクが１７０８０１、１７０８０２コラーゲンと類似の生物学的活性を有する限り、配列番号２又は配列番号３の配列などのアミノ酸配列から１、２又は３個及び３個以上のアミノ酸を欠失できることを指し、細胞接着活性、細胞遊走促進活性、組織再生促進、及び毛包修復再生促進の活性が含まれる。

本発明では、上記のアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸であることが好ましく、同時に、ここでの１個又は複数（如２～５個、２～４個又は２～３個）のアミノ酸も、ポリペプチドのバイオアベイラビリティ、安定性及び／又は抗ウィルス活性を改善するために、配座がＤ型であるアミノ酸、人工的に修飾されたアミノ酸、自然に存在する希少アミノ酸などに置換されてもよい。ここで、Ｄ型アミノ酸とは、構成タンパク質のＬ型アミノ酸に対応するアミノ酸を指し、人工的に修飾されたアミノ酸とは、メチル化、リン酸化などによって修飾された構成タンパク質の普通なＬ型アミノ酸を指し、自然に存在する希少アミノ酸は、５－ヒドロキシリシン酸、メチルヒスチジン、γ－アミノ酪酸、ホモセリンなどの構成タンパク質の普通でないアミノ酸とタンパク質を構成しないアミノ酸が含まれる。

（２)組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンアミノ酸配列とＤＮＡ配列の最適化

本発明において、１７０８０１、１７０８０２のＤＮＡ配列を修飾し、２つのアミノ末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、二重特異性のアフィニティー精製タグが含まれるようにさせ、アフィニティークロマトグラフィー精製が可能になり、２種類のタグ配列に基づいて免疫抗体検出が可能になる。具体的には、１７０８０１、１７０８０２のアミノ酸配列及びその遺伝子配列に基づいて、ＤＮＡ配列のコドンバイアス及びその転写、翻訳中での関わる最適化パラメーターが計算され、接合、組換え、及び最適化して、ピキア酵母での高効率の発現されたより適切なＤＮＡ配列が合成される。

本発明において、１７０８０１の両末端はそれぞれ修飾され、アミノ末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列を付加してから、１７０８０１は最終的に発現して得られたのは、タグを含むタンパクであり、合計２４９個のアミノ酸であり、最適化された１７０８０１のアミノ酸配列は配列番号４に示される。１７０８０１の両末端にはそれぞれ修飾され、アミノ末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列が付加され、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列、終止コドン（ＴＡＡ）、及びＮｏｔ Ｉの制限酵素消化切断部位が付加されたＤＮＡ配列は、配列番号８に示される。

配列番号４：
YVWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQHHHHHH

配列番号８：
TACGTATGGTCTCATCCACAATTCGAGAAGGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTTTTCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCACCTGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCTAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGTGACAAGGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCTGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTCCTCCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACAAGGTCCTAAAGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCAGGTCCACCTGGTCAAAAAGGTGAAATGGGTACTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCACCTGGTCATCCTGGTCCACCAGGTCCAAGAGGTCATAAGGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAACACCATCATCACCATCATTAAGCGGCCGC

同様に、１７０８０２の両末端にはそれぞれ修飾され、アミノ末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列を付加し、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列を付加してから、１７０８０２が最終的に発現して得られたのはタグを含むタンパクであり、合計４８２個のアミノ酸で、最適化された１７０８０２のアミノ酸配列は配列番号５に示される。１７０８０２の両末端にはそれぞれ修飾され、アミノ末端にＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグをコードするＤＮＡ配列が付加され、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列、終止コドン（ＴＡＡ）、及びＮｏｔ Ｉの制限酵素消化切断部位が付加されたＤＮＡ配列は、配列番号９に示される。

配列番号５：
YVWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQHHHHHH

配列番号９：
TACGTATGGTCTCATCCTCAATTTGAAAAGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTTTTCCAGGTACTCCAGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCTGGTGAAAAAGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCTCCAGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCTGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAAGGTGACAAAGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCTCCAGGTCCTCCTGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTGACAAGGGTGACCCTGGTGTTCCAGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCTCCAGGTCAAAAGGGTGAGATGGGTACTCCTGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCTCCTGGTCACCCAGGTCCTCCTGGTCCTAGAGGTCATAAAGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAAGGTTCTCCAGGTCCAAAGGGTGACATGGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACAGAGGTTTCCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCACCCAGGTCCACAAGGTCCAAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCAGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCAGGTCCTCATGGTCCACCAGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCAAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCTGGTGTTAAGGGTGACAAAGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCTAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACCTGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCAGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCACCAGGTCCTCAAGGTCCTAAGGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCACCTGGTCAAAAGGGTGAAATGGGTACTCCTGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTCCTGCTGGTCCACCTGGTCATCCAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACAAAGGTGAAAAGGGTGACAAGGGTGACCAACACCATCACCATCATCATTAAGCGGCCGC

本発明において、全長ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンアミノ酸配列（すなわち、ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンα１鎖）をコードするＤＮＡ配列（アミノ末端にＥｃｏＲ Ｉの制限酵素消化切断部位、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグのＤＮＡ配列が付加され、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓ ＴａｇタグをコードするＤＮＡ配列、終止コドン（ＴＡＡ）及びＮｏｔ Ｉの制限酵素消化切断部位が付加された）は、配列番号１０に示される。

配列番号１０：
GAATTCTGGAGTCATCCTCAATTCGAAAAAATGGATGTCACTAAAAAGAACAAGAGAGACGGAACTGAGGTCACTGAGAGAATCGTTACCGAAACTGTCACCACAAGACTTACTTCATTACCTCCAAAGGGTGGAACTTCTAATGGTTACGCAAAGACAGCATCATTAGGAGGTGGTTCAAGACTTGAGAAACAATCCCTTACTCATGGTTCAAGTGGATACATAAATTCAACTGGTTCAACAAGAGGACATGCAAGTACTTCTTCTTATAGAAGAGCACATAGTCCAGCATCAACTTTGCCCAACTCTCCTGGTTCAACATTTGAGAGAAAAACTCATGTAACCAGACATGCCTATGAGGGTTCTAGTTCTGGTAATTCATCTCCAGAATACCCTAGAAAAGAGTTTGCATCATCCTCAACTAGAGGTAGATCACAGACTAGAGAATCTGAAATCAGAGTCAGATTACAATCAGCATCTCCTTCAACTAGATGGACTGAGTTAGACGACGTGAAAAGATTATTAAAGGGATCAAGAAGTGCAAGTGTTTCCCCTACAAGAAATTCTTCCAACACCCTTCCCATTCCTAAGAAAGGAACCGTTGAAACTAAAATCGTTACAGCATCATCTCAGTCTGTATCCGGAACCTACGACGCTACCATTCTGGACGCCAACTTACCTTCTCATGTCTGGTCTTCAACTTTACCCGCAGGTTCCTCAATGGGAACTTACCACAATAACATGACTACTCAATCAAGTTCTCTTCTGAATACCAATGCATACTCAGCCGGTTCCGTTTTTGGAGTCCCTAACAATATGGCCTCTTGCTCCCCAACTCTTCATCCAGGTCTTTCAACCTCATCAAGTGTATTTGGTATGCAGAACAACTTAGCCCCTTCCTTGACAACCCTGTCTCATGGTACTACTACCACTAGTACAGCATATGGAGTCAAGAAGAACATGCCACAGTCACCTGCTGCCGTTAACACTGGAGTTTCAACATCTGCTGCCTGCACTACATCTGTTCAATCAGATGATCTTCTGCATAAGGACTGCAAGTTTTTAATTTTAGAGAAAGACAATACCCCTGCCAAAAAGGAAATGGAGTTACTTATAATGACCAAAGATTCTGGTAAAGTATTCACTGCTTCTCCCGCTAGTATCGCCGCAACTTCATTCTCTGAAGATACTTTAAAGAAGGAAAAACAAGCCGCATACAACGCAGACTCAGGTTTAAAAGCAGAAGCAAACGGTGACCTTAAAACAGTGTCAACTAAGGGAAAGACTACAACCGCAGACATCCATTCATATGGTTCTTCAGGTGGAGGAGGATCTGGAGGAGGTGGTGGAGTGGGAGGTGCTGGAGGAGGTCCATGGGGTCCTGCACCTGCATGGTGCCCTTGCGGTTCTTGCTGCAGTTGGTGGAAGTGGCTTCTGGGTTTATTATTAACTTGGCTGCTTTTACTGGGTCTTTTATTCGGTCTTATCGCATTAGCAGAAGAGGTCAGAAAACTTAAGGCCAGAGTTGATGAGTTAGAGAGAATCAGAAGATCAATCCTTCCCTATGGAGACTCCATGGACAGAATCGAAAAGGATAGACTTCAGGGTATGGCCCCTGCAGCAGGAGCTGATCTGGATAAAATCGGACTTCATTCAGATTCTCAAGAGGAATTATGGATGTTTGTTAGAAAGAAACTTATGATGGAGCAGGAGAACGGTAACCTGAGAGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGAGATATGGGTTCACCCGGTCCCAAAGGAGATAGAGGATTCCCTGGTACTCCAGGTATCCCCGGTCCCCTGGGTCACCCTGGACCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTAGGAGATCCAGGTATGGAGGGTCCCATGGGTCAGAGAGGTAGAGAAGGTCCCATGGGACCAAGAGGTGAAGCTGGACCTCCCGGAAGTGGTGAAAAAGGAGAAAGAGGAGCAGCAGGAGAACCTGGACCCCATGGACCTCCAGGAGTTCCTGGATCAGTCGGACCCAAAGGTTCATCCGGTTCTCCTGGACCTCAAGGTCCACCAGGACCCGTCGGATTGCAAGGATTGAGAGGAGAAGTTGGACTTCCCGGAGTTAAGGGTGACAAGGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCAAAGGGAGATCAGGGTGAAAAGGGTCCTAGAGGTCTGACTGGTGAACCAGGAATGAGAGGACTTCCCGGTGCCGTGGGTGAACCCGGTGCAAAAGGAGCAATGGGTCCTGCCGGTCCTGATGGACACCAGGGACCCAGAGGAGAGCAGGGATTAACAGGAATGCCTGGTATCAGAGGTCCCCCAGGTCCCTCAGGAGACCCAGGAAAGCCAGGACTTACTGGTCCCCAGGGTCCTCAAGGTCTGCCTGGAACTCCCGGAAGACCCGGAATCAAAGGTGAACCAGGAGCCCCAGGAAAAATCGTTACTAGTGAAGGATCTTCAATGCTGACTGTGCCAGGTCCACCTGGTCCTCCTGGAGCTATGGGTCCTCCCGGTCCCCCTGGAGCACCCGGTCCTGCAGGTCCTGCCGGATTACCTGGACATCAGGAAGTCTTAAACCTGCAAGGTCCACCAGGTCCTCCTGGTCCAAGAGGACCCCCTGGTCCTTCAATCCCTGGTCCACCTGGACCTAGAGGTCCACCCGGAGAGGGACTTCCCGGACCACCAGGACCTCCTGGATCATTTCTGTCTAATTCTGAGACATTTCTTTCAGGACCTCCTGGTCCTCCCGGACCACCTGGACCAAAAGGAGATCAGGGACCACCTGGTCCCAGAGGACATCAAGGAGAGCAGGGTCTTCCAGGTTTCTCTACTTCTGGATCATCATCATTTGGTCTTAATCTTCAAGGTCCTCCTGGACCCCCAGGACCACAGGGACCCAAGGGTGACAAGGGAGACCCTGGAGTCCCAGGTGCACTGGGAATCCCTTCAGGTCCTTCAGAAGGTGGTTCATCTTCAACCATGTATGTGTCTGGACCCCCAGGACCTCCCGGACCTCCAGGTCCTCCTGGTTCAATCTCTTCTTCTGGTCAAGAAATTCAGCAGTATATTTCTGAGTACATGCAATCTGACTCTATTAGAAGTTATTTGTCTGGTGTGCAGGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCCCCTGGACCAGTCACTACTATCACTGGAGAGACATTTGATTATAGTGAATTAGCATCACACGTCGTTTCTTATCTGAGAACTTCAGGTTATGGTGTTTCATTATTTTCCTCCTCAATCTCTTCAGAAGACATCTTAGCCGTACTGCAGAGAGATGATGTAAGACAGTACCTTAGACAATACTTGATGGGTCCAAGAGGACCACCAGGTCCACCCGGTGCATCAGGAGACGGATCATTATTATCTTTGGATTACGCTGAATTATCATCAAGAATCCTTAGTTACATGTCCTCTTCTGGTATCTCCATAGGTCTGCCCGGTCCTCCTGGTCCTCCCGGACTTCCTGGTACTTCTTACGAAGAGCTTCTGTCACTTTTAAGAGGATCTGAGTTTAGAGGTATAGTTGGTCCCCCAGGACCTCCAGGTCCTCCAGGTATCCCAGGTAACGTGTGGTCATCTATCTCAGTTGAGGATCTTTCATCTTATCTTCACACCGCCGGATTGTCCTTTATACCTGGTCCTCCAGGACCCCCTGGACCTCCTGGACCCAGAGGTCCTCCAGGAGTATCCGGTGCTTTAGCAACTTATGCAGCAGAAAACTCCGATTCTTTTAGATCAGAATTGATCTCCTACCTTACTTCTCCTGATGTTAGATCATTCATCGTCGGACCTCCAGGACCACCTGGACCTCAAGGACCTCCTGGAGATTCAAGATTACTGAGTACAGATGCATCACATTCAAGAGGTTCAAGTTCTTCTTCTCACTCCTCTTCTGTTAGAAGAGGATCATCATATTCATCAAGTATGTCAACTGGTGGAGGAGGAGCTGGTTCATTGGGTGCCGGAGGTGCATTTGGTGAGGCCGCTGGTGACAGAGGACCTTATGGTACTGACATTGGACCTGGTGGAGGTTATGGTGCAGCAGCAGAAGGTGGAATGTATGCTGGTAATGGAGGTTTACTGGGAGCCGACTTTGCCGGAGACCTGGACTACAACGAGTTAGCTGTTAGAGTGTCAGAGTCAATGCAGAGACAAGGATTATTACAGGGTATGGCTTATACAGTTCAGGGACCCCCAGGTCAGCCAGGTCCTCAAGGACCCCCTGGTATTTCAAAAGTCTTCTCCGCTTATTCTAACGTTACTGCAGACCTGATGGATTTCTTCCAGACTTACGGTGCCATCCAAGGTCCTCCAGGACAGAAGGGTGAAATGGGAACTCCCGGTCCCAAGGGTGACAGAGGTCCTGCAGGACCTCCTGGTCACCCTGGACCACCTGGACCTAGAGGACACAAAGGTGAGAAGGGTGACAAGGGAGACCAGGTTTACGCAGGAAGAAGAAGAAGAAGAAGTATTGCCGTCAAGCCTCACCATCACCATCATCACTAAGCGGCCGC

（３）ＤＮＡ配列の合成と組換え発現ベクターの構築

本発明において、最適化された配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｃｏ．Ｌｔｄ．に依頼して合成され、３つの遺伝子の断片はｐＵＣ５７－１７０８０１、ｐＵＣ５７－１７０８０２、ｐＵＣ５７－ｃｏｌ１７ａ１として示される。合成された遺伝子の断片の配列番号８、配列番号９をＳｎａＢ ＩとＮｏｔ Ｉで二重酵素消化して、酵素消化して得られた標的遺伝子の断片を同様に二重酵素消化されたｐＰＩＣ９Ｋ空ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社から購入）にライゲーションする。同時に、合成された遺伝子の断片の配列番号１０をＥｃｏＲ ＩとＮｏｔ Ｉで二重酵素消化し、比較として、酵素消化して得られた標的断片を同様に二重酵素消化されたｐＰＩＣ９Ｋ空ベクターにライゲーションする。

工程ａ．標的遺伝子、発現ベクターを増幅する。プラスミドミニプレップキット（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．から購入）によりｐＵＣ５７－１７０８０１、ｐＵＣ５７－１７０８０２、ｐＵＣ５７－ｃｏｌ１７ａ１、ｐＰＩＣ９Ｋ空ベクターのプラスミドをそれぞれ抽出し、具体的な操作は、キットの説明書に従って実行される。

工程ｂ．工程ａ得られた標的遺伝子の断片とｐＰＩＣ９Ｋベクターのプラスミドを３７℃で３０分間二重酵素消化し、酵素消化反応系は次の通りである（しようしたＱｕｉｃｋＣｕｔ^TM制限酵素はＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｄａｌｉａｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、酵素消化プロセスは、その説明書に従って実行される）。

得られた標的遺伝子の断片とベクター断片をＰＣＲ産物精製キットで精製する（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｄａｌｉａｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、具体的な操作は、キットの説明書に従って実行される）。二重酵素消化された標的遺伝子の断片とベクターｐＰＩＣ９Ｋ線形化断片を回収し、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩライゲーション試薬（ライゲーションキットはＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｄａｌｉａｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され）でライゲーションし（１６℃で３０分間ライゲーションする）、標的遺伝子の断片を分泌シグナルα－因子の分泌型ベクターのリーディングフレーム内に正確に挿入し、ライゲーション反応系は、次の通りである（ライゲーションキットの説明書に従って実行される）。

ライゲーション産物をコンピテントな大腸菌ＤＨ５α（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．から購入）に形質転換し、陽性クローンをＡｍｐが含まれるＬＢ抗性プレートでスクリーニングし、コロニーＰＣＲ検証を行い、組換えプラスミドを抽出してシーケンシング同定（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．により完成させる）し、本実施例は組換え発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０１、ｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０２、ｐＰＩＣ９Ｋ－ｃｏｌ１７ａ１を構築したことがシーケンシング検証により正確に証明され、関連するプラスミドグラフは、図１、図２、及び図３に示される。

（４）組換えエンジニアリングバクテリア株の構築、菌種選別
工程（３）で得られた組換え発現ベクタープラスミド１０μｇをＳａｃＩ（酵素消化キットは、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｉａｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、具体的な操作はキットの説明書に従って実行される）により３７℃で一晩酵素消化して線形化させ、ＰＣＲ産物精製キット（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．から購入）を使用して線形化プラスミドを回収し、回収された体積が１０μＬ程度に制御された。

線形化したプラスミドを空の宿主菌種のピキア酵母ＧＳ１１５（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入）コンピテント細胞に電気形質転換し、電気形質転換された菌液をＭＤプレートに塗布し、１００μＬ～２００μＬ毎に1つのプレートに塗布し、室温で１０分間静置して、単一のコロニー（陽性の形質転換体）が現れるまで３０℃で２～５日間反転培養した。

ＭＤプレートの表面に２ｍＬの滅菌再蒸留水を添加して、滅菌三角スプレッダーでプレート表面のＨｉｓ^＋形質転換体（陽性の形質転換体）を手軽にこすり取り、５０ｍＬの遠心管に移り、滅菌再蒸留水で細菌懸濁液に希釈し、１０^５個の細胞を含む細菌懸濁液を０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８が含まれるＹＰＤプレートに塗布し、反転して、単一のコロニーが現れるまで３０℃で３～４日間培養した。ＹＰＤプレートからコロニーを滅菌９６ウェルプレートに選別し（各ウェルには２００μＬのＹＰＤが含まれる）、均一に混合して、３０℃で４８時間培養し、ウェル中の菌液を均一に混合し、１０μＬをそれぞれ取って新しい滅菌９６ウェルプレートに接種し、３０℃で２４時間培養してから、該工程を一回繰り返し、２４時間後で３番目の９６ウェルプレートから１μＬ取って１．０ｍｇ／ｍＬと４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＹＰＤプレートにそれぞれスポットし、３０℃で引き続き９６時間～１２０時間培養した。ピキア酵母の形質転換体は、高濃度のＧ４１８を含むプレート上で増殖できれば、該形質転換体が複数のコピーの標的遺伝子を含み、すなわち、複数の組換え断片が酵母体内に入って相同組換えによって酵母の染色体に組み込まれた。コピー数が多く、効率的に発現できる組換え酵母エンジニアリングバクテリア種は、この段階のスクリーニングより得ることができる。

ｐＰＩＣ９Ｋ－ｃｏｌ１７ａ１、ｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０１、ｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０２の３種類のエンジニアリングバクテリアのサンプルは、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに送られ、菌種寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８６５９、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０６２６、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２０６２７である。住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３号であり、寄託日はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８６５９が２０１９年１０月１０日であり、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０６２６、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２０６２７が２０２０年９月９日である。分類名は、ピキアパストリス酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

（５）誘導発現と組換えコラーゲンの同定
工程（４）において、１．０ｍｇ／ｍＬと４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８をそれぞれ含むＹＰＤプレートに単一のコロニーを選別し、１０ｍＬのＢＭＧＹ培地を含む１００ｍＬの三角ボトルに入れ、２８～３０℃、２２０ｒｐｍでＯＤ_６００が２～６（１６～１８時間）になるまで培養した。室温で１５００～３０００ｇで５分間遠心し、菌体を集めて、ＯＤ_６００が２程度になるまで菌体をＢＭＭＹ培地に再懸濁し、２８～３０℃、２２０のｒｐｍのシェーカー上に置いて３日間増殖させ、２４時間ごとに培地に最終濃度が１．０％になるまで１００％のメタノールを添加した。各時点（２４時間以上、必要に応じて２４時間、４８時間、７２時間、９６時間でサンプリング）で菌液サンプルを採取し、サンプリング量は１ｍＬであり、１．５ｍＬのＥＰチュープに入れ、最大回転速度で２～３分間遠心して発現上清と菌体を収集した。菌体をガラス株（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）の破壊法により溶解し、溶解バッファー（１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４）、４℃、１２０００ｇで５分間遠心し、細胞内の溶解上清を採取し、８Ｍの尿素を加えて振とうして沈殿を溶解させ、標的タンパクの発現量と菌液の最佳採取時点を分析した。検出されるサンプルは、後で使用するために－８０℃で保存された。

採取した発現上清、細胞内溶解上清、細胞内沈殿溶解液に５×ローディングバッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ値は６．８であり、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、５％β－メルカプトエタノール）を加え、１００℃の金属浴に置いて１０分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行った。発現された標的タンパクは、アミノ末端にＳｒｔｅｐ－ＴａｇＩＩタグがあり、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓタグがあるため、抗Ｓｒｔｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ、抗６×Ｈｉｓ Ｔａｇの抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｃｏ．Ｌｔｄ．から購入）を使用してウエスタンブロット検出した。

組換え全長ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンα１鎖の発現と同定：
図４のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果図に示されるように、発現上清には予想される標的バンドが見られなかった（その見かけ分子量は約１８０ｋＤａである）。

抗６×Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体を使用してウエスタンブロット検出した結果、図５に示されるように、発現上清には非常に少ない量の分解標的タンパクしか検出されず（見かけ分子量は予想よりも小さく、約１２０ｋＤａである）、さらに長い間で誘導発現した後にのみ見られた。細胞内溶解上清には、分解された標的タンパクが多く（見かけ分子量は予想よりも小さい）、その見かけ分子量は約１２０ｋＤａである（ヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの細胞外ドメインの見かけ分子量とは一致）。細胞内沈殿溶解部でのみ、予想される見かけ分子量（１８０ｋＤａ）の標的タンパクが存在した。実験結果は、膜貫通型のコラーゲンとして、細胞内の膜系に固定されるべき、分解後にのみ細胞に脱落して溶解でき、発現上清で検出された分解した標的タンパク質は、長期間培養で死んでいた細胞が溶解された後で発現上清に放出された可能性があり、いずれの場合も、全長の組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンは、ピキア酵母胞外に効率的に分泌することができなかった。

１７０８０１、１７０８０２コラーゲンの発現と同定：
図６は、２４時間誘導した後、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンのエンジニアリングバクテリアの発現上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果であり、図６に示されるように、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンは、２４時間誘導発現しただけで細胞外の培養上清に効率的に分泌して発現され、１７０８０１の見かけ分子量は約３０ｋＤａであり、１７０８０２の見かけ分子量は約５２ｋＤａである。

図７は、２４時間誘導した後、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンのエンジニアリングバクテリアの発現上清のウエスタンブロット結果（Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ、抗体は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｌｔｄ．から購入、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体、カタログ番号はＤ１９９９８７である）であり、図８は、２４時間誘導した後、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンのエンジニアリングバクテリアの発現上清のウエスタンブロット結果（Ａｎｔｉ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩ、抗体は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ）Ｃｏ．Ｌｔｄ．から購入、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇポリクローナル抗体、カタログ番号はＡ００６２６）である。図７、及び図８の結果（ＥＣＬ化学発光着色、全自動化学発光画像解析システムＴａｎｏｎ ５２００による画像中のタンパク質分子質量標準の合成）に見られるように、アミノ末端にＳｒｔｅｐ－ＴａｇＩＩタグが検出され、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓタグが検出され得、標的バンドの大きさはＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける見かけ分子量と同じであり、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２は、高効率的に分泌されて発現されたことを示している。

切断誘導によって発現されたタンパクバンドを回収し、トリプシンによりそれを酵素分解して、Ｎａｎｏ－ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ質量分析により組換えコラーゲンのトリプシン酵素分解後のペプチドセクション（Ｓｕｚｈｏｕ Ｐｕｔａｉ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に依頼して完成させた）を検出し、検出されたペプチドセクションを配列アラインメントした（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース）。その結果、図９、図１０に示されるように、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンは、酵素分解されて検出されたペプチドセクションは、アミノ酸配列の選択及び設計中に選択されたヒトＸＶＩＩ型コラーゲン配列の関連領域に属し、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンは発現されたことを示している。

実施例２．遺伝子工学菌のパイロット発酵とタンパク精製
（１）パイロット発酵
構築されたｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０１、ｐＰＩＣ９Ｋ－１７０８０２をそれぞれ含むエンジニアリングバクテリアを５０Ｌ～５００Ｌのリンケージパイロット発酵に供して、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲンを含む発酵液を得て、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２の大規模な発現生産を実現した。

種子培地ＹＰＧ（処方は、酵母粉１０ｇ／Ｌ、酵母ペプトンＦＰ１０２ ２０ｇ／Ｌ、無水グリセロール１０ｇ／Ｌ）、発酵培地（処方は、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４ １９０．４ ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １０．０６ ｇ／Ｌ、ＣａＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏ １．１８ ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＳＯ_４ １８．２ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １４．９ ｇ／Ｌ、グリセロール４０ ｇ／Ｌ）、フィード培地（５０％Ｗ／Ｖグリセロール、1リットルあたり１２ｍＬのＰＴＭ_１微量元素を加え）、誘導培地（１００％メタノール、1リットルあたり１２ｍＬのＰＴＭ_１微量元素を加え）、ここで、ＰＴＭ_１は、０．２２μｍのフィルターメンブレンでろ過除菌し、４℃で保存した。発酵培地を高温で滅菌した後、温度が室温まで下がった時にＰＴＭ_１を加え、ｐＨ値をアンモニア水で５．０に調整した。

構築されたエンジニアリングバクテリア株のバッチ培養条件と誘導発現の条件は次の通りである。

バッチ流加培養法を採用し、培養温度を３０℃にした。構築されたエンジニアリングバクテリアは、種子培地ＹＰＧを入れた振とうフラスコに接種され、薬瓶の容量が２Ｌで、２２０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養し、１０％の接種量で発酵培地を含む種子発酵槽に接種し（接種後のＯＤ_６００が５になるように）、発酵槽の容量は５０Ｌであり、培養を拡大し、攪拌回転速度を２００ｒ／ｍｉｎ～６００ｒ／ｍｉｎに調整し、エアフラックスは２ＶＶＭであり、ＤＯは３０％以上であり、炭素源がなくなるまで培養し、発酵培地を含む発酵槽に移って発酵培養を開始し、発酵槽の容量は５００Ｌである。発酵培養の条件は、攪拌回転速度は１５０ｒ／ｍｉｎ～５００ｒ／ｍｉｎであり、タンク圧は０～０．０５ＭＰａであり、エアフラックスは１ＶＶＭであり、ＤＯは３０％以上であり、溶存酸素がリバウンドするとフィード培地を流加し、流加速率はＤＯを３０％以上に維持し、ＯＤ_６００が１９０～２１０になるまで増殖させ、フィードを停止した。溶存酸素がＤＯ７０％以上に跳ね返った後、誘導培地を流加して誘導発現し、ＤＯが３０％以上になるように回転速度、通気量、タンク圧、及び流加速度を調整する。誘導は４０～７２時間であり、ＵＶ測定によるタンパク濃度の増加が明らかでない又は低下する場合は、タンクに入れてもよい。

ＵＶタンパクの定量の式：Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝０．１４４＊（Ａ２１５－Ａ２２５）、Ａ２１５＜１．５。

構築されたエンジニアリングバクテリアを高密度のパイロット発酵させた結果、４８時間誘導した時に、菌の濃度（ＯＤ_６００）はいずれも２５０以上に達し、菌の湿重量は３００ｇ／Ｌ程度に達し、発酵液におけるタンパクの濃度はいずれも１０ｇ／Ｌ（ＵＶ定量）を超えたことが分かった。結果は、図１１、及び図１２、図１１に見られるように、１７１８０１のエンジニアリングバクテリアは、増殖が良好で、４８時間誘導した時に菌の濃度（ＯＤ_６００）が２７０に達し、菌の湿重量が３５５ｇ／Ｌに達し、発酵液におけるタンパクの濃度が１２ｇ／Ｌ（ＵＶで定量）に達し得る。図１２に見られるように、１７１８０２のエンジニアリングバクテリアは、増殖が良好で、４８時間誘導した時に菌の濃度（ＯＤ６００）が２５０に達し、菌の湿重量が２９３ｇ／Ｌに達し、発酵液におけるタンパクの濃度が１１ｇ／Ｌ（ＵＶで定量）に達し得る。

（２）精製
本実施例で使用されるバッファーは、次の通りである。
バッファーＡ：２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ値は４．０である。
バッファーＢ：２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ値は４．０である。
得られたエンジニアリングバクテリアの発酵液を収集し、セラミック膜分離システム（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｕｗｕ Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ＪＷＣＭＦ－９）を用いて菌体と発酵上清を分離した。Ａ２１５の吸光値と電導率値が変わらなくなるまで、カチオン交換媒体をバッファーＡで平衡化した（クロマトグラフィーパッキングは、Ｓｕｚｈｏｕ Ｎａｎｏｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製のＵｎｉＧｅｌ－８０ｓｐであり、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈａｎｂｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製の自動クロマトグラフィーシステムにロードされる）後で、サンプルローディングの流速は１００ｕｓ／ｃｍであり、サンプルローディングの容量は２０Ｌ／回であり、検出した紫外線Ａ２１５の吸光値が上がる時に、流出物を受け取り始めた。サンプルローディングが終わったら、サンプルの受け取りを閉じ、カチオンクロマトグラフィー媒体をバッファーＡで平衡化し、Ａ２１５の吸光値が低下した時に、紫外線と電気伝導が最小になるまでサンプルの受け取りを開き、サンプルの受け取りを停止した。５００ｍＭと１Ｍの塩化ナトリウムでそれぞれ溶出し、溶出液を収集し、５００ｍＭの溶出液と１Ｍの溶出液の画分における精製タンパクの状態をそれぞれ検出し、画分を決定した後、透析し（透析液は超純水である）、濃縮して冷凍結乾燥燥させ、凍結乾燥したコラーゲンスポンジを収集した。

１７０８０１、１７０８０２コラーゲンの凍結乾燥スポンジを超純水で２ｍｇ／ｍＬに溶解し、０．２２μｍのフィルターメンブレンでろ過し、１０μＬ（Ｓｅｐａｘ Ｂｉｏ－Ｃ１８カラム、高速液体クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ２６９５又はＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣ１２６０である）を注入し、精製されたコラーゲン１７０８０１、１７０８０２の純度を分析した。

精製の結果は、図１３、図１４に示し、図に見られるように、精製された１７０８０１、１７０８０２コラーゲンは、単一ピークが明らかで、純度が高く（９１．２％、９０％）、本精製法の信頼性と効果が高く、得られたコラーゲンの純度が高いことが分かった。

本実施例で使用した精製法に加えて、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンは、アミノ末端にＳｒｔｅｐ－ＴａｇＩＩタグがあり、カルボキシ末端に６×Ｈｉｓタグがあるため、Ｎｉ－ＮＴＡ、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎなどのアフィニティー媒体でシンプル又はダブルアフィニティー精製を行ってもよく、本実例と類似する効果を得ることもできる。

（３）組換えコラーゲンの特徴づけ
分子量の測定：
得られた１７０８０１、１７０８０２タンパクの理論的に予測された分子量は、それぞれ２３．８ｋＤａ、４５．４ｋＤａであり、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出された見かけ分子量は、理論的に予測された値よりも大きかった。組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２タンパクを精製して得られた凍結乾燥品をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＡＢ ＳＣＩＥＸ ５８００ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ）でその相対分子量を検出し、タンパクの実際分子量を判断し、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に依頼して検出された結果は、図１５、図１６に示されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（電荷数＋１）で検出された１７０８０１コラーゲンの分子量は２３８１１．６７９７Ｄａ（理論値は２３８００Ｄａ）であり、１７０８０２コラーゲンの分子量は４５６８９．５７８１Ｄａ（理論値は４５４００Ｄａ）であり、ピキア酵母での発現後の翻訳後修飾及び分子量実験的測定における系統的な誤差のために、実際に発現されたコラーゲンの分子量は理論値と一致している。

フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴ－ＩＲ）分析：
コラーゲン基の特徴的な吸収ピークは、赤外スペクトル分析により検出でき、試験では１７０８０１、１７０８０２コラーゲンを微量採取して精製されて得られた凍結乾燥サンプルは、ＫＢｒで粉末に研磨して錠剤化し、室温、４０００～４００ｃｍ^－１の範囲内の走査（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｉｃｏｌｅｔ^ＴＭ ｉＳ^ＴＭ １０ ＦＴ－ＩＲ分光計）、方法及び結果の分析は、Ｊｅｏｎｇ、Ｈ．、Ｊ．Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ ａｎｄ Ｓ． Ｋｉｍ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｎｅ ｆｉｓｈ （Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｂｅｓｕｓ）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１３． １８（６）： ｐ． １１８５－１１９１．を参照した。

１７０８０１、１７０８０２コラーゲンは、精製サンプルの赤外スペクトルスキャンの図１７から見られるように、アミドＡ、アミドＢ、アミドＩ、アミドＩＩ、アミドＩＩＩの波数は、全て組換えコラーゲンの構造特性に適している（文献［１］．陳静涛ら、組換えコラーゲンとウシ由来Ｉ型コラーゲン赤外スペクトル研究．材料導報、２００８（０３）：第１１９－１２１頁．［２］．Ｄｏｙｌｅ、Ｂ．Ｂ．、Ｅ．Ｇ．Ｂｅｎｄｉｔ ａｎｄ Ｅ．Ｒ． Ｂｌｏｕｔ、Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ‐ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９７５． １４（５）： ｐ． ９３７－９５７． ［３］．周愛梅ら、組換えヒト由来コラーゲンの分離精製及びその構造的特徴づけ．食品と発酵工業、２０１５（０３）： 第４６－５２頁．を参照）。

コラーゲン凍結乾燥スポンジサンプルの走査型電子顕微鏡走査分析：
走査型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ ＴＭ３０３０ＰＬＵＳ）を使用して１７０８０１、１７０８０２コラーゲン凍結乾燥スポンジサンプルの表面を走査した結果、図１８に示し、図に見られるように、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２は、いずれも明らかなラメラ構造を有し、人体でヒトＸＶＩＩ型コラーゲンの基底膜での層状分布と類似し、そのような構造は、生体医学材料の分野に適用できる可能性があることを示している。

実施例３．組換えコラーゲンの細胞接着活性の検出
組換えコラーゲンの細胞接着活性の検出方法は、文献Ｊｕｍｉｎｇ Ｙａｏ、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ、Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓａｋｕｒａ． Ｄｅｓｉｇｎ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ 、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ．１３６、６４３－６４９（２００４）を参照した。常州大学薬学部機能性ナノ材料と生体医学試験実験室に依頼して完成させた。

具体的な実施方法は、次の通りである。

ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（中国科学院のセルバンクから購入され、カタログ番号はＧＮＭ６で、培養、継代方法は細胞の説明書に従って実行された）を正常に培養した。１７０８０１、１７０８０２タンパクの精製凍結乾燥品、対照品としての天然ヒトコラーゲン（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｃ７７７４）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を採取して溶解し（超純水又は１ＭのＨＣｌ溶液）、ＵＶでタンパクの定量的経験式Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝０．１４４＊（Ａ２１５－Ａ２２５）を使用してタンパクの濃度を測定し、ＰＢＳ（ｐＨ値は７．４）で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェル細胞培養プレートに１００μＬの各タンパク溶液とブランクＰＢＳ溶液対照を加え、室温で６０分間静置し、良好な培養状態の３Ｔ３細胞を各ウェルに１０^５個接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で６０分間培養した。ウェル中の細胞をＰＢＳで４回洗浄した。ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ、０４７４４９２６００１）を使用してＯＤ４９２ｎｍの吸光度値（具体的な操作は説明書に従って実行させた）を検出した。

ＯＤ４９２ｎｍの吸光度では、吸光度の値が高いほど、タンパクが接着する細胞が多くなり、接着活性が高くなり、コラーゲンは、細胞が細胞壁又は細胞外マトリックスに短時間で接着するのを助け、より良い細胞外環境を構築するのに寄与するコラーゲンサンプルの細胞接着活性を対応的に特徴づけて得る。その結果は、図１９の結果に示されるように、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２は、市販の天然ヒトコラーゲンよりも優れた細胞接着活性を有する。

実施例４．スクラッチ法による組換えコラーゲン細胞遊走活性の検出
組換えコラーゲンの細胞遊走活性を検出及び分析するための方法は、文献Ｂｏｂａｄｉｌｌａ、Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｃｒａｔｃｈ ａｓｓａｙｓ． Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、２０１９． １６（１５１）： ｐ． ２０１８０７０９．を参照し、常州大学薬学部機能性ナノ材料と生体医学試験実験室に依頼して完成させた。

具体的な実施方法は、次の通りである。

１７０８０１、１７０８０２コラーゲンの精製凍結乾燥品、対照品としての天然ヒトコラーゲン（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｃ７７７４）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を溶解し（超純水又は１ＭのＨＣｌ溶液）、ＵＶでタンパクの定量的経験式：Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝０．１４４＊（Ａ２１５－Ａ２２５）を使用してタンパクの濃度を測定し、ＤＭＥＭ無血清培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１２８０００１７、ｐＨ ７．４）で０．５ｍｇ／ｍＬ（希釈した後、ｐＨ値を７．０～７．４で安定するように調節する）に希釈した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（中国科学院のセルバンクから購入、カタログ番号ＧＮＭ６、培養、継代方法は、細胞の説明書に従って実行された）を正常に培養、継代した。良好な状態の細胞を６ウェルプレートに接種し、各ウェルに２万個の細胞／ｍＬの密度で細胞懸濁液を２ｍＬ接種し、３６時間培養した。２００μＬのピペットチップによってスクラッチを作成し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、スクラッチされた細胞を除去した。ＤＭＥＭ無血清培地で希釈されたタンパク溶液をウェルに加え、引き続き３７℃、５％ＣＯ_２培養箱で培養し、０時間、２４時間、４８時間でサンプリングして写真を撮った。細胞遊走の写真をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアにより処理し、初期のスクラッチ面積と無細胞ブランク領域の面積データを取得し、遊走率＝（１－無細胞ブランク領域面積／初期スクラッチ面積）＊１００％で遊走率を算出した。

インビトロ細胞遊走実験は、インビボ細胞遊走のプロセスをある程度シミュレートし、細胞と細胞外マトリックス及びマトリックスの影響での細胞との間の相互役割を直接反映する。細胞遊走活性は、コラーゲンの生物学的活性をより効果的に特徴づける指標であり、遊走率が高く、速度が速いほど、コラーゲンの生物学的活性が良くなる。その結果、図２０に示されるように、異なる時で撮られた細胞遊走の実際の比較図（２つの黒い線内は、初期及び細胞遊走後のスクラッチ傷の領域であり）、及び図２１に示される算出した細胞遊走率（Ｉｍａｇｅ Ｊによって計算された無細胞ブランク領域）の比較によると、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２は、いずれも市販の天然ヒトコラーゲンよりも優れた細胞遊走活性を有することを示している。

実施例５．１７０８０１、１７０８０２組換えコラーゲンゲルの調製とウサギの耳の瘢痕モデルでの実験
ナトリウムカルボキシメチルセルロースを取り、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンの精製凍結乾燥品をそれぞれ取って超純水に溶解し、０．０１％の濃度のナトリウムカルボキシメチルセルロース、５％のコラーゲンを得て、０．０１％のナトリウムカルボキシメチルセルロースを５％のコラーゲンと均一に混合してコラーゲンゲルを調製し、コラーゲンが含まれないナトリウムカルボキシメチルセルロースゲルを陰性対照とした。

ニュージーランド白ウサギ（中国人民解放軍海軍軍医大学実験動物センターから購入）は、体重が２～３ｋｇである。ニュージーランド白ウサギは、２１℃の室温、１２時間の昼夜サイクル、シングルケージ、換気の良い部屋で飼育され、実験前に２週間飼育されて環境に適応させた。次に、実験動物は、耳静脈麻酔のために３０ｇ／Ｌのペントバルビタールナトリウム１．０ｍＬ／ｋｇ（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与されることにより、瘢痕モデルを構築した。麻酔を確定した後、皮膚をアルコールで３回擦り洗った。直径１ｃｍの皮膚生検装置を使用してウサギの耳の内側にきちんとした皮膚切開端を描き、眼のはさみで直径約１ｃｍの全層皮膚欠損創を切り出し、耳の軟骨の表面を露出させた。傷口を滅菌ワセリンガーゼで覆い、外側を滅菌ガーゼで覆い、包帯を巻いて固定した。２～３日ごとにヨードフォアで創傷を消毒および創面切除し、創傷被覆材を交換した。

２１日目に、創傷が治癒した後、創傷を各群に分け、それぞれ１７０８０１コラーゲンゲル、１７０８０２コラーゲンゲルを使用して創傷を塗り、ヨウ素含有抗菌手術用フィルム（Ｄｒａｐｅ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ（登録商標）、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）、自己接着性シリコーンフィルムドレッシング（Ｃｉｃａ－Ｃａｒｅ（登録商標）、Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して瘢痕介入治療をした。

デジタルカメラ及びダーモスコピーを使用して瘢痕介入実験の１～６週間の瘢痕の全体的な外観を記録し、６週目の麻酔後、耳の静脈に過飽和塩化カリウム溶液を注射して犠牲させ、耳の瘢痕のサンプルを採取し、固定液に浸し、ＨＥで染色し、マッソンで染色し、顕微鏡で観察して写真を撮った。具体的な方法は、［１］劉▲トン▼．組換えヒトコラーゲンヒドロゲルと人工真皮は、それぞれマイクロスキングラフトカバーとして全層皮膚欠損を修復する実験研究［Ｄ］．中国人民解放軍海軍軍医大学、２０１９．［２］李継承編集．組織学および発生学実験ガイド［Ｍ］．北京：人民衛生出版社、２０１８．０９．を参照してもよい。

実験結果を図２２に示し、１７０８０１、１７０８０２コラーゲンゲルによっては、ウサギ耳の皮膚の傷に対す治癒後の瘢痕が良く回復し、ウサギ耳の内側には明らかな新しい毛が成長し、生物学的機能を備えた明らかな毛包が形成されて毛が成長することを示し、組織スライスのマッソン染色、ＨＥ染色の結果によると、組織内のコラーゲン繊維が整然と配置され、真皮組織が形成され始め、特に新しい毛包構造の存在と明確な発毛（図の矢印で示された円内）は、効果的な真皮組織の回復と生物学的機能（毛の生成）を伴う毛包再生の明確な兆候であり、対照群では、予後の瘢痕は、瘢痕構造と同様に、依然として大量の規則的な緻密なコラーゲン沈着であり、毛包構造、真皮組織形成、及び回復した成長を伴うウサギの毛はない。実験結果は、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン１７０８０１、１７０８０２が組織修復及び毛包修復再生促進の優れた生物学的活性を有することを示している。

Claims (19)

1. コラーゲンのアミノ酸配列は、配列番号２又は配列番号３に示すアミノ酸配列から選択されることを特徴とする、組換えヒトＸＶＩＩ型コラーゲン。
2. 前記のコラーゲンのペプチド鎖のアミノ末端とカルボキシ末端は、タンパク質タグが付加されるように設計され、前記のアミノ末端は、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩタグが付加され、カルボキシ末端は６×Ｈｉｓ Ｔａｇタグが付加されることを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲン。
3. 前記のコラーゲンは、細胞接着活性、細胞遊走促進活性、組織再生促進、及び毛包修復再生促進の活性を有することを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲン。
4. 請求項１に記載のコラーゲンをコードするポリヌクレオチド。
5. 前記のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号６又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
6. 請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
7. 請求項６に記載の組換え発現ベクターを含むエンジニアリングバクテリア。
8. 前記のエンジニアリングバクテリアは、ピキア酵母であることを特徴とする、請求項７に記載のエンジニアリングバクテリア。
9. （１）エンジニアリングバクテリアの培養とスクリーニング：構築されたエンジニアリングバクテリアをスクリーニングした後、発現量の多いエンジニアリングバクテリアをスクリーニングすること、及び
   （２）大規模な高密度発酵、培養、及びタンパク質の精製：発酵槽を採用して発酵させ、発酵上清を精製し、高純度のコラーゲンを得ること
   が含まれることを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲンの調製方法。
10. 工程（１）に記載のスクリーニングされる発現量の多いエンジニアリングバクテリアは、ピキアパストリス酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０６２６又はＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２０６２７であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 請求項１に記載のコラーゲン又は請求項９に記載の方法で調製されたコラーゲンを含む組成物。
12. 請求項１に記載のコラーゲン又は請求項９に記載の方法で調製されたコラーゲン又は請求項１１に記載の組成物を含み、薬物、医療機器、生体材料、組織工学製品、化粧品又は保健品が含まれる製品。
13. 最終製品は、薬物、医療機器、生体材料、組織工学製品、化粧品又は保健品が含まれる、請求項１に記載のコラーゲン、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換え発現ベクター、請求項７に記載のエンジニアリングバクテリア又は請求項１１に記載の組成物の最終製品を調製ための使用。
14. 請求項１に記載のコラーゲン、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換え発現ベクター、請求項７に記載のエンジニアリングバクテリア又は請求項１１に記載の組成物の瘢痕治癒、組織修復を促進する又は毛包修復を促進する製品を調製するための使用。
15. 前記の製品は、外用薬であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
16. 前記の製品は、外用塗り薬であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
17. 前記の製品は、外用ゲル塗り薬であることを特徴とする、請求項１６に記載の用途。
18. 請求項６に記載の組換え発現ベクターを含む細胞。
19. 前記の細胞は、ピキア酵母であることを特徴とする、請求項１８に記載の細胞。

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