CN114099366B - 一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。它包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；以质量百分比计，包括如下组分：细胞能量代谢酶：NADH水溶液：5％‑50％，ATP水溶液：1％‑10％；抗氧化自由基清除剂：水杨苷：0.1％‑1.5％，富勒烯水溶液：1％‑10％，三七皂苷：0.02％‑0.1％；皮肤天然保湿因子：氨基酸：0.1％‑1％，吡咯烷酮羧酸钠：0.5％‑3％，乳酸钠：0.5％‑2％，尿囊素：0.1％‑4％；余量为纯化水。促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液可应用于制备抗衰老美容产品中，应用后有效改善皮肤衰老状态，提高皮肤抗衰老能力。

Description

一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说，涉及一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤老化是机体衰老过程中最先出现衰老表征之一。皮肤老化是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤的屏障和防御功能，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。表现为皱纹、皮肤松弛、萎缩、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成，以及皮肤衰老相关疾病的发生。

一般来说，皮肤老化是皮肤细胞衰老的结果。细胞衰老在生理学上的表现为功能衰退与代谢低下，常常表现为：①细胞内水分减少，体积变小，新陈代谢速度减慢；②细胞周期停滞，细胞复制能力丧失，对促有丝分裂刺激的反应性减弱，对促凋亡因素的反应性改变；③细胞内酶活性中心被氧化，酶活性降低，蛋白质合成下降；④细胞内的色素会积累；⑤细胞内呼吸速度减慢，细胞核体积增大，核膜内折，染色质收缩，颜色加深.线粒体数量减少，体积增大；⑥细胞膜通透性功能改变，使物质运输功能降低。

迄今为止，已经提出许多组合物和方法用于预防或延缓皮肤衰老效应，然而，目前市面上的产品仍然无法全面满足人们的需求。目前市面上宣称具有皮肤抗衰老作用的产品很多，但是存在夸大宣称功效的问题，实际上很难达到明显的抗衰老作用，相反，添加过多的化学成分的产品会刺激皮肤，加速肌肤的衰老，达不到护肤的目的。甚至很多抗衰老化妆品有的为了达到很好的抗衰老效果使用了抗氧化性强的工业成分、短时见效快，但是长时间使用对人体危害极大；有的抗衰老化妆品添加维生素类抗氧化剂，但是这类抗氧化剂稳定性差。将有抗衰老功效的生物提取物制成稳定性好的成分添加到化妆品中，赋予产品良好的抗衰老功效，是抗衰老产品的一个趋势。

中国专利，申请号：CN202010930511.9，公开号：CN112043816A，公开了一种抗氧化、抗衰老组合物及其制剂和应用，其技术方案如下：

“本发明提供一种抗氧化、抗衰老组合物。本发明的另一目的是提供上述组合物在制备抗氧化、抗衰老的药品、护肤品或日化品中的应用。本发明的另一目的是提供一种由上述组合物制备的制剂。本发明的另一目的是提供一种包含上述组合物的护肤品。本发明的另一目的是提供一种包含上述组合物的护肤品。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：本发明提供了一种抗氧化、抗衰老组合物，该组合物由以下各组分组成：NADH水溶液、羊胎盘多肽、人参多糖、寡肽、辅酶Q10。本发明的抗氧化、抗衰老组合物，通过科学分析各抗氧化活性组分的协同配伍作用规律总结得到。其中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH水溶液)作为氧化还原过程中的必需辅酶和NAD+依赖性二磷酸腺苷(ADP)核糖基转移酶唯一能利用的物质，在生物氧化过程中起着传递氢的作用，能活化多酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，提高物质转运和调节控制，改善代谢。NADH水溶液成分明确、作用机制清晰、安全性高，具有“促营养物质和能量代谢+抗深度氧化损伤+调节免疫”的功能，有较高的临床应用价值。但是如上文所述，NADH水溶液价格昂贵，且分子量较大、生物利用度较低，本发明通过大量探索研究，得到与NADH水溶液复配使用能够明显提到NADH水溶液生物利用度、各组分协同发挥显著效果提升的组合物，即NADH水溶液辅以羊胎盘多肽、人参多糖、寡肽、辅酶Q10的组合。羊胎盘多肽广泛应用于医疗保健、食品、化妆品等领域，作为一种小分子抗氧化肽，其对超氧阴离子、羟自由基、DPPH、ABTS+具有良好的清除效果。人参多糖的结构和药理活性越来越多的被人们重视起来，已有研究报道人参多糖结构特征复杂，生物活性多样，能增强机体的免疫功能，可作为辅助药剂预防和治疗肿瘤，能明显抑制四氯化碳所致的肝损伤和降低血糖；同时还能够有效提高机体抗氧化酶类的含量，有助于提高机体防御自由基的能力，有助于清除自由基，增强机体抗氧化能力。寡肽为化学合成NADH水溶液能量合成调控活性肽，可以增强NADH水溶液生物学作用。辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，是人类生命不可缺少的重要元素之一，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上广泛用于心血管系统疾病的治疗。我们实验结果显示，本发明的组合物中，NADH水溶液复配以羊胎盘多肽、人参多糖、寡肽、辅酶Q10的组合后，NADH水溶液的生物利用度得到显著的提高，复配的组合物在对自由基的清除效果方面整体得到了显著的提升，各活性成分在抗氧化、抗衰老方面协同增效。优选地，本发明所述组合中各组分的质量份数为：NADH水溶液40～70份、羊胎盘多肽5～12份、人参多糖5～12份、寡肽8～20份、辅酶Q10 10～22份。进一步优选地，所述各组分的质量份数为：NADH水溶液40～60份、羊胎盘多肽8～10份、人参多糖8～10份、寡肽10～15份、辅酶Q10 15～20份。最为一种最优的实施例，所述各组分的质量份数为：NADH水溶液50份、羊胎盘多肽10份、人参多糖10份、寡肽10份、辅酶Q10 20份。本发明还请求保护上述组合物在制备抗氧化、抗衰老的药品、护肤品或日化品中的应用。本发明还请求保护由上述组合物制备的制剂，所述制剂为在所述抗氧化、抗衰老的组合物中加入药学上可以接受的辅料，制成不同的剂型。优选地，所述剂型为散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。优选地，所述寡肽包括寡肽-1、寡肽-3、寡肽-5、寡肽-6。本发明上述组合物中各组分药食同用，因此既可以用于食品中，也可以用于日化品中，内服外用皆可，达到在抗氧化、抗衰老方面标本兼治的目的。因此，本发明还请求保护一种包含上述组合物的抗氧化、抗衰老的护肤品，所述护肤品为在所述抗氧化、抗衰老的组合物中加入药学上可以接受的辅料制成。所述护肤品可以是口服液、胶囊、颗粒、片、软胶囊、颗粒、冲调粉等等。本发明的抗氧化、抗衰老组合物在施用频率和剂量方面没有严格的限制，一般情况下，本发明的抗氧化、抗衰老组合物可以每天一次或多次施用。作为一种优选方案，本发明的抗氧化、抗衰老组合物的服用量为每日100～5000mg，分一日1～2次服用。此外，本发明还请求保护一种包含上述组合物的抗氧化、抗衰老的护肤品，所述护肤品为在所述抗氧化、抗衰老的组合物中加入护肤品中可接受的基质制成。所述护肤品可以是面膜、眼霜、面霜、精华、乳液、洁面、爽肤水、防晒产品等等”。

但经分析，上述现有技术存在以下问题：经测试，应用于本申请的相关测试试验，其无法有效改善皮肤的衰老状态，其中寡肽、羊胎盘多肽等使用提高了整体的经济成本，同时，其采用单一的NADH水溶液，测试后，不能有效促进皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成；相反，在本申请中提供的无菌抗衰祛皱组合液，其核心为促进细胞能量代谢，为细胞的生命活动提供充足能量入手，保证细胞正常的生长、分化和以及保护细胞减少损伤，促进皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成，从而有效改善皮肤的衰老状态，提升皮肤的抗衰老能力。

发明内容

1、要解决的问题

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液及其制备方法和应用，从促进皮肤细胞能量代谢，增强细胞能量供给，为细胞的生命活动提供充足能量入手，保证细胞正常的生长、分化和以及保护细胞减少损伤，促进皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成，从而有效改善皮肤的衰老状态，提升皮肤的抗衰老能力。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 5％-50％，

ATP合酶水溶液 1％-10％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.1％-1.5％，

富勒烯水溶液 1％-10％，

三七皂苷 0.02％-0.1％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 15％-30％，

ATP合酶水溶液 5％-10％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.1％-1.5％，

富勒烯水溶液 4％-10％，

三七皂苷 0.02％-0.1％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液：

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 25％，

ATP合酶水溶液 8％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.8％，

富勒烯水溶液 8％，

三七皂苷 0.07％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的NADH水溶液的浓度为200ppm；

所述的ATP合酶水溶液的浓度为50ppm；

所述的富勒烯水溶液的浓度为200ppm。

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)取5～50份NADH水溶液和1～10份ATP合酶水溶液进行混合，搅拌均匀得细胞能量代谢酶液；

(2)向步骤(1)中的细胞能量代谢酶液中依次加入0.5～3份吡咯烷酮羧酸钠、0.5～2乳酸钠及0.1～1份氨基酸，边搅拌边加入，搅拌充分溶解，混合均匀后得细胞能量代谢保湿因子液；

(3)分别制备水杨苷溶液、三七皂苷溶液：

取0.1～1.5份水杨苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得水杨苷溶液；

取0.02～0.1份三七皂苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得三七皂苷溶液；

(4)分别将水杨苷溶液、三七皂苷溶液经0.45μm精滤膜过滤得精滤液，二者搅拌混合均匀得水杨苷三七皂苷精滤混合液；

(5)将1～10份200ppm富勒烯水溶液加入水杨苷三七皂苷精滤混合液中，边搅拌边加入，均匀得抗氧化自由基清除液；

(6)将步骤(5)制备的抗氧化自由基清除液加入步骤(2)制备的细胞能量代谢保湿因子液中，边搅拌边加入，混合均匀后再加入0.1～0.4份尿囊素，搅拌充分溶解；最后加纯化水定容至100份，得细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液；

(7)在100级洁净间中，将步骤(6)制备的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合粗液经0.22μm除菌过滤，封装，最终得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液。

一种所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液在制备抗衰老护肤品中应用。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱液，由细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子(NMF)三部分物质以及溶剂纯化水组成。基础研究实验表明本发明液在维持加强细胞能量代谢，为细胞的生命活动提供充足能量，保证细胞生长、分化，清除自由基减少自由基形成，保护细胞等方面起着重要作用。临床实验表明，本发明液用于皮肤可起到抗皮肤衰老，减轻皱纹、色素，紧致皮肤，改善皮肤色泽，嫩肤的作用。细胞能量代谢酶主要包括NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，ATP(三磷酸腺苷)合成酶。在细胞中，ATP为细胞各项生命活动提供能量供应。生成ATP的途径主要有两条：一条是植物体内含有叶绿体的细胞，在光合作用的光反应阶段生成ATP；另一条是所有活细胞都能通过细胞呼吸生成ATP。NADH主要在细胞中参与物质和能量代谢，产生于糖酵解和细胞呼吸作用中的柠檬酸循环，并作为生物氢的载体和电子供体，在线粒体内膜上通过氧化磷酸化过程，转移能量供给ATP合成，所以NADH又被称为线粒体素。理论上，1分子NADH释放的能量，可以合成3分子ATP。而ATP合成酶，则是利用呼吸链产生的质子的电化学势能，通过改变蛋白质的结构来进行ATP的合成。因此，NADH与ATP合酶组成的细胞能量代谢酶，在维持细胞能量代谢，为细胞的生命活动提供充足能量，保证细胞生长、分化和以及细胞保护方面起着重要作用。抗氧化自由基清除剂主要包括水杨苷、富勒烯(C60)、三七皂苷。氧自由基的累积是造成细胞损伤引起衰老的重要原因。水杨苷具有类阿司匹林属性，是一种有效的消炎成分，传统上用于愈合伤口、缓解肌肉疼痛。研究发现，水杨苷是一种氧化酶(NADH oxidase)的抑制剂，减少氧自由基的形成。具有抗衰老、去角质、祛痘的护肤功效。富勒烯(C60)是一种完全由碳组成的中空分子，形状呈球型、椭球型、柱型或管状。富勒烯能够亲和自由基，将自由基吸附到表面,当自由基的数量变成偶数后,自由基会相互结合淬灭,富勒烯回复最初状态,因此富勒烯具有清除自由基，抗氧化的作用。用于皮肤，具有抗皱，增加皮肤光泽度及弹性，减少色素沉着等功效。三七皂苷其主要成份为人参皂苷Rb1,人参皂苷Rg1,三七皂苷R1。通过细胞学,形态学与脂质过氧化损伤指标的检测观察三七总皂苷对模型细胞的保护作用，结果表明三七总皂苷能有效抑制脂质过氧化的产生，具有较强的自由基清除能力和抗氧化作用。皮肤天然保湿因子(NMF)是皮肤自身保湿成分，是低相对分子质量水溶性物质的复杂的混合物。这些混合物是来自角化细胞向上移动，通过堆积层和被酶破坏成为角蛋白和聚角蛋白微丝之间的链接的产物。包括氨基酸、吡咯烷酮羧酸钠、乳酸钠、尿囊素等。这些盐类吸收大气中的水分和溶解于它们水合作用的水中，因而对皮肤起到保湿剂的作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 5％，

ATP合酶水溶液 10％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.1％，

富勒烯水溶液 10％，

三七皂苷 0.02％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的NADH水溶液的浓度为200ppm；

所述的ATP合酶水溶液的浓度为50ppm；

所述的富勒烯水溶液的浓度为200ppm。

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)取5～50份NADH水溶液和1～10份ATP合酶水溶液进行混合，搅拌均匀得细胞能量代谢酶液；

(2)向步骤(1)中的细胞能量代谢酶液中依次加入0.5～3份吡咯烷酮羧酸钠、0.5～2乳酸钠及0.1～1份氨基酸，边搅拌边加入，搅拌充分溶解，混合均匀后得细胞能量代谢保湿因子液；

(3)分别制备水杨苷溶液、三七皂苷溶液：

取0.1～1.5份水杨苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得水杨苷溶液；

取0.02～0.1份三七皂苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得三七皂苷溶液；

(4)分别将水杨苷溶液、三七皂苷溶液经0.45μm精滤膜过滤得精滤液，二者搅拌混合均匀得水杨苷三七皂苷精滤混合液；

(5)将1～10份200ppm富勒烯水溶液加入水杨苷三七皂苷精滤混合液中，边搅拌边加入，均匀得抗氧化自由基清除液；

(6)将步骤(5)制备的抗氧化自由基清除液加入步骤(2)制备的细胞能量代谢保湿因子液中，边搅拌边加入，混合均匀后再加入0.1～0.4份尿囊素，搅拌充分溶解；最后加纯化水定容至100份，得细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液；

(7)在100级洁净间中，将步骤(6)制备的细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液经0.22μm除菌过滤，封装，最终得细胞能量-无菌抗衰祛皱组合液。

所述的含NADH水溶液+ATP水溶液合酶促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液在制备抗衰老护肤品中应用。

实施例2

本实施例的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 50％，

ATP合酶水溶液 1％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 1.5％，

富勒烯水溶液 1％，

三七皂苷 0.1％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的NADH水溶液的浓度为200ppm；

所述的ATP合酶水溶液的浓度为50ppm；

所述的富勒烯水溶液的浓度为200ppm。

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)取5～50份NADH水溶液和1～10份ATP合酶水溶液进行混合，搅拌均匀得细胞能量代谢酶液；

(2)向步骤(1)中的细胞能量代谢酶液中依次加入0.5～3份吡咯烷酮羧酸钠、0.5～2乳酸钠及0.1～1份氨基酸，边搅拌边加入，搅拌充分溶解，混合均匀后得细胞能量代谢保湿因子液；

(3)分别制备水杨苷溶液、三七皂苷溶液：

取0.1～1.5份水杨苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得水杨苷溶液；

取0.02～0.1份三七皂苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得三七皂苷溶液；

(4)分别将水杨苷溶液、三七皂苷溶液经0.45μm精滤膜过滤得精滤液，二者搅拌混合均匀得水杨苷三七皂苷精滤混合液；

(5)将1～10份200ppm富勒烯水溶液加入水杨苷三七皂苷精滤混合液中，边搅拌边加入，均匀得抗氧化自由基清除液；

(6)将步骤(5)制备的抗氧化自由基清除液加入步骤(2)制备的细胞能量代谢保湿因子液中，边搅拌边加入，混合均匀后再加入0.1～0.4份尿囊素，搅拌充分溶解；最后加纯化水定容至100份，得细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液；

(7)在100级洁净间中，将步骤(6)制备促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合粗液经0.22μm除菌过滤，封装，最终得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液。

所述的含NADH水溶液+ATP水溶液合酶促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液在制备抗衰老护肤品中应用。

实施例3

本实施例的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 15％，

ATP合酶水溶液 10％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.1％，

富勒烯水溶液 10％，

三七皂苷 0.02％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的NADH水溶液的浓度为200ppm；

所述的ATP水溶液的浓度为50ppm；

所述的富勒烯水溶液的浓度为200ppm。

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)取5～50份NADH水溶液和1～10份ATP合酶水溶液进行混合，搅拌均匀得细胞能量代谢酶液；

(2)向步骤(1)中的细胞能量代谢酶液中依次加入0.5～3份吡咯烷酮羧酸钠、0.5～2乳酸钠及0.1～1份氨基酸，边搅拌边加入，搅拌充分溶解，混合均匀后得细胞能量代谢保湿因子液；

(3)分别制备水杨苷溶液、三七皂苷溶液：

取0.1～1.5份水杨苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得水杨苷溶液；

取0.02～0.1份三七皂苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得三七皂苷溶液；

(4)分别将水杨苷溶液、三七皂苷溶液经0.45μm精滤膜过滤得精滤液，二者搅拌混合均匀得水杨苷三七皂苷精滤混合液；

(5)将1～10份200ppm富勒烯水溶液加入水杨苷三七皂苷精滤混合液中，边搅拌边加入，均匀得抗氧化自由基清除液；

(6)将步骤(5)制备的抗氧化自由基清除液加入步骤(2)制备的细胞能量代谢保湿因子液中，边搅拌边加入，混合均匀后再加入0.1～0.4份尿囊素，搅拌充分溶解；最后加纯化水定容至100份，得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合粗液；

(7)在100级洁净间中，将步骤(6)制备的细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液经0.22μm除菌过滤，封装，最终得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液。

所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液在制备抗衰老护肤品中应用。

实施例4

本实施例的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 30％，

ATP合酶水溶液 5％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 1.5％，

富勒烯水溶液 4％，

三七皂苷 0.1％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的NADH水溶液的浓度为200ppm；

所述的ATP合酶水溶液的浓度为50ppm；

所述的富勒烯水溶液的浓度为200ppm。

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)取5～50份NADH水溶液和1～10份ATP合酶水溶液进行混合，搅拌均匀得细胞能量代谢酶液；

(2)向步骤(1)中的细胞能量代谢酶液中依次加入0.5～3份吡咯烷酮羧酸钠、0.5～2乳酸钠及0.1～1份氨基酸，边搅拌边加入，搅拌充分溶解，混合均匀后得细胞能量代谢保湿因子液；

(3)分别制备水杨苷溶液、三七皂苷溶液：

取0.1～1.5份水杨苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得水杨苷溶液；

取0.02～0.1份三七皂苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得三七皂苷溶液；

(4)分别将水杨苷溶液、三七皂苷溶液经0.45μm精滤膜过滤得精滤液，二者搅拌混合均匀得水杨苷三七皂苷精滤混合液；

(5)将1～10份200ppm富勒烯水溶液加入水杨苷三七皂苷精滤混合液中，边搅拌边加入，均匀得抗氧化自由基清除液；

(6)将步骤(5)制备的抗氧化自由基清除液加入步骤(2)制备的细胞能量代谢保湿因子液中，边搅拌边加入，混合均匀后再加入0.1～0.4份尿囊素，搅拌充分溶解；最后加纯化水定容至100份，得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合粗液；

(7)在100级洁净间中，将步骤(6)制备的细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液经0.22μm除菌过滤，封装，最终得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液。

所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液在制备抗衰老护肤品中应用。

实施例5

本实施例的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 25％，

ATP合酶水溶液 8％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.8％，

富勒烯水溶液 8％，

三七皂苷 0.07％；

皮肤天然保湿因子：

上述所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，

所述的NADH水溶液的浓度为200ppm；

所述的ATP合酶水溶液的浓度为50ppm；

所述的富勒烯水溶液的浓度为200ppm。

上述所述的含NADH水溶液+ATP合酶水溶液促进细胞能量代谢的-无菌抗衰祛皱组合液，所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)取5～50份NADH水溶液和1～10份ATP合酶水溶液进行混合，搅拌均匀得细胞能量代谢酶液；

(2)向步骤(1)中的细胞能量代谢酶液中依次加入0.5～3份吡咯烷酮羧酸钠、0.5～2乳酸钠及0.1～1份氨基酸，边搅拌边加入，搅拌充分溶解，混合均匀后得细胞能量代谢保湿因子液；

(3)分别制备水杨苷溶液、三七皂苷溶液：

取0.1～1.5份水杨苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得水杨苷溶液；

取0.02～0.1份三七皂苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得三七皂苷溶液；

(4)分别将水杨苷溶液、三七皂苷溶液经0.45μm精滤膜过滤得精滤液，二者搅拌混合均匀得水杨苷三七皂苷精滤混合液；

(5)将1～10份200ppm富勒烯水溶液加入水杨苷三七皂苷精滤混合液中，边搅拌边加入，均匀得抗氧化自由基清除液；

(6)将步骤(5)制备的抗氧化自由基清除液加入步骤(2)制备的细胞能量代谢保湿因子液中，边搅拌边加入，混合均匀后再加入0.1～0.4份尿囊素，搅拌充分溶解；最后加纯化水定容至100份，得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合粗液；

(7)在100级洁净间中，将步骤(6)制备的细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液经0.22μm除菌过滤，封装，最终得促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液。

所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液在制备抗衰老护肤品中应用。

实施例6

以实施例5为例，

开展本发明无菌抗衰祛皱液(细胞能量无菌抗衰去皱液)的应用研究

(一)细胞能量无菌抗衰祛皱液对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响研究

摘要：目的：研究本发明细胞能量无菌抗衰祛皱液对人皮肤成纤维细胞(humanskin fibr oblast，HSFb)的增殖及胶原蛋白合成的影响。方法-原代培养人皮肤成纤维细胞，传代培养后加入不同浓度的本无菌发明液作用后，应用流式细胞仅检测细胞周期变化，应用碱水解法检测培养液中羟脯氨酸的含量变化，应用免疫组化法检测本发明液对成纤维细胞Ⅰ型前胶原合成的影响。结果-细胞周期时项分析结果显示：经含浓度为30％、50％、80％的细胞能量无菌抗衰祛皱培养液处理后的各组成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率较对照组显著降低(P<0.01)，而S+G2/M期细胞百分率较对照组显著增高(P<0.01)；随着细胞能量无菌抗衰祛皱液含量的从30％，50％增高到80％，成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率明显降低(P<0.01)，S+G2/M期细胞百分率明显增高(P<0.01)，具有明显的量效变化；浓度为30％、50％、80％的细胞能量无菌抗衰祛皱培养液处理后的各组成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率，在24、48、72小时均依次有明显的降低，具有明显的时效变化(P<0.01)；浓度为30％、50％、80％的细胞能量无菌抗衰祛皱组均使成纤维细胞细胞培养液中羟脯氨酸的含量发生明显改变，较空白对照组，均有显著差异性(P<0.01)；且羟脯氨酸含量增加呈明显的量效变化(P<0.01)。免疫组化实验结果：浓度为30％、50％、80％的细胞能量无菌抗衰祛皱组较空白组人成纤维细胞中Ⅰ型前胶原表达，均有显著升高，表达测值有显著差异(P<0.01)；且Ⅰ型前胶原表达随浓度增加表达测值显著升高，具有明显的量效关系(P<0.01)。结论：细胞能量无菌抗衰去皱液能有效促进人皮肤成纤维细胞的增殖和胶原的合成。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

细胞能量无菌抗衰祛皱组合液，DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料所)，羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，羊抗人I型前胶原多克隆抗体(Santa Cruz公司)，SP-9003免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，DU-800型紫外分光光度计(美国Beckman公司)，流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养取汉族人小儿包皮环切术后皮肤，采用胶原酶消化法原代培养人皮肤成纤维细胞。待原代培养细胞生长达到90％融合后用0.25％胰蛋白酶按1:3比例传代。本实验选取第4～8代培养生长状态良好处于对数生长期的细胞用于研究。

1.2.2药物配制

取细胞能量无菌抗衰祛皱液，用含10％胎牛血清的DMEM培养液稀释浓度至30％、50％、80％。根据预实验结果所定，待后续实验使用。

1.2.3流式细胞仪测定细胞周期的变化

0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，以2x105/5mL接种于25mL的培养瓶，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液培养24h后，设空白对照组和实验组，空白对照组换液，实验组吸弃原培养液，分别加人浓度为30％、50％、80％的细胞能量无菌抗衰祛皱培养液3～4mL，每一浓度重复3瓶。继续培养24、48、72h后用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，1000r/min离心5min.弃上清液，加入PBS 2mL重悬，1000r/min离心5min，弃上清液；加人75％乙醇(4℃预冷)lmL重悬，4℃固定24h；1 000r/min离心5min后去固定液，PBS 2mL重悬，1 000r/min离心5min去PBS；采用碘化丙啶(P1)染液，4℃避光染色30min后上样，每个样本检测15 000个细胞，流式细胞仪检测成纤维细胞在细胞周期各时相所占的百分比。用Cell Quest软件获取细胞图像，Mod Fit LT forMac V3.0软件分析细胞后期分布，根据细胞周期计算细胎增殖指数(proliferative index，PI)，计算公式:P1(％)＝(S+G2M)/(G1+S+G2M)×100％。

1.2.4样本碱水解法测定培养液中羟脯氨酸的含量变化

0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，以每孔1x105/mL接种于6孔培养板中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液培养24h后，设空白对照组和实验组，空白对照组换液，实验组吸弃原培养液，分别加入含30％、50％、80％浓度的细胞能量无菌抗衰祛皱培养液1～2mL，每个浓度做3个复孔。继续培养24、48、72h。分别取培养上清液0.5mL严格按照试剂盒操作说明书测定上清液中羟脯氨酸在550nm处的吸光值(A值)，并根据公式计算羟脯氨酸含量，间接反应成纤维细胞胶原含量。计算公式:羟脯氨酸含量(pg/mL)＝[(测定管吸光度一空白管吸光度)/(标准管吸光度一空白管吸光度)]×标准管含量×水解液总体积(mL)/取样量(mL)。

1.2.5免疫组化

0.25％胰蛋白酶消化收集生长状态良好的细胞悬液，接种于12孔培养板中的盖玻片上，待细胞完全贴壁后更换为含30％、50％、80％细胞能量无菌抗衰祛皱培养液，继续培养48h，取出盖玻片，4％多聚甲醛固定。严格按照SP试剂盒操作:3％过氧化氢液阻断内源性过氧化酶；封闭液封闭非特异性抗原；抗I型前胶原多克隆抗体(1:200)37℃孵育3h；加生物素标记的二抗37C孵育1h:加标记过氧化酶的链霉亲和素孵育40min加DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。结果判定标准为阳性细胞胞浆内显棕褐色颗粒。

1.3统计方法

计量资料采用了xˉ±s描述，连续性资料采用t检验，多个均数间的比较采用多因素方差分析，检验水准以P<0.01为差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞能量-无菌抗衰祛皱液对成纤维细胞周期的影响

表1

/>

如表1所示：

2.1.1量效变化

经含浓度为30％、50％、80％的细胞能量-无菌抗衰祛皱培养液处理后的各组成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率较对照组显著降低(P<0.01)，而S+G2/M期细胞百分率较对照组显著增高(P<0.01)。

随着细胞能量-无菌抗衰祛皱液含量的从30％，50％增高到80％，成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率明显降低(P<0.01)，具有明显的量效变化，具有统计学意义；S+G2/M期细胞百分率明显增高，具有明显的量效变化，具有统计学意义(P<0.01)。

2.1.2时效变化

浓度为30％、50％、80％的细胞能量-无菌抗衰祛皱培养液处理后的各组成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率，在24、48、72小时均依次有明显的降低，具有明显的时效变化，具有统计学意义(P<0.01)。

2.2细胞能量-无菌抗衰祛皱液对成纤维细胞细胞培养液中羟脯氨酸的含量的影响

表2

如表2所示：

根据以上结果进行统计分析得出：

浓度为30％、50％、80％的细胞能量-无菌抗衰祛皱组均使成纤维细胞细胞培养液中羟脯氨酸的含量发生明显改变，较空白对照组，均有显著差异性(P<0.01)；

细胞能量-无菌抗衰祛皱浓度的增加，使成纤维细胞细胞培养液中羟脯氨酸的含量发生明显改变，含量增加呈明显的量效变化，具有统计学意义(P<0.01)；

2.2.2时效变化

30％、50％、80％的细胞能量-无菌抗衰祛皱各组，随着时间的延长，在24小时、48小时、72小时，使成纤维细胞细胞培养液中羟脯氨酸的含量发生明显改变，含量增加呈明显的量效变化，差异具有统计学意义(P<0.01)；

2.3免疫组化结果

2.3.1细胞能量-无菌抗衰祛皱液对人成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达分析结果

将0％、50％、80％的细胞能量-无菌抗衰祛皱各组与对照组人成纤维细胞中I型前胶原表达结果分别随机观察5个100倍视野，采用ImagePro Plus 5.1图像分析软件采集相关数据，I型前胶原表达强度以累积光密度值代表(integrated optical density,IOD),应用SPSS13.0统计学软件进行t检验，结果见表3。

表3

组别	I型前胶原IOD值
		空白对照组	31.3346±0.4476
30％细胞能量-无菌抗衰祛皱液组	41.8726±0.3324
		50％细胞能量-无菌抗衰祛皱液组	45.7769±0.2627
80％细胞能量-无菌抗衰祛皱液组	47.6636±0.2913

2.3.2结果分析

各浓度实验组与空白对照组均可见人成纤维细胞中Ⅰ型前胶原表达；

浓度为30％、50％、80％的细胞能量-无菌抗衰祛皱组较空白组人成纤维细胞中Ⅰ型前胶原表达，均有显著升高，表达测值有显著差异(P<0.01)；

细胞能量-无菌抗衰祛皱液人成纤维细胞中Ⅰ型前胶原表达，随浓度增加表达测值显著升高。具有明显的量效关系，具有统计学差异(P<0.01)。

3讨论

成纤维细胞是真皮组织的主要效应细胞，能产生胶原、纤维粘连蛋自等多种细胞外基质，成纤维细胞及其所产生的细胞外基质、基质所保持的水分是维持皮肤弹性的物质基础，大景研究证明，成纤维细胞生物学特性改变在皱纹形成过程申发挥着重要的作用，其中成纤维细胞增殖能力降低及胶原蛋白合成的降低是其最为重要的生物学特性改变之一，通过改善成纤维细胞生物学特性可以延缓皮肤衰老和皱纹的形成。

细胞周期的分布可以直观地反映细胞群体的增殖状况，应用流式细胞仪定量分析细胞周期的分布能快速、准确地研究任何类型细胞的周期分布规律。本实验研究结果显示，经细胞能量-无菌抗衰祛皱液作用后的人皮成纤维细胞的G0/G1期细胞所占百分率下降，S+G2/M期细胞所占百分率及PI值显著增高，推测其可能作用机制是通过增强对细胞的能量供给，促使静止态的G./G:期细胞活跃而向S+G/M期转变，使DNA管成量增加从而促进细胞的增殖。

羟脯氨酸是胶原蛋白中一种重要且含量稳定(占13.4％)的氨基酸，在弹力蛋白中含量甚微，在其他蛋白中均不存在，因此测定其含量是检测胶原蛋自合成能力的可靠办法。本实验发现，细胞能量-无菌抗衰祛皱液能显著增加培养液中羟脯氨酸含量且在作用后72h达最高水平。皮肤胶原蛋白主要包括Ⅰ型胶原蛋白(85％～90％)I型胶原蛋白(10％～15％)及其他类型的胶原蛋自，主要分布在皮肤真皮层由真皮内成纤维细胞合成。前胶原是成熟胶原的前体分子，检测它的水平可以反应胶原的生物合成活性，本实验研究显示，经细胞能量-无菌抗衰祛皱液作用后成纤维细胞I型前胶原表达也显著增加。

本实验以体外培养的人皮肤成纤维细胞为研究对象，对细胞能量-无菌抗衰祛皱液的生物活性进行研究，以探讨其抗皮肤衰老的理论基础。综合上述的研究结果显示，细胞能量-无菌抗衰祛皱液能有效促进人皮成纤维细胞增殖及胶原的合成，并由此推测细胞能量-无菌抗衰祛皱液可能通过促进成纤维细胞增殖及胶原合成延缓皮肤衰老及皱纹的形成。

(二)细胞能量无菌抗衰祛皱液自由基清除实验

摘要：目的研究本发明细胞能量无菌抗衰祛皱液的抗氧化性，即对自由基的清除能力。方法我们采用分光光度法，对本发明细胞能量无菌抗衰祛皱液分别进行对DPPH自由基、超氧阴离子自由基(O2·-)、羟基自由基(·OH)的清除试验。结果细胞能量无菌抗衰祛皱液相对于VC，有更显著清除自由基能力。结论细胞能量无菌抗衰祛皱液能显著清除自由基，减少自由基形成，可作为一种功效性抗衰祛皱护肤原液。

自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系(O2-·)、羟基自由基体系(·OH)、二苯代苦味酰基自由基体系(DPPH)对抗氧化剂的体外清除自由基能力进行研究。

本实验中，细胞能量无菌抗衰祛皱液实验样品为原液；对照品采用0.4mg/mL浓度的VC溶液。

1、对DPPH自由基的清除实验

1.1实验方法

精密称取12.5mg·DPPH标准品，用无水乙醇溶解并定容至250ml。分别精密量取0.2m l、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml体积的本发明样品溶液和对照品VC溶液，加去氧水补足1.00ml，分别加入5.00mL·DPPH溶液(方法如下表1)，充分混合，静置30min，于517nm处测吸光度值As，5.00mL·DPPH溶液与1.0mL无水乙醇混合后测得的吸光度A0，5.00mL无水乙醇与1.00mL样品溶液混合后测得的吸光度Ab。每个样品平行测定3次，按下式计算清除率：

清除率(％)＝[A0－(As－Ab)]/A0×100％。

表4

1.2实验结果与分析

1.2.1实验结果：对DPPH自由基的清除率

表5

1.2.2结果分析

DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基。若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链式反应的作用。在·DPPH的反应体系中，各体积(对应浓度)发明液样品和对照品VC溶液样品对·DPPH的清除能力如表2所示。

可以看出，发明液样品和对照品VC溶液样品在有效浓度范围内(VC浓度0.4mg/mL内)对·DPPH的清除能力呈良好的量效关系，随着质量浓度增加，清除率也逐渐增强。

并且发明液样品对·DPPH的清除能力明显高于对照品VC溶液。

2、对超氧阴离子自由基(·O2-)的清除试验

2.1实验方法：采用邻苯三酚自氧化法。

具体操作如下表3：取4.50mL0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液(PH8.2)于具塞试管中，于25℃恒温20min，分别加入0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml体积的本发明样品溶液和对照品VC溶液，去氧水补足，再加入0.40mL50.0mmol/L邻苯三酚，混匀后于25℃恒温反应4min，立即加入0.10mL8.0mol/L HCl终止反应。以蒸馏水做参比，在320nm处测定吸光度值。每个样品平均测定3次，按下式计算清除率。

清除率(％)＝[1-(A样品-A样品空白)/A空白]×100％

式中：A空白——加邻苯三酚但不加样品的吸光度；A样品——加邻苯三酚和样品的吸光度；A样品空白——不加邻苯三酚只加样品的吸光度。

表6

2.2实验结果与分析

2.2.1实验结果：对超氧阴离子自由基(·O2-)的清除率

表7

2.2.2结果分析

·O2-自由基是机体内寿命最长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基。O2-自由基可从其生成位置扩散到较远距离，达到靶位置，具有较大的危害性。因此，对O2·-自由基的清除，可以有效地减少氧自由基的生成量。

表4结果表明，对照品VC在其0.4mg/mL浓度范围内，和本发明液样品均具有一定的清除超氧阴离子自由基O2-活性，且随着样品浓度的增加，对O2·-的清除率呈上升趋势。

同时，本发明液样品对超氧阴离子自由基的清除能力极其显著强于0.4mg/mL浓度VC。20％浓度本发明液样品几乎与0.4mg/mL浓度VC的对超氧阴离子自由基的清除能力相当。

3.对羟基自由基(·OH)的清除试验

3.1实验方法

利用H2O2与Fe²⁺反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收。在250mL具塞锥形瓶中依次移入25.00mL7.5mmol/L FeS04溶液和25.00mL4％H2O2溶液，混合均匀后加入25.00mL6mmol/L水杨酸溶液，于36～37℃恒温水浴中反应15min后于510nm处测其吸光度，此值记为A0。将A0值的测定体系分成6份，放入25mL具塞管中，每份5.00mL，依次加入0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml体积的本发明样品溶液和对照品VC溶液，去氧水补足，于36～37℃恒温水浴中反应15min，于510nm处测其吸光度，此值记为Ax。具体方法见下表.

每个样品平行测定3次，计算清除率。清除率(％)＝(A0－Ax)/A0×100％。

表8

3.2实验结果与分析

3.2.1实验结果：对羟基自由基(·OH)的清除率

表9

3.2.2结果分析

·OH是活性氧中最活泼的氧自由基，它几乎能与活细胞中任何分子发生反应，可介导机体组织脂质过氧化，蛋白质解聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老。减少此类自由基，可预防衰老、心血管疾病，并具有防癌、抗癌的作用。

表6结果表明，对照品VC和本发明液样品都具有强大的对羟基自由基清除能力。VC在其0.4mg/mL浓度范围内，和本发明液样品对羟基自由基的清除都呈量效关系。

4、总结

通过对本发明细胞能量无菌抗衰祛皱液对DPPH自由基、超氧阴离子自由基

(·O2-)、羟基自由基(·OH)的清除试验，结果表明：

·本发明液有显著优于VC的清除自由基抗氧化能力；

·20％本发明液即可产生比较显著的清除自由基抗氧化能力；

·本发明液含量越高，清除自由基抗氧化能力越强。

(三)细胞能量-无菌抗衰祛皱液抗衰祛皱液的人体试验

摘要：目的探索本发明细胞能量无菌抗衰祛皱液对人面部的抗衰祛皱功效。方法征集30名自愿者，每日早、晚面部涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液8周，在使用4周及8周分别进行皮肤改善观察，采用直接评价法，对志愿者额头、眼角及其他测试区域皮肤进行直接目测分级，对皮肤形态进行分析评价。结果连续涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液4周后，在肤色、细腻度、紧致度、皱纹长度减少、皱纹深度变浅几方面都有改善；63.7％有皱纹减少。连续涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液8周后，皮肤持续改善，皱纹数量减少有效率达到100％。结论细胞能量无菌抗衰祛皱液是一种优异的抗衰祛皱功效性护肤原液。

1、试验目的：探索本发明细胞能量无菌抗衰祛皱液对人面部的抗衰祛皱功效。

2、自愿者征集：

2.1自愿者人数：30名，男、女各15名；

2.2征集条件：

2.2.1年龄30～45岁；

2.2.2无过敏、皮炎等皮肤问题；

2.2.3皮肤性质如干性、油性、中性等不限。

2.2.4皱纹严重程度为II、III、IV级者。

II级为中度皱纹，在面部表情静止时隐约可见，而在面部作表情运动明显可见；III级为重度皱纹，在面部表情静止时皱纹就明显可见，但在用力伸展皱纹时可见皱纹明显减轻；IV级为严重皱纹，即使加力伸展皱纹，皱纹仍然清晰可见。

3、试验方法

3.1将所有受试者统一编为一组；

3.2每日早、晚面部涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液，连续8周；

3.3在使用前、使用完4周及使用完8周分别进行皮肤状态观察，采用直接评价法，对志愿者面部皮肤进行直接目测分级，对受试皮肤形态进行分析评价。

4、评价标准及方法

4.1评价项目及标准

4.1.1项目

表10

4.1.2评价标准

明显改善：目测很容易发现。

有改善：通过拍照放大对比或者仔细目测可以看到改善，或者通过触摸可以感觉到改善。

无改善：通过拍照放大对比或者仔细目测均看不到改善，或者通过触摸也感觉不到改善。

*皱纹数量减少：减少1条以上，试验部位总皱纹数量减少20％以下为有效改善，减少20％以上为明显改善。

5、试验结果及分析

5.1试验结果

表11

5.2结果分析：

5.2.1使用4周后

肤色均改善，其中显效30％；细腻度均改善，其中显效60％；紧致度改善率83.3％，其中20％显效；

皱纹长度、深度均有改善：其中显效者分别达到16.7％，13.3％；

皱纹数量减少，涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液有改善，无显著改善者。

5.2.2使用8周后

肤色、细腻度改善，显著改善均达到100％；

紧致度明显改善率上升到76.7％；

皱纹长度、深度明显改善率大幅上升到80％，76.7％；

皱纹数量减少有效率达到100％，其中明显改善率达到70％

6结论

6.1连续涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液4周后，在肤色、细腻度、紧致度、皱纹长度减少、皱纹深度变浅几方面都有改善；63.7％有皱纹减少。

6.2连续涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液8周后，皮肤持续改善，皱纹数量减少有效率达到100％。

6.3结果表明，连续涂抹细胞能量无菌抗衰祛皱液4周后，皮肤出现年轻化表现，继续使用，皮肤年轻化现象进一步显著。细胞能量无菌抗衰祛皱液用于护肤，是一种优异的功效性抗衰祛皱液。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，其特征在于：

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 5％-50％，

ATP合酶水溶液 1％-10％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.1％-1.5％，

C60富勒烯水溶液 1％-10％，

三七皂苷 0.02％-0.1％；

皮肤天然保湿因子：

余量为纯化水；

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

2.根据权利要求1所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，其特征在于：

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 15％-30％，

ATP合酶水溶液 5％-10％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.1％-1.5％，

C60富勒烯水溶液 4％-10％，

三七皂苷 0.02％-0.1％；

皮肤天然保湿因子：

余量为纯化水；

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

3.根据权利要求2所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，其特征在于：

包括细胞能量代谢酶、抗氧化自由基清除剂、皮肤天然保湿因子及纯化水；

以质量百分比计，包括如下组分：

细胞能量代谢酶：

NADH水溶液 25％，

ATP合酶水溶液 8％；

抗氧化自由基清除剂：

水杨苷 0.8％，

C60富勒烯水溶液 8％，

三七皂苷 0.07％；

皮肤天然保湿因子：

余量为纯化水。

所述的富勒烯水溶液中富勒烯为C60。

4.根据权利要求1所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液，其特征在于：

所述的NADH水溶液的浓度为200ppm；

所述的ATP合酶水溶液的浓度为50ppm；

所述的C60富勒烯水溶液的浓度为200ppm。

5.如权利要求1所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)取5～50份NADH水溶液和1～10份ATP合酶水溶液进行混合，搅拌均匀得细胞能量代谢酶液；

(2)向步骤(1)中的细胞能量代谢酶液中依次加入0.5～3份吡咯烷酮羧酸钠、0.5～2乳酸钠及0.1～1份氨基酸，边搅拌边加入，搅拌充分溶解，混合均匀后得细胞能量代谢保湿因子液；

(3)分别制备水杨苷溶液、三七皂苷溶液：

取0.1～1.5份水杨苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得水杨苷溶液；

取0.02～0.1份三七皂苷溶于10份纯化水中，搅拌溶解均匀得三七皂苷溶液；

(4)分别将水杨苷溶液、三七皂苷溶液经0.45μm精滤膜过滤得精滤液，二者搅拌混合均匀得水杨苷三七皂苷精滤混合液；

(5)将1～10份200ppmC60富勒烯水溶液加入水杨苷三七皂苷精滤混合液中，边搅拌边加入，均匀得抗氧化自由基清除液；

(6)将步骤(5)制备的抗氧化自由基清除液加入步骤(2)制备的细胞能量代谢保湿因子液中，边搅拌边加入，混合均匀后再加入0.1～0.4份尿囊素，搅拌充分溶解；最后加纯化水定容至100份，得细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液；

(7)在100级洁净间中，将步骤(6)制备的细胞能量-无菌抗衰祛皱组合粗液经0.22μm除菌过滤，封装，最终得细胞能量-无菌抗衰祛皱组合液。

6.如权利要求1-4任意一项所述的促进细胞能量代谢的无菌抗衰祛皱组合液在皮肤抗衰祛皱的应用。