CN116492280A - 白细胞提取物的制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用、牙科用或化妆用的配制品领域，具体涉及一种白细胞提取物的制备方法及其在化妆品中的应用。所述白细胞提取物使用在化妆品中时，包括组分甘油、透明质酸钠、角鲨烷、山嵛醇、花生醇葡糖苷、二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚、白细胞提取物。此配方中具有角鲨烷、山嵛醇、花生醇葡糖苷、二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚(维生素E)、卡波姆、黄原胶、白细胞提取物等多种原料；其中角鲨烷、山嵛醇具有锁住肌肤内部水分、抗皱嫩肤、增强肌肤屏障，使肌肤更稳定的有益效果；而二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚及白细胞提取物，具有加快皮肤细胞新陈代谢、加速肌肤的修复，促进胶原蛋白再生的有益效果。
Description
技术领域
本发明属于医用、牙科用或化妆用的配制品领域，具体涉及一种白细胞提取物的制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术
白细胞是人体内一类细胞的总称，其中包含粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。它们在体内主要参与免疫防御的功能。其中单核细胞在体内被活化后能生产并释放多种细胞因子，如干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素等，对其他细胞的生长有调控作用。
CIK(cytokine induced killer)细胞，是由从外周血、骨髓或脐血中分离出来的单核细胞，在体外经由多种细胞因子如白细胞介素-2、干扰素-γ及某些单克隆抗体的刺激，培养扩增而成的、具有非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的一类异质细胞群。其在体外培养的过程中，能分泌并释放大量生长因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等。且脐带血来源的CIK细胞，其在培养过程中还会分泌大量包裹mRNA、小分子肽等信息物质的外泌体。这些物质能够通过与特异性细胞膜受体结合，调节细胞生长、促进损伤组织修复等多种功能。因此，将CIK细胞体外培养，可获得含有大量生长因子及外泌体的培养液，富集后便可得到白细胞提取物。将白细胞提取物添加到美容护肤产品中，对促进皮肤的新陈代谢、细胞活化与再生、微环境血管的形成，加速皮肤的修复等有显著作用。
目前，在制备白细胞提取物时，也存在如下技术缺陷：一是白细胞提取物的产率低，二是存在死细胞、核苷酸等杂质，影响白细胞提取物的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白细胞提取物的制备方法及其在化妆品中的应用，该提取物具有修复皮肤，抗皱嫩肤的作用。
一种白细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)：取无传染性病原体的新生儿脐带血，离心分离后弃去上层血浆，保留下层血细胞层；
(2)：将生理盐水添加至血细胞层，混匀；混匀后缓慢加入到血液分离液中，离心；
(3)：离心结束后，收集中间层PBMC细胞；
(4)：再次离心，去除上层液体，保留底部PBMC细胞；将PBMC细胞接种至无血清培养基中，加入FBS与IL-2进行培养；
(5)：培养至第五天后，将细胞转移至培养袋中继续培养；每隔两天，补充添加培养基；培养至12-14天后，离心分离细胞，并收集全部培养液；
(6)：将培养液进行过滤，除去杂质，所得液体即为白细胞提取物。
本发明还提供前述的白细胞提取物在化妆品领域中的应用。
具体例子为：
一种护肤组合物，按质量份计算包括以下原料：
特别地，一种护肤组合物，按重量百分比计，包括如下成分：
所述醇类保湿剂为丁二醇、1，3-丙二醇和1，2-己二醇中的至少一种。
所述调节剂为精氨酸、EDTA二钠和磷酸氢二钠中的至少一种。
所述舒缓剂为甘草酸二钾、尿囊素、叶酸和甘油辛酸酯中的至少一种。
所述防腐剂为对羟基苯乙酮和辛酰羟肟酸中的至少一种。
PBMC细胞是指外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell)。
前述护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下，向反应容器中加入水、卡波姆、醇类保湿剂、黄原胶、甘油、透明质酸钠，60℃加热并搅拌均匀，制成混合物A；
(2)将角鲨烷、山嵛醇、花生醇葡糖苷、二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚、卡波姆、白细胞提取物、调节剂、舒缓剂和防腐剂依次加入到混合物A中，50℃加热搅拌均匀，得到混合物B，降温，得护肤组合物。
与现有技术相比，本发明提供的护肤组合物具有角鲨烷、山嵛醇、花生醇葡糖苷、二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚(维生素E)、卡波姆、黄原胶、白细胞提取物等多种原料；其中角鲨烷、山嵛醇具有锁住肌肤内部水分、抗皱嫩肤、增强肌肤屏障，使肌肤更稳定的有益效果；而二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚(维生素E)及白细胞提取物，具有加快皮肤细胞新陈代谢、加速肌肤的修复，促进胶原蛋白再生的有益效果。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1a、图1b、图1c分别为对照组角质形成细胞生长状态：图1-a为接种24小时后生长状态；图1b为接种48小时生长状态；图1c为接种72小时生长状态。
图2a、图2b、图2c分别为实验组角质形成细胞生长状态：图2-a为接种24小时后生长状态；图2b为接种48小时生长状态；图2c为接种72小时生长状态。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在具体实施例中，没有详细说明的步骤、材料选择、数值参数均为现有技术中的常规选择，或者任何现有公开的现有技术。
实施例1白细胞提取物的制备与测试
1.一种白细胞提取物的制备方法：
(1)采集无传染病源的新生儿脐带血50ML，2500-3000rpm/min离心5-10分钟，离心结束后，弃去上层血浆层，保留下次血细胞层；
(2)加入生理盐水，与血细胞层混匀定容至30ml，缓慢加入到20ml细胞分离液中，700g离心15-20min；
(3)离心结束后，收集中层白膜层(白细胞层)，将所收集的白膜层细胞再次用2200rpm/min离心5-10分钟，离心结束后，弃去上层清液，所得底部细胞即为PBMC细胞。
(4)将PBMC细胞接种于无血清培养基中，并加入5％FBS与300U/ml的IL-2，用培养基定容至培养体积为50ml左右，放入37°、5CO2条件培养箱中进行培养。
(5)培养至第五天时，将细胞转移至培养袋中，并补充200ml培养基继续培养。
(6)后续培养过程中，根据细胞生长状态，每隔两天补充300ml无血清培养基；直至培养到12-14天，培养基总体积为1500ml。结束培养，离心分离细胞及培养液，收集全部培养液。
(7)使用0.22μm滤膜过滤培养液，去除杂质，所得液体即为含白细胞提取物的上清液。
2.测试白细胞提取物对人角质形成细胞的增殖作用
1、取生长良好的人角质形成细胞接种于T25瓶中，采用无血清培养基(K-SFM)进行培养；
2、待培养瓶中细胞生长融合至80％时，消化传代，接种于六孔板中，细胞接种量为种量为2ml(4*105cell/ml)，每孔接种2ml。
3、取六孔板中的其中三孔为实验组，每孔加入100μl的白细胞提取物。以另外三孔不添加作为对照组。放入37℃、5％CO2条件培养箱中进行培养，分别于24小时、48小时、72小时进行观测并在两组中取平均值进行消化计数；结果如表1与图1a、图1b、图1c(对照组)；图2a、图2b、图2c(实验组)所示。
表1细胞计数结果
| 24H | 48H | 72H | |
| 对照组细胞数量 | 3.56*105cell/ml | 5.63*105cell/ml | 9.70*105cell/ml |
| 实验组细胞数量 | 4.79*105cell/ml | 7.01*105cell/ml | 13.25*105cell/ml |
3.扩大试验
为了进一步扩大验证白细胞提取物的效果，进行不同添加量的扩大试验。
1、取生长良好的人角质形成细胞接种于T25瓶中，采用无血清培养基(K-SFM)进行培养；
2、待培养瓶中细胞生长融合至80％时，消化传代，接种于多个六孔板中，细胞接种量为种量为2ml(4*105cell/ml)，每孔接种2ml。
3、六孔板中，加入25μl、50μl、200μl的白细胞提取物，每个浓度接种三孔。放入37℃、5％CO2条件培养箱中进行培养，于72小时进行观测取每孔的平均值进行消化计数；结果如表2。
表2细胞计数结果
| 浓度 | 72H |
| 25μl | 10.62*105cell/ml |
| 50μl | 11.83*105cell/ml |
| 200μl | 15.41*105cell/ml |
实施例2护肤组合物的制备与测试
一种面膜液制备方法，包括如下步骤：
(1)称取如下表3按重量百分比计的原料：
(2)无菌条件下，向反应容器中加入水、卡波姆、醇类保湿剂、黄原胶、甘油、透明质酸钠，60℃加热并搅拌均匀，制成混合物A；
(3)将角鲨烷、山嵛醇、花生醇葡糖苷、二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚(维生素E)、卡波姆、白细胞提取物、调节剂、舒缓剂和防腐剂依次加入到混合物A中，50℃搅拌均匀，得到混合物B，所述混合物B降温至常温，即为成品。
表3面膜液的原料配比
表3中，空白表示不添加对应成分。
样品稳定性测试
1、耐热测试：恒温培养箱调节到40℃，将前述制取的4个制品，每个制品取三支装于铝膜面膜袋中，装样量为30ml/袋，封口后置于恒温培养箱内，三个月后取出，恢复至室温，观察外观变化。
2、耐寒测试：恒温培养箱调节到-10℃，将前述制取的4个制品，每个制品取三支装于铝膜面膜袋中，装样量为30ml/袋，封口后置于恒温培养箱内，三个月后取出，恢复至室温，观察外观变化。
3、常温测试：将前述制取的4个制品，每个制品取三支装于铝膜面膜袋中，装样量为230ml/袋，封口后常温下放置6个月后，观察精华液的外观变化。
耐热测试、耐寒测试、常温测试均未观察到析出、沉淀等现象，保持原来外观。
人体皮肤斑贴测试
将获得的4组制品参照《2022化妆品安全技术规范》中的人体皮肤斑贴实验。
分别于30min(待压痕消失后)、24h和48h按标准观察皮肤反应，并记录观察结果，见表4。
表4人体安全性测试结果
| 编号 | 30min | 24h | 48h |
| 1号制品 | 0级，10人 | 0级，10人 | 0级，10人 |
| 2号制品 | 0级，10人 | 0级，10人 | 0级，10人 |
| 3号制品 | 0级，10人 | 0级，10人 | 0级，10人 |
| 4号制品 | 0级，10人 | 0级，10人 | 0级，10人 |
人体主观感受测试
对获得的4组制品，选取年龄为25-35岁的女性为实验对象进行临床试验，实验总人数为40人，连续1个月每晚使用，以面膜纸浸润制品后，贴敷在使用者脸部，每次使用15min后清水洗涤残留物；在实验过程中通过实验对象对面部皮肤的弹性、皱纹减少数量和保湿度进行评价，实验结果如下表5。
表5人体主观感受测试结果
| 实验人数：40人 | 改善效果明显 | 改善效果一般 | 无改善效果 |
| 弹性 | 43 | 5 | 2 |
| 皱纹减少数量 | 44 | 3 | 3 |
| 保湿度 | 47 | 2 | 1 |
细胞活性测试
(1)细胞接种：按2.2*104个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，放置培养箱孵育过夜(37℃、5％CO2)。
(2)实验分组：实验设置空白对照组与实验组，另设3个无细胞的孔做调零孔，实验组中样品以4号制品为基础，设置5个浓度梯度，每个梯度浓度下设置3个复孔。
(3)配液：按实验设计，用基础培养基配置不同浓度的受试物。
表6测试浓度设定表
(4)给药：24h后取出96孔板，废除旧培养基，空白对照组每孔加100μL培养液,样品组每孔加入100μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入100μL细胞培养液。给药完成后放回培养箱继续培养。
(5)检测：细胞培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液。37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加100μL DMSO，在490nm处读取OD值。
(6)细胞相对活力计算：根据公式计算；
(7)利用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析，对测试区域的测量值进行描述性统计。计算分析数值的变化，对照组与样品组之间的差异。如测试数据为正态分布，则采用独立T检验方法进行统计分析；如测试数据为非正态分布，则采用秩和检验方法进行统计分析。统计方法均采用双尾检验，检验水准α＝0.05。
结果如表7所示。
表7MTT检测结果
成纤维细胞分泌I型胶原蛋白影响实验
(1)接种：按2.2*104个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，放置培养箱孵育过夜(37℃、5％CO2)。
(2)UVA照射：PBS清洗细胞后，根据实验分组，对有UVA照射的组别进行30J/cm2的UVA辐照。
(3)配液：根据前述细胞活力测试结果，选择4号制品，选择适宜的样品浓度为测试浓度并配置待测样品溶液，以TGF-β(100ng/mL)为阳性对照进行实验。每孔加样100uL，每组设置3个复孔。给药完成后将96孔板放置在37℃培养箱中避光孵育24h。
(4)细胞上清收集：给药24h后取出96孔板，分别收集各样品组对应的细胞上清液至离心管中，1000rpm离心10min，收集上清置于1.5mL离心管中，-20℃储存备用。
(5)ELISA试剂盒测定细胞上清中I型胶原蛋白浓度：测试前30min取出试剂盒及待测样品，放置于室温后使用，测试操作严格按照试剂盒说明书操作。
(6)利用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析，对测试区域的测量值进行描述性统计。计算分析数值的变化，对照组与样品组之间的差异。如测试数据为正态分布，则采用独立T检验方法进行统计分析；如测试数据为非正态分布，则采用秩和检验方法进行统计分析。统计方法均采用双尾检验，检验水准α＝0.05。结果如表8所示。
表8I型胶原蛋白含量检测结果
注：与模型进行比较，“*”：P<0.05，表示有显著性差异，“**”：P<0.01、“***”：P<0.001，表示非常显著性差异。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.白细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)：取无传染性病原体的新生儿脐带血，离心分离后弃去上层血浆，保留下层血细胞层；
(2)：将生理盐水添加至血细胞层，混匀；混匀后缓慢加入到血液分离液中，离心；
(3)：离心结束后，收集中间层PBMC细胞；
(4)：再次离心，去除上层液体，保留底部PBMC细胞；将PBMC细胞接种至无血清培养基中，加入FBS与IL-2进行培养；
(5)：培养至第五天后，将细胞转移至培养袋中继续培养；每隔两天，补充添加培养基；培养至12-14天后，离心分离细胞，并收集全部培养液；
(6)：将培养液进行过滤，除去杂质，所得液体即为白细胞提取物。
2.权利要求1所述的白细胞提取物在化妆品领域中的应用。
3.一种护肤组合物，其特征在于，按质量份计算包括以下原料：
4.根据权利要求3所述的护肤组合物，其特征在于，白细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)：取无传染性病原体的新生儿脐带血，离心分离后弃去上层血浆，保留下层血细胞层；
(2)：将生理盐水添加至血细胞层，混匀；混匀后缓慢加入到血液分离液中，离心；
(3)：离心结束后，收集中间层PBMC细胞；
(4)：再次离心，去除上层液体，保留底部PBMC细胞；将PBMC细胞接种至无血清培养基中，加入FBS与IL-2进行培养；
(5)：培养至第五天后，将细胞转移至培养袋中继续培养；每隔两天，补充添加培养基；培养至12-14天后，离心分离细胞，并收集全部培养液；
(6)：将培养液进行过滤，除去杂质，所得液体即为白细胞提取物。
5.根据权利要求3所述的护肤组合物，其特征在于，按重量百分比计，包括如下成分：
6.根据权利要求5所述的护肤组合物，其特征在于，所述醇类保湿剂为丁二醇、1，3-丙二醇和1，2-己二醇中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的护肤组合物，其特征在于，所述调节剂为精氨酸、EDTA二钠和磷酸氢二钠中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的护肤组合物，其特征在于，所述舒缓剂为甘草酸二钾、尿囊素、叶酸和甘油辛酸酯中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的护肤组合物，其特征在于，所述防腐剂为对羟基苯乙酮和辛酰羟肟酸中的至少一种。
10.权利要求5-9任一所述的护肤组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下，向反应容器中加入水、卡波姆、醇类保湿剂、黄原胶、甘油、透明质酸钠，加热并搅拌均匀，制成混合物A；
(2)将角鲨烷、山嵛醇、花生醇葡糖苷、二裂酵母发酵产物溶胞产物、生育酚、卡波姆、白细胞提取物、调节剂、舒缓剂和防腐剂依次加入到混合物A中，加热搅拌均匀，得到混合物B，降温，得护肤组合物。
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