CN115154356B - 一组胶原蛋白组合在制备抗衰老产品中的应用以及包括其的外用化妆品 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一组胶原蛋白组合在制备抗衰老产品中的应用以及包括其的外用化妆品。本发明提供的胶原蛋白组合物包括III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白，所述III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的质量比为0.01:1、0.1:0.01或者1:1。申请人研究中意外地发现，特定类型的胶原蛋白以特定的比例复配使用可以发挥协同增效的作用，从而在较小的添加量的前提下发挥更好的抗衰老作用。实验结果表明，本申请提供的胶原蛋白组合物能够显著提高紫外诱导条件下，皮肤成纤维细胞中Collagen I的表达，从而用于制备抗衰老产品。
Description
技术领域
本发明属于日化用品技术领域，尤其涉及一组胶原蛋白组合在制备抗衰老产品中的应用以及包括其的外用化妆品。
背景技术
随着年龄增长，大多数人会出现皮肤衰老的情况，皮肤衰老的表现主要包括皮肤松弛、产生皱纹等现象。当然，除因年龄的增长自然衰老外，皮肤衰老还可能是受日光、机械作用、不良生活习惯、污染、过度美容等原因影响，加速衰老。衰老是一个机体内在的固有特征，同时又是一个不可逆的过程。衰老是生命发展的必然，衰老过程在整体、组织、细胞，乃至分子水平皆有所体现。随年龄增加，器官、组织的实质细胞数、反应敏感性及功能均逐步下降。
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25%～30%，某些生物体甚至高达80%以上。胶原蛋白对皮肤的重要性毋庸置疑，它对于皮肤，就像大楼中的钢筋架构，起到支撑的作用。现有市场上出现了很多包含胶原蛋白的抗衰老功能产品，但是，产品中胶原蛋白浓度低时，抗衰老作用不明显，浓度较高时，成本又较高。因此，如何获得成本低、抗衰老作用明显的产品是目前的研究方向之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胶原蛋白组合物在制备抗衰老制品中的应用及化妆品，本发明提供的胶原蛋白组合物具有协同增效的作用，以较低浓度使用时也具有良好的抗衰老效果。
本发明提供了一种胶原蛋白组合物在制备抗衰老制剂中的应用，所述胶原蛋白组合物包括III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白，所述III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的质量比为0.01:1、0.1:0.01或者1:1。
本发明人创造性的发现，将III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白复配使用后，尤其是在质量比为0.01:1、0.1:0.01或者1:1时，III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白能够显著增加皮肤成纤维细胞中Collagen I的表达，对皮肤成纤维细胞中Collagen I的表达的促进作用与同等质量的单剂具有显著性差异。
基于此，本发明还提供了胶原蛋白组合物在制备提高皮肤成纤维细胞中CollagenI表达的制剂中的应用，所述胶原蛋白组合物包括III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白，所述III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的质量比为0.01:1、0.1:0.01或者1:1。
在一些可能的实现方式中，所述III型胶原蛋白为重组III型胶原蛋白，在一个典型的实施例中，所述重组III型胶原蛋白具有如中国专利201911093124.8公开的氨基酸序列，例如实施例1公开的重组人源III型胶原蛋白的氨基酸序列。
在一些可能的实现方式中，所述XVII型胶原蛋白为重组XVII型胶原蛋白，在一个典型的实施例中，其具有如中国专利202110520499.9公开的氨基酸序列，例如实施例1公开的重组XVII型胶原蛋白的氨基酸序列。
申请人还发现，虽然I型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白复配并无协同作用，但是III型胶原蛋白、XVII型胶原蛋白和I型胶原蛋白三者复配可以具有协同作用，可以提高皮肤成纤维细胞中Collagen I表达，进而具有抗衰老作用。因此，在一些可能的实现方式中，所述胶原蛋白组合物还包括I型胶原蛋白。
在一个典型的实施例中，所述III型胶原蛋白、XVII型胶原蛋白和I型胶原蛋白的质量比为1:1:1。
在一些可能的实现方式中，所述I型胶原蛋白为重组I型胶原蛋白，在一个典型的实施例中，其具有如中国专利202111470250.8公开的氨基酸序列，例如实施例1公开的成熟形态人I型胶原蛋白氨基酸序列。
除此之外，本申请发明人还发现，I型胶原蛋白和III型胶原蛋白质量比为1:0.1的比例下复配使用可以具有协同作用，可以提高皮肤成纤维细胞中Collagen I表达，进而具有抗衰老作用，而在其他比例下复配使用，则不具有协同作用。
本发明提供的胶原蛋白组合物可以用于制备抗衰老产品，例如化妆品、保健品或药品等。
基于此，本申请还提供了一种抗衰老制剂，包括上述技术方案所述的胶原蛋白组合物。
在一些可能的实现方式中，所述抗衰老制剂为化妆品、保健品或药品等。此时，所述抗衰老制剂中包含相应的辅料。优选的，所述抗衰老制剂为化妆品，例如外用化妆品，包括但不限于乳液、膏霜、化妆水或精华液等。
在一些可能的实现方式中，所述胶原蛋白组合物在抗衰老制剂，尤其是化妆品中的质量百分数为0.01~2wt%。
申请人研究中意外地发现，特定类型的胶原蛋白以特定的比例复配使用可以发挥协同增效的作用，从而在较小的添加量的前提下发挥更好的抗衰老作用。实验结果表明，本申请提供的胶原蛋白组合物能够显著提高紫外诱导条件下，皮肤成纤维细胞中Collagen I的表达，从而用于制备抗衰老产品。
附图说明
图1为样品细胞活力曲线图；
图2为样品细胞形态学图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下各实施例中，I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、XVII型胶原蛋白为购自创健医疗企业的重组I型胶原蛋白海绵、重组III型胶原蛋白海绵、重组XVII型胶原蛋白海绵；
其中，重组I型胶原蛋白海绵具有如中国专利202111470250.8实施例1公开的成熟形态人I型胶原蛋白氨基酸序列；所述III型胶原蛋白为重组III型胶原蛋白具有如中国专利201911093124.8实施例1公开的重组人源III型胶原蛋白的氨基酸序列；重组XVII型胶原蛋白具有如中国专利202110520499.9实施例1公开的重组XVII型胶原蛋白的氨基酸序列。
实施例1~5
一种抗衰老制剂，所述抗衰老制剂包括胶原蛋白组合物和基质溶液；
其中，所述胶原蛋白组合物的组成及其在抗衰老制剂中的含量如表1所示：
表1 实施例中胶原蛋白组合物的组成及含量
| 组别 | I型胶原蛋白 | III型胶原蛋白 | XVII型胶原蛋白 |
| 实施例1 | / | 0.01% | 1.00% |
| 实施例2 | / | 0.10% | 0.01% |
| 实施例3 | / | 1.00% | 1.00% |
| 实施例4 | 1.00% | 0.10% | / |
| 实施例5 | 0.10%% | 0.10% | 0.10% |
所述基质溶液为低糖DMEM培养液（Gibco）。
试验例1
1.1 测试目的
本测试分为两部分，第一部分基于成纤维细胞，开展细胞毒性检测，确定样品在成纤维细胞上的安全给药浓度；第二部分采用 UVA辐照成纤维细胞后，检测 I型胶原（Collagen I）蛋白含量，评价待测样品的抗皱功效。
1.2 测试材料
1.2.1 测试系统
本测试所用细胞为成纤维细胞，批号：Fb20081902，由广东博溪生物科技有限公司提供。
1.2.2 主要试剂
低糖 DMEM培养液（博溪生物）、 PBS（索莱宝）、胎牛血清（ FBS，兰州荣晔）、 MTT（Sigma）、 DMSO（Sigma）、无水乙醇（国药）、 CollagenIELISA试剂盒（ Abcam）， TGF-β1（Peprotech）。
1.2.3 主要耗材
无菌96孔板（Corning）、无菌24孔板（Corning）、无菌6孔板（Corning）、 1.5mLEP管（洁特）。
1.2.4 主要设备
CO2培养箱（Thermo，150I）、超净工作台（苏净安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、倒置显微镜（Olympus，CKX41）、UVA照射仪（博溪生物）。
1.2.5 样品信息
表2 样品信息
| 样品名称 | 样品类别 | 规格 | 理化性质 | 溶解性 | 储存条件 |
| 玻色因 Pro-Xylane | 原料 | 5g | 透明啫喱 | 水溶 | 4℃ |
| 重组 III型胶原蛋白海绵 | 原料 | 2g | 白色固体 | 水溶 | 常温，密封保存 |
| 重组 XVII型胶原蛋白海绵 | 原料 | 2g | 白色固体 | 水溶 | 常温，密封保存 |
1.3 成纤维细胞毒性测试
1.3.1 测试方法
1）细胞接种：成纤维细胞按 8×103个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。
2）试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置 8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置 3个重复孔。
3）配液：按表3所示的测试浓度设定表配制不同浓度的样品工作液。
表3 测试浓度设定表
| 序号 | 样品组1 | 样品组2 | 样品组3 | 样品组4 | 样品组5 |
| III型胶原蛋白 | 1% | 1.2% | 1% | 2% | / |
| XVII型胶原蛋白 | 1% | 1% | 1.2% | / | 2% |
4）给药：待96孔板中细胞铺板率达到 40%~60%时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL低糖DMEM培养液；阳性对照组每孔加入 200μL含10%DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入 200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱（37℃、5%CO2）中培养 24h。
5）检测：细胞孵育培养 24h后，弃掉上清，加入MTT工作液（0.5mg/mL）， 37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μLDMSO，在490nm处读取OD值。
6）细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力（%）=（样品孔OD-凋零孔OD）/（溶剂对照孔OD-凋零孔OD）*100%。
1.3.2 测试结果
结果参见表4、图1和图2，表4为样品MTT检测结果，图1为样品细胞活力曲线图，图2为样品细胞形态学图。
表4 样品MTT检测结果
| 细胞活力 | 样品组1 | 样品组2 | 样品组3 | 样品组4 | 样品组5 | 阳性对照 | Control |
| Mean | 97.08% | 91.62% | 93.40% | 91.82% | 96.21% | 1.66% | 100.00% |
| SD | 2.58% | 3.18% | 4.89% | 1.25% | 5.24% | 0.18% | 3.56% |
| P-value | 0.313 | 0.038 | 0.132 | 0.020 | 0.358 | 0.000 | / |
其中，control为溶剂对照组。
由表4、图1和图2可知，Ⅲ型胶原蛋白海绵和XVII型胶原蛋白海绵基于成纤维细胞在其所选复配浓度范围内均未表现出明显的细胞毒性。
1.4 CollagenI测试
1.4.1 测试方法
1）细胞接种：按 4×104个/孔的接种密度接种成纤维细胞至 24孔板，培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。
2）配液：根据如表5所示的测试方案分别配制受试物工作液。
表5 测试方案
3）给药：根据表5所示的测试方案，待24孔板中细胞铺板率达到 40%~60%时，进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱（37℃、5%CO2）中培养 24h。
4）UVA辐照：根据试验分组，对需要 UVA照射的组别进行 30J/cm2的 UVA辐照，置于培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养 24h。
5）收样：培养 24h后，收集细胞培养上清液于 EP管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。
6） ELISA检测：根据 CollagenI ELISA试剂盒的操作说明书进行检测。
1.4.2 结果统计分析
应用 GraphPadPrism作图，结果表示为 Mean±SD。各组间比较采用 t-test统计分析。P<0.05认为具有显著差异， P<0.01认为具有极显著差异。
1.4.3 测试结果
结果参见表6，表6为CollagenI含量检测结果汇总表。
表6 CollagenI含量检测结果汇总表
备注：用 t-test方法进行统计分析时，P Value一列表示：与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。P1值一列表示与样品组4相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**；P2值一列表示与样品组5相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**；P3值一列表示与样品组6相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**；P4值一列表示与样品组7相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**；P5值一列表示与样品组8相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**；P6值一列表示与样品组9相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**；P7值一列表示与样品组10相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**；P8值一列表示与样品组11相比，显著性*表示，P1值＜0.05表示为*，P1值＜0.01表示为**。
由表5可知，样品组1以0.01%的III型胶原蛋白与1%的XVII型胶原蛋白复配，对于CollagenI含量的提升作用，与0.01%的III型胶原蛋白组、0.1%的III型胶原蛋白组和1%的XVII型胶原蛋白组均有显著差异，与2%的XVII型胶原蛋白组无显著性差异，因此，可以认为样品组1中III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的复配产生了协同增效；
样品组2以0.1%的III型胶原蛋白与0.01%的XVII型胶原蛋白复配，对于CollagenI含量的提升作用，与0.1%的III型胶原蛋白组、0.01%的XVII型胶原蛋白组相比均有显著差异，与1%的III型胶原蛋白组无显著性差异，因此，可以认为样品组2中III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的复配产生了协同增效；
样品组3以1%的III型胶原蛋白与1%的XVII型胶原蛋白复配，对于CollagenI含量的提升作用，与%的III型胶原蛋白组、1%的XVII型胶原蛋白组和2%XVII型胶原蛋白组均有显著差异，因此，可以认为样品组3中III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的复配产生了协同增效。
综上所述，III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白复配具有协同增效作用，在较少的用量下获得较好的促进作用。
试验例2
2.1 测试目的
本测试分为两部分，第一部分基于成纤维细胞，开展细胞毒性检测，确定样品在成纤维细胞上的安全给药浓度；第二部分采用 UVA辐照成纤维细胞后，检测 I型胶原（Collagen I）蛋白含量，评价待测样品的抗皱功效。
2.2 测试材料
2.2.1 测试系统
本测试所用细胞为成纤维细胞，批号：Fb19052002，由广东博溪生物科技有限公司提供。
2.2.2 主要试剂
低糖 DMEM培养液（博溪生物）、 PBS（博士德）、胎牛血清（ FBS，兰州荣晔）、 MTT（Sigma）、 DMSO（Sigma）、无水乙醇（国药）、 CollagenI ELISA试剂盒（ Abcam）， TGF-β1（Peprotech）。
2.2.3 主要耗材
无菌96孔板（Corning）、无菌24孔板（Corning）、无菌6孔板（Corning）、 1.5mLEP管（洁特）。
2.2.4 主要设备
CO2培养箱（Thermo，150I）、超净工作台（苏净安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、倒置显微镜（Olympus，CKX41）、UVA照射仪（博溪生物）。
2.2.5 样品信息
表7 样品信息
| 样品名称 | 样品类别 | 规格 | 理化性质 | 溶解性 | 储存条件 |
| 玻色因 Pro-Xylane | 原料 | 5g | 透明啫喱 | 水溶 | 4℃ |
| 重组I型胶原蛋白海绵 | 原料 | 2g | 白色固体 | 水溶 | 常温，密封保存 |
| 重组III型胶原蛋白海绵 | 原料 | 2g | 白色固体 | 水溶 | 常温，密封保存 |
| 重组XVII型胶原蛋白海绵 | 原料 | 2g | 白色固体 | 水溶 | 常温，密封保存 |
2.3 成纤维细胞毒性测试
2.3.1 测试方法
1）细胞接种：成纤维细胞按 8×103个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。
2）试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置 8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置 3个重复孔。
3）配液：按表8所示的测试浓度设定表配制不同浓度的样品工作液。
表8 测试浓度设定表
按照上述浓度分别将各样品组稀释1倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍、0.0625倍、0.0313倍、0.0156倍和0.0078倍，获得梯度浓度样品。
4）给药：待96孔板中细胞铺板率达到 40%~60%时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL低糖DMEM培养液；阳性对照组每孔加入 200μL含10%DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入 200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱（37℃、5%CO2）中培养 24h。
5）检测：细胞孵育培养 24h后，弃掉上清，加入MTT工作液（0.5mg/mL）， 37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μLDMSO，在490nm处读取OD值。
6）细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力（%）=（样品孔OD-凋零孔OD）/（溶剂对照孔OD-凋零孔OD）*100%。
3.3.2 测试结果
结果参见表9，表9为样品MTT检测结果。
表9 样品MTT检测结果
其中，control为溶剂对照组；
由表9可知，I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白海绵和XVII型胶原蛋白海绵基于成纤维细胞在其所选复配浓度范围内均未表现出明显的细胞毒性。
2.4 CollagenI测试
2.4.1 测试方法
1）细胞接种：按 4×104个/孔的接种密度接种成纤维细胞至 24孔板，培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。
2）配液：根据如表10所示的测试方案分别配制受试物工作液。
表10 测试方案
3）给药：根据表10所示的测试方案，待24孔板中细胞铺板率达到 40%~60%时，进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱（37℃、5%CO2）中培养 24h。
4）UVA辐照：根据试验分组，对需要 UVA照射的组别进行 30J/cm2的 UVA辐照，置于培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养 24h。
5）收样：培养24h后，收集细胞培养上清液于 EP管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。
6） ELISA检测：根据 CollagenI ELISA试剂盒的操作说明书进行检测。
2.4.2 结果统计分析
应用 GraphPadPrism作图，结果表示为 Mean±SD。各组间比较采用 t-test统计分析。 P<0.05认为具有显著差异， P<0.01认为具有极显著差异。
2.4.3 测试结果
结果参见表11，表11为CollagenI含量检测结果汇总表。
表11 CollagenI含量检测结果汇总表
备注：用 t-test方法进行统计分析时，P Value一列表示：与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
由表11可知，样品组9和样品组13对Collagen I的分泌有明显的提升作用，与各单剂相比，产生了协同作用；而其他样品组的复配虽然对Collagen I的分泌也有明显的提升作用，但是与各单剂相比，并未产生协同作用。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (7)
1.胶原蛋白组合物在制备抗衰老制剂中的应用，所述胶原蛋白组合物包括III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白，所述III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的质量比为0.01:1、0.1:0.01或者1:1；
所述III型胶原蛋白的质量百分数为0.01wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为1wt%；
或者所述III型胶原蛋白的质量百分数为0.1wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为0.01wt%；
或者所述III型胶原蛋白的质量百分数为1wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为1wt%。
2.胶原蛋白组合物在制备提高皮肤成纤维细胞中Collagen I表达的制剂中的应用，所述胶原蛋白组合物包括III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白，所述III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的质量比为0.01:1、0.1:0.01或者1:1；
所述III型胶原蛋白的质量百分数为0.01wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为1wt%；
或者所述III型胶原蛋白的质量百分数为0.1wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为0.01wt%；
或者所述III型胶原蛋白的质量百分数为1wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为1wt%。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，还包括I型胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述III型胶原蛋白、XVII型胶原蛋白和I型胶原蛋白的质量比为1:1:1
所述III型胶原蛋白的质量百分数为1wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为1wt%，I型胶原蛋白的质量百分数为1wt%。
5.一种抗衰老制剂，其特征在于，包括胶原蛋白组合物，所述蛋白胶原组合物包括III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白，所述III型胶原蛋白和XVII型胶原蛋白的质量比为0.01:1、0.1:0.01或者1:1；
所述III型胶原蛋白的质量百分数为0.01wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为1wt%；
或者所述III型胶原蛋白的质量百分数为0.1wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为0.01wt%；
或者所述III型胶原蛋白的质量百分数为1wt%，XVII型胶原蛋白的质量百分数为1wt%。
6.根据权利要求5所述的抗衰老制剂，其特征在于，还包括I型胶原蛋白。
7.根据权利要求5所述的抗衰老制剂，其特征在于，为化妆品。
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